CN116858916A - 一种具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，步骤包括，在葡萄糖氧化酶传感器组件表面制作壳聚糖外膜；加入盐的固体颗粒到预固化PDMS溶液中，超声混合，获得盐‑PDMS混合液，将盐‑PDMS混合液滴入一凹槽内并真空抽取其中空气；然后将具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件浸入到凹槽内的盐‑PDMS混合液中，后取出固化，重复浸入和固化多次，直至壳聚糖膜层上形成设定值厚度的PDMS外膜，然后去离子水溶解PDMS外膜中盐颗粒，获得具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器。本申请方法制备的传感器使用壳聚糖和具有多孔结构的PDMS为外膜材料，制备方法简单，产品品质控制方便。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种具有具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法。
背景技术
糖尿病是一种慢性病，常常伴随着一系列的并发症如中风、失明或肾功能衰竭等，病情严重可能导致糖尿病人的离世，但良好的血糖控制能够降低并发症危害，大大提升糖尿病人的存活期。在糖尿病的控制和治疗过程中，血糖监测是非常重要的一环，为了正确管理血糖水平并与胰岛素保持平衡，需要连续(或至少经常)监测血糖，但连续的针刺取样不仅取样麻烦还给病患带来痛苦使得病人容易产生恐惧。随着科技的发展，连续血糖监测系统(CGMS)概念被提出，CGMS可以提供连续、全面的血糖信息，而皮下植入针型电流型葡萄糖生物传感器是CGMS最常用的传感器，其主要目标生物样本是血液，同时，间质液也是葡萄糖检测的目标生物样本。
皮下植入针型电流型葡萄糖生物传感器利用电化学酶传感器器法检测葡萄糖是通过葡萄糖氧化酶与葡萄糖的酶促反应，其产物再与电极之间进行作用从而检测葡萄糖。需要传感器保证葡萄糖、氧气等反应物质的顺利传递。然而皮下植入针型电流型葡萄糖生物传感器传感器植入过程中会发生材料-组织相互作用，即所谓的生物污损，例如蛋白质/血小板沉积，或炎症反应相关细胞的附着，导致植入葡萄糖生物传感器行为不可预测。
外膜材料是实现葡萄糖生物传感器解决生物相容性的关键因素，良好的生传感器外膜材料可以提升组织界面的兼容性，降低异物反应对传感器带来的负面影响。传感器外膜有多重功能，主要包括：一是限制葡萄糖通过；二是加速氧传质；三是改善传感器－组织界面的生物兼容性；四是保护传感器，增强传感器的生物一力学特性。目前市面上的外模材料包括有聚氨酯(PU)及热塑性聚氨酯(TPU)、Nafion、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯(PC)等，然而这些聚合物材料具有疏水性，并且交联程度过高，会限制葡萄糖、氧气以及过氧化氢的均匀扩散。同时，PU和Nafion基膜的性能高度依赖于聚合条件，在生产批次内导致传感器性能的高度可变性。
发明内容
为了克服现有的技术的不足，本发明提供一种具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法。
本发明技术方案如下所述：
所述制备方法步骤包括：
步骤S1：滴加壳聚糖溶液到葡萄糖氧化酶传感器组件表面，温箱晾干，在葡萄糖氧化酶传感器组件表面形成壳聚糖外膜，获得具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件；
步骤S2：加入盐的固体颗粒到预固化PDMS溶液中，超声混合，获得盐-PDMS混合液，将所述盐-PDMS混合液滴入一凹槽内，真空抽取所述凹槽内的盐-PDMS混合液中空气；
步骤S3：将具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件浸入到所述凹槽内，使所述凹槽内的盐-PDMS混合液浸没所述具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件一段时间，后取出固化，在传感器表面形成PDMS外膜；重复本步骤至PDMS外膜厚度至设定值，获得具有PDMS/壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器；
步骤S4：放置所述具有PDMS/壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器至去离子水中，溶解PDMS外膜中盐颗粒，获得具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器。
进一步地，在一实施例中，所述壳聚糖溶液的配置方法如下：
将壳聚糖粉末加到0.1mmol的醋酸中，搅拌溶解壳聚糖粉末，配成0.5％的壳聚糖溶液。
进一步地，在一实施例中，所述盐-PDMS混合液中的盐为锰盐，PDMS外膜多孔结构的的孔径与所述锰盐固体颗粒粒径相同。
