CN113718014A - 用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层及制备方法，属于植入式葡萄糖监测仪技术领域。所述用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层加于传感器上，具体加载在传感器的探针上，附载有葡萄糖氧化酶，所述载酶膜层包括由赖氨酸异氰酸酯生成的聚氨酯。本发明还公开了制备所述用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层的方法。本发明的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层具有适宜的网状结构、载酶量高、酶的稳定性好，氧的通透性好，生物相容性好，无毒，无炎症反应，使用寿命长，适合在体内长期使用。本发明采用电沉积的方法制备所述载酶膜层并加到传感器上，所得到的膜薄厚均匀，性能稳定，废品率低。

Description

用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层及制备方法
技术领域
本发明属于植入式葡萄糖监测仪技术领域，具体地，涉及一种用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层及制备方法。
背景技术
糖尿病是一种世界范围的常见病，其特征是由于糖代谢异常而引起的慢性高血糖症。在美国，目前有 9.6% 的人口患有糖尿病，如果目前的趋势继续下去，到 2050 年，预计这一数字将增加到三分之一的成年人。经研究发现，糖尿病是美国第七大死因，每年的成本负担为 1740 亿美元，其中包括 1160 亿美元的直接医疗费用。糖尿病患者的血糖水平在一天中波动很大，长期的血糖失调导致严重的并发症，包括心脏病发作、中风、高血压、肾衰竭、失明和截肢。
血糖监测是控制血糖的必要措施。1987 年，Medisense Inc. 推出了第一台由试纸和阅读器组成的个人血糖检测设备。此后推出了 40 多种不同的小型葡萄糖测定仪。迄今为止，美国食品和药物管理局 (FDA) 已批准了超过 25 种血糖监测仪，其中大多数使用由固定在丝网印刷电极上的葡萄糖脱氢酶 (GDH) 或葡萄糖氧化酶 (GOx) 组成的试纸。该分析基于通过手指穿刺获取少量血液样本 (小于1μL)，随后通过毛细作用将其引入试纸。虽然这些监测器明显提升了对糖尿病患者的健康管理水平，但是这种监测只能提供瞬时血糖浓度，无法提前预警高血糖或低血糖的事件。此外，样本采集（即指尖）方法不仅会造成皮肤损伤，而且操作不便，不能随时监测患者的血糖变化。
因此，人们一直在寻求能够连续监测血糖的分析方法。连续血糖监测 (CGM) 可提供血糖变化的动态趋势（即，血糖水平是升高还是降低）、幅度、持续时间和血糖波动频率的实时信息。理想情况下，具有分析功能的连续血糖监测设备可以与胰岛素输送泵相连，从而形成人工胰腺。植入式葡萄糖传感器可使患者能够连续监测血糖水平、管理胰岛素水平并降低发病率和糖尿病的死亡率。目前所用的葡萄糖监测技术主要基于电化学原理，采用葡萄糖氧化酶作为工作电极，以测定血液/体液中葡萄糖的浓度。但是，直接将葡萄糖氧化酶加到电极上会造成酶的流失，无法长期使用。为了延长传感器在体内的使用寿命，大多数的传感器采用加涂合成的高分子聚合物。但是目前所用的高分子聚合物大多为合成的聚氨酯类，这些聚氨酯具有较差的生物相容性，从而使它们对异物组织反应的抵抗力较低，容易引起炎症、纤维化和脉管系统丧失。目前大多数的植入式葡萄糖传感器的性能（精度和响应时间）会随着时间而发生改变，通常需要重新校准传感器设备以补偿传感器输出漂移。研究发现生物相容性低下/缺乏被认为是导致传感器功能差和体内传感器寿命短的主要原因。因此，如何保持植入体内的葡萄糖氧化酶的活性是连续血糖监测技术的关键所在。
发明内容
为了克服现有的植入式葡萄糖传感器的不足，本发明的目的是通过采用完全生物相容的高分子聚合物作为传感器的涂层以延长传感器的使用寿命，增加传感器的测定精度，减少炎症反应，提高植入式电化学葡萄糖传感器的工作效率。
