CN113710707A

CN113710707A - 结合于psma的重链抗体

Info

Publication number: CN113710707A
Application number: CN202080030552.0A
Authority: CN
Inventors: W·范斯库滕; S·克拉克; K·党; B·比洛
Original assignee: TeneoBio Inc
Current assignee: TeneoBio Inc
Priority date: 2019-04-05
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2021-11-26
Also published as: US20230242668A1; EA202192736A1; KR20210149076A; WO2020206330A1; CL2021002586A1; AU2020252556A1; CA3133654A1; PE20220142A1; JP2022526595A; US20220195068A1; CO2021013279A2; JOP20210253A1; EP3947470A1; IL286398A; BR112021019334A2; MX2021012205A; SG11202111027WA; CR20210500A

Abstract

公开了抗PSMA重链抗体(例如UniAbs^TM)，连同制备此类抗体的方法，包含此类抗体的组合物，包括药物组合物，以及它们用于治疗以PSMA表达为特征的病症的用途。

Description

结合于PSMA的重链抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年4月5日提交的美国临时专利申请号62/830,130的申请日期的优先权权益，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文中。

发明领域

本发明涉及与PSMA结合的人重链抗体(例如UniAbs^TM)。本发明进一步涉及制备此类抗体的方法、包含此类抗体的组合物(包括药物组合物)以及其用于治疗以PSMA表达为特征的病症的用途。

发明背景

PSMA

PSMA也称为前列腺特异性膜抗原和谷氨酸羧肽酶II(UniProt Q04609)，是具有N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶、叶酸水解酶和二肽基-肽酶活性的II型跨膜蛋白。其由人类的FOLH1基因编码并且由19个氨基酸的细胞质域、24个氨基酸的跨膜部分和707个氨基酸的细胞外部分组成。所述蛋白质作为非共价同型二聚体具有酶活性。PSMA在前列腺上皮组织上表达，并在前列腺癌和实体瘤的新血管系统中上调。它也在诸如脑、肾脏和唾液腺的健康组织中低水平表达，但其在恶性前列腺组织中的过度表达使其成为前列腺癌的治疗性治疗的有吸引力的靶。鉴于其在恶性新血管系统中的高表达，它也可能与实体瘤的治疗或成像相关。针对转移性前列腺癌的治疗，已经描述了靶向PSMA的单克隆抗体、抗体-药物缀合物和嵌合抗原受体T细胞(Hernandez-Hoyos等人2016,PMID:27406985，DiPippo等人2014,PMID:25327986，Serganova等人2016,PMID:28345023)。此外，针对前列腺癌的成像和治疗，正在研究PSMA特异性放射性核素缀合物(例如Hofman等人,2018 PMID:29752180)。

重链抗体

在常规IgG抗体中，重链和轻链的缔合部分地是由于轻链恒定区与重链CH1恒定区之间的疏水性相互作用。重链框架2(FR2)和框架4(FR4)区中存在额外残基，它们也有助于重链与轻链之间的这种疏水性相互作用。

然而，已知骆驼科动物(包括骆驼、单峰骆驼和美洲驼在内的胼足亚目)的血清含有仅由成对的H-链构成的主要类型的抗体(仅重链抗体或UniAbs^TM)。骆驼科动物(单峰驼、双峰驼、大羊驼、原驼、羊驼和骆马)的UniAbs^TM具有由单一可变域(VHH)、铰链区和两个恒定域(CH2和CH3)组成的独特结构，所述恒定域与经典抗体的CH2和CH3域高度同源。这些UniAbs^TM缺乏恒定区的第一个域(CH1)，所述域存在于基因组中，但在mRNA加工过程中被剪接。CH1域的不存在解释了UniAbs^TM中轻链的不存在，因为这个域是轻链的恒定域的锚定位置。此类UniAbs^TM自然进化为由来自常规抗体或其片段的三个CDR赋予抗原结合特异性和高亲和力(Muyldermans,2001；J Biotechnol 74:277–302；Revets等人,2005；Expert OpinBiol Ther 5:111–124)。诸如鲨鱼的软骨鱼也已经进化出一种独特类型的免疫球蛋白(命名为IgNAR)，它缺乏多肽轻链并且完全由重链构成。IgNAR分子可通过分子工程改造加以操纵以产生单一重链多肽(vNAR)的可变域(Nuttall等人Eur.J.Biochem.270,3543-3554(2003)；Nuttall等人Function and Bioinformatics 55,187-197(2004)；Dooley等人,Molecular Immunology 40,25-33(2003))。

缺乏轻链的仅重链抗体结合抗原的能力是在20世纪60年代建立的(Jaton等人(1968)Biochemistry,7,4185-4195)。以物理方式与轻链分离的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留了80％的抗原结合活性。Sitia等人(1990)Cell,60,781-790证明了从重排的小鼠μ基因去除CH1域会导致在哺乳动物细胞培养物中产生缺乏轻链的仅重链抗体。所产生的抗体保留了VH结合特异性和效应子功能。

可通过免疫作用产生针对多种抗原的具有高特异性和亲和力的重链抗体(vander Linden,R.H.等人Biochim.Biophys.Acta.1431,37-46(1999))并且VHH部分可容易在酵母中克隆和表达(Frenken,L.G.J.等人J.Biotechnol.78,11-21(2000))。其表达水平、溶解性和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段的那些(Ghahroudi,M.A.等人FEBS Lett.414,521-526(1997))。

其中λ(lambda)轻(L)链基因座和/或λ和κ(kappa)L链基因座已在功能上沉默的小鼠和由此类小鼠产生的抗体描述于美国专利号7,541,513和8,367,888中。在小鼠和大鼠中重组产生仅重链抗体已经报道于例如WO2006008548；美国申请公布号20100122358；Nguyen等人,2003,Immunology；109(1),93-101；Brüggemann等人,Crit.Rev.Immunol.；2006,26(5):377-90；和Zou等人,2007,J Exp Med；204(13):3271–3283中。经由锌指核酸酶的胚胎显微注射产生基因敲除大鼠是描述于Geurts等人,2009,Science,325(5939):433中。可溶性仅重链抗体和包含产生此类抗体的异源重链基因座的转基因啮齿动物是描述于美国专利号8,883,150和9,365,655中。包含单域抗体作为结合(靶向)域的CAR-T结构是描述于例如Iri-Sofla等人,2011,Experimental Cell Research 317:2630-2641和Jamnani等人,2014,Biochim Biophys Acta,1840:378-386中。

发明内容

本发明的多个方面涉及对PSMA具有结合亲和力的重链抗体，包括但不限于UniAbs^TM。本发明的其他方面涉及制备此类抗体的方法、包含此类抗体的组合物以及其用于治疗以PSMA表达为特征的病症的用途。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含第一重链可变区，其包含：(a)在氨基酸序列SEQ ID NO:1至10中的任一者中具有两个或更少取代的CDR1；和/或(b)在氨基酸序列SEQ ID NO:11至17中的任一者中具有两个或更少取代的CDR2；和/或(c)在氨基酸序列SEQ ID NO:18至23中的任一者中具有两个或更少取代的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体还包含第二重链可变区，其包含：(a)在氨基酸序列SEQ ID NO:1至10中的任一者中具有两个或更少取代的CDR1；和/或(b)在氨基酸序列SEQ ID NO:11至17中的任一者中具有两个或更少取代的CDR2；和/或(c)在氨基酸序列SEQ ID NO:18至23中的任一者中具有两个或更少取代的CDR3。在一些实施方案中，所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。在一些实施方案中，抗体还包含不存在CH1序列的重链恒定区序列。

在一些实施方案中，所述抗体的第一重链可变区包含：(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和/或(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和/或(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。

在一些实施方案中，所述抗体还包含第二重链可变区，其包含：(a)选自由SEQ IDNO:1至10组成的组的CDR1序列；和/或(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和/或(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含：(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。在一些实施方案中，所述抗体包含第二重链可变区，其包含：(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含：(a)CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ IDNO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18；或(b)CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，所述抗体包含与序列SEQ ID NO:24至58中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变区序列。在一些实施方案中，抗体包含选自由SEQ ID NO:24至58组成的组的重链可变区序列。在一些实施方案中，所述抗体包含选自由以下组成的组的重链可变区序列：SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含第一重链可变区，其包含：(a)下式的CDR1序列：

G G S I S S X₁ X₂ Y X₃(SEQ ID NO:67)

其中X₁是S或N；X₂是S或N；并且X₃是Y或F；和(b)下式的CDR2序列：

X₄ X₅ X₆ S G X₇ T(SEQ ID NO:68)

其中X₄是I或V；X₅是D或Y；X₆是Y或D；并且X₇是Y或S；和(c)下式的CDR3序列：

A R H K A A T A D F D Y(SEQ ID NO:69)，呈单价或二价形式。

G F X₁ F X₂ X₃ Y G(SEQ ID NO:70)

其中X₁是S或I或T；X₂是S或T或R或I；并且X₃是R或S；和(b)下式的CDR2序列：

I X₄ Y D G S N X₅(SEQ ID NO:71)

其中X₄是W或S；并且X₅是R或K；和(c)下式的CDR3序列：

A R E P R X₆ G Y Y Y X₇ X₈ S G Y X₉ S L D Y(SEQ ID NO:72)

其中X₆是I或V；X₇是E或D；X₈是S或T；并且X₉是Y或D，呈单价或二价形式。

在一些实施方案中，结合PSMA的抗体包含：第一重链可变区，其包含：(a)下式的CDR1序列：

G G S I S S X₁ X₂ Y X₃(SEQ ID NO:67)

X₄ X₅ X₆ S G X₇ T(SEQ ID NO:68)

A R H K A A T A D F D Y(SEQ ID NO:69)，和第二重链可变区，其包含：(a)下式的CDR1序列：

G F X₁ F X₂ X₃ Y G(SEQ ID NO:70)

I X₄ Y D G S N X₅(SEQ ID NO:71)

其中X₄是W或S；并且X₅是R或K；和(c)下式的CDR3序列：

A R E P R X₆ G Y Y Y X₇ X₈ S G Y X₉ S L D Y(SEQ ID NO:72)

其中X₆是I或V；X₇是E或D；X₈是S或T；并且X₉是Y或D。

在一些实施方案中，所述抗体包含第一和第二重链可变区，其中所述第一重链可变区相对于所述第二重链可变区位于更靠近N末端的位置。在一些实施方案中，所述第一重链可变区相对于所述第二重链可变区位于更靠近C末端的位置。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含在选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的CDR序列中具有两个或更少取代的序列。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列是选自由SEQ ID NO:1-23组成的组。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含：重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含：重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18，呈单价或二价构型。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含：重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含：重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20，呈单价或二价构型。

在一些实施方案中，结合于PSMA的抗体包含：第一重链可变区，其包含：CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18；以及第二重链可变区，其包含：人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，所述抗体包含第一重链可变区，其相对于所述第二重链可变区位于更靠近N末端的位置。在一些实施方案中，所述第一重链可变区相对于所述第二重链可变区位于更靠近C末端的位置。

在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的。在一些实施方案中，抗体是双特异性的。在一些实施方案中，抗体对CD3蛋白和PSMA蛋白具有结合亲和力。在一些实施方案中，抗体对同一PSMA蛋白上的两个不同表位具有结合亲和力。在一些实施方案中，抗体对效应子细胞具有结合亲和力。在一些实施方案中，抗体对T细胞抗原具有结合亲和力。在一些实施方案中，抗体对CD3具有结合亲和力。在一些实施方案中，抗体是呈CAR-T形式。

本发明的多个方面包括双特异性抗体，其包含：(i)对CD3具有结合亲和力的重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:59、CDR2序列SEQ ID NO:60和CDR3序列SEQ ID NO:61；(ii)轻链可变区，其包含人VL框架中的CDR1序列SEQ ID NO:62、CDR2序列SEQ ID NO:63和CDR3序列SEQ ID NO:64；以及(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18。

本发明的多个方面包括双特异性抗体，其包含：(i)对CD3具有结合亲和力的重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:59、CDR2序列SEQ ID NO:60和CDR3序列SEQ ID NO:61；(ii)轻链可变区，其包含人VL框架中的CDR1序列SEQ ID NO:62、CDR2序列SEQ ID NO:63和CDR3序列SEQ ID NO:64；以及(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18，呈单价或二价构型。