进一步地，在一实施例中，所述预固化PDMS溶液配置方法如下：
将二甲基硅油和固化剂以重量比为10：1的比例混合均匀，获得所述预固化PDMS溶液，其中所述固化剂为邻苯二甲酸二丁酯。
进一步地，在一实施例中，所述预固化PDMS溶液配置方法如下：
将二甲基硅油和固化剂以体积比为10：1的比例混合均匀，获得所述预固化PDMS溶液，其中所述固化剂为邻苯二甲酸二丁酯。
进一步地，在一实施例中，所述葡萄糖氧化酶传感器组件包括酶涂层电极和Ag/AgCl参考电极。
进一步地，在一实施例中，步骤S3重复次数为5次，每次盐-PDMS混合液浸没传感器的时间为3s。
进一步地，在一实施例中，PDMS外膜固化条件为37℃下固化2h。
进一步地，在一实施例中，步骤S1中，使用微量移液器吸取所述壳聚糖溶液，以将壳聚糖溶液滴加到葡萄糖氧化酶传感器组件表面，温箱晾干温度为25℃。
进一步地，在一实施例中，所述制备方法步骤S4以后，还包括步骤S5，
步骤S5：将所述具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器在室温下干燥，然后转移至磷酸盐缓冲液中并在4℃下储存。
根据上述方案的发明，制备出的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器的有益效果在于：
1)如图1所示，PDMS外膜的电镜扫描图片中可看出，本申请方法制备出的PDMS具有多孔结构且孔隙均匀，孔隙均匀的PDMS外膜多孔结构有利于促进细胞向内生长，有利于氧气，过氧化氢和葡萄糖通过，保证传感器工作的稳定性，在制造后连续测量后14天后测量，传感器37°恒温条件，对12mM葡萄糖溶液的葡萄糖浓度变化响应电流仅衰减30％、响应时间小于6s、灵敏度为148nA·L·mmol-1·cm-2，与初始性能非常相似。
2)本申请方法外膜形成方法操作简单，且PDMS外膜多孔结构的孔径依赖于所选择盐的固体颗粒粒径，多孔结构的孔隙率依赖于盐的用量，外膜多孔结构形成条件明确且容易控制，批间传感器具有较高的一致性，对制备获得的传感器进行性能测试其准确度高，线性系数达0.995，满足体内葡萄糖监测的要求。
附图说明
图1为本发明一实施例获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器的SEM图；
图2为本发明一实施例获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器的C-V图；
图3为本发明一实施例获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器的I-T特性图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合具体实施例，对本发明进行更详细的说明。本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
此外，下面所描述的本发明不同实施例中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明提供了一种具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法的实施例，制备方法步骤如下所述。
(1)、取一包括有酶涂层电极和Ag/AgCl参考电极的葡萄糖氧化酶传感器组件，并使用使用微量移液器吸取壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴加到葡萄糖氧化酶传感器组件表面，25℃温箱晾干，在葡萄糖氧化酶传感器组件表面形成壳聚糖外膜，获得具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件。
其中，壳聚糖溶液的配置方法为，将壳聚糖粉末缓慢加入到0.1mmol的醋酸水溶液中，搅拌溶解壳聚糖粉末，配成质量分数为0.5％的壳聚糖溶液。
壳聚糖溶液在葡萄糖氧化酶传感器组件表面形成与天然组织相似的具有柔韧性的网状聚合物，其具有较高的含水量以及优秀的生物学相容性。在生理溶液中，壳聚糖可以减少蛋白质的吸附和随后的炎症反应。同时，其多孔的外层结构，不作为葡萄糖的选择性屏障，使葡萄糖扩散更均匀，且同时有利于细胞在体内的粘附。
(2)、加入锰盐的固体颗粒到预固化PDMS溶液中，超声混合，获得盐-PDMS混合液；将盐-PDMS混合液滴入一不锈钢凹槽内，真空抽取凹槽内的盐-PDMS混合液中空气。
聚二甲基硅氧烷英文名称为Polydimethylsiloxane，简称PDMS，为一种高分子有机硅化合物，具有良好的生物、化学惰性，和无毒、不易燃的特点。本实施例中，预固化PDMS溶液为将二甲基硅油和邻苯二甲酸二丁酯以重量比为10：1的比例混合均匀获得，邻苯二甲酸二丁酯英文名称为Dibutyl phthalate，简称DBP，为二甲基硅油的固化剂，用于后续PDMS外膜的成型固化。在另一实施例中，预固化PDMS溶液也可以为将二甲基硅油和DBP以体积比为10：1的比例混合均匀获得。