为了达到该目的，本发明采用的技术方案是：
本发明第一方面提供一种用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层，包括葡萄糖氧化酶，所述载酶膜层包括由赖氨酸异氰酸酯生成的聚氨酯。
在本发明的一些实施方案中，所述聚氨酯由所述赖氨酸异氰酸酯与带有活泼氢的化合物反应生成。
在本发明的一些具体实施方案中，所述带有活泼氢的化合物选自包括水、醇、氨基酸、酶、蛋白质和高分子聚合物的含活泼氢化合物组合中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方案中，所述高分子聚合物为天然高分子聚合物。
在本发明的一些更优选实施方案中，所述天然高分子材料选自包括聚糖（Chitosan）、海藻酸盐（Alginate）、果胶（Pectin）、透明质酸（Hyaluronate；HA）、胶原蛋白（Collagen）和明胶（Gelatin）的细胞外基质组合中的至少一种。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层的一种制备方法，包括以下步骤：
S1，利用赖氨酸异氰酸酯生成聚氨酯薄膜，
S2，在所述聚氨酯薄膜上附载所述葡萄糖氧化酶，即得到所述载酶膜层。
在本发明的一些实施方案中，步骤S1利用电化学沉积的方法生成所述聚氨酯薄膜。
在本发明的一些实施方案中，步骤S1中，利用赖氨酸异氰酸酯与带有活泼氢的化合物反应生成所述聚氨酯薄膜。
在本发明的一些具体实施方案中，所述带有活泼氢的化合物选自包括水、醇、氨基酸、酶、蛋白质和高分子聚合物的含活泼氢化合物组合中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方案中，所述高分子聚合物为天然高分子聚合物。
在本发明的一些更优选实施方案中，所述天然高分子材料选自包括聚糖、海藻酸盐、果胶、透明质酸、胶原蛋白和明胶的细胞外基质组合中的至少一种。
在发明的一些实施方案中，步骤S2中在所述聚氨酯薄膜上滴加葡萄糖氧化酶进行附载。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法进一步包括，
S3，在步骤S2得到的载酶膜层上，进一步利用赖氨酸异氰酸酯生成聚氨酯薄膜。优选地，还可以在聚氨酯薄膜上继续滴加葡萄糖氧化酶，以进一步提高栽酶量，提高血糖监测的准确率。
本发明第三方面提供本发明第一方面所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层的另一种制备方法，步骤包括如下：将赖氨酸异氰酸酯和葡萄糖氧化酶反应，生成含有葡萄糖氧化酶的聚氨酯，再将所述葡萄糖氧化酶的聚氨酯加涂在所述传感器的探针上生成所述载酶膜层。
在本发明中，所述赖氨酸异氰酸酯和葡萄糖氧化酶利用共价交联的方法生成含有葡萄糖氧化酶的聚氨酯。
在本发明的一些实施方案中，进一步包括在所述载酶膜层上滴加葡萄糖氧化酶的步骤，用于增加所述传感器的探针上的载酶量，提高血糖监测的准确率。
本发明第四方面提供本发明第一方面所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层的又一种制备方法，包括以下步骤：
S1’，利用葡萄糖氧化酶与天然高分子聚合物反应生成含有葡萄糖氧化酶的天然高分子聚合物膜层，
S2’，在步骤S1’获得的所述含有葡萄糖氧化酶的天然高分子聚合物膜层上，利用赖氨酸异氰酸酯生成聚氨酯薄膜，即得到所述载酶膜层。
在本发明的一些实施方案中，所述天然高分子材料选自包括聚糖、海藻酸盐、果胶、透明质酸、胶原蛋白和明胶的细胞外基质组合中的至少一种。
在本发明的一些实施方案中，所述葡萄糖氧化酶与天然高分子聚合物利用共价交联生成所述含有葡萄糖氧化酶的天然高分子聚合物膜层。
