EA046268B1 - Антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые связываются с псма - Google Patents
Антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые связываются с псма Download PDFInfo
- Publication number
- EA046268B1 EA046268B1 EA202192736 EA046268B1 EA 046268 B1 EA046268 B1 EA 046268B1 EA 202192736 EA202192736 EA 202192736 EA 046268 B1 EA046268 B1 EA 046268B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- antibody
- cdr2
- cdr3
- Prior art date
Links
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 title claims description 189
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 title claims description 188
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 title claims description 73
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 228
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 130
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 130
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 130
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 122
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 118
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 107
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 104
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 claims description 104
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims description 104
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 85
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 76
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 74
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 74
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 10
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 claims 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 230000006870 function Effects 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 22
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 19
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 18
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 16
- 102100021651 SUN domain-containing ossification factor Human genes 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 12
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 11
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 11
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 10
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 6
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 4
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 4
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 3
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108091005956 Type II transmembrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- -1 framework 2 Proteins 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- 102000004860 Dipeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090001081 Dipeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 2
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000014447 Complement C1q Human genes 0.000 description 1
- 108010078043 Complement C1q Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150079449 Folh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000369 Glutamate Carboxypeptidase II Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 1
- 241000282852 Lama guanicoe Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100058506 Mus musculus Bloc1s5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000282830 Tylopoda Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 241000282840 Vicugna vicugna Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000003314 affinity selection Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H bis[(2-oxo-1,3,2$l^{5},4$l^{2}-dioxaphosphaplumbetan-2-yl)oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012506 imaged capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/830130, поданной 05 апреля 2019 г., описание которой включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и, таким образом, полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 09 июля 2020 г., называется TNO-0016-WO_SL.txt и имеет размер 121310 байт.
Область техники
Настоящее изобретение относится к человеческим антителам, содержащим только тяжелые цепи, (например, UniAb™) которые связываются с ПСМА (англ.: PSMA -prostate specific membrane antigen). Данное изобретение также относится к способам получения таких антител, к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие такие антитела, и их применению для лечения расстройств, которые характеризуются экспрессией ПСМА.
Уровень техники
ПСМА.
ПСМА, также известный как простатспецифический мембранный антиген и глутаматкарбоксипептидаза II (UniProt Q04609), представляет собой трансмембранный белок типа II, который обладает активностью N-ацетилированной альфа-связанной кислой дипептидазы, фолатгидролазы и дипептидилпептидазы. Он кодируется геном FOLH1 у человека и состоит из цитоплазматического домена из 19 аминокислот, трансмембранной части из 24 аминокислот и внеклеточной части из 707 аминокислот. Белок является ферментативно активным в качестве нековалентного гомодимера. ПСМА экспрессируется в ткани эпителия предстательной железы и его экспрессия усиливается в злокачественном новообразовании предстательной железы и в новой сосудистой сети солидных опухолей. Он также экспрессируется на низких уровнях в нормальных тканях, таких как мозг, почки и слюнные железы, но его избыточная экспрессия в злокачественной ткани предстательной железы делает его привлекательной мишенью для терапевтического лечения злокачественного новообразования предстательной железы. Он также может быть актуален для терапии или визуализации солидных опухолей, учитывая его высокую экспрессию в злокачественных новообразованных сосудах. Моноклональные антитела, конъюгаты антителолекарственное средство и Т-клетки с химерным антигенным рецептором, нацеленные на ПСМА, были описаны в контексте лечения метастатического злокачественного новообразования предстательной железы (Hernandez-Hoyos et al 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al 2014, PMID: 25327986, Serganova et al 2016, PMID: 28345023). Кроме того, радионуклидные конъюгаты, специфичные для ПСМА, исследуют в отношении визуализации и лечения злокачественного новообразования предстательной железы (например, Hofman et al., 2018 PMID: 29752180).
Антитела, содержащие только тяжелые цепи.
В обычном антителе IgG, ассоциация тяжелой цепи и легкой цепи частично обусловлена гидрофобным взаимодействием между константной областью легкой цепи и константным доменом СН1 тяжелой цепи. В областях тяжелой цепи каркаса 2 (FR2) и каркаса 4 (FR4) имеются дополнительные остатки, которые также способствуют этому гидрофобному взаимодействию между тяжелой и легкой цепями.
Известно, однако, что сыворотка верблюдовых (подгруппа Tylopoda, которая включает верблюдов, дромадеров и лам) содержит основной тип антител, состоящих исключительно из парных Н-цепей (антитела, содержащие только тяжелые цепи, или UniAb™). UniAb™ Camelidae (Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca и Lama vicugna) имеют уникальную структуру, состоящую из одного вариабельного домена (VHH), шарнирной области и двух константных доменов (СН2 и СН3), которые высокогомологичны доменам СН2 и СН3 классических антител. Данные UniAb™ не имеют первого домена константной области (СН1), который присутствует в геноме, но удаляется во время процессинга мРНК. Отсутствие домена СН1 объясняет отсутствие легкой цепи в UniAb™, поскольку этот домен является местом присоединения константного домена легкой цепи. Такие UniAb™ естественным образом эволюционировали для придания антигенсвязывающей специфичности и высокой аффинности тремя CDR из обычных антител, или их фрагментов (Muyldermans, 2001; J Biotechnol 74:277-302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111-124). Хрящевые рыбы, такие как акулы, также выработали особый тип иммуноглобулина, обозначенный как IgNAR, который лишен легких полипептидных цепей и полностью состоит из тяжелых цепей. Молекулами IgNAR можно манипулировать с помощью молекулярной инженерии для получения вариабельного домена полипептида с одной тяжелой цепью (vNAR) (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).
Способность антител, содержащих только тяжелые цепи, лишенных легкой цепи, связывать антиген была установлена в 1960-х годах (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). Тяжелая цепь иммуноглобулина, физически отделенная от легкой цепи, сохранила 80% антигенсвязывающей активности отно
- 1 046268 сительно тетрамерного антитела. Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790 продемонстрировали, что удаление домена СН1 из перегруппированного гена μ мыши приводит к получению антитела, содержащего только тяжелые цепи, лишенного легкой цепи, в клеточной культуре млекопитающих. Вырабатываемые антитела сохраняли специфичность связывания VH и эффекторные функции.
Антитела, содержащие только тяжелые цепи, с высокой специфичностью и аффинностью могут создаваться против различных антигенов посредством иммунизации (van der Linden, R.H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), а часть VHH может быть легко клонирована и экспрессирована в дрожжах (Frenken, L.G.J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Их уровни экспрессии, растворимости и стабильности значительно выше, чем у классических фрагментов F(ab) или Fv (Ghahroudi, M.A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)).
Мыши, у которых λ (лямбда) локус легкой (Г)-цепи и/или λ и к (каппа) локусы L-цепи были функционально подвергнуты сайленсингу, и антитела, продуцируемые такими мышами, описаны в патентах США № 7541513 и 8367888. Рекомбинантное продуцирование антител, содержащих только тяжелую цепь, у мышей и крыс было описано, например, в WO2006008548; публикации заявки на патент США № 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology; 109(1), 93-101; Bruggemann et al., Crit. Rev. Immunol; 2006, 26(5):377-90; и Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271-3283. Получение нокаутных крыс с помощью микроинъекций эмбрионам цинк-пальцевой нуклеазы описано в Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433. Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи, и трансгенные грызуны, содержащие гетерологичный локус тяжелой цепи, продуцирующий такие антитела, описаны в патентах США № 8883150 и 9365655. Структуры CAR-T, содержащие однодоменные антитела в качестве связывающего (нацеливающего) домена, описаны, например, в Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641 и Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386.
Сущность изобретения
Аспекты изобретения относятся к антителам, содержащим только тяжелые цепи, включая, но не ограничиваясь, UniAb™, с аффинностью связывания с ПСМА. Дальнейшие аспекты изобретения относятся к способам получения таких антител, композициям, содержащим такие антитела, и их применению для лечения расстройств, которые характеризуются экспрессией ПСМА.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ПСМА, содержит первую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-10; и/или (b) CDR2, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11-17; и/или (с) CDR3, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 18-23. В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит вторую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-10; и/или (b) CDR2, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11-17; и/или (с) CDR3, имеющую две или менее замен в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 18-23. В некоторых вариантах осуществления последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 присутствуют в человеческом каркасе. В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит последовательность константной области тяжелой цепи в отсутствие последовательности СН1.
В некоторых вариантах осуществления первая вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит: (а) последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10; и/или (b) последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-17; и/или (с) последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-23.
В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит вторую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит: (а) последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10; и/или (b) последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-17; и/или (с) последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1823.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит: (а) последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10; и (b) последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-17; и (с) последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-23. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вторую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит: (а) последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10; и (b) последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:
11-17; и (с) последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-23.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит: (а) последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18; или (b) последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последова
- 2 046268 тельности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 24-58. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24-58. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ПСМА, содержит первую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) последовательность CDR1 формулы:
G G S I S S X1 X2 Y Х3 (SEQ ID NO: 67), где X представляет собой S или N; Х2 представляет собой S или N; и Х3 представляет собой Y или F; и (b) последовательность CDR2 формулы:
Х4 Х5 X6 S G X7 T (SEQ ID NO: 68), где Х4 представляет собой I или V; X5 представляет собой D или Y; Х6 представляет собой Y или D; и Х7 представляет собой Y или S; и (с) представляет собой CDR3 формулы:
ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 69), в одновалентном или двухвалентном формате.
В некоторых вариантах осуществления антитела, которое связывается с ПСМА, содержит первую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) последовательность CDR1 формулы:
G F X1 F Х2 Х3 Y G (SEQ ID NO: 70), где X1 представляет собой S или I, или Т; Х2 представляет собой S или Т, или R, или I; и Х3 представляет собой R или S; и (b) последовательность CDR2 формулы:
I Х4 Y D G S N Х5 (SEQ ID NO: 71), где Х4 представляет собой W или S; и X5 представляет собой R или K; и (с) последовательность CDR3 формулы:
AREPRX6GYYYX7X8SGYX9SLDY (SEQ ID NO: 72), где Х6 представляет собой I или V; Х7 представляет собой Е или D; X8 представляет собой S или Т; и Х9 представляет собой Y или D, в одновалентном или двухвалентном формате.
В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающее ПСМА, содержит: первую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) последовательность CDR1 формулы:
G G S I S S X1 X2 Y Х3 (SEQ ID NO: 67), где X1 представляет собой S или N; Х2 представляет собой S или N; и Х3 представляет собой Y или F; и (b) последовательность CDR2 формулы:
Х4 Х5 Х6 S G X7 T (SEQ ID NO: 68), где Х4 представляет собой I или V; X5 представляет собой D или Y; Х6 представляет собой Y или D; и Х7 представляет собой Y или S; и (с) представляет собой CDR3 формулы:
ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 69), и вторую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) последовательность CDR1 формулы:
G F X1 F Х2 Х3 Y G (SEQ ID NO: 70), где X1 представляет собой S или I, или Т; Х2 представляет собой S или Т, или R, или I; и Х3 представляет собой R или S; и (b) последовательность CDR2 формулы:
I Х4 Y D G S N Х5 (SEQ ID NO: 71), где Х4 представляет собой W или S; и X5 представляет собой R или K; и (с) последовательность CDR3 формулы:
AREPRX6GYYYX7X8SGYX9SLDY (SEQ ID NO: 72), где Х6 представляет собой I или V; Х7 представляет собой Е или D; X8 представляет собой S или Т; и Х9 представляет собой Y или D.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит первую и вторую вариабельную область тяжелой цепи, причем первая вариабельная область тяжелой цепи расположена ближе к N-концу относительно второй вариабельной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления первая вариабельная область тяжелой цепи расположена ближе к С-концу относительно второй вариабельной области тяжелой цепи.
В некоторых вариантах осуществления антитела, которое связывается с ПСМА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека, где последовательности CDR содержат последовательность, имеющую две или менее замен в последовательности CDR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-23.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ПСМА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека, где последовательности CDR выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-23.
В некоторых вариантах осуществления антитела, которое связывается с ПСМА, содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18 в каркасе VH человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ПСМА, содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18 в каркасе VH человека в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
- 3 046268
В некоторых вариантах осуществления антитела, которое связывается с ПСМА, содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20 в каркасе VH человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ПСМА, содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20 в каркасе VH человека в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ПСМА, содержит: первую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18; и вторую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20 в каркасе VH человека. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит первую вариабельную область тяжелой цепи, которая расположена ближе к N-концу относительно второй вариабельной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления первая вариабельная область тяжелой цепи расположена ближе к С-концу относительно второй вариабельной области тяжелой цепи.
В некоторых вариантах осуществления антитело является моноспецифическим. В некоторых вариантах осуществления антитело является полиспецифическим. В некоторых вариантах осуществления антитело является биспецифическим. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет аффинность связывания с белком CD3 и белком ПСМА. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет аффинность связывания с двумя разными эпитопами на одном и том же белке ПСМА. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет аффинность связывания с эффекторной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет аффинность связывания с Т-клеточным антигеном. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет аффинность связывания с CD3. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет формат CAR-T.
Аспекты изобретения включают биспецифическое антитело, содержащее: (i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 61 в каркасе VH человека; (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 64 в каркасе VL человека; и (ш) антигенсвязывающий домен антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА, содержащий последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18, в каркасе VH человека.
Аспекты изобретения включают биспецифическое антитело, содержащее: (i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 61 в каркасе VH человека; (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 64 в каркасе VL человека; и (iii) антигенсвязывающий домен антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА, содержащий последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18, в каркасе VH человека в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
Аспекты изобретения включают биспецифическое антитело, содержащее: (i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 61 в каркасе VH человека; (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 64 в каркасе VL человека; и (iii) антигенсвязывающий домен антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА, содержащий последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20, в каркасе VH человека.
Аспекты изобретения включают биспецифическое антитело, содержащее: (i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 61 в каркасе VH человека; (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 64 в каркасе VL человека; и (iii) антигенсвязывающий домен антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА, содержащий последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20, в каркасе VH человека в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
Аспекты изобретения включают полиспецифическое антитело, содержащее: (i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO:
- 4 046268 в каркасе VH человека; (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 64 в каркасе VL человека; и (iii) антигенсвязывающий домен антитела, содержащего только тяжелой цепи, к ПСМА, где антигенсвязывающий домен содержит первую и вторую антигенсвязывающую область в двухвалентной конфигурации, при этом: первая антигенсвязывающая область содержит последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18 в каркасе VH человека; и вторая антигенсвязывающая область содержит последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20 в каркасе VH человека. В определенных вариантах осуществления первая антигенсвязывающая область расположена ближе к N-концу относительно второй антигенсвязывающей области. В определенных других вариантах осуществления первая антигенсвязывающая область расположена ближе к С-концу по сравнению со второй антигенсвязывающей областью.
Аспекты изобретения включают полиспецифические или биспецифические антитела, в которых первая и вторая антигенсвязывающие области антигенсвязывающего домена антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА соединены полипептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер представляет собой GS-линкер. В некоторых вариантах осуществления GS-линкер состоит из последовательности SEQ ID NO: 73 или SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА является монопаратопным и индуцирует меньшую продукцию цитокинов по сравнению с бипаратопным антигенсвязывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен антитела, содержащего только тяжелые цепи, в ПСМА является монопаратопным и увеличивает количество CD8+ Т-клеток в большей степени, чем бипаратопный антигенсвязывающий домен.
В некоторых вариантах осуществления антитело является бипаратопным и имеет повышенную аффинность к ПСМА по сравнению с монопаратопным антителом к ПСМА. В некоторых вариантах осуществления антитело является бипаратопным и имеет повышенную эффекторную функцию по сравнению с монопаратопным антителом к ПСМА.
Аспекты изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим описанное в данном документе антитело.
Аспекты изобретения относятся к способам лечения расстройства, характеризующегося экспрессией ПСМА, включающим введение субъекту с указанным расстройством антитела или фармацевтической композиции, описанной в данном документе. В определенных других аспектах изобретение относится к применению описанного в данного документе антитела при приготовлении лекарственного препарата для лечения расстройства, характеризующегося экспрессией ПСМА. В еще других аспектах изобретение относится к описанному в данном документе антителу для применения при лечении расстройства, характеризующегося экспрессией ПСМА. В определенных других аспектах изобретение относится к способам лечения, включающим введение нуждающемуся человеку эффективной дозы антитела или фармацевтической композиции, описанной в данном документе. Что касается этих аспектов и в некоторых вариантах осуществления, заболевание представляет собой злокачественное новообразование предстательной железы.
Аспекты изобретения относятся к полинуклеотидам, кодирующим описанное в данном документе антитело, векторам, содержащим такие полинуклеотиды, и клеткам, содержащим такие векторы.
Аспекты изобретения относятся к способам получения описанного в данном документе антитела, включающим культивирование описанной в данном документе клетки в условиях, допускающих экспрессию антитела, и выделение антитела из клетки.
Аспекты изобретения относятся к способам получения описанного в данном документе антитела, включающим иммунизацию животного UniRat белком ПСМА и идентификацию последовательностей ПСМА-связывающих антител.
Данные и другие аспекты будут дополнительно объяснены в остальной части описания, включая примеры.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1, панели А-В, представлена серия графиков, демонстрирующих титр сыворотки в зависимости от разведения.
На фиг. 2, панели А, представлен график, демонстрирующий связывание клеток с ПСМА человека.
На фиг. 2, панели В, представлен график, демонстрирующий связывание клеток с ПСМА яванского макака.
На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий конкуренцию связывания между двумя семействами антител в соответствии с вариантом осуществления изобретения.
На фиг. 4, панели А, представлен график Скэтчарда, демонстрирующий аффинность связывания с ПСМА, экспрессируемым на клеточной поверхности, биспецифического антитела, имеющего аффинность связывания с CD3 и ПСМА, где плечо к ПСМА является монопаратопным и одновалентным согласно варианту осуществления изобретения.
На фиг. 4, панели В, представлен график Скэтчарда, демонстрирующий аффинность связывания с ПСМА, экспрессируемым на клеточной поверхности, биспецифического антитела, имеющего аффин
- 5 046268 ность связывания с CD3 и ПСМА, где плечо к ПСМА является бипаратопным согласно варианту осуществления изобретения.
На фиг. 5, панели А-С, представлены схематические изображения: анти-CD3 х одновалентного моноспецифического анти-ПСМА антитела (панель А); анти-CD3 х двухвалентное моноспецифическое анти-ПСМА антитело (панель В); и анти-CD3 х двухвалентное бипаратопное анти-ПСМА антитело (панель С) в соответствии с вариантами осуществления изобретения.
На фиг. 6 представлен график, изображающий опосредованный Т-клетками лизис ПСМАположительных клеток с использованием предварительно активированных Т-клеток.
На фиг. 7 представлен график, изображающий опосредованный Т-клетками лизис ПСМАположительных клеток с использованием нестимулированных Т-клеток.
На фиг. 8 представлен график, изображающий процент специфического лизиса ПСМАотрицательных клеток DU145 в зависимости от концентрации полиспецифических антител в присутствии предварительно активированных Т-клеток.
На фиг. 9 представлен график, демонстрирующий связывание биспецифических антител к ПСМА х CD3 с положительными и отрицательными по ПСМА клетками.
На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий опосредованный Т-клетками лизис ПСМАположительных клеток.
На фиг. 11, панели А, представлен график, изображающий пролиферацию Т-клеток в зависимости от концентрации антитела.
На фиг. 11, панели В, представлен график, изображающий пролиферацию Т-клеток в зависимости от концентрации антитела.
На фиг. 11, панели С, представлен график, изображающий отношение CD8 к CD4 пролиферированных Т-клеток.
На фиг. 11, панели D, представлен график, изображающий отношение CD8 к CD4 пролиферированных Т-клеток.
На фиг. 12, панели А, представлен график, изображающий опосредованный Т-клетками лизис ПСМА-положительных клеток в зависимости от концентрации антитела.
На фиг. 12, панели В, представлен график, изображающий высвобождение цитокина (ИФН-γ) в зависимости от концентрации антитела.
На фиг. 12, панели С, представлен график, изображающий высвобождение цитокина (ИЛ-2) в зависимости от концентрации антитела.
На фиг. 13 представлен график, изображающий ингибирование роста опухоли 22Rvl в модели ксенотрансплантата опухоли.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
При практической реализации данного изобретения применяют, если не указано иное, стандартные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы полностью описаны в литературе, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); и Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).
Когда приводится диапазон значений, следует понимать, что данное изобретение охватывает каждое промежуточное значение с точностью до десятого знака нижнего предела, если в контексте явно не указано иное, между верхним и нижним пределом этого диапазона, а также любое другое указанное или промежуточное значение в таком указанном диапазоне. Верхний и нижний пределы данных меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны и также включены в данное изобретение с учетом любого специальным образом исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба этих включенных предела, также включены в данное изобретение.
Если не указано иное, остатки антител в данном документе нумеруются в соответствии с системой нумерации Kabat (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Для обеспечения полного понимания данного изобретения в нижеследующем подробном описании изложены многочисленные конкретные детали. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что настоящее изобретение может применяться на практике и без одной или более указанных конкретных деталей. В других случаях общеизвестные отличительные признаки и процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники, не были описаны во избежание затруднения понимания изобретения.
- 6 046268
Все приведенные в данном документе ссылки, включая патентные заявки и публикации, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
I. Определения.
Под термином содержащий подразумевается, что перечисленные элементы требуются для композиции/способа/набора, однако для формирования композиции/способа/набора и тому подобного в рамках формулы изобретения могут быть включены и другие элементы.
Под термином состоящий по существу из подразумевается ограничение рамок описанной композиции или способа указанными материалами или поэтапными действиями, не оказывающими существенного влияния на основную и новую характеристику(и) объекта изобретения.
Под термином состоящий из подразумевается исключение любого элемента, поэтапного действия или ингредиента, не указанного в формуле изобретения, из композиции, способа или набора.
Остатки антител в данном документе нумеруются в соответствии с системой нумерации Kabat и системой нумерации EU. Система нумерации Kabat в общем случае используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed.
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Система нумерации EU или индекс EU, как правило, используется для обозначения аминокислотного остатка в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, представленный в Kabat et al., ранее). Индекс EU по Kabat относится к нумерации аминокислотных остатков антитела человека IgG1 EU. Если не указано иначе, ссылки на номера остатков в вариабельном домене антител означают нумерацию остатков по системе нумерации Kabat. Если не указано иначе, ссылки на номера остатков в константном домене антител означают нумерацию остатков по системе нумерации EU.
Антитела, также называемые иммуноглобулинами, как правило, содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, где N-концевой домен тяжелой и легкой цепей является вариабельным по последовательности, поэтому, как правило, его называют доменом вариабельной области или вариабельным доменом тяжелый цепи (VH) или вариабельным доменом легкой цепи (VL). Эти два домена, как правило, связываются с образованием области специфического связывания, хотя, как будет обсуждаться в данном документе, специфическое связывание также может быть получено с вариабельными последовательностями только тяжелых цепей, а в данной области техники известный и используются различные неприродные конфигурации антител.
Функциональное или биологически активное антитело или антигенсвязывающая молекула (включая антитела, содержащие только тяжелые цепи, и полиспецифические (например, биспецифические) трехцепочечные антителоподобные молекулы (ТСА, описанные в данном документе), является молекулой, способной оказывать одно или более своих природных активностей действий в структурных, регуляторных, биохимических или биофизических событиях. Например, функциональное антитело или другая связывающая молекула, например, ТСА, может обладать способностью специфически связывать антиген, а связывание может, в свою очередь, вызывать или изменять клеточное или молекулярное событие, такое как передача сигнала или ферментативная активность. Функциональное антитело или другая связывающая молекула, например, ТСА, также может блокировать лигандную активацию рецептора или действовать в качестве агониста или антагониста. Способность антитела или другой связывающей молекулы, например, ТСА, проявлять одну или более своих природных активностей, зависит от нескольких факторов, включая правильный фолдинг и сборку полипептидных цепей.
Термин антитело в данном документе используется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мономеры, димеры, мультимеры, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), антитела, содержащие только тяжелые цепи, трехцепочечные антитела, ТСА, одноцепочечный Fv ( scFv), наноантитела и т.д., а также включают фрагменты антител, если они проявляют желаемую биологическую активность (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов.
Термин антитело может относиться к полноразмерной тяжелой цепи, полноразмерной легкой цепи, интактной молекуле иммуноглобулина; или иммунологически активной части любого из этих полипептидов, то есть к полипептиду, который содержит антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывает антиген представляющей интерес мишени или ее часть, причем такие мишени включают, но не ограничиваются ими, раковые клетки или клетки, которые вырабатывают аутоиммунные антитела, связанные с аутоиммунным заболеванием. Описанный в данном документе иммуноглобулин может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина, включая сконструированные подклассы с измененными Fc-частями, которые обеспечивают снижение или усиление активности эффекторных клеток. Легкие цепи рассматриваемых антител могут быть легкими цепями каппа (V-каппа) или легкими цепями лямбда (V-лямбда). Иммуноглобулины могут быть получены из любых видов. В одном аспекте иммуноглобулин имеет преимущественно человеческое происхождение.
Термин моноклональное антитело в данном документе относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени однородных антител, то есть отдельные антитела в составе популяции
- 7 046268 являются идентичными, за исключением мутаций, происходящих по естественным причинам, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты на антигене. Моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al. (1975) Nature 256:495, также могут быть получены, например, способами получения рекомбинантного белка (см., например, патент США № 4816567).
Термин вариабельный, в контексте данного документа, в связи с антителами относится к тому факту, что последовательности некоторых частей вариабельных доменов антитела сильно различаются у разных антител и вносят вклад в связывание и специфичность каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. В то же время вариабельность не является равномерно распределенной по вариабельным доменам антител. Она сосредоточена в трех сегментах вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, называемых гипервариабельными областями. Более консервативные фрагменты вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Вариабельные домены нативных легких и тяжелых цепей содержат по четыре FR, преимущественно принимающих конфигурацию Р-листа и соединенных тремя гипервариабельными областями, образующими петли, соединяющие структуры Р-типа, а в некоторых случаях, являющиеся их частью. Гипервариабельные области каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости при помощи FR и, вместе с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, например, участие антитела в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ).
Термин гипервариабельная область при применении в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область, как правило, содержит аминокислотные остатки из определяющей комплементарность области или CDR (например, остатки 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из остатков гипервариабельной петли 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). В некоторых вариантах осуществления CDR означает определяющую комплементарность область антитела, как определено в Lefranc, MP et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database, Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999). Остатки каркасной области или FR представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области/CDR, как определено в данном документе.
Примерные обозначения CDR показаны в данном документе, однако специалист в данной области техники поймет, что обычно используется ряд определений CDR, включая определение Kabat (см. Zhao et al. A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions. Mol Immunol. 2010; 47:694-700), которое основано на изменчивости последовательности и является наиболее часто используемым. Определение Chothia основано на расположении областей структурных петель (Chothia et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989; 342:877-883). Представляющие интерес альтернативные определения CDR включают, без ограничения, те, которые раскрыты Honegger, Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. J Mol Biol. 2001;309:657-670; Ofran et al. Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cell epitopes. J Immunol. 2008; 181:6230-6235; Almagro Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires. J Mol Recognit. 2004; 17:132-143; и Padlanet al. Identification of specificity-determining residues in antibodies. Faseb J. 1995; 9:133-139, содержание каждого из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
Термины антитело, содержащее только тяжелые цепи и антитело, состоящее из тяжелых цепей используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся в самом широком смысле к антителам или одной или более частям антитела, например, одному или более плечам антитела, в которых отсутствует легкая цепь обычного антитела. Термины, в частности, включают, без ограничения, гомодимерные антитела, содержащие антигенсвязывающий домен VH и константные домены СН2 и СН3, в отсутствие домена СН1; функциональные (антигенсвязывающие) варианты таких антител, растворимые варианты VH, Ig-NAR, содержащие гомодимер одного вариабельного домена (V-NAR) и пяти С-подобных константных доменов (C-NAR), и их функциональные фрагменты; и растворимые однодоменные антитела (sUniDab™). В одном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена вариабельной области, состоящего из каркаса 1, CDR1, каркаса 2, CDR2, каркаса 3, CDR3 и каркаса 4. В другом варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые
- 8 046268 цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и доменов СН2, и СН3. В еще одном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена по меньшей мере части шарнирной области и домена СН2. В дополнительном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена СН3. Антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых домен СН2 и/или СН3 укорочен, также включены в данный документ. В другом варианте осуществления тяжелая цепь состоит из антигенсвязывающего домена и по меньшей мере одного домена СН (CH1, СН2, СН3 или СН4), но без шарнирной области. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может быть в форме димера, в котором две тяжелые цепи дисульфидно связаны друг с другом, ковалентно или нековалентно связаны друг с другом. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может принадлежать к подклассу IgG, но также в данном документе включены антитела, относящиеся к другим подклассам, таким как подкласс IgM, IgA, IgD и IgE. В конкретном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, имеет подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности подтип IgG1. В одном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, в данном документе используются в качестве связывающего (нацеливающего) домена химерного антигенного рецептора (CAR). Определение, в частности, включает антитела человека, содержащие только тяжелые цепи, называемые UniAb™, продуцируемые трансгенными крысами с иммуноглобулином человека (UniRat™). Вариабельные области (VH) UniAb™ называют UniDab™, и являются универсальными строительными блоками, которые могут быть связаны с областями Fc или сывороточным альбумином для разработки новых терапевтических средств с полиспецифичностью, повышенной эффективностью и увеличенным периодом полужизни. Поскольку гомодимерные UniAb™ лишены легкой цепи и, следовательно, домена VL, антиген распознается одним единственным доменом, то есть вариабельным доменом тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи, (VH или VHH).
Используемый в данном документе термин интактная цепь антитела представляет собой цепь, содержащую полноразмерную вариабельную область и полноразмерную константную область (Fc). Интактное стандартное антитело содержит интактную легкую цепь и интактную тяжелую цепь, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, СН1, шарнир, СН2 и СН3 для секретируемого IgG. Другие изотипы, такие как IgM или IgA, могут иметь разные домены СН. Константные домены могут представлять собой константные домены нативной последовательности (например, константные домены человеческой нативной последовательности) или их варианты аминокислотной последовательности. Интактное антитело может иметь одну или более эффекторных функций, которые относятся к той биологической активности, которая присуща константной области Fc (области Fc с нативной последовательностью или области Fc с вариантной аминокислотной последовательностью) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; и снижение количества рецепторов клеточной поверