CN113712922A - 一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂及其制备方法 - Google Patents

一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂及其制备方法，所述防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂包含或由防己诺林碱衍生物、磷脂和泊洛沙姆组成；其中，所述防己诺林碱衍生物为7‑O‑(o‑溴苯磺酰基)防己诺林碱和/或其药学上可接受的盐。本发明提供了防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，其具有良好的稳定性，较高的包封率和载药量。并能发挥出优异的细胞毒性，其针对肺癌细胞的细胞毒性显著由于其等质量的原药水溶剂以及临床上的常用药羟基喜树碱。

Description

一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂及其制备方法
技术领域
本申请涉及药物制剂领域，具体涉及一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂及其和制备方法。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
癌症是威胁人类健康和生命的重大疾病。肺癌是世界五大最常见的癌症之一，大多数晚期肺癌患者缺乏有效的系统性治疗措施，药物治疗在肝癌治疗中有着不可替代的作用。近年来，天然药物及其衍生物取得了显著的治疗效果并受到研究者的密切关注，但是由于药物的溶解性以及稳定性问题，使其在临床应用方面受到了一定的限制。共溶剂增溶、环糊精包合物、乳剂、脂质体、微粉化等只能部分解决药物溶解性问题，且载药量低、辅料用量大。
纳米混悬剂借助于表面活性剂或高分子材料将药物直接制备成稳定的纳米大小微粒，从而形成纯药物纳米颗粒的亚微细粒胶态分散体。与传统意义上的纳米体系(比如纳米脂质体、纳米微囊和纳米微球以及聚合物胶束等)不同，纳米混悬剂可以无需载体材料，只需借助表面活性剂的稳定作用，是近乎“纯药物”的纳米级颗粒。
纳米混悬剂具有如下优点：(1)在理论上，纳米混悬剂是近乎纯药物的纳米粒，具有最大限度的载药量和药物传输效率，特别适合大剂量难溶性药物给药；(2)适用性强，不论是水难溶的药物，还是油难溶的药物，都可采用一定的方法制得相应的纳米混悬剂；(3)纳米混悬剂配方组成少、工艺简单、制备快速，易于实现规模化生产；(4)纳米混悬剂经过干燥即可制得粉末，进而可制备成口服、注射、外用等不同剂型的药物，方便储存和运输携带。
然而，纳米混悬剂的稳定性问题往往是其应用及规模化生产的瓶颈，影响因素较多，除了剂型、分散介质、给药途径、生产方法等的影响外，药物自身的性质比如药物表面能、溶解性、分子量、官能团、晶体结构等以及纳米混悬剂内在相互作用都会为稳定性以及解决稳定性问题带来影响。由于目前人们对纳米混悬剂内在的相互作用的认识尚不全面，对于如何改善纳米混悬剂的稳定性缺乏合适的引导；而不同药物的差异性更是导致了药物与表面活性剂和/或溶剂之间的内在相互作用的直接差异，使得不同药物之间的直接套用几乎无可能，而目前又尚无明确的法则可遵循，这成为纳米混悬剂开发中的难点。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂及其制备方法，本申请的提供的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂的粒径平均在40-100nm，具有较好的稳定性和高载药量。此外，本申请的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂具有良好的生物相容性，能够显著提升防己诺林碱衍生物的细胞毒性，更好的应用于抗肿瘤治疗。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，其包含或由防己诺林碱衍生物、磷脂和泊洛沙姆组成；其中，所述防己诺林碱衍生物为7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱和/或其药学上可接受的盐。
所述7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱为淡黄色粉末状物，分子式为C43H43O8N2SBr，相对分子质量为827.78，结构如式I所示：
Figure BDA0003229077030000031
防己诺林碱衍生物属于双苄基异喹啉类的生物碱类化合物，其中，7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱不稳定导致其生物利用度不高。本发明以磷脂为乳化剂，以泊洛沙姆为稳定剂能够制备得到防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，得到的脂质纳米混悬剂的具有一定的载药量，能够较好的包封药物；并且外观形态呈类球形，具有一定的稳定性。
本发明所述的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱的盐形式选自盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、醋酸盐、丙酸盐、草酸盐、甲苯磺酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、烟酸盐、富马酸盐、马来酸盐、葡萄糖酸盐、苹果酸盐、二盐酸盐、二氢溴酸盐、二甲酸盐、二醋酸盐、二丙酸盐、二(对甲苯磺酸)盐和二(苯甲酸)盐。
在本发明的实施过程中，发明人发现不同的防己诺林碱衍生物的盐与磷脂和泊洛沙姆制备脂质纳米混悬剂时，稳定性、包封率、载药量或对于癌细胞的细胞毒性作用均有不成程度的差异，比如，在本发明的一些实施方式中，当所述防己诺林碱衍生物为7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱或其富马酸盐、二盐酸盐、二氢溴酸盐、二醋酸盐或二(对甲苯磺酸)盐时，普遍具有较好的稳定性，制备得到的脂质纳米混悬剂中分布的纳米粒呈类圆形且无粘连，制剂载药量，基本无药物泄露现象，载药量可达8.0％～20.0％。而相同情况下，其他盐形式或多或少会存在药物泄露问题，载药量很难超过8％。发明人推测这些表现差异明显的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱的不同盐形式可能在表面能、溶解性、分子量、官能团上存在较大的差异，当然也极有可能存在不同的晶型结构，这导致其在乳化剂以及稳定剂的选择上难以保持一致，表现出不可预测性。