盐-PDMS混合液制备的过程中，空气容易进入混合液中，产生气泡，影响后续成膜过程中PEDMS外膜多孔结构的孔径和孔隙率，使得传感器外膜多孔结构不可控，通过抽真空可将不锈钢凹槽内的盐-PDMS混合液中的空气排除，使得本申请方法形成的PDMS外膜多孔结构的孔径以及孔隙率仅取决于加入的锰盐的固体颗粒粒径和盐的用量。
(3)、然后将具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件浸入到所述凹槽内，使所述凹槽内的盐-PDMS混合液浸没所述具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件3s，后取出37℃下固化2小时，在传感器表面形成一层PDMS外膜，重复本步骤5次至PDMS外膜厚度至设定值，获得具有PDMS/壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器。
在其他实施例中，可以根据传感器的性能设计需求适当调整传感器的浸没时间和固化条件，以及适当调整重复本步骤操作的次数。
(4)、放置具有PDMS/壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器至流动的去离子水中2小时，溶解PDMS外膜中锰盐颗粒，PDMS外膜形成多孔结构，获得具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器。
本实施例中锰盐的固体颗粒的粒径约为30um，由于锰盐固体颗粒易溶于水，不溶于有机溶剂，PDMS外膜上的锰盐固体颗粒溶解进入到去离子水中，从而在PDMS外膜上留下约等于锰盐固体颗粒粒径大小的孔洞，从而使得PDMS外膜具有孔径约为30um的多孔结构。本申请中锰盐带有颜色，可以根据PDMS外膜的颜色判断其上的锰盐是否完成完全溶解，可以方便观察盐固体颗粒的溶解情况。
在其他实施例中，可根据PDMS外膜的孔径需求不同改变盐-PDMS混合液中加入盐的固体颗粒粒径或种类，以使获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器的多孔结构的孔径大小不同，即盐-PDMS混合液中所使用盐的固体颗粒粒径影响PDMS外膜的多孔结构的孔径大小，其孔径大小约等于固体颗粒粒径。由于孔隙的孔径大小与加入的盐的固体颗粒粒径相关，同一批次的传感器之间会具有较好的一致性。
特别地，盐-PDMS混合液中盐的用量影响PDMS外膜的多孔结构的孔隙率。假定预固化的PDMS溶液体积为V，孔隙体积为Vpore，孔隙率＝Vpore/V。因此可按需要的孔隙率及实验用的PDMS体积来计算总的孔隙体积。本实施例中孔隙大小约为30um，用球形体积公式从而计算出单个孔隙的体积，由此可以求出盐-PDMS混合液中总的锰盐的用量。
(5)、经去离子水清洗后，还需要将具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器在室温下干燥，然后转移至磷酸盐缓冲液中并在4℃下储存。磷酸盐缓冲液储存使得PDMS外膜以及壳聚糖外膜空隙中充满磷酸盐缓冲液，保持传感器表面的湿润，防止干燥脱水导致外膜损坏以保护传感器，且便于后续的皮下植入。
壳聚糖具有生物降解性、生物相容性、无毒性，价格低廉，被广泛的应用在体内材料上，但在植入过程中过于脆弱，无法维持其膜结构和功能，因此，壳聚糖难以单独作为植入式葡萄糖传感器的最外层膜。PDMS属于有机硅家族，具有优异的氧气透过率，较好的物理稳定性和强度、柔韧性、很好的生物相容性，并且足够稳定，耐受周围液体环境的长时间的浸泡，还能保持其形状和性能的稳定,并且价格低廉。本申请开发出了具有多孔结构的PDMS，这种多孔结构在应力的作用下会弹性变形，降低了断裂的风险，与壳聚糖联合使用作为植入性葡萄糖传感器的外膜，可以防止植入时壳聚糖结构的塌陷、溶胀，并且使得传感器具有足够的机械强度以及锋利的尖端以刺穿皮肤，并且在插入皮肤后具有韧性和机械稳定性，允许氧气和水分子通过。同时，以PDMS和壳聚糖作为外膜，可以减少传感器周围的异物反应，从而提高体内时传感器的性能，满足传感器外层的生物相容性和结构稳定性要求。同时本申请中壳聚糖膜层以及多孔结构的PDMS膜层制备方法简单。
对按照上述方法制备获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器外膜进行电镜扫描，扫描结果如图1所示，其PDMS外膜具有多孔结构，且多孔结构孔洞分布均匀，对制备获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器进行葡萄糖浓度检测结果测试，测试发现传感器准确度高，线性系数达0.995，满足体内葡萄糖监测的要求，具有较好的一致性。
本申请方法制备获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器在制造后连续测量14天后再进行测量，37°恒温下测定12mM葡萄糖溶液，传感器对葡萄糖浓度变化响应电流衰减仅为30％、响应时间小于6s、灵敏度为148nA·L·mmol-1·cm-2，与初始测定结果非常相似，因此本申请方法制备获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器具有较好的稳定性。