本发明的多个方面包括双特异性抗体，其包含：(i)对CD3具有结合亲和力的重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:59、CDR2序列SEQ ID NO:60和CDR3序列SEQ ID NO:61；(ii)轻链可变区，其包含人VL框架中的CDR1序列SEQ ID NO:62、CDR2序列SEQ ID NO:63和CDR3序列SEQ ID NO:64；以及(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。

本发明的多个方面包括双特异性抗体，其包含：(i)对CD3具有结合亲和力的重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:59、CDR2序列SEQ ID NO:60和CDR3序列SEQ ID NO:61；(ii)轻链可变区，其包含人VL框架中的CDR1序列SEQ ID NO:62、CDR2序列SEQ ID NO:63和CDR3序列SEQ ID NO:64；以及(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20，呈单价或二价构型。

本发明的多个方面包括多特异性抗体，其包含：(i)对CD3具有结合亲和力的重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:59、CDR2序列SEQ ID NO:60和CDR3序列SEQ ID NO:61；(ii)轻链可变区，其包含人VL框架中的CDR1序列SEQ ID NO:62、CDR2序列SEQ ID NO:63和CDR3序列SEQ ID NO:64；以及(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域包含第一和第二抗原结合区，呈二价构型，其中：所述第一抗原结合区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18；并且所述第二抗原结合区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。在某些实施方案中，所述第一抗原结合区相对于所述第二抗原结合区位于更靠近N末端的位置。在某些其他实施方案中，所述第一抗原结合区相对于所述第二抗原结合区位于更靠近C末端的位置。

本发明的多个方面包括多特异性或双特异性抗体，其中所述抗PSMA重链抗体的抗原结合域的第一和第二抗原结合区通过多肽接头连接。在一些实施方案中，所述多肽接头是GS接头。在一些实施方案中，所述GS接头由序列SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74组成。在一些实施方案中，所述抗PSMA重链抗体的抗原结合域是单互补位的，并且如与双互补位抗原结合域相比诱导较少的细胞因子产生。在一些实施方案中，所述抗PSMA重链抗体的抗原结合域是单互补位的，并且相比于双互补位抗原结合域，在更大程度上扩增CD8+T细胞。

在一些实施方案中，抗体是双互补位的并且如与单互补位抗PSMA抗体相比对PSMA具有增加的亲和力。在一些实施方案中，抗体是双互补位的并且如与单互补位抗PSMA抗体相比具有增加的效应子功能。

本发明的多个方面涉及包含本文所述的抗体的药物组合物。

本发明的多个方面涉及用于治疗以PSMA表达为特征的病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用本文所述的抗体或药物组合物。在某些其他方面，本发明涉及本文所述的抗体在制备用于治疗以PSMA表达为特征的病症的药剂中的用途。在其他方面，本发明涉及用于治疗以PSMA表达为特征的病症的本文所述的抗体。在某些其他方面，本发明涉及治疗方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的抗体或药物组合物。关于这些方面，并且在一些实施方案中，所述病症是前列腺癌。

本发明的多个方面涉及编码本文所述的抗体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体和包含此类载体的细胞。

本发明的多个方面涉及产生本文所述的抗体的方法，所述方法包括使本文所述的细胞在允许表达所述抗体的条件下生长，和从所述细胞中分离所述抗体。

本发明的多个方面涉及制备本文所述的抗体的方法，所述方法包括用PSMA蛋白使UniRat动物免疫和鉴定PSMA结合的抗体序列。

这些和其他方面将在包括实施例的本公开的剩余部分中进一步解释。

附图说明

图1的图A-B提供一系列曲线图，其示出随稀释度而变的血清效价。

图2的图A是曲线图，其示出细胞与人PSMA的结合。

图2的图B是曲线图，其示出细胞与食蟹猴PSMA的结合。

图3是曲线图，其示出根据本发明的一个实施方案的两个抗体家族之间的结合竞争。

图4的图A是斯卡查德图，其示出对CD3和PSMA具有结合亲和力的双特异性抗体对细胞表面表达的PSMA的结合亲和力，其中根据本发明的一个实施方案，PSMA臂是单互补位和单价的。

图4的图B是斯卡查德图，其示出对CD3和PSMA具有结合亲和力的双特异性抗体对细胞表面表达的PSMA的结合亲和力，其中根据本发明的一个实施方案，PSMA臂是双互补位的。

图5的图A-C提供以下示意图：根据本发明的多个实施方案的抗CD3 x单价、单特异性抗PSMA抗体(图A)；抗CD3 x二价、单特异性抗PSMA抗体(图B)；以及抗CD3 x二价、双互补位抗PSMA抗体(图C)。

图6是曲线图，其描绘使用预活化的T细胞进行的T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解。

图7是曲线图，其描绘使用未受刺激的T细胞进行的T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解。

图8是曲线图，其描绘在预活化的T细胞存在下随多特异性抗体浓度而变的PSMA阴性DU145细胞的特异性溶解百分比。

图9是曲线图，其示出PSMA x CD3双特异性抗体与PSMA阳性和阴性细胞的结合。

图10是曲线图，其示出T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解。

图11的图A是曲线图，其描绘随抗体浓度而变的T细胞增殖。

图11的图B是曲线图，其描绘随抗体浓度而变的T细胞增殖。

图11的图C是曲线图，其描绘增殖的T细胞的CD8与CD4的比率。

图11的图D是曲线图，其描绘增殖的T细胞的CD8与CD4的比率。

图12的图A是曲线图，其描绘随抗体浓度而变的T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解。

图12的图B是曲线图，其描绘随抗体浓度而变的细胞因子(IFNγ)释放。

图12的图C是曲线图，其描绘随抗体浓度而变的细胞因子(IL-2)释放。

图13是曲线图，其描绘在肿瘤异种移植物模型中22Rv1肿瘤生长的抑制。

具体实施方式

除非另外指示，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术是在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第二版(Sambrook等人,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编,1984)；“Animal CellCulture”(R.I.Freshney编,1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编,1987，并定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等人编,1994)；“A Practical Guide toMolecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988)；“Phage Display:A LaboratoryManual”(Barbas等人,2001)；Harlow,Lane和Harlow,Using Antibodies:A LaboratoryManual:Portable Protocol No.I,Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory；(1988)。

当提供值的范围时，应理解在那个范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另外清楚地指出，否则所述中间值达到下限单位的十分之一)和在那个规定范围中的任何其他规定或中间值均涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括于较小范围中，也涵盖于本发明中，所述规定范围中的任何极限值均可特别地加以排除。当所述规定范围包括所述极限值中的一个或两个时，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括于本发明中。

除非另外指示，否则本文中的抗体残基均是根据Kabat编号系统(例如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))进行编号。

在以下描述中，提出了许多具体细节以提供对本发明的更透彻的了解。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在没有一个或多个这些具体细节的情况下实践本发明。在其他情况下，没有描述本领域技术人员众所周知的出名特征和程序以便避免混淆本发明。

本公开通篇所引用的所有参考文献(包括专利申请和公布)均以全文引用的方式并入本文中。

I.定义

“包含”意指所陈述的要素是组合物/方法/试剂盒中所需要的，但可以包括其他要素以形成在权利要求书的范围内的组合物/方法/试剂盒等。

“基本上由……组成”意指将所描述的组合物或方法的范围限制为不实质上影响本发明的基本和新颖特征的规定材料或步骤。

“由……组成”意指从所述组合物、方法或试剂盒中排除权利要求书中未规定的任何要素、步骤或成分。

本文中的抗体残基是根据Kabat编号系统和EU编号系统进行编号。当提及可变域中的残基(大约是重链的残基1-113)时，一般使用Kabat编号系统(例如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，一般使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如Kabat等人,同上中报道的EU指数)。“如Kabat中的EU指数”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文中另外规定，否则对抗体可变域中的残基编号的提及意指通过Kabat编号系统进行的残基编号。除非本文中另外规定，否则对抗体恒定域中的残基编号的提及意指通过EU编号系统进行的残基编号。

抗体也称为免疫球蛋白，惯常包含至少一条重链和一条轻链，其中所述重链和轻链的氨基末端域在序列上是可变的，因此通常被称为可变区域或可变重(VH)或可变轻(VL)域。所述两个域惯常缔合以形成特异性结合区，不过如此处将讨论，特异性结合也可用仅重链可变序列获得，并且多种非天然的抗体构型在本领域中是已知的并且加以使用。

“功能性”或“生物活性”抗体或抗原结合分子(包括仅重链抗体和多特异性(例如双特异性)三链抗体样分子(TCA，描述于本文中)是能够在结构、调节、生物化学或生物物理学事件中发挥一种或多种其天然活性的抗体或抗原结合分子。例如，功能性抗体或其他结合分子(例如TCA)可以具有特异性结合抗原的能力，并且所述结合又可以引起或改变诸如信号转导或酶活性的细胞或分子事件。功能性抗体或其他结合分子(例如TCA)也可以阻断受体的配体活化或用作激动剂或拮抗剂。抗体或其他结合分子(例如TCA)发挥一种或多种其天然活性的能力取决于若干因素，包括多肽链的正确折叠和装配。

本文中术语“抗体”以最广泛含义使用并且特定地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、仅重链抗体、三链抗体、TCA、单链Fv(scFv)、纳米抗体等，并且还包括抗体片段，只要其展现期望的生物活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠科动物、人、人源化、嵌合的，或来源于其他物种。

术语抗体可提及全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子；或这些多肽中的任一者的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合目标靶的抗原的抗原结合位点的多肽或其部分，此类靶包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子，包括具有提供降低或增强的效应子细胞活性的改变的Fc部分的工程改造的亚类。主题抗体的轻链可为κ轻链(Vκ)或λ轻链(Vλ)。所述免疫球蛋白可来源于任何物种。一方面，所述免疫球蛋白主要具有人类起源。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从大体上同质抗体的群体获得的抗体，即构成所述群体的个别抗体是同一的，除了可以微量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体具有高度特异性(针对单一抗原位点)。另外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂形成对比，每种单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。根据本发明的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，并且也可例如经由重组蛋白产生方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。

如关于抗体所用，术语“可变”是指抗体可变域的某些部分在抗体的序列中广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布于抗体的整个可变域中。在轻链和重链可变域中，其集中在三个称为高变区的区段中。可变域的更加高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，其形成连接β-折叠结构的环并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现多种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

术语"高变区"当在本文中使用时是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自重链可变域中的“高变环”残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的那些残基；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些实施方案中，“CDR”意指抗体的互补决定区，如Lefranc,MP等人,IMGT,the international ImMunoGeneTicsdatabase,Nucleic Acids Res.,27:209-212(1999)中所定义。“框架区”或“FR”残基是除了如本文所定义的高变区/CDR残基之外的那些可变域残基。

本文中示出示例性CDR名称，然而本领域技术人员将理解，通常使用多种CDR定义，包括Kabat定义(参见“Zhao等人A germline knowledge based computational approachfor determining antibody complementarity determining regions.”MolImmunol.2010；47:694–700)，所述定义是基于序列变异性并且是最常用的。Chothia定义是基于结构环区的位置(Chothia等人“Conformations of immunoglobulin hypervariableregions.”Nature.1989；342:877–883)。替代的目标CD R定义包括但不限于由以下公开的那些：Honegger,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variabledomains:an automaticmodeling and analysis tool.”J Mol Biol.2001；309:657–670；Ofran等人“Automated identification of complementarity determining regions(CDRs)reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cell epitopes.”JImmunol.2008；181:6230–6235；Almagro“Identification of differences in thespecificity-determining residues of antibodies that recognize antigens ofdifferent size:implications for the rational design of antibody repertoires.”J Mol Recognit.2004；17:132–143；以及Padlan等人“Identification of specificity-determining residues in antibodies.”Faseb J.1995；9:133–139.，其中每一者均以引用的方式特定地并入本文中。