在本发明的一些实施方案中，还包括在所述含有葡萄糖氧化酶的天然高分子聚合物膜层上滴加葡萄糖氧化酶的步骤。在本发明的一些实施方案中，进一步包括在最外层再利用赖氨酸异氰酸酯生成一层聚氨酯薄膜。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层具有适宜的网状结构、载酶量高、酶的稳定性好，氧的通透性好，生物相容性好，无毒，无炎症反应，适合在体内长期使用。
本发明的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层包括由赖氨酸异氰酸酯（LDI）生成的聚氨酯，相对于现有技术中用于传感器上的如由六亚甲基二异氰酸酯（hexamethylenediisocyanate；HDI) 或甲苯二异氰酸酯（toluene diisocyanate；TDI) 制备的聚氨酯类具有显著的进步，后者的降解产物均为有毒的二胺类化合物，特别是TDI的降解产物2，4-二氨基甲苯（2,4-diaminotoluene）是致癌物质，而赖氨酸异氰酸酯的降解产物是赖氨酸，众所周知，赖氨酸是人体必需的8个氨基酸之一，所以本发明所合成的高分子聚合物不含有任何有毒物质, 生物相容性好，适合植入式生物传感器的使用。
本发明采用电沉积的方法将载酶膜层加到传感器上，所得到的膜薄厚均匀，性能稳定，废品率低。
附图说明
图1示出了壳聚糖的化学结构。
图2示出了壳聚糖电沉积的原理示意图。
图3示出了壳聚糖电沉积的过程。
图4示出了阳离子电解质的电沉积过程示意图。
图5示出了阴离子电解质的电沉积过程示意图。
图6示出了海藻酸纳的电化学沉积化学反应示意图。
图7示出了透明质酸钠的电化学沉积化学反应示意图。
图8示出了赖氨酸氰酸酯与醋酸纤维素的反应示意图。
图9未出了赖氨酸氰酸酯可以和赖氨酸异氰酸酯与壳聚糖、果胶、透明质酸盐、海藻酸钠盐、醋酸纤维素反应。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质（如分子量，熔体指数等）是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数（例如1.1，1.5等）的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10（例如1到5）的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然（例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体）。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明实验方法，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例 1
在搅拌下，将0.5g醋酸纤维素溶于10mL含有50%丙酮和50%乙醇的溶液中，制成5%的醋酸纤维素溶液。充分搅拌均匀后，将探针浸泡在5%的醋酸纤维素溶液中10s，然后将探针慢慢抽出后，在醋酸纤维素溶液的上方蒸汽中停留5s，再将探针第二次浸入醋酸纤维素溶液中10s，然后缓慢抽出探针，在室温下自然干燥（22°C）60s以形成薄膜，再将探针置于蒸馏水中浸泡6h，以便除去残留在膜孔中的溶剂。
将40mg葡萄糖氧化酶溶于1mL的100mM的磷酸盐缓冲液中，制成浓度为每mL含有40mg葡萄糖氧化酶的溶液，将此葡萄糖氧化酶溶液5μL滴加到醋酸纤维素薄膜上，室温下干燥10min，然后将探针置于密闭的玻璃缸中，下方放有25%的戊二醛溶液，室温下探针在25%的戊二醛溶液上方的蒸汽中熏蒸12h以固定葡萄糖氧化酶。然后再将探针用去离子水冲洗，并在空气中干燥2h。以这种方式制成的醋酸纤维素薄膜具有良好的长期稳定性，酶不会受热降解，不被蛋白分解，也不会被水解，并且可以排除抗坏血酸和尿酸对葡萄糖的干扰。
实施例 2