进一步地，发明人在研究过程中还发现，即便相同的盐形式，将其制备成脂质纳米混悬剂时，仍然会有差异存在，比如7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱的二氢溴酸盐，其对制备方法表现出选择性，以相同的原料组成分别采用纳米沉淀法和高压均质法将其制备成脂质纳米混悬剂后，进行检测表现出相差显著地生物相容性和细胞毒性，比如，在测试对于A549细胞的抑制率时，采用纳米沉淀法制备得到的制剂在48h时的抑制率仅有74.2％，而采用高压均质法制备得到的制剂在48h时的抑制率可达到91.5％。发明人推测不同的制备方法可能会影响制剂内在的相互作用进而对结构或稳定性产生影响，进而影响细胞毒性的发挥。
以及，发明人还进一步还采用相同原料组成相同制备方法分别制备了7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱、7-O-(p-溴苯磺酰基)防己诺林碱和7-O-(m-溴苯磺酰基)防己诺林碱的脂质纳米混悬剂，结果证明，当以磷脂为乳化剂、泊洛沙姆为稳定剂时，7-O-(p-溴苯磺酰基)防己诺林碱和7-O-(m-溴苯磺酰基)防己诺林碱难以形成粒径较小、稳定性良好的脂质纳米混悬剂，并且难以发挥较好的细胞毒性作用。
因此，在本发明的一些实施方式中，本发明所述防己诺林碱衍生物优选为7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱或其盐酸盐或二(对甲苯磺酸)盐。以本发明的原料组成将这些药物制备成脂质纳米混悬剂时具有优异的稳定性、无药物泄露发生，且载药量在10％以上，可高达20％，尤其是既可以采用纳米沉淀法进行制备也可以采用高压均质法进行制备，制备得到的制剂均可表现出良好的细胞毒性，且重现性良好，适于工业化规模生产。
在本发明的一些实施方式中，所述磷脂为卵磷脂、脑磷脂或肌醇磷脂；更优选为肌醇磷脂；所述泊洛沙姆为泊洛沙姆F68或泊洛沙姆F124或泊洛沙姆F188，更优选为泊洛沙姆F124。
在本发明的研究过程中，发明人当使用肌醇磷脂与泊洛沙姆组合使用时，相较于卵磷脂和脑磷脂总是能够获得更好的技术效果，且技术效果随着用量变化(在本发明所述的较大用量范围内变化)的变动较小，能够保持组方的稳定性，更适于工业化应用。
在本发明的一些实施方式中，所述防己诺林碱衍生物为7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱及其药学上可接受的盐与磷脂、泊洛沙姆的质量比为1：(0.2-50)：(0.0001-1.0)，优选1：(3-15)：(0.001-0.1)，更优选1：(5-15)：(0.001-0.1)。
在本发明的实施方式中，乳化剂和稳定剂的选择是影响本发明制剂的较为关键的因素，在此基础上，事宜的用量能够更好的助益制剂的改善。在本发明的实施方式中，发明人发现，所述防己诺林碱衍生物为7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱及其药学上可接受的盐与磷脂、泊洛沙姆的质量比为1：(0.2-50)：(0.0001-1.0)时，可采用纳米沉淀法以及高压均质法制备得到脂质纳米混悬剂，但是制备得到的制剂的稳定性、包封率、载药量以及细胞毒性等性能会有差异，在此基础上，发明人进一步发现，当该用量比例为1：(3-15)：(0.001-0.1)时，尤其为1：(5-15)：(0.001-0.1)时，两种制备方法之间的差异性较小，制备得到的制剂的稳定性、包封率以及载药量、尤其是在细胞毒性上均能够实现满意的效果，且效果在较小的浮动范围下稳定，且具有良好的重现性。
在本发明的实施方式中，所述防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂中的离子的粒径为40-100nm。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂的方法，其包括：将防己诺林碱衍生物与磷脂溶于有机溶剂中作为有机相，将泊洛沙姆溶于水中作为水相，将有机相滴加至水相中，除去溶剂，压滤即得。
在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂能与水混溶，优选选自乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈和乙酸乙酯中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述防己诺林碱衍生物、磷脂、泊洛沙姆的质量比为1：(0.2-50)：(0.0001-1.0)，优选1：(3-15)：(0.001-0.1)。
在本发明的一些实施方式中，有机相的滴加速度为1-50mL/min，优选为5-20mL/min。
在本发明的实施方式中，除去有机溶剂的方法可采用旋转蒸发法或者透析法。
以及，本发明还提供了另外一种制备上述第一方面中所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂的方法，其包括：将磷脂、泊洛沙姆加至水中溶解，向其中加入防己诺林碱衍生物，超声分散后进行高速剪切乳化，经高压均质后即得。
在本发明的一些实施方式中，防己诺林碱衍生物、磷脂、泊洛沙姆的质量比为1：(0.2-50)：(0.0001-1.0)，优选1：(5-15)：(0.001-0.1)。
在本发明的一些实施方式中，高速剪切的速度为1000～4000r/min；高压均质时可设定参数为：依次在100～500bar循环3～50次、600～1500bar循环5～25次。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物制剂，其包含上述第一方面中所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂和至少一种药学上可接受的辅料。
比如，所述药物制剂为冻干制剂，其包含上述第一方面中所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂和冻干保护剂；所述冻干保护剂的加入量为0.005-0.5mg每mL防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂。