术语“仅重链抗体”和“重链抗体”在本文中可互换使用并且在最广泛含义上是指缺乏常规抗体的轻链的抗体，或抗体的多个或多个部分，例如抗体的一个或多个臂。所述术语特定地包括但不限于包含VH抗原结合域以及CH2和CH3恒定域但不存在CH1域的同型二聚抗体；此类抗体的功能性(抗原结合)变体、可溶性VH变体、包含一个可变域(V-NAR)和五个C样恒定域(C-NAR)的同型二聚体的Ig-NAR和其功能片段；以及可溶性单域抗体(sUniDabs^TM)。在一个实施方案中，仅重链抗体由可变区抗原结合域构成，所述域由框架1、CDR1、框架2、CDR2、框架3、CDR3以及框架4构成。在另一实施方案中，仅重链抗体由抗原结合域、铰链区的至少一部分以及CH2和CH3域构成。在另一实施方案中，仅重链抗体由抗原结合域、铰链区的至少一部分以及CH2域构成。在另一实施方案中，仅重链抗体由抗原结合域、铰链区的至少一部分以及CH3域构成。其中CH2和/或CH3域被截短的仅重链抗体也包括于本文中。在另一实施方案中，重链由抗原结合域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)域构成，但不含铰链区。仅重链抗体可呈二聚体形式，其中两条重链以二硫键连接，或以其他方式彼此共价或非共价附接。仅重链抗体可属于IgG亚类，但属于诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类的其他亚类的抗体也包括于本文中。在一个特定实施方案中，重链抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型。在一个实施方案中，本文中的仅重链抗体用作嵌合抗原受体(CAR)的结合(靶向)域。所述定义特定地包括由人免疫球蛋白转基因大鼠(UniRat^TM)产生的人仅重链抗体，称作UniAbs^TM。UniAbs^TM的可变区(VH)被称为UniDabs^TM，并且是可连接至Fc区或血清白蛋白的通用结构单元以开发具有多特异性、增加的效力和延长的半衰期的新颖治疗剂。由于同型二聚UniAbs^TM缺乏轻链并且因此缺乏VL域，所述抗原由一个单域，即重链抗体的重链的可变域(VH或VHH)识别。

如本文所用，“完整抗体链”是包含全长可变区和全长恒定区(Fc)的链。针对分泌型IgG，完整“常规”抗体包含完整轻链和完整重链，以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、铰链、CH2和CH3。其他同种型(诸如IgM或IgA)可以具有不同的CH域。所述恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；和细胞表面受体的下调。恒定区变体包括改变效应子谱、与Fc受体的结合等的那些变体。

视其重链的Fc(恒定域)的氨基酸序列而定，可提供呈不同类别的抗体和多种抗原结合蛋白。有五种主要类别的重链Fc区：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类别的Fc恒定域可分别提及为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US 2004/0229310)。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链均可基于其恒定域的氨基酸序列而被指定为称为κ(kappa)和λ(lambda)的两种类型之一。根据本发明的实施方案的抗体可包含κ轻链序列或λ轻链序列。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。效应子功能的非限制性实例包括C1q结合；CDC；Fc-受体结合；ADCC；ADCP；细胞表面受体(例如B细胞受体)等的下调。此类效应子功能一般需要Fc区与受体，例如FcγRI；FcγRIIA；FcγRIIB1；FcγRIIB2；FcγRIIIA；FcγRIIIB受体和低亲和力FcRn受体相互作用；并且可使用本领域中已知的多种分析进行评估。“死”或“沉默”Fc是已经突变以保留关于例如延长血清半衰期的活性，但不活化高亲和力Fc受体，或对Fc受体具有降低的亲和力的Fc。

“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括例如天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。

“变体Fc区”包含由于至少一种氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而区别于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，所述变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中存在约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且最优选与其具有至少约90％同源性，更优选与其具有至少约95％同源性。

变体Fc序列可以在CH2区中包括三个氨基酸取代以降低在EU指数位置234、235和237处的FcγRI结合(参见Duncan等人,(1988)Nature 332:563)。在EU指数位置330和331处的补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代降低补体固定(参见Tao等人,J.Exp.Med.178:661(1993)以及Canfield和Morrison,J.Exp.Med.173:1483(1991))。在位置233-236处的人IgG1或IgG2残基以及在位置327、330和331处的IgG4残基中的取代极大地降低了ADCC和CDC(参见例如Armour KL.等人,1999Eur J Immunol.29(8):2613-24；和Shields RL.等人,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604)。人IgG4 Fc氨基酸序列(UniProtKB编号P01861)在本文中呈SEQ ID NO:76提供。沉默IgG1描述于例如Boesch,A.W.等人,“Highly parallelcharacterization of IgG Fc binding interactions.”MAbs,2014.6(4):第915-27页中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

其他Fc变体也是可能的，包括但不限于其中缺失能够形成二硫键的区，或其中在天然Fc的N末端消除某些氨基酸残基，或向其中添加甲硫氨酸残基的变体。因此，在一些实施方案中，抗体的一个或多个Fc部分可在铰链区中包含一个或多个突变以消除二硫键。在又一个实施方案中，可完全去除Fc的铰链区。在又一个实施方案中，抗体可包含Fc变体。

此外，可通过取代(突变)、缺失或添加氨基酸残基以实现补体结合或Fc受体结合来构建Fc变体以去除或大体上降低效应子功能。例如但不限于，缺失可发生于补体结合位点，诸如C1q结合位点中。用于制备免疫球蛋白Fc片段的此类序列衍生物的技术公开于国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478中。此外，Fc域可以通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰化、酰胺化等进行修饰。

在一些实施方案中，抗体包含包括T366W突变的变体人IgG4 CH3域序列，其在本文中可任选地称为IgG4 CH3杵序列。在一些实施方案中，抗体包含包括T366S突变、L368A突变和Y407V突变的变体人IgG4 CH3域序列，其在本文中可任选地称为IgG4 CH3臼序列。可以任何合适的方式使用本文所述的IgG4 CH3突变以便在抗体二聚体中的第一单体的第一重链恒定区上放置“杵”，并在抗体二聚体中的第二单体的第二重链恒定区上放置“臼”，由此促进所述抗体中期望的重链多肽亚基对的适当配对(异二聚化)。

在一些实施方案中，抗体包含重链多肽亚基，所述亚基包含包括S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(杵)的变体人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，并且抗体包含重链多肽亚基，所述亚基包含包括S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(臼)的变体人IgG4 Fc区。

术语“含Fc区抗体”是指包含Fc区的抗体。可以例如在抗体的纯化期间或通过重组工程改造编码所述抗体的核酸来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，根据本发明的具有Fc区的抗体可包括具有或不具有K447的抗体。

本发明的多个方面包括包含呈单价或二价构型的仅重链可变区的抗体。如本文所用，如关于仅重链可变区域所使用的术语“单价构型”意指仅存在一个仅重链可变区域，具有单个结合位点(参见图5的图A，抗体的右臂)。相比之下，如关于仅重链可变区域所使用的术语“二价构型”意指存在两个仅重链可变区域(各自具有单个结合位点)，并且通过接头序列连接(参见图5的图B和图C，抗体的右臂)。接头序列的非限制性实例在本文中进一步讨论，并且包括但不限于各种长度的GS接头序列。当仅重链可变区是呈二价构型时，所述两个仅重链可变区域中的每一个可对同一抗原或对不同抗原(例如，对同一蛋白质上的不同表位；对两种不同的蛋白质等)具有结合亲和力。然而，除非另有特别说明，否则表示为呈“二价构型”的仅重链可变区应理解为含有通过接头序列连接的两个同一的仅重链可变区域，其中所述两个同一的仅重链可变区域中的每一个对同一靶抗原具有结合亲和力。

本发明的多个方面包括具有多特异性构型的抗体，其包括但不限于双特异性、三特异性等。多种方法和蛋白质构型是已知的并且用于双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。

已经通过重组融合两种或更多种抗体的可变域开发了用于制造多价人工抗体的多种方法。在一些实施方案中，多肽上的第一和第二抗原结合域通过多肽接头连接。此类多肽接头的一个非限制性实例是GS接头，其具有四个甘氨酸残基、随后一个丝氨酸残基的氨基酸序列，并且其中所述序列重复n次，其中n是介于1至约10范围内的整数，诸如2、3、4、5、6、7、8或9。此类接头的非限制性实例包括GGGGS(SEQ ID NO:73)(n＝1)和GGGGSGGGGS(SEQID NO:74(n＝2)。也可使用其他合适的接头，并且所述接头描述于例如Chen等人,Adv DrugDeliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357-69中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

术语“三链抗体样分子”或“TCA”在本文中用于指抗体样分子，其包含三个多肽亚基，基本上由三个多肽亚基组成，或由三个多肽亚基组成，所述三个多肽亚基中的两个包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链，或此类抗体链的功能性抗原结合片段(包含抗原结合区和至少一个CH域)，基本上由单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的功能性抗原结合片段组成，或由单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的功能性抗原结合片段组成。这个重链/轻链对对于第一抗原具有结合特异性。第三个多肽亚基包含含有Fc部分的仅重链抗体，基本上由含有Fc部分的仅重链抗体组成，或由含有Fc部分的仅重链抗体组成，所述Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4域，但不含CH1域，以及结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位的一个或多个抗原结合域(例如两个抗原结合域)，其中此类结合域来源于抗体重链或轻链的可变区或与抗体重链或轻链的可变区具有序列同一性。此类可变区的部分可以由V_H和/或V_L基因区段、D和J_H基因区段或J_L基因区段编码。所述可变区可以由重排的V_HDJ_H、V_LDJ_H、V_HJ_L或V_LJ_L基因区段编码。

TCA结合化合物使用“仅重链抗体”或“重链抗体”或“重链多肽”，如本文所用，其意指包含重链恒定区CH2和/或CH3和/或CH4但不包含CH1域的单链抗体。在一个实施方案中，所述重链抗体由抗原结合域、铰链区的至少一部分以及CH2和CH3域构成。在另一实施方案中，所述重链抗体由抗原结合域、铰链区的至少一部分以及CH2域构成。在另一实施方案中，所述重链抗体由抗原结合域、铰链区的至少一部分以及CH3域构成。其中CH2和/或CH3域被截短的重链抗体也包括于本文中。在另一实施方案中，重链由抗原结合域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)域构成，但不含铰链区。所述仅重链抗体可呈二聚体形式，其中两条重链以二硫键连接，其他以其他方式彼此共价或非共价附接，并且可任选地在一个或多个CH域之间包括不对称界面以促进多肽链之间的适当配对。所述重链抗体可属于IgG亚类，但属于诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类的其他亚类的抗体也包括于本文中。在一个特定实施方案中，所述重链抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型或IgG4亚型。TCA结合化合物的非限制性实例描述于例如WO2017/223111和WO2018/052503中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

重链抗体构成由骆驼科动物(例如骆驼和美洲驼)产生的IgG抗体的约四分之一(Hamers-Casterman C.等人Nature.363,446-448(1993))。这些抗体由两条重链形成，但不含轻链。因此，可变抗原结合部分被称为VHH域并且其代表最小的天然存在的完整抗原结合位点，仅为约120个氨基酸长(Desmyter,A.等人J.Biol.Chem.276,26285-26290(2001))。可通过免疫作用产生针对多种抗原的具有高特异性和亲和力的重链抗体(van der Linden,R.H.等人Biochim.Biophys.Acta.1431,37-46(1999))并且VHH部分可容易在酵母中克隆和表达(Frenken,L.G.J.等人J.Biotechnol.78,11-21(2000))。其表达水平、溶解性和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段的那些(Ghahroudi,M.A.等人FEBS Lett.414,521-526(1997))。鲨鱼也已经显示在其抗体(称为VNAR)中具有单一VH样域。(Nuttall等人Eur.J.Biochem.270,3543-3554(2003)；Nuttall等人Function and Bioinformatics 55,187-197(2004)；Dooley等人,Molecular Immunology 40,25-33(2003))。

如本文所用，术语“PSMA”是指具有N-乙酰化-α-连接的酸性去肽酶、叶酸水解酶和二肽基-肽酶活性的II型跨膜蛋白。术语“PSMA”包括任何人和非人动物物种的PSMA蛋白，并且特定地包括人PSMA以及非人哺乳动物的PSMA。

如本文所用，术语“人PSMA”包括人PSMA(UniProt Q04609)的任何变体、同种型和物种同系物，无论其来源或制备方式如何。因此，“人PSMA”包括由细胞天然表达的人PSMA以及在用人PSMA基因转染的细胞上表达的PSMA。