将0.5g醋酸纤维素（CA）溶于10mL二氧六环中，制成5%的醋酸纤维素溶液。在不断搅拌下，将赖氨酸异氰酸酯（LDI）按不同重量百分比（表1）滴加至反应的混合物中，待LDI全部滴加完毕后，继续搅拌5h，以形成醋酸纤维酸-聚氨酯（CA-LDI）溶液。再将探针浸泡在醋酸纤维素-聚氨酯溶液中10s，然后将探针慢慢抽出后，在空气中干燥10s，再将探针第二次浸入醋酸纤维素-聚氨酯溶液中10s，然后缓慢抽出探针，在真空干燥箱中（50°C）30min以形成薄膜，再将探针置于蒸馏水中浸泡6h，以便除去残留在膜孔中的溶剂。
表 1 醋酸纤维素-聚氨酯高分子溶液的组成
样本 醋酸纤维素(g） 二氧六环（mL） 赖氨酸异氰酸酯（% w/w醋酸纤维素）
CA 1 10 0
CA-LDI-15 1 10 15
CA-LDI-30 1 10 30
CA-LDI-45 1 10 45
CA-LDI-60 1 10 60
再按实施例1所述方法将葡萄糖氧化酶加载在探针上。
实施例 3
将0.5g壳聚糖（Chitosan）（化学结构式如图1）加到250mL 1%醋酸溶液中，搅拌溶解后再加入250mg的葡萄糖氧化酶，继续搅拌均匀。
将搅拌均匀的溶液加到电沉积用的电池中，电沉积是在含有铂电极（50×50×0.1mm），AISI304不锈钢（50×50×0.1mm）和镀铂硅晶片（20×30×1mm）的基板上进行。硅晶片包含通过溅射沉积的1000安培的铂金层和400安培的钛粘附层，电沉积电压是15-20伏。
酸性下，壳聚糖的氨基质子化形成带有正电荷的高分子阳离子（图2），当溶液的酸度降低时，壳聚糖的氨基质子化程度降低乃至去质子化。在电沉积的过程中，带有正电荷的壳聚糖大分子在电场的作用下向阴极迁移最后在阴极表面形成不溶性的沉淀（图3、图4）。
电沉积后在铂电极上得到含有葡萄糖氧化酶的醋酸纤维素薄膜，将膜在室温下干燥48h，然后低温存放、备用。
实施例 4
将0.3g海藻酸钠（Sodium Alginate）加到100mL去离子水中，搅拌溶解后再加入100mg的葡萄糖氧化酶，继续搅拌均匀，然后将此溶液用氢氧化钠或醋酸调至pH 8，再按实施例3所述的方法进行电沉积。
利用电化学沉积的方法可以从海藻酸钠盐（AlgCOONa）溶液中制备阴离子电解质海藻酸（AlgCOOH）。沉积机制涉及海藻酸根阴离子AlgCOO-大分子的电泳和在阳极表面的电荷中和以及阳极反应中水的电化学分解（图5、图6）。
实施例 5
将0.3g透明质酸钠（Sodium Hyaluronate）加到100mL去离子水中，搅拌溶解后再加入100mg的葡萄糖氧化酶，继续搅拌均匀，然后将此溶液用氢氧化钠或醋酸调至pH8，再按实施例3所述的方法进行电沉积。
利用电化学沉积的方法可以从透明质酸钠溶液中在阳极电沉积出另一种含有阴离子-COO-基团的生物聚合物——透明质酸（图7），由此，得到透明质酸薄膜。
实施例 6
将0.1g透明质酸钠（Sodium Hyaluronate）加到5mL去离子水中，搅拌溶解后再加入10mg的葡萄糖氧化酶和10mg的EDC，继续在室温下搅拌反应1h，然后将此溶液滴加至探针上，室温下干燥过夜、备用。
实施例 7
将0.1g海藻酸钠（Sodium Alginate）加到5mL去离子水中，搅拌溶解后再加入10mg的葡萄糖氧化酶和10mg的EDC，继续在室温下搅拌反应1h，然后将此溶液滴加至探针上，室温下干燥过夜、备用。
实施例 8
将0.1g壳聚糖（Chitosan）加到25mL1%的醋酸溶液中，搅拌溶解后再加入10mg的葡萄糖氧化酶和10mg的EDC，继续在室温下搅拌反应1h，然后将此溶液滴加至探针上，室温下干燥过夜、备用。
实施例 9
将0.69g赖氨酸异氰酸酯（LDI；3mM；异氰酸酯6mM）加到含有0.92g甘油（1mM；羟基3mM）的圆底烧瓶中，充氮气后，在密闭条件下搅拌反应5h，得到以异氰酸酯封端的聚氨酯溶液（LDI-Gly聚氨酯）。
将LDI-Gly聚氨酯溶液直接加在实施例1~实施例8的探针上，使其与葡萄糖氧化酶以及含有活波氢的化合物（如壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸等）反应，形成最外层膜，用以控制葡萄糖的透膜量，保护葡萄糖氧化酶的丢失，并且阻止其他干扰物质的渗透。此膜不仅提高了传感器的精度，而且延长了传感器的使用寿命。