所述冻干保护剂选自DMSO、DMF、甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、菊糖、海藻糖、右旋糖酐、麦芽多糖、β-环糊精、糊精、肝素、L-丝氨酸、L-谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸、氨基酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐中的一种或多种。较为优选地冻干保护剂为DMSO、甘油、甘露醇或山梨醇。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种制备上述防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂冻干制剂的方法，其包括：在上述第一方面中所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂中加入冻干保护剂混合均匀，预冻后进行冷冻干燥，即得。
在本发明的一些较优的实施方式中，预冻的温度为-80℃预冻24h，冷冻干燥的条件为-40℃、0.5bar下48h。在本发明的实施方式中，预冻和冷冻干燥可直接在西林瓶中进行，经上述过程制备得到的冻干制剂呈白色疏松状，分散性良好。
相较于现有技术，本发明的优势在于：本发明提供了防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，其具有良好的稳定性，并能发挥出优异的细胞毒性，其针对肺癌细胞的细胞毒性显著由于其等质量的原药水溶剂以及临床上的常用药羟基喜树碱。本发明的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，以卵磷脂等为乳化剂、以泊洛沙姆为稳定剂，保证了药剂的稳定性和药物的相容性，且制剂载药量高、无药物泄露，载药量可达8.0％～20.0％，制剂外观形态呈类球形，平均粒径小且均匀，粒径在40-100nm，稳定性良好，zeta电位约为-25.0mV～-12.0mV；冻干制剂呈疏松多孔状态，再分散性良好，冻干保护剂用量少；以及，本发明制剂处方组成简洁，制备工艺简单，重现性良好，可通过滤膜过滤除菌，因此易于实现规模化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
防己诺林碱在碱性条件下与o-溴苯磺酰基溴、p-溴苯磺酰基或m-溴苯磺酰基反应制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱、7-O-(p-溴苯磺酰基)防己诺林碱和7-O-(m-溴苯磺酰基)防己诺林碱，其中制备得到的化合物再与有机酸或无机酸反应即可制得相应的盐形式。具体地，7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱、7-O-(p-溴苯磺酰基)防己诺林碱和7-O-(m-溴苯磺酰基)防己诺林碱或成盐的方法可参照中国专利CN112250690A中记载的方法进行，并且，CN112250690A中的内容以其全文以引用的方式并入本发明。
实施例1
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，卵磷脂10mg溶于5mL无水乙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.5g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌800r/min、-1～5℃条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到10mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙醇，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后3～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂的检测如下：
形态采用TEM检测，取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米粒适量，稀释50倍后滴于铜网上，滤纸吸去水分后自然晾干，置于透射电镜(Hitachi HT7700 120kV)检测形貌、粒径大小和粒径分布，选定区域中拍照，结果汇总见表1。
纳米乳粒径大小及Zeta电位的测定，采用zeta电位分析仪法，将待测7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米粒用超纯水稀释10倍，用纳米粒度及Zeta电位分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS 90)对其粒径大小和Zeta电位进行测定。记录平均粒径和Zeta电位，结果汇总见表1。
包封率与载药量采用低温高速离心的方法，将7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米粒在4℃的条件下将其离心1-2h，将上清液取出后过0.45um滤膜，然后用HPLC(岛津LC-20A)分析，色谱柱为Shim-pack ODS(250×4.6mm)，柱温25℃，流动相为甲醇+水(V:V＝10:1)，流速0.8mL/min，检测波长270nm，进样量5μL，包封率和载药量计算式如下。结果汇总见表1。
包封率＝(C总浓度—C上清液浓度)/C总浓度×100％
载药量＝W包裹在粒子中的药物/W全部的药物及辅料×100％
说明，以下的实施例中采用类似的方法检测，即TEM检测形貌、平均粒径大小，Zeta电位检测，计算包封率与载药量。
实施例2
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱富马酸盐脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱富马酸盐12mg，脑磷脂20mg溶于10mL95％乙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F124溶于水中得0.1g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1000r/min、20～30℃条件下将有机相以10mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙醇，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例3