术语“抗PSMA仅重链抗体”、“PSMA仅重链抗体”、“抗PSMA重链抗体”和“PSMA重链抗体”在本文中可互换使用以指免疫特异性结合于PSMA(包括如上文所定义的人PSMA)的如上文所定义的仅重链抗体。所述定义包括但不限于由表达人免疫球蛋白的转基因动物(诸如转基因大鼠或转基因小鼠)产生的人重链抗体，包括如上文所定义的UniRats^TM，其产生人抗PSMA UniAb^TM抗体。

关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”是定义为在比对序列并在必要时引入间隙以实现最大百分比的序列同一性之后，并在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与所述参考多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分率。为了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以在本领域的技术范围内的多种方式实现，例如使用公开可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文中的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生％氨基酸序列同一性值。

“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定并且分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是将干扰所述抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，所述抗体将被纯化(1)至超过95重量％的抗体，如通过Lowry方法所测定，并且最优选地超过99重量％，(2)至足以通过使用转杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染色通过SDS-PAGE发现均质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为所述抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

本发明的抗体包括多特异性抗体。多特异性抗体具有超过一种结合特异性。术语“多特异性”特定地包括“双特异性”和“三特异性”，以及更高阶的独立特异性结合亲和力，诸如更高阶的多表位特异性，以及四价抗体和抗体片段。术语“多特异性抗体”、“多特异性仅重链抗体”、“多特异性重链抗体”和“多特异性UniAb^TM”在本文中以最广泛含义使用并且涵盖具有超过一种结合特异性的所有抗体。本发明的多特异性重链抗PSMA抗体特定地包括免疫特异性结合于PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的两个或更多个非重叠表位的抗体(即，二价和双互补位)。本发明的多特异性重链抗PSMA抗体还特定地包括免疫特异性结合于PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的表位和不同蛋白质(诸如CD3蛋白，诸如人CD3)上的表位的抗体(即，二价和双互补位)。本发明的多特异性重链抗PSMA抗体还特定地包括免疫特异性结合于PSMA蛋白(诸如人PSMA蛋白)上的两个或更多个非重叠或部分重叠表位和不同蛋白质(诸如CD3蛋白，诸如人CD3蛋白)上的表位的抗体(即，三价和双互补位)。

本发明抗体包括具有一种结合特异性的单特异性抗体。单特异性抗体特定地包括包含单一结合特异性的抗体，以及包含超过一个具有相同结合特异性的结合单元的抗体。术语“单特异性抗体”、“单特异性仅重链抗体”、“单特异性重链抗体”和“单特异性UniAb^TM”在本文中以最广泛含义使用并且涵盖具有一种结合特异性的所有抗体。本发明的单特异性重链抗PSMA抗体特定地包括免疫特异性结合于PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的一个表位的抗体(单价和单特异性)。本发明的单特异性重链抗PSMA抗体还特定地包括具有超过一个免疫特异性结合于PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的表位的结合单元的抗体(例如多价抗体)。例如，根据本发明的实施方案的单特异性抗体可包括包含两个抗原结合域的重链可变区，其中每个抗原结合域结合于PSMA蛋白上的同一表位(即，二价和单特异性)。

“表位”是抗原分子的表面上结合单个抗体分子的位点。一般说来，抗原具有数个或多个不同的表位并与多种不同的抗体反应。所述术语特定地包括线性表位和构象表位。

“表位定位”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中的连续氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但在蛋白质折叠成其三维结构时集合在一起。

“多表位特异性”是指特异性结合于相同或不同靶上的两个或更多个不同表位的能力。如上所述，本发明特定地包括具有多表位特异性的抗PSMA重链抗体，即结合于PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的一个或多个非重叠表位的抗PSMA重链抗体；和结合于PSMA蛋白上的一个或多个表位和不同蛋白(诸如CD3蛋白)上的表位的抗PSMA重链抗体。术语抗原的“非重叠表位”或“非竞争性表位”在本文中是定义为意指由一对抗原特异性抗体的一个成员而非另一成员识别的表位。识别非重叠表位的抗体对或多特异性抗体上靶向同一抗原的抗原结合区不会竞争结合于那个抗原，并且能够同时结合那个抗原。

当两种抗体识别同一或空间重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否结合于同一或空间重叠的表位的最广泛使用并且快速的方法是竞争分析，其可经构型为多种不同的形式，使用标记抗原或标记抗体。通常，将抗原固定于96孔板上，并且使用放射性或酶标记来测量未标记抗体阻断标记抗体的结合的能力。

如本文所用，术语“价”是指抗体分子中规定数目的结合位点。

“单价”抗体具有一个结合位点。因此，单价抗体也是单特异性的。

“多价”抗体具有两个或更多个结合位点。因此，术语“二价”、“三价”和“四价”分别是指存在两个结合位点、三个结合位点和四个结合位点。因此，根据本发明的双特异性抗体至少是二价的并且可以是三价、四价或在其他情况下多价的。根据本发明的实施方案的二价抗体可以具有针对同一表位(即，二价、单互补位)或针对两个不同表位(即，二价、双互补位)的两个结合位点。

多种方法和蛋白质构型是已知的并且用于制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。

术语“三链抗体样分子”或“TCA”在本文中用于指抗体样分子，其包含三个多肽亚基，基本上由三个多肽亚基组成，或由三个多肽亚基组成，所述三个多肽亚基中的两个包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链，或此类抗体链的功能性抗原结合片段(包含抗原结合区和至少一个CH域)，基本上由单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的功能性抗原结合片段组成，或由单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的功能性抗原结合片段组成。这个重链/轻链对对于第一抗原具有结合特异性。第三个多肽亚基包含含有Fc部分的仅重链抗体，基本上由含有Fc部分的仅重链抗体组成，或由含有Fc部分的仅重链抗体组成，所述Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4域，但不含CH1域，以及结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位的抗原结合域，其中此类结合域来源于抗体重链或轻链的可变区或与抗体重链或轻链的可变区具有序列同一性。此类可变区的部分可以由V_H和/或V_L基因区段、D和J_H基因区段或J_L基因区段编码。所述可变区可以由重排的V_HDJ_H、V_LDJ_H、V_HJ_L或V_LJ_L基因区段编码。TCA蛋白使用如上文所定义的仅重链抗体。

术语“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中以最广泛含义使用，是指工程改造的受体，其将期望的结合特异性(例如，单克隆抗体或其他配体的抗原结合区)移植至跨膜和细胞内信号传导域。典型地，使用所述受体将单克隆抗体的特异性移植至T细胞上以创建嵌合抗原受体(CAR)。(J Natl Cancer Inst,2015；108(7):dvj439；和Jackson等人,Nature ReviewsClinical Oncology,2016；13:370–383)。CAR-T细胞是已经过基因工程改造以产生用于免疫疗法的人工T细胞受体的T细胞。在一个实施方案中，“CAR-T细胞”意指表达转基因的治疗性T细胞，所述转基因编码一种或多种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体最少包含细胞外域、跨膜域和至少一个细胞质域。

术语“人抗体”在本文中用于包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文中的人抗体可以包括未由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变。术语“人抗体”特定地包括由转基因动物(诸如转基因大鼠或小鼠)产生的具有人重链可变区序列的仅重链抗体，特别是如上文所定义的由UniRats^TM产生的UniAbs^TM。

“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指包含来自至少两个不同的Ig基因座的氨基酸序列的免疫球蛋白分子，例如包含由人Ig基因座编码的一部分和由大鼠Ig基因座编码的一部分的转基因抗体。嵌合抗体包括具有非人Fc-区或人工Fc-区和人独特型的转基因抗体。此类免疫球蛋白可从本发明的动物中分离，所述动物已经过工程改造以产生此类嵌合抗体。

如本文所用，术语“效应子细胞”是指参与免疫反应的效应子阶段的免疫细胞，如与免疫反应的认知和活化阶段相对。一些效应子细胞表达特异性Fc受体并执行特定免疫功能。在一些实施方案中，效应子细胞(诸如天然杀手细胞)能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀死并将抗原呈递至免疫系统的其他组分，或结合于呈递抗原的细胞。在一些实施方案中，效应子细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。

“人效应子细胞”是表达受体(诸如T细胞受体或FcR)并执行效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括天然杀手(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中NK细胞是优选的。效应子细胞可以从其天然来源，例如血液或如本文所述的PBMC分离。

术语“免疫细胞”在本文中以最广泛含义使用，包括但不限于骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(诸如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀手细胞、天然杀手(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，诸如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。

抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后导致靶细胞的溶解。用于介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评估目标分子的ADCC活性，可以执行体外ADCC分析，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的分析。可用于此类分析的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀手(NK)细胞。或者或另外，可以在体内，例如在动物模型(诸如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的模型)中评估目标分子的ADCC活性。

“补体依赖性细胞毒性”或"CDC"是指在补体存在下分子溶解靶的能力。补体活化途径由补体系统的第一组分(C1q)与同源抗原所复合的分子(例如抗体)的结合启动。为了评估补体活化，可以执行CDC分析，例如描述于Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中。

“结合亲和力”是指在分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的全部非共价相互作用的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常见方法测量。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且倾向于快速解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并且倾向于保持结合。

如本文所用，“Kd”或“Kd值”是指在动力学模式下使用Octet QK384仪器(FortebioInc.,Menlo Park,CA)通过生物层干涉术测定的解离常数。例如，用小鼠-Fc融合抗原装载抗小鼠Fc传感器并且接着浸渍于含抗体的孔中以测量浓度依赖性缔合速率(k缔合)。在最后步骤中测量抗体解离速率(k解离)，其中将所述传感器浸渍于仅含有缓冲液的孔中。Kd是k解离/k缔合的比率。(有关更多细节，参见Conce pcion,J等人,Comb Chem HighThroughput Screen,12(8),791-800,2009)。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文中一般用于意指获得期望的药理和/或生理效应。在完全地或部分地预防疾病或其症状方面，所述效应可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不良效应方面，所述效应可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防所述疾病出现于可易患所述疾病但尚未诊断出患有所述疾病的受试者中；(b)抑制所述疾病，即阻止其发展；或(c)减轻所述疾病，即引起所述疾病的消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。其中治疗使患者的不合需要的临床症状稳定或减少的对正在进行的疾病的治疗尤其受到关注。希望在受影响组织的功能完全丧失之前执行此类治疗。本发明疗法可以在所述疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在所述疾病的症状阶段之后施用。

“治疗有效量”意指向受试者赋予治疗益处所必需的活性剂的量。例如，“治疗有效量”是诱导、改善或以其他方式引起病理性症状、疾病进展或与疾病相关的生理状况的改进或改进对病症的抵抗力的量。

如本文所用，术语“前列腺癌”是指前列腺中的腺体来源的恶性肿瘤。

术语“以PSMA表达为特征”泛指任何疾病或病症，其中PSMA表达是与所述疾病或病症所特有的一个或多个病理过程相关或涉及所述一个或多个病理过程。此类病症包括但不限于前列腺癌。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指正在针对治疗进行评估和/或正在经受治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人类。术语“受试者”、“个体”和“患者”涵盖但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫疾病的个体、患有病原体感染等。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。

术语“药物制剂”是指呈允许活性成分的生物活性有效的形式的制剂，并且其不含对将施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒剂、添加剂)是可合理地施用于受试哺乳动物以提供所用活性成分的有效剂量的那些。

“无菌”制剂是无菌的或不含或基本上不含所有活的微生物和其孢子。“冷冻”制剂是在低于0℃的温度下的制剂。

“稳定”制剂是其中蛋白质在存储时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。优选地，所述制剂在存储时基本上保持其物理和化学稳定性，以及其生物活性。存储期一般是基于所述制剂的预期保质期来选择。用于测量蛋白质稳定性的多种分析技术在本领域中可获得并且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301.Vincent Lee编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones.A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90)(1993)中。可在所选择的温度下测量稳定性持续所选择的时间段。可以多种不同方式定性和/或定量评估稳定性，包括评估聚集体形成(例如使用尺寸排阻色谱、通过测量浊度和/或通过目视检查)；通过使用阳离子交换色谱、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原抗体和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物活性或抗原结合功能；等。不稳定性可能涉及以下任一者或多者：聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪取/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、未配对半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。

II.详述

抗PSMA抗体

本发明提供结合于人PSMA的密切相关抗体的家族。这个家族的抗体包含如本文所定义和表1中所示的CDR序列的集合，并由表2中陈述的所提供重链可变区(VH)序列SEQ IDNO:24至54示例。所述抗体家族提供了许多促进用作临床治疗剂的益处。所述抗体包括具有一系列结合亲和力的成员，从而允许选择具有期望的结合亲和力的特定序列。

表1:抗PSMA重链抗体的独特CDR氨基酸序列。

表2.抗PSMA重链抗体可变域氨基酸序列。

合适的抗体可以选自本文所提供的那些，用于开发和治疗或其他用途，包括但不限于作为双特异性抗体(例如，如图5的图A-C所示)或三特异性抗体或CAR-T结构的一部分的用途。图5的图A-C提供抗CD3 x抗PSMA多特异性抗体的图解，其中抗PSMA域是单价和单特异性的、二价和单特异性的或二价和双特异性(双互补位)的。抗CD3域含有CH1域并与轻链配对，而抗PSMA域来源于仅重链抗体并且不含CH1域或与轻链相互作用。在一些实施方案中，使用例如杵臼技术剪掉两条重链。转向图5中描绘的抗体，图A描绘了抗CD3x抗PSMA双特异性抗体，其中抗PSMA结合臂是单价和单特异性的，并且抗PSMA臂的抗原结合域是呈单价构型，意味着仅存在一个抗原结合域。图B描绘了抗CD3 x抗PSMA双特异性抗体，其中抗PSMA结合臂是二价和单特异性的，并且抗PSMA臂的抗原结合域是呈二价构型，意味着存在串联放置的两个同一抗原结合域。图C描绘了抗CD3 x抗PSMA双特异性抗体，其中抗PSMA结合臂是二价和双互补位的，并且抗PSMA臂的抗原结合域是呈二价构型。

可使用本领域中已知的方法(诸如Biacore测量)来执行对候选蛋白质的亲和力的测定。所述抗体家族的成员可以对PSMA具有亲和力，其Kd为约10^-6至大约10^-11，包括但不限于：约10^-6至大约10^-10；约10^-6至大约10^-9；约10^-6至大约10^-8；约10^-8至大约10^-11；约10^-8至大约10^-10；约10^-8至大约10^-9；约10^-9至大约10^-11；约10^-9至大约10^-10；或这些范围内的任何值。可以通过用于调节(例如阻断)PSMA生物活性的生物学评估，包括体外分析、临床前模型和临床试验，以及潜在毒性的评估来确认亲和力选择。

本文中的抗体家族的成员不可与食蟹猴的PSMA蛋白交叉反应，但必要时可经过工程改造以提供与食蟹猴的PSMA蛋白或与任何其他动物物种的PSMA的交叉反应性。

本文中的PSMA特异性抗体的家族包含VH域，其包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列。例如，分别针对CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR序列可以位于以SEQ ID NO:24至58陈述的所提供示例性可变区序列的氨基酸残基26-33；51-58；和97-116附近的区中。本领域普通技术人员将理解，如果选择不同的框架序列，那么所述CDR序列可能位于不同的位置中，不过一般说来，所述序列的顺序将保持相同。

本发明的抗PSMA抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列可以由以下结构式涵盖，其中X指示可变氨基酸，其可以是如下文所指示的特定氨基酸。

CDR1

G G S I S S X₁ X₂ Y X₃(SEQ ID NO:67)

其中 X₁是S或N；

X₂是S或N；并且

X₃是Y或F；和

CDR2

X₄ X₅ X₆ S G X₇ T(SEQ ID NO:68)

其中 X₄是I或V；

X₅是D或Y；

X₆是Y或D；并且

X₇是Y或S；和

CDR3

A R H K A A T A D F D Y(SEQ ID NO:69)

CDR1

G F X₁ F X₂ X₃ Y G(SEQ ID NO:70)

其中 X₁是S或I或T；

X₂是S或T或R或I；并且

X₃是R或S；和

CDR2

I X₄ Y D G S N X₅(SEQ ID NO:71)

其中 X₄是W或S；并且

X₅是R或K；和

CDR3

A R E P R X₆ G Y Y Y X₇ X₈ S G Y X₉ S L D Y(SEQ ID NO:72)

其中 X₆是I或V

X₇是E或D；

X₈是S或T；并且

X₈是Y或D。

代表性CDR1、CDR2和CDR3序列在表1和3中示出。

表3：抗PSMA重链抗体CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PSMA抗体包含CDR1序列SEQ ID NO:1-10中的任一者。在一个特定实施方案中，所述CDR1序列是SEQ ID NO:2或7。

在一些实施方案中，抗PSMA抗体包含CDR2序列SEQ ID NO:11-17中的任一者。在一个特定实施方案中，所述CDR2序列是SEQ ID NO:11或15。

在一些实施方案中，抗PSMA抗体包含CDR3序列SEQ ID NO:18-23中的任一者。在一个特定实施方案中，所述CDR3序列是SEQ ID NO:18或20。

在另一实施方案中，抗PSMA仅重链抗体包含CDR1序列SEQ ID NO:2；CDR2序列SEQID NO:11；和CDR3序列SEQ ID NO:18。

在另一实施方案中，抗PSMA抗体包含CDR1序列SEQ ID NO:7；CDR2序列SEQ ID NO:15；和CDR3序列SEQ ID NO:20。

在另一实施方案中，抗PSMA抗体包含重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:24至58中的任一者(表2)。

在又一实施方案中，抗PSMA抗体包含重链可变区序列SEQ ID NO:25。

在又一实施方案中，抗PSMA抗体包含重链可变区序列SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，相对于以SEQ ID NO:1至23(表1)中的任一者表示的CDR1、CDR2和/或CDR3序列或CDR1、CDR2和CDR3序列的集合，本发明的抗PSMA抗体中的CDR序列包含一个或两个氨基酸取代。

在一些实施方案中，抗PSMA抗体优选地包含重链可变域(VH)，其中CDR3序列在氨基酸层面上与具有表1中提供的CDR3序列的任一抗体的CDR3序列具有大于或等于80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性，并且结合于PSMA。

在一些实施方案中，抗PSMA抗体优选地包含重链可变域(VH)，其中CDR 1、2和3(组合)的完整集合在氨基酸层面上与具有表1中提供的CDR序列的抗体的CDR 1、2和3(组合)具有大于或等于八十五百分比(85％)的序列同一性，并且结合于PSMA。

在一些实施方案中，抗PSMA抗体优选地包含重链可变域(VH)，其中CDR 1、2和3(组合)的完整集合在氨基酸层面上与具有表3中提供的CDR序列的抗体的CDR 1、2和3(组合)具有大于或等于八十五百分比(85％)的序列同一性，并且结合于PSMA。

在一些实施方案中，抗PSMA抗体包含与重链可变区序列SEQ ID NO:24至58(在表2中示出)中的任一者具有至少约80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的重链可变区序列，并且结合于PSMA。

在一些实施方案中，提供双特异性或多特异性抗体，其可以具有本文所讨论的任何构型，包括但不限于双特异性三链抗体样分子(TCA)。在一些实施方案中，多特异性抗体可包含至少一个对PSMA具有结合特异性的重链可变区和至少一个对除PSMA以外的蛋白质具有结合特异性的重链可变区。在一些实施方案中，多特异性抗体可包含包括至少两个抗原结合域的重链可变区，其中所述抗原结合域中的每一者均对PSMA具有结合特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体可包含对第一抗原(例如CD3)具有结合特异性的重链/轻链对，和来自仅重链抗体的重链。在某些实施方案中，所述来自仅重链抗体的重链包含Fc部分，所述Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4域，但不含CH1域。在一个特定实施方案中，双特异性抗体包含对效应子细胞上的抗原(例如T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性的重链/轻链对，和来自仅重链抗体的重链，所述重链包含对PSMA具有结合特异性的抗原结合域。

在一些实施方案中，多特异性抗体包含与轻链可变域配对的CD3结合VH域。在某些实施方案中，轻链是固定的轻链。在一些实施方案中，所述CD3结合VH域包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:59、CDR2序列SEQ ID NO:60和CDR3序列SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，所述固定的轻链包含人VL框架中的CDR1序列SEQ ID NO:62、CDR2序列SEQ ID NO:63和CDR3序列SEQ ID NO:64。合起来，所述CD3结合VH域和所述轻链可变域对CD3具有结合亲和力。在一些实施方案中，CD3结合VH域包含重链可变区序列SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，CD3结合VH域包含与重链可变区序列SEQ ID NO:65具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％百分比同一性的序列。在一些实施方案中，固定的轻链包含轻链可变区序列SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，固定的轻链包含与重链可变区序列SEQ ID NO:66具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％百分比同一性的序列。

包含上述CD3结合VH域和轻链可变域的多特异性抗体具有有利的特性，例如，如公布的PCT申请公布号WO2018/052503所述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。任何本文所述的多特异性抗体和抗原结合域均对PSMA具有结合亲和力，可与本文所述的CD3结合域和固定的轻链域(参见例如表4和表5)，以及另外的序列(诸如表6和表7中所提供的那些)组合，以产生对一个或多个PSMA表位以及CD3具有结合亲和力的多特异性抗体。

表4.抗CD3重链和轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列。

表5.抗CD3重链和轻链可变区氨基酸序列。

表6:人IgG1和IgG4 Fc区序列。

表7:另外的序列。

在一些实施方案中，提供双特异性或多特异性抗体，其可以具有本文所讨论的任何构型，包括但不限于双特异性三链抗体样分子(TCA)。在一些实施方案中，双特异性抗体可包含至少一个对PSMA具有结合特异性的重链可变区和至少一个对除PSMA以外的蛋白质具有结合特异性的重链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体可包含对第一抗原具有结合特异性的重链/轻链对，和来自仅重链抗体的重链，所述重链包含Fc部分，所述Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4域，但不含CH1域，以及结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位的抗原结合域。在一个特定实施方案中，双特异性抗体包含对效应子细胞上的抗原(例如T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性的重链/轻链对，和来自仅重链抗体的重链，所述重链包含对PSMA具有结合特异性的抗原结合域。

在一些实施方案中，当本发明抗体是双特异性抗体时，所述抗体的一个臂(一个结合部分或一个结合单元)对人PSMA具有特异性，而另一个臂可以对靶细胞、肿瘤相关细胞抗原、靶向抗原(例如整合素等)、病原体抗原、检查点蛋白等具有特异性。靶细胞特定地包括癌细胞，包括但不限于来自如下文所讨论的实体瘤(例如前列腺肿瘤)的细胞。在一些实施方案中，所述抗体的一个臂(一个结合部分或一个结合单元)对人PSMA具有特异性，而另一个臂对CD3具有特异性。

在一些实施方案中，抗体包含包括与序列SEQ ID NO:79连接的序列SEQ ID NO:66的抗CD3轻链多肽、包括序列SEQ ID NO:80、81、82、83、84或85中的任一者的抗CD3重链多肽以及包括与序列SEQ ID NO:75、76、77、78、84或85中的任一者连接的序列SEQ ID NO:24-58中的任一者的抗PSMA重链多肽，呈单价或二价构型。这些序列可以多种方式组合以产生期望的IgG亚类的双特异性抗体，例如IgG1、IgG4、沉默的IgG1、沉默的IgG4。在一个优选实施方案中，抗体是TCA，其包含包括SEQ ID NO:86的第一多肽、包括SEQ ID NO:87的第二多肽以及包括SEQ ID NO:88、89、90、91、92或93的第三多肽。在一个优选实施方案中，抗体是TCA，其由由SEQ ID NO:86组成的第一多肽、由SEQ ID NO:87组成的第二多肽以及由SEQ IDNO:88、89、90、91、92或93组成的第三多肽组成。

多种形式的多特异性抗体在本发明的范围内，包括但不限于单链多肽、两链多肽、三链多肽、四链多肽以及其多倍物。本文中的多特异性抗体特定地包括结合于PSMA和CD3的T细胞多特异性(例如，双特异性)抗体(抗PSMA x抗CD3抗体)。此类抗体诱导有效的T细胞介导的表达PSMA的细胞的杀死。

抗PSMA抗体的制备

本发明抗体可通过本领域中已知的方法制备。在一个优选实施方案中，本文中的抗体由转基因动物产生，包括转基因小鼠和大鼠，优选大鼠，其中内源性免疫球蛋白基因被敲除或失能。在一个优选实施方案中，在UniRat^TM中产生本文中的重链抗体。UniRat^TM具有沉默的内源性免疫球蛋白基因并使用人免疫球蛋白重链易位点来表达多样化、自然优化的全人类HCAb谱。虽然可使用多种技术来敲除大鼠中的内源性免疫球蛋白基因座或使其沉默，但在UniRat^TM中，使用锌指(内切)核酸酶(ZNF)技术来灭活内源性大鼠重链J-基因座、轻链Cκ基因座和轻链Cλ基因座。用于显微注射至卵母细胞中的ZNF构建体可产生IgH和IgL敲除(KO)线。有关细节，参见例如Geurts等人,2009,Science 325:433。Ig重链敲除大鼠的表征已经由Menoret等人,2010,Eur.J.Immunol.40:2932-2941报道。ZNF技术的优点在于，非同源末端接合以经由多达数个kb的缺失使基因或基因座沉默也可为同源整合提供靶位点(Cui等人,2011,Nat Biotechnol 29:64-67)。UniRat^TM中产生的人重链抗体被称为UniAbs^TM并且可结合常规抗体无法攻击的表位。其高特异性、亲和力和小尺寸使其成为单特异性和多特异性应用的理想选择。

除了UniAbs^TM以外，本文中还特定地包括缺乏骆驼科动物VHH框架和突变的仅重链抗体，以及其功能性VH区。此类仅重链抗体可例如在转基因大鼠或小鼠中产生，所述转基因大鼠或小鼠包含如例如WO2006/008548中所述的全人类仅重链基因座，但也可使用其他转基因哺乳动物，诸如兔、豚鼠、大鼠，优选大鼠和小鼠。也可通过重组DNA技术，通过在合适的真核或原核宿主(包括例如哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、大肠杆菌或酵母)中表达编码核酸来产生仅重链抗体，包括其VHH或VH功能片段。

仅重链抗体的域结合了抗体和小分子药物的优点：可以是单价或多价；具有低毒性；并且制造成本低。由于其小尺寸，这些域容易施用，包括口服或表面施用，其特征是高稳定性，包括胃肠稳定性；并且其半衰期可针对期望的用途或适应症加以调适。另外，可以成本效益的方式制造HCAb的VH和VHH域。

在一个特定实施方案中，本发明的重链抗体(包括UniAbs^TM)在FR4区的第一个位置(根据Kabat编号系统的氨基酸位置101)处的天然氨基酸残基由另一氨基酸残基取代，所述另一氨基酸残基能够破坏包含那个位置处的天然氨基酸残基或与所述天然氨基酸残基相关的表面暴露的疏水性补丁。此类疏水性补丁通常包埋于与抗体轻链恒定区的界面中，但在HCAb中变得表面暴露并且至少部分地用于HCAb的不合需要的聚集和轻链缔合。所述取代的氨基酸残基优选地带电，并且更优选地带正电，诸如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)，优选精氨酸(R)。在一个优选实施方案中，来源于转基因动物的仅重链抗体在位置101处含有Trp至Arg的突变。所得HCAb优选在生理条件下具有高抗原结合亲和力和溶解度，而无聚集。

作为本发明的一部分，在ELISA蛋白和细胞结合分析中鉴定具有来自UniRat^TM动物的独特序列的人IgG抗PSMA重链抗体(UniAb^TM)与人PSMA的结合。所鉴定的重链可变区(VH)序列对人PSMA蛋白结合和/或与PSMA+细胞的结合呈阳性，并且对与不表达PSMA的细胞的结合均呈阴性。参见例如表8。

可通过竞争结合分析，诸如酶联免疫分析(ELISA分析)或流式细胞术竞争结合分析来鉴定结合于PSMA蛋白上的非重叠表位的重链抗体(例如UniAbs^TM)。例如，可使用结合于靶抗原的已知抗体与目标抗体之间的竞争。通过使用这种方法，可将抗体的集合分成与参考抗体竞争的那些和不与参考抗体竞争的那些。非竞争性抗体被鉴定为结合于不同的表位，所述表位不与参考抗体结合的表位重叠。通常，一种抗体被固定，抗原发生结合，并且在ELISA分析中测试第二种标记的(例如生物素化)抗体结合所捕获的抗原的能力。这也可通过使用表面等离子体共振(SPR)平台，包括ProteOn XPR36(BioRad,Inc)、Biacore 2000和Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences)和MX96 SPR成像仪(Ibis technologiesB.V.)，以及生物层干涉术平台诸如Octet Red384和Octet HTX(ForteBio,Pall Inc)来执行。有关其他细节，参见本文中的实施例。

典型地，如果竞争导致参考抗体与靶抗原的结合降低约15-100％，如通过标准技术，诸如通过上述竞争结合分析所测定，那么抗体与参考抗体“竞争”。在多个实施方案中，相对抑制是至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高。

药物组合物、用途和治疗方法

本发明的另一方面提供药物组合物，其包含本发明的一种或多种抗体与合适的药学上可接受的载体的混合物。如本文所用的药学上可接受的载体是例如但不限于佐剂、固体载体、水、缓冲液或本领域中用于支撑治疗组分的其他载体或其组合。

在一个实施方案中，药物组合物包含结合于PSMA的重链抗体(例如UniAb^TM)。在另一实施方案中，药物组合物包含对PSMA蛋白上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性的多特异性(包括双特异性)重链抗体(例如UniAb^TM)。在一个优选实施方案中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性和TCA)重链抗体(例如UniAb^TM)，其对PSMA具有结合特异性并且对效应子细胞上的结合靶(例如T细胞上的结合靶，诸如T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性。

通过使具有期望程度的纯度的蛋白质与视情况选用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合来制备根据本发明使用的抗体的药物组合物以供存储，诸如呈冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌的和大体上等渗的，并且在优良制造规范(GMP)条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即，用于单次施用的剂量)提供。所述制剂取决于所选择的施用途径。本文中的抗体可通过静脉内注射或输注或皮下施用。对于注射施用，本文中的抗体可在水溶液中，优选在生理学上可相容的缓冲液中配制以降低注射位点处的不适。所述溶液可含有如上文所讨论的载体、赋形剂或稳定剂。或者，抗体可呈冻干形式以在使用之前用适合媒剂(例如，无菌无热原质水)构成。

抗体制剂公开于例如美国专利号9,034,324中。类似的制剂可用于本发明的重链抗体，包括UniAbs^TM。皮下抗体制剂描述于例如US20160355591和US20160166689中。

使用方法

本文所述的抗PSMA抗体和药物组合物可用于治疗以PSMA表达为特征的疾病和疾患，包括但不限于本文进一步描述的疾患和疾病。

PSMA是一种II型跨膜蛋白，其在前列腺上皮组织上表达，并在前列腺癌和实体瘤的新血管系统中上调。它也在诸如脑、肾脏和唾液腺的健康组织中低水平表达，但其在恶性前列腺组织中的过度表达使其成为前列腺癌的治疗性治疗的有吸引力的靶。鉴于其在恶性新血管系统中的高表达，它也可能与实体瘤的治疗或成像相关。针对转移性前列腺癌的治疗，已经描述了靶向PSMA的单克隆抗体、抗体药物缀合物和嵌合抗原受体T细胞(Hernandez-Hoyos等人,2016,PMID:27406985，DiPippo等人,2014,PMID:25327986，Serganova等人,2016,PMID:28345023)。此外，针对前列腺癌的成像和治疗，正在研究PSMA特异性放射性核素缀合物(例如Hofman等人,2018 PMI D:29752180)。

一方面，本文中的抗PSMA抗体(例如UniAbs^TM)和药物组合物可用于治疗以PSMA表达为特征的病症，包括但不限于前列腺癌和实体瘤。

用于治疗疾病的本发明组合物的有效剂量视多种不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人或动物、施用的其他药物以及是否治疗是预防性的或治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物(诸如狗、猫、马等)、实验室哺乳动物(诸如兔、小鼠、大鼠等)等。可用滴定法测量治疗剂量以优化安全性和功效。

剂量水平可由普通熟练临床医生容易地确定，并且可根据需要，例如根据修改受试者对疗法的反应的需要进行修改。可与载体物质组合产生单一剂型的活性成分的量视所治疗的宿主和特定施用模式而变化。剂量单位形式一般含有约1mg至约500mg之间的活性成分。

在一些实施方案中，所述剂的治疗剂量可以介于约0.0001至100mg/kg并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。本发明的治疗实体通常在多种情况下施用。单个剂量之间的时间间隔可以是每周、每月或每年。时间间隔也可以是无规律的，如通过测量治疗实体在患者中的血液水平所指示。或者，本发明的治疗实体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率视所述多肽在患者中的半衰期而变化。

典型地，制备呈可注射剂(液体溶液或悬浮液)形式的组合物；也可制备可用于在注射之前溶解或悬浮于液体媒剂中的固体形式。本文中的药物组合物可直接地或在固体(例如冻干)组合物的重构之后用于静脉内或皮下施用。也可将所述制剂乳化或封装于脂质体或微粒(诸如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物)中以增强佐剂效果，如上文所讨论。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的剂可以储库注射剂或植入制剂的形式施用，其可以此类方式配制以便允许活性成分的持续或脉冲式释放。所述药物组合物一般是配制成无菌、大体上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有优良制造规范(GMP)法规。

可通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来测定本文所述的抗体和抗体结构的毒性。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数。可使用从这些细胞培养分析和动物研究获得的数据来配制用于人类的无毒剂量范围。本文所述的抗体的剂量优选在循环浓度范围内，所述范围包括毒性很小或没有毒性的有效剂量。所述剂量可视所用剂型和所用施用途径而在这一范围内变化。确切的制剂、施用途径和剂量可由个别医生根据患者的疾患来选择。

用于施用的组合物通常将包含溶解于药学上可接受的载体、优选水性载体中的抗体或其他烧蚀剂。可使用多种水性载体，例如缓冲生理盐水等。这些溶液是无菌的并且一般不含不合需要的物质。可以通过常规、众所周知的灭菌技术对这些组合物进行灭菌。所述组合物可以含有如模拟生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可广泛地变化，并且将根据所选择的特定施用模式和患者的需求(例如Remington'sPharmaceutical Science(第15版,1980)以及Goodman和Gillman,The PharmacologicalBasis of Therapeutics(Hardman等人编辑,1996))，主要基于流体体积、粘度、体重等进行选择。

包含本发明的活性剂和其制剂以及使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。所述试剂盒还可含有至少一种附加试剂，例如化学治疗药物等。试剂盒典型地包括指示试剂盒的内容物的预期用途的标签。如本文所用，术语“标签”包括在试剂盒上或随试剂盒供应或以其他方式伴随试剂盒的任何书面或记录材料。

现已充分描述了本发明，本领域技术人员应显而易知，可在不脱离本发明的精神或范围的情况下作出各种变化和修改。

实施例

材料和方法

实施例1:用重组人PSMA使UniRat^TM免疫

用融合至his标签的重组人PSMA蛋白(R&D Systems目录号：4234-ZN)使十二只UniRat^TM动物免疫。每周两次使所述动物免疫，持续八周。在35天免疫时程之后，从大鼠中收集血清以测定血清效价。

血清效价结果

血清效价概述信息在图1的图A-B中示出。在图1的图A-B中描绘的曲线图中，每条线代表个别动物。所述曲线图的图例示出每只个别动物的ID号。通过ELISA针对huPSMA+His标签蛋白和His标签脱靶蛋白测试血清的12点稀释系列的结合活性。在这组动物中，观察到一系列针对人PSMA蛋白的血清反应性水平。未观察到对His标签脱靶蛋白的血清反应。

实施例2:流式细胞术分析抗PSMA UniAbs^TM与与PSMA阳性和阴性细胞的结合

使用LNCaP细胞系(ATCC：CRL-1740)、22Rv1细胞系(ATCC CRL-2505)、经过稳定转染以表达人PSMA的PC3细胞系(ATCC CRL-1435)或DU-145细胞系(ATCC HTB-81)通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT,EMD Millipore)来评估与PSMA阳性细胞的结合。简单说来，在4℃下用纯化的UniAbs^TM的稀释系列对50,000个靶细胞进行染色持续30分钟。在孵育之后，用流式细胞术缓冲液(1X PBS、1％BSA、0.1％NaN₃)洗涤细胞两次并用缀合至R-藻红蛋白(PE)的山羊F(ab’)₂抗人IgG(Southern Biotech,目录#2042-09)染色以检测细胞结合的抗体。在4℃下孵育20分钟之后，用流式细胞术缓冲液洗涤细胞两次并通过流式细胞术测量平均荧光强度(MFI)。使用单独用二次抗体染色的细胞的MFI来确定背景信号并将每种抗体的结合转化为背景倍数。使用具有以下修改的相同方案来确定与食蟹猴PSMA阳性细胞的结合：靶细胞是来自经过瞬时转染以表达食蟹猴PSMA的细胞外域的Freestyle 293-F细胞(ThermoFisher R79007)。在一些实验中，使用GraphPad Prism 7来计算EC50值。

表8概述了数种本文所述的抗PSMA重链抗体(HCAb)的靶结合活性。第1列指示HCAb的克隆ID。第2列指示与LNCaP细胞的结合，测量为背景MFI信号的倍数。

表8:与表达PSMA的细胞系的结合

如图2的图A和图B所示，与食蟹猴PSMA的结合的差异支持由HCAb 346181和345497识别的人PSMA表位的差异。

实施例3:通过生物层干涉术(BLI)进行重组蛋白结合

使用生物层干涉术，评估含有克隆ID 345497和克隆ID 346181作为成员的两个抗体家族之间的结合竞争。在Octet QK-384(ForteBio)上执行抗原-抗体表位分箱分析。简单说来，使用抗Penta HIS Capture(HIS1K)传感器来固定抗原-重组人PSMA(R&D Systems目录号：4234-ZN)持续120秒。在基线读数之后，将传感器浸渍于含有抗体1(325867)的溶液中持续300秒并且设置另一基线持续60秒。接着将传感器浸渍于含有作为用于阻断的阳性对照的抗体1或抗体2(325920)的孔中。分别测量缔合和解离速率持续300和600秒。用OctetData Analysis HT v11.0(ForteBio)执行数据分析。如图3所示，325920结合与325867抗体预先结合的PSMA蛋白，表明这两种抗体识别PSMA上的非重叠表位。以纳米为单位报告结合信号的移位。

实施例4:双互补位和二价抗PSMA抗体的组合物

如表9所示，克隆ID 350123由连接至克隆ID 345497序列的克隆ID 346181序列和桥接序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:74)构成。克隆ID 350122由克隆ID 346181的两个重复序列构成，所述重复序列由同一接头序列接合。克隆ID 350123是双互补位的，因为它由识别PSMA上的不同表位的两个抗PSMA域构成。克隆ID 350122是二价但非双互补位的，因为它由串联的相同抗PSMA域构成。多种抗PSMA x抗CD3抗体的示意图描绘于图5的图A-C中。

表9:双互补位和二价抗PSMA抗体的氨基酸序列的描述

实施例5:测定对细胞表面表达的人PSMA的亲和力

使用人前列腺癌细胞系22Rv1通过Scatchard分析来测定PSMA细胞表面亲和力。首先，使用Alexa Fluor 488 5-SDP酯试剂盒(ThermoFisher A30052)用Alexa Fluor 488标记PSMAxCD3多特异性抗体。接着通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT,EMD Millipore)评估与22Rv1s的结合。简单说来，在4℃下用Alexa Fluor 488标记的多特异性抗体的稀释系列对100,000个靶细胞染色持续1小时。在孵育之后，用流式细胞术缓冲液洗涤细胞两次并且通过流式细胞术测量平均荧光强度。

为了建立用于计算可溶性荧光团当量分子(MESF)的标准曲线，将Bangs LabQuantum Alex Fluor 488 MESF珠群体1至4组合至单一管中并在Guava easyCyte 8HT上运行。在单独的管中分析空白珠。针对FITC-通道测量每个珠群体的MFI。使用GraphPad Prism7来绘制Log10(MFI)针对Log10(MESF)的线性回归。

将每个实验样品的MFI插入至校准曲线上并测定每个样品的MESF。随后，通过将平均MESF除以抗体的标记程度(DOL)来计算每个细胞结合的抗体(ABC)的平均数目。使ABC的数目乘以细胞浓度以测定结合抗体的总浓度。通过从染色浓度(开始剂量)中减去结合抗体浓度来计算游离抗体浓度。在GraphPad Prism 7中针对结合抗体浓度对游离抗体浓度绘图。将所得的图拟合至非线性回归、单位点特异性结合函数以测定亲和力，如图4的图A和图B所示。

实施例6:多特异性抗体通过T细胞重定向介导的PSMA阳性前列腺肿瘤细胞的杀死

使用静息T细胞的分析

以每孔15,000个细胞将靶细胞接种于96孔板中并在37℃下生长过夜。在孵育之后，以10:1效应子:靶细胞比率添加日益增加的量的多特异性抗体连同静息人T细胞并在37℃下再孵育48或72小时(对于使用LNCaP、MDA-PCa-2b和PC3-PSMA细胞的分析是48小时并且对于使用22Rv1细胞的分析是72小时)。使用细胞增殖试剂WST-1(Sigma目录号：11644807001)或流式细胞术来测量细胞死亡。在一些实验中，在孵育之后但在分析靶细胞活力之前收集每个上清液的小样品并保存以用于细胞因子产生的分析。当用WST-1试剂分析细胞活力时，以1:10稀释度将试剂储备液添加至各孔中并且在37℃下孵育持续90分钟。接着在450nm(参考690nm)处测量吸光度，并计算特异性溶解百分比。

如果通过流式细胞术分析靶细胞活力，那么在启动所述分析之前用膜染料DiR(ThermoFisher D12731)标记靶细胞。在与T细胞和抗体一起孵育之后，保存上清液以用于细胞因子分析，或处理掉上清液。接着将孔洗涤一次以收集死亡的肿瘤细胞和T细胞，将所述细胞转移至流式细胞仪板上。使剩余的附着肿瘤细胞胰蛋白酶化并且接着添加至流式细胞仪板中的相应孔中。使用膜联蛋白-V试剂对死细胞染色并进行流式细胞术(BDFACSCelesta)以定量每个样品中死亡的肿瘤细胞的百分比，通过DiR染色进行门控。使用含有未处理的靶细胞的孔来归一化自发性细胞死亡。在一些实验中，使用阴性对照抗体，所述抗体由与PSMAxCD3多特异性分子中相同的CD3靶向臂组成，但用对HIV蛋白gp120具有特异性的VH置换肿瘤靶向臂。

图7示出使用未受刺激的T细胞进行的T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解。使未受刺激的人T细胞与表达PSMA的细胞(LNCaP)和不同浓度的多特异性抗体一起孵育。双互补位抗PSMAxCD3抗体(350123xCD3)优于单互补位PSMAxCD3抗体(346181xCD3)。

使用预活化的T细胞的分析

用板结合的OKT3和IL-2预活化人全T细胞持续三天，随后在新鲜IL-2中再孵育一天。使靶细胞胰蛋白酶化，装载Calcein-AM(ThermoFisher C3100MP)，与活化的T细胞混合至20:1的E:T比率，并且添加至96孔板的孔中。添加不同的多特异性抗体的稀释系列，随后在37℃下孵育4小时。接着将上清液转移至黑色96孔板中并在480nm/520nm ex/em下测量吸光度以定量钙黄绿素的释放。使用未与T细胞一起孵育的靶细胞来归一化完整肿瘤细胞的自发性钙黄绿素释放。将2％Triton-X添加至含有靶细胞的对照孔中允许计算对应于最大细胞溶解的钙黄绿素信号。使用这个值，将每个实验孔报告为最大细胞溶解的百分比。使用GraphPad prism 7进行数据分析。

图6示出使用预活化的T细胞进行的T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解。使预活化的人T细胞与表达PSMA的人细胞(LNCaP)和不同浓度的多特异性抗体一起孵育。通过钙黄绿素释放来测量肿瘤细胞死亡并且针对不存在T细胞的情况下肿瘤细胞的自发释放归一化。双互补位抗PSMAxCD3抗体(350123xCD3)优于两种单互补位PSMAxCD3抗体。

图8示出多特异性抗体不溶解PSMA阴性细胞。使预活化的人T细胞与PSMA阴性前列腺癌细胞(DU145)和不同浓度的多特异性抗体一起孵育。任何所测试的抗体均未发生这些细胞的溶解。

图9示出PSMAxCD3多特异性抗体与PSMA阳性和阴性细胞的结合。多特异性抗PSMAx抗CD3抗体显示结合于PSMA阳性前列腺肿瘤细胞(22Rv1)，但未结合于PSMA阴性前列腺肿瘤细胞(DU145)。双互补位分子(350123)显示最强的中靶细胞结合。

图10描绘T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解。图10中的数据证明如与二价但单特异性形式的抗体相比，经由两个不同表位结合于PSMA会导致增加的细胞杀死。

实施例7:与双互补位PSMAxCD3多特异性抗体相比，单互补位PSMAxCD3双特异性抗体诱导更少的细胞因子产生

在肿瘤细胞毒性分析中用静息T细胞分析细胞因子产生。这些分析的设计在别处详述。在所述分析完成后(针对使用22Rv1细胞的分析在孵育72小时之后，针对所有其他细胞系在孵育48小时之后)收集上清液。根据制造商的方案，使用ELISA试剂盒来检测IL-2(Biolegend 431804)和IFNγ(Biolegend 430104)。在ELISA中的分析之前稀释实验上清液，使得细胞因子的水平将属于用每个试剂盒供应的标准曲线的线性部分内。在一些情况下，在实验孔中可能无法检测到细胞因子，并且报告的值小于或等于所述分析的定量下限。

图12的图A-C示出T细胞介导的PSMA阳性细胞的溶解以及用细胞因子产生进行的比较。多特异性PSMAxCD3抗体诱导T细胞介导的PSMA阳性前列腺癌细胞系LNCaP的溶解。如与单互补位分子(346181)相比，双互补位分子(350123)刺激更有效的肿瘤细胞杀死，但也导致产生更高水平的细胞因子干扰素γ(IFNγ)和白细胞介素2(IL-2)，如图12的图B和图C示例。

表10示出针对四种PSMA阳性前列腺肿瘤细胞系的T细胞介导的溶解和细胞因子产生。在体外肿瘤细胞细胞毒性分析中，使用未受刺激的T细胞和针对一组四种PSMA阳性肿瘤细胞系的抗体的剂量系列来测试PSMAxCD3多特异性抗体。在72小时(22Rv1)或48小时(MDA-PCa-2b、LNCAP、PC3-PSMA)之后，通过EC50计算和报告肿瘤细胞死亡的百分比以及所实现的最高杀死百分比。收集来自这些实验孔的上清液并通过ELISA分析细胞因子干扰素-γ(IFNγ)或白细胞介素-2(IL-2)。如与双互补位分子相比，单互补位分子(3461881)针对所测试的所有四种细胞系诱导大致相等水平的肿瘤细胞毒性，但针对细胞因子产生具有较高的EC50并且在大多数情况下刺激较低水平的最大细胞因子产生。

表10:针对四种PSMA阳性前列腺肿瘤细胞系的T细胞介导的溶解和细胞因子产生。

实施例8:PSMAxCD3多特异性抗体诱导T细胞增殖

以每孔25,000个细胞将PSMA阳性肿瘤细胞接种于96孔板中并在37℃下生长过夜。根据制造商的说明书(ThermoFisher C34554)，用谱系示踪染料CFSE标记从静息PBMC(Miltenyi 130-096-535)中分离的人全T细胞。接着将100,000个标记的全T细胞添加至含有肿瘤细胞的孔中，随后添加抗体的稀释系列，并在37℃、8％CO₂下孵育。在孵育5天之后，轻轻混合细胞并转移至流式细胞仪板中。使细胞集结成粒，并去除上清液，随后在冰上用缀合至APC的抗CD8(Biolegend 301049)和缀合至PE的抗CD4(Biolegend 317410)染色持续20分钟。接着洗涤细胞并且再悬浮于流式细胞术缓冲液中以供分析(BD FACSCelesta)。根据前向和侧向散射以及CD4或CD8表达对细胞进行门控。针对整个T细胞群体以及CD4和CD8子集，计算已经增殖的T细胞的百分比，如CD4或CD8阳性染色和低或阴性CFSE信号所指示。使用FlowJo来分析流式细胞术数据并且在GraphPad Prism 7中作图。