赖氨酸异氰酸酯与天然高分子聚合物反应，能够生成具有良好生物相容性的聚氨酯薄膜。
将LDI-Gly聚氨酯溶液加在实施例1和实施例2的探针上，即是将赖氨酸异氰酸酯与醋酸纤维素反应，得到赖氨酸-醋酸纤维素聚氨酯（如图8所示）。
将LDI-Gly聚氨酯溶液直接加在实施例3~实施例8的探针上，即是将赖氨酸异氰酸酯与壳聚糖、果胶、透明质酸盐、海藻酸钠盐反应，生成聚氨酯薄膜（如图9所示）。
实施例 10
将葡萄糖氧化酶水溶液与实施例9制备的LDI-Gly聚氨酯溶液混合，然后再将含有葡萄糖氧化酶的LDI-Gly聚氨酯加到实施例1~实施例8的探针上，在最外层形成含有共价结合的葡萄糖氧化酶的保护膜，此膜同样不仅提高了传感器的精度，而且延长了传感器的使用寿命。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层，包括葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述载酶膜层包括由赖氨酸异氰酸酯生成的聚氨酯。
2.根据权利要求1所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层，其特征在于，所述聚氨酯由所述赖氨酸异氰酸酯与带有活泼氢的化合物反应生成。
3.根据权利要求2所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层，其特征在于，所述带有活泼氢的化合物选自包括水、醇、氨基酸、酶、蛋白质和高分子聚合物的含活泼氢化合物组合中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层，其特征在于，所述高分子聚合物为天然高分子聚合物。
5.根据权利要求4所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层，其特征在于，所述天然高分子材料选自包括醋酸纤维素、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、果胶、胶原蛋白和明胶的细胞外基质组合中的至少一种。
6.权利要求1所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，利用赖氨酸异氰酸酯生成聚氨酯薄膜，
S2，在所述聚氨酯薄膜上附载所述葡萄糖氧化酶，即得到所述载酶膜层。
7.权利要求1所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层的制备方法，其特征在于，将赖氨酸异氰酸酯和葡萄糖氧化酶反应，生成含有葡萄糖氧化酶的聚氨酯，再将所述葡萄糖氧化酶的聚氨酯加涂在所述传感器的探针上生成所述载酶膜层。
8.权利要求1所述的用于植入式葡萄糖监测仪的载酶膜层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，利用葡萄糖氧化酶与天然高分子聚合物反应生成含有葡萄糖氧化酶的天然高分子聚合物膜层，
S2，在步骤S1获得的所述含有葡萄糖氧化酶的天然高分子聚合物膜层上，利用赖氨酸异氰酸酯生成聚氨酯薄膜，即得到所述载酶膜层。
9.根据权利要求7-8任一所述的制备方法，其特征在于，进一步包括在所述载酶膜层上滴加葡萄糖氧化酶的步骤。
10.根据权利要求6-8任一所述的制备方法，其特征在于，利用电化学沉积的方法生成薄膜。
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CN110181806A (zh) * 2019-06-03 2019-08-30 北京科技大学 具有生物适配性的可降解水性聚氨酯的低温3d打印方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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