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，脑磷脂5mg溶于3mL95％乙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F188溶于水中得0.5g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1000r/min、1～10℃条件下将有机相以10mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙醇，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例4
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，卵磷脂50mg溶于10mL丙酮中，作为有机相；将泊洛沙姆F188溶于水中得0.02g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1200r/min、-10～0℃条件下将有机相以10mL/min的速度缓慢滴加到6mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除丙酮，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例5
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱100mg，卵磷脂20mg溶于10mL异丙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F188溶于水中得0.05g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1200r/min、5～10℃条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，透析法去除异丙醇溶剂，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例6
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，卵磷脂100mg溶于20mL乙腈中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.1g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1000r/min、60～80℃条件下将有机相以20mL/min的速度滴加到50mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙腈，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例7
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，卵磷脂40mg溶于2mL无水乙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F188溶于水中得0.5g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌800r/min、-1～5℃条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到60mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙醇，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例8
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，肌醇磷脂50mg溶于2mL 95％乙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.5g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1000r/min、-1～5℃条件下将有机相以10mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙醇，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例9
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，肌醇磷脂20mg溶于20mL丙酮中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.01g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1200r/min、0～5℃条件下将有机相以10mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除丙酮，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例10
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，卵磷脂20mg溶于10mL异丙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F124溶于水中得0.02g/100mL泊洛沙姆溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1200r/min、5～10℃条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，透析法去除异丙醇，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例11
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐12mg，肌醇磷脂120mg溶于120mL丙酮中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得1.0g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌800r/min、30～40℃条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除丙酮，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例12