图11的图A-D示出PSMAxCD3多特异性抗体在PSMA阳性肿瘤细胞存在下刺激T细胞增殖，并且单互补位PSMA双特异性抗体优先活化CD3 T细胞。使多特异性抗体与表达PSMA的肿瘤细胞和用谱系示踪染料CFSE标记的T细胞一起孵育。在孵育5天之后，通过流式细胞术来分析T细胞增殖和增殖的T细胞的组成(CD8+对CD4+)。图A和图B示出总的T细胞增殖，而图C和图D指示在增殖的孔中的CD8+:CD4+ T细胞的比率。虚水平线指示未受刺激的T细胞的CD8:CD4比率并且大致是1:2(实际值＝0.64)。单互补位PSMAxCD3双特异性抗体(346181)优先活化CD8 T细胞(在扩增之后大致2:1的CD8:CD4比率)，而双互补位PSMAxCD3多特异性抗体(350123)不太优先活化CD8+ T细胞(约1:1的CD8:CD4比率)。

实施例9:多特异性抗体在异种移植物模型中引起对前列腺肿瘤生长的抑制

将10百万个22Rv1细胞皮下植入至5-6周龄雄性免疫缺陷CIEA-NOG小鼠(Taconic)的右下侧中，随后在肿瘤植入之后一天经由尾静脉注射添加10百万个人PBMC。在第1、5、9和13天肿瘤植入之后一天开始，动物通过尾静脉注射接受使用100μg多特异性抗体或媒剂的治疗。使用卡尺定量肿瘤体积并加以记录持续25天。

图13示出22Rv1肿瘤异种移植物模型的结果。双互补位PSMAxCD3分子(350123)在肿瘤异种移植物模型中显示对22Rv1肿瘤生长的抑制。针对每个治疗组测试三只小鼠，并且以立方毫米为单位对每只动物的肿瘤体积的变化作图。动物在肿瘤植入后第1天接受PBMC并在第1、5、9和13天用抗体治疗。用多特异性抗体治疗的三只动物中有两只显示肿瘤进展的延迟。

虽然本发明的优选实施方案已在本文中示出和描述，但本领域技术人员将显而易知，此类实施方案仅以举例的方式提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现将进行多种变型、变化和取代。应理解，本文所述的发明的实施方案的多种替代方案可以用于实施本发明。这意味着以下权利要求书限定本发明的范围并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构因此被涵盖。这意味着以下权利要求书限定本发明的范围并且由此涵盖在这些权利要求和其相等物的范围内的方法和结构。

Claims

1.一种结合于PSMA的抗体，其包含第一重链可变区，所述重链可变区包含：

(a)在氨基酸序列SEQ ID NO:1至10中的任一者中具有两个或更少取代的CDR1；和/或

(b)在氨基酸序列SEQ ID NO:11至17中的任一者中具有两个或更少取代的CDR2；和/或

(c)在氨基酸序列SEQ ID NO:18至23中的任一者中具有两个或更少取代的CDR3。

2.如权利要求1所述的抗体，其还包含第二重链可变区，所述第二重链可变区包含：

3.如权利要求1或2中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其还包含不存在CH1序列的重链恒定区序列。

5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述第一重链可变区包含：

(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和/或

(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和/或

(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。

6.如权利要求2至5中任一项所述的抗体，其中所述第二重链可变区包含：

(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和/或

(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和/或

(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。

7.如权利要求5至6中任一项所述的抗体，其包含：

(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和

(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和

(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。

8.如权利要求5至7中任一项所述的抗体，其中所述第二重链可变区包含：

(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和

(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和

(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。

9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体，其包含：

(a)CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18；或

(b)CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。

10.如权利要求1至9中任一项所述的抗体，其包含与序列SEQ ID NO:24至58中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变区序列。

11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体，其包含选自由SEQ ID NO:24至58组成的组的重链可变区序列。

12.如权利要求11所述的抗体，其中所述重链可变区序列是选自由以下组成的组：SEQID NO:25和SEQ ID NO:38。

13.一种结合于PSMA的抗体，其包含第一重链可变区，所述重链可变区包含：

(a)下式的CDR1序列：

G G S I S S X₁ X₂ Y X₃(SEQ ID NO:67)

其中X1是S或N；

X2是S或N；并且

X3是Y或F；和

(b)下式的CDR2序列：

X₄ X₅ X₆ S G X₇ T(SEQ ID NO:68)

其中X4是I或V；

X5是D或Y；

X6是Y或D；并且

X7是Y或S；和

(c)下式的CDR3序列：

A R H K A A T AD F D Y(SEQ ID NO:69)，

呈单价或二价形式。

14.一种结合于PSMA的抗体，其包含第一重链可变区，所述重链可变区包含：

(a)下式的CDR1序列：

G F X₁ F X₂ X₃ Y G(SEQ ID NO:70)

其中X1是S或I或T；

X2是S或T或R或I；并且

X3是R或S；和

(b)下式的CDR2序列：

I X₄ Y D G S N X₅(SEQ ID NO:71)

其中X4是W或S；并且

X5是R或K；和

(c)下式的CDR3序列：

A R E P R X₆ G Y Y Y X₇ X₈ S G Y X₉ S L D Y(SEQ ID NO:72)

其中X6是I或V；

X7是E或D；

X8是S或T；并且

X9是Y或D，

呈单价或二价形式。

15.一种结合于PSMA的抗体，其包含：

第一重链可变区，所述第一重链可变区包含：

(a)下式的CDR1序列：

G G S I S S X₁ X₂ Y X₃(SEQ ID NO:67)

其中X1是S或N；

X2是S或N；并且

X3是Y或F；和

(b)下式的CDR2序列：

X₄ X₅ X₆ S G X₇ T(SEQ ID NO:68)

其中X4是I或V；

X5是D或Y；

X6是Y或D；并且

X7是Y或S；和

(c)下式的CDR3序列：

A R H K A A T A D F D Y(SEQ ID NO:69)，和

第二重链可变区，所述第二重链可变区包含：

(a)下式的CDR1序列：

G F X₁ F X₂ X₃ Y G(SEQ ID NO:70)

其中X1是S或I或T；

X2是S或T或R或I；并且

X3是R或S；和

(b)下式的CDR2序列：

I X₄ Y D G S N X₅(SEQ ID NO:71)

其中X4是W或S；并且

X5是R或K；和

(c)下式的CDR3序列：

A R E P R X₆ G Y Y Y X₇ X₈ S G Y X₉ S L D Y(SEQ ID NO:72)

其中X6是I或V；

X7是E或D；

X8是S或T；并且

X9是Y或D。

16.如权利要求15所述的抗体，其中相对于所述第二重链可变区，所述第一重链可变区位于更靠近N末端的位置。

17.如权利要求15所述的抗体，其中相对于所述第二重链可变区，所述第一重链可变区位于更靠近C末端的位置。

18.一种结合于PSMA的抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含在选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的CDR序列中具有两个或更少取代的序列。

19.如权利要求18所述的抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列是选自由SEQ ID NO:1-23组成的组。

20.一种结合于PSMA的抗体，其包含：

重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18。

21.一种结合于PSMA的抗体，其包含：

重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18，呈单价或二价构型。

22.一种结合于PSMA的抗体，其包含：

重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。

23.一种结合于PSMA的抗体，其包含：

重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20，呈单价或二价构型。

24.一种结合于PSMA的抗体，其包含：

第一重链可变区，所述第一重链可变区包含：

CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18；和

第二重链可变区，所述第二重链可变区包含：

CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20，

在人VH框架中。

25.如权利要求24所述的抗体，其中相对于所述第二重链可变区，所述第一重链可变区位于更靠近N末端的位置。

26.如权利要求24所述的抗体，其中相对于所述第二重链可变区，所述第一重链可变区位于更靠近C末端的位置。

27.如权利要求1-14和18-23中任一项所述的抗体，其是单特异性的。

28.如权利要求1至26中任一项所述的抗体，其是多特异性的。

29.如权利要求28所述的抗体，其是双特异性的。

30.如权利要求28或29所述的抗体，其对CD3蛋白和PSMA蛋白具有结合亲和力。

31.如权利要求28或29所述的抗体，其对同一PSMA蛋白上的两个不同表位具有结合亲和力。

32.如权利要求28或29所述的抗体，其对效应子细胞具有结合亲和力。

33.如权利要求32所述的抗体，其对T细胞抗原具有结合亲和力。

34.如权利要求33所述的抗体，其对CD3具有结合亲和力。

35.如权利要求1至34中任一项所述的抗体，其是呈CAR-T形式。

36.一种双特异性抗体，其包含：

(i)对CD3具有结合亲和力的重链可变区，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:59、CDR2序列SEQ ID NO:60和CDR3序列SEQ ID NO:61；

(ii)轻链可变区，其包含人VL框架中的CDR1序列SEQ ID NO:62、CDR2序列SEQ ID NO:63和CDR3序列SEQ ID NO:64；以及

(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18。

37.一种双特异性抗体，其包含：

(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18，呈单价或二价构型。

38.一种双特异性抗体，其包含：

(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。

39.一种双特异性抗体，其包含：

(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20，呈单价或二价构型。

40.一种多特异性抗体，其包含：

(iii)抗PSMA重链抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域包含第一和第二抗原结合区，呈二价构型，其中：

所述第一抗原结合区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:2、CDR2序列SEQ ID NO:11和CDR3序列SEQ ID NO:18；并且

所述第二抗原结合区包含人VH框架中的CDR1序列SEQ ID NO:7、CDR2序列SEQ ID NO:15和CDR3序列SEQ ID NO:20。

41.如权利要求40所述的多特异性抗体，其中相对于所述第二抗原结合区，所述第一抗原结合区位于更靠近N末端的位置。

42.如权利要求40所述的多特异性抗体，其中相对于所述第二抗原结合区，所述第一抗原结合区位于更靠近C末端的位置。

43.如权利要求36至42中任一项所述的多特异性或双特异性抗体，其中所述抗PSMA重链抗体的所述抗原结合域的所述第一和第二抗原结合区通过多肽接头连接。

44.如权利要求43所述的多特异性或双特异性抗体，其中所述多肽接头是GS接头。

45.如权利要求44所述的多特异性或双特异性抗体，其中所述GS接头由序列SEQ IDNO:73或SEQ ID NO:74组成。

46.如权利要求36-39中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗PSMA重链抗体的所述抗原结合域是单互补位的，并且如与双互补位抗原结合域相比诱导较少的细胞因子产生。

47.如权利要求36-39中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗PSMA重链抗体的所述抗原结合域是单互补位的，并且相比于双互补位抗原结合域，在更大程度上扩增CD8+T细胞。

48.如权利要求1至45中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双互补位的并且如与单互补位抗PSMA抗体相比对PSMA具有增加的亲和力。

49.如权利要求1至45中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双互补位的并且如与单互补位抗PSMA抗体相比具有增加的效应子功能。

50.一种药物组合物，其包含如权利要求1至49中任一项所述的抗体。

51.一种用于治疗以PSMA表达为特征的病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用如权利要求1至49中任一项所述的抗体或如权利要求50所述的药物组合物。

52.如权利要求1至49中任一项所述的抗体在制备用于治疗以PSMA表达为特征的病症的药剂中的用途。

53.如权利要求1至49中任一项所述的抗体，用于治疗以PSMA表达为特征的病症。

54.如权利要求51至53中任一项所述的方法、用途或抗体，其中所述病症是前列腺癌。

55.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至49中任一项所述的抗体。

56.一种载体，其包含如权利要求55所述的多核苷酸。

57.一种细胞，其包含如权利要求56所述的载体。

58.一种产生如权利要求1至49中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括使根据权利要求57所述的细胞在允许表达所述抗体的条件下生长，和从所述细胞中分离所述抗体。

59.一种制备如权利要求1至49中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括用PSMA蛋白使UniRat动物免疫和鉴定PSMA结合的抗体序列。

60.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求1至49中任一项所述的抗体或如权利要求50所述的药物组合物。