对按照上述方法制备获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器进行了电极的电化学性能测试，结果如图2所示，其C-V曲线中出现了一对可逆的氧化还原峰，曲线对称性良好，曲线对称性高说明电极可逆性良好，说明具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器具有良好的电流响应的灵敏度，其电极与体液或血液之间电子传递的效率高，电极氧化还原的可逆性好。
按照上述方法制备获得的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器分别对浓度为0mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM葡萄糖溶液进行测试，测试结果如图3所示，在葡萄糖浓度为0-20mM之间，传感器具有良好的响应，因此本申请方法获得的生物传感器具有较宽的检测范围，高血糖条件下也具有良好的检测能力，适用于糖尿病人血液中血糖浓度的准确监测。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤包括，
步骤S1：滴加壳聚糖溶液到葡萄糖氧化酶传感器组件表面，温箱晾干，在葡萄糖氧化酶传感器组件表面形成壳聚糖外膜，获得具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件；
步骤S2：加入盐的固体颗粒到预固化PDMS溶液中，超声混合，获得盐-PDMS混合液，将所述盐-PDMS混合液滴入一凹槽内，真空抽取所述凹槽内的盐-PDMS混合液中空气；
步骤S3：将具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件浸入到所述凹槽内，使所述凹槽内的盐-PDMS混合液浸没所述具有壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器组件一段时间，后取出固化，在传感器表面形成PDMS外膜；重复本步骤至PDMS外膜厚度至设定值，获得具有PDMS/壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器；
步骤S4：放置所述具有PDMS/壳聚糖外膜的葡萄糖氧化酶传感器至去离子水中，溶解PDMS外膜中盐颗粒，获得具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器。
2.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，所述盐-PDMS混合液中的盐为锰盐，PDMS外膜多孔结构的的孔径与所述锰盐固体颗粒粒径相同。
3.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的配置方法如下：
将壳聚糖粉末加到0.1mmol的醋酸水溶液中，搅拌溶解壳聚糖粉末，配成0.5%的壳聚糖溶液。
4.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，所述预固化PDMS溶液配置方法如下：
将二甲基硅油和固化剂以重量比为10：1的比例混合均匀，获得所述预固化PDMS溶液，其中所述固化剂为邻苯二甲酸二丁酯。
5.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，所述预固化PDMS溶液配置方法如下：
将二甲基硅油和固化剂以体积比为10：1的比例混合均匀，获得所述预固化PDMS溶液，其中所述固化剂为邻苯二甲酸二丁酯。
6.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶传感器组件包括酶涂层电极和Ag/AgCl参考电极。
7.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，步骤S3重复次数为5次，每次盐-PDMS混合液浸没传感器的时间为3s。
8.根据权利要求7所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，PDMS外膜固化条件为37℃下固化2h。
9.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，步骤S1中，使用微量移液器吸取所述壳聚糖溶液，以将壳聚糖溶液滴加到葡萄糖氧化酶传感器组件表面，温箱晾干温度为25℃。
10.根据权利要求1所述的具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤S4以后，还包括步骤S5，
步骤S5：将所述具有多孔结构外膜的葡萄糖氧化酶传感器在室温下干燥，然后转移至磷酸盐缓冲液中并在4℃下储存。
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