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐15mg，卵磷脂100mg溶于30mL异丙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.05g/100mL溶液，作为水相；在冷阱磁力搅拌1000r/min、20～30℃条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到20mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除异丙醇，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例13
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二醋酸盐脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二醋酸盐12mg，卵磷脂80mg溶于20mL乙腈中，作为有机相；将泊洛沙姆F188溶于水中得0.01g/100mL溶液，作为水相；在磁力搅拌600r/min、50～60℃条件下将有机相以20mL/min的速度滴加到40mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙腈，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二醋酸盐脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二醋酸盐脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例14
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二盐酸盐脂质纳米混悬剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二盐酸盐20mg，卵磷脂160mg溶于10mL乙酸乙酯中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.05g/100mL溶液，作为水相；在磁力搅拌800r/min、40～50℃条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到100mL水相中，滴加完毕，旋转蒸发去除乙酸乙酯，220nm水系滤膜压滤制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二盐酸盐脂质纳米混悬液，然后4～6℃低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二盐酸盐脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例15
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取肌醇磷脂100mg及泊洛沙姆F188加至50mL蒸馏水中(泊洛沙姆F188浓度为1.0g/100mL)溶解构成分散介质(溶液A)。加入20mg7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱，超声分散均匀得混悬液B。继续采用高速剪切乳化机2000r/min高速剪切3min，制得混悬液C。然后将混悬液C放入高压均质机，分别在200bar循环5次，1000bar循环20次，制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，在4～6℃下低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例16
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂
精密称取肌醇磷脂120mg及泊洛沙姆F188加至30mL蒸馏水中(泊洛沙姆F188浓度为0.05g/100mL)溶解构成分散介质(溶液A)。加入20mg7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐，超声分散均匀得混悬液B。继续采用高速剪切乳化机1000r/min高速剪切2min，制得混悬液C。然后将混悬液C放入高压均质机，分别在300bar循环6次，1200bar循环12次，制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂，在4～6℃下低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例17
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂
精密称取卵磷脂80mg及泊洛沙姆F124加至30mL蒸馏水中(泊洛沙姆F124浓度为0.5g/100mL)溶解构成分散介质(溶液A)。加入15mg7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐，超声分散均匀得混悬液B。继续采用高速剪切乳化机4000r/min高速剪切3min，制得混悬液C。然后将混悬液C放入高压均质机，分别在500bar循环3次，1500bar循环10次，制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂，在4～6℃下低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例18
制备7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂
精密称取肌醇磷脂120mg及泊洛沙姆F124加至20mL蒸馏水中(泊洛沙姆F124浓度为1.0g/100mL)溶解构成分散介质(溶液A)。加入20mg7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱，超声分散均匀得混悬液B。继续采用高速剪切乳化机3000r/min高速剪切3min，制得混悬液C。然后将混悬液C放入高压均质机，分别在400bar循环4次，1200bar循环15次，制得7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，在4～6℃下低温保存。
上述制备的7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂，检测方法类似实例1，即TEM检测形貌、平均粒径、Zeta电位检测、计算包封率、载药量，结果汇总见表1。
实施例19
制备包含7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂的冻干制剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，卵磷脂100mg溶于1mL无水乙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F124溶于水中得0.05g/100mL溶液，作为水相。于冰浴磁力搅拌条件下将有机相以4mL/min的速度缓慢滴加到10mL水相中，滴加完毕，挥干乙醇，1000bar条件下高压均质10次改善粒径，平均粒径41.2nm，载药量12.6％，电位-24.4mV。以上制备的混悬液加入0.05mg/mL甘露醇混合均匀，装入西林瓶中、置冰箱中-80℃预冻24h，转入冷冻干燥机中、在-40℃、0.5bar、48h条件下制得白色疏松状7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂冻干制剂。
该冻干制剂加入2mL蒸馏水经振摇可于1min内完全复溶。7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂加入适量PBS后再分散，粒径分布较均匀，平均粒径为103.9nm，比冻干前有所增加，载药量11.2％，zeta电位为-17.4mV。透射电镜观察其外观形态，结果显示其外观类球形，无粘连，再分散性良好。初步稳定性试验证明在4℃、-20℃条件下放置3个月，冻干制剂的外观无明显变化。
实施例20
制备包含7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂的冻干制剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱10mg，卵磷脂150mg溶于5mL无水乙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.05g/100mL溶液，作为水相。于冰浴磁力搅拌条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到10mL水相中，滴加完毕，挥干乙醇，1000bar条件下高压均质10次改善粒径，平均粒径40.2nm，载药量11.5％，电位-24.7mV。以上制备的混悬液加入0.05mg/mL甘油混合均匀，装入西林瓶中、置冰箱中-80℃预冻24h，转入冷冻干燥机中、在-40℃、0.5bar、48h条件下制得白色疏松状7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂冻干制剂。
该冻干制剂加入2mL蒸馏水经振摇可于1min内完全复溶。7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱脂质纳米混悬剂加入适量PBS后再分散，粒径分布较均匀，平均粒径为122.5nm，比冻干前有所增加，载药量10.2％，zeta电位为-15.1mV。透射电镜观察其外观形态，结果显示其外观类球形，无粘连，再分散性良好。初步稳定性试验证明在4℃、-20℃条件下放置3个月，冻干制剂的外观无明显变化。
实施例21
制备包含7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂的冻干制剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐15mg，卵磷脂100mg溶于1mL异丙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F124溶于水中得1.0g/100mL溶液，作为水相。于冰浴磁力搅拌条件下将有机相以4mL/min的速度缓慢滴加到10mL水相中，滴加完毕，挥干乙醇，1000bar条件下高压均质10次改善粒径，平均粒径41.6nm，载药量11.0％，电位-24.3mV。以上制备的混悬液加入0.05mg/mL山梨醇混合均匀，装入西林瓶中、置冰箱中-80℃预冻24h，转入冷冻干燥机中、在-40℃、0.5bar、48h条件下制得白色疏松状7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂冻干制剂。
该冻干制剂加入2mL蒸馏水经振摇可于1min内完全复溶。7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二(对甲苯磺酸)盐脂质纳米混悬剂加入适量PBS后再分散，粒径分布较均匀，平均粒径为148.4nm，比冻干前有所增加，载药量9.7％，zeta电位为-12.4mV。透射电镜观察其外观形态，结果显示其外观类球形，无粘连，再分散性良好。初步稳定性试验证明在4℃、-20℃条件下放置3个月，冻干制剂的外观无明显变化。
实施例22
制备包含7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂的冻干制剂
精密称取7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐12mg，卵磷脂120mg溶于2mL无水异丙醇中，作为有机相；将泊洛沙姆F68溶于水中得0.02g/100mL溶液，作为水相。于冰浴磁力搅拌条件下将有机相以5mL/min的速度缓慢滴加到10mL水相中，滴加完毕，挥干乙醇，1000bar条件下高压均质8次改善粒径，平均粒径41.7nm，载药量11.7％，电位-24.3mV。以上制备的混悬液加入0.05mg/mL DMSO混合均匀，装入西林瓶中、置冰箱中-80℃预冻24h，转入冷冻干燥机中、在-40℃、0.5bar、48h条件下制得白色疏松状7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂冻干制剂。
该冻干制剂加入2mL蒸馏水经振摇可于1min内完全复溶。7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱二氢溴酸盐脂质纳米混悬剂加入适量PBS后再分散，粒径分布较均匀，平均粒径为112.2nm，比冻干前有所增加，载药量9.9％，zeta电位为-16.2mV。透射电镜观察其外观形态，结果显示其外观类球形，无粘连，再分散性良好。初步稳定性试验证明在4℃、-20℃条件下放置3个月，冻干制剂的外观无明显变化。
表1制备样品的基本特性
Figure BDA0003229077030000161
Figure BDA0003229077030000171
实施例23
一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂细胞毒性试验
采用CCK-8实验，测定7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱溶液、一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂(实施例1～22)和羟基喜树碱溶液对人肺癌细胞A549的生长抑制作用。
取出待测细胞置于超净工作台内，胰酶消化，吹成单细胞悬液，用计数板计数，以每孔5000个细胞的密度接种到96孔板中，置于5％CO2，37℃培养箱中孵育24h。配置含7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱、防己诺林碱衍生物脂质纳米粒、HCPT不同浓度的培养基：所有测试化合物均称取10mg，加入一定量的DMSO将化合物溶解成1mg/mL的母液；取出一定体积的母液，用对应培养基稀释成浓度为1.0ug/mL。弃掉旧的培养基，每孔加入100μL对应浓度的含药培养基。再将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育48h，弃掉旧的培养基，每孔加入100μL含10％CCK-8测试液的培养基，每组均有6个平行孔，并重复3次，多加3个不含细胞的孔作为空白组。培养箱中孵育2h，酶标仪检测每孔在450nm波长处的OD值。
细胞生长抑制率按如下公式计算：
细胞抑制率％＝[(A对照-A样品)/(A对照-A空白)]×100％
实施例1～22的活性实验结果汇总于表2。
表2 A549细胞抑制活性实验结果(样品浓度2.5μg/mL)
Figure BDA0003229077030000181
Figure BDA0003229077030000191
结果表明，纳米混悬剂的细胞毒性明显高于溶液组，与7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱溶液组相比，7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱及其盐脂质纳米混悬剂对细胞A549细胞的抑制率明显高于原药，相同浓度下，纳米混悬剂的细胞毒性明显高于临床上常用药羟基喜树碱溶液组。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，其包含或由防己诺林碱衍生物、磷脂和泊洛沙姆组成；其中，所述防己诺林碱衍生物为7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱和/或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，其特征在于，所述药学上可接受的盐为二盐酸盐、或二(对甲苯磺酸)盐。
3.根据权利要求1或2所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，其特征在于，所述磷脂为卵磷脂、脑磷脂或肌醇磷脂。
优选地，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆F68或泊洛沙姆F124或泊洛沙姆F188。
4.根据权利要求1或2所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂，其特征在于，所述防己诺林碱衍生物为7-O-(o-溴苯磺酰基)防己诺林碱及其药学上可接受的盐与磷脂、泊洛沙姆的质量比为1：(0.2-50)：(0.0001-1.0)，优选为1：(3-15)：(0.001-0.1)；
优选地，所述防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂中的离子的粒径为40-100nm。
5.一种制备权利要求1至4中任一项所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂的方法，其包括：将防己诺林碱衍生物与磷脂溶于有机溶剂中作为有机相，将泊洛沙姆溶于水中作为水相，将有机相滴加至水相中，除去溶剂，压滤即得。
6.一种制备权利要求1至4中任一项所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂的方法，其包括：将磷脂、泊洛沙姆加至水中溶解，向其中加入防己诺林碱衍生物，超声分散后进行高速剪切乳化，经高压均质后即得。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂能与水混溶，优选选自乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈和乙酸乙酯中的一种或多种。
8.一种药物制剂，其包含权利要求1至4中任一项所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂和至少一种药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为冻干制剂，其包括权利要求1至4中任一项所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂和冻干保护剂；
优选地，所述冻干保护剂的加入量为0.005-0.5mg每mL防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂；
优选地，所述冻干保护剂选自DMSO、DMF、甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、菊糖、海藻糖、右旋糖酐、麦芽多糖、β-环糊精、糊精、肝素、L-丝氨酸、L-谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸、氨基酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐中的一种或多种；优选的冻干保护剂为DMSO、甘油、甘露醇或山梨醇。
10.一种制备权利要求9中所述的冻干制剂的方法，其包括：在权利要求1至4中任一项所述的防己诺林碱衍生物脂质纳米混悬剂中加入冻干保护剂混合均匀，预冻后进行冷冻干燥，即得。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110840837A (zh) * 2019-12-10 2020-02-28 宁夏医科大学 一种汉防己甲素纳米混悬液及其制备方法和应用
CN112250690A (zh) * 2020-09-24 2021-01-22 山东师范大学 磺酰基防己诺林碱类化合物及其制备方法和应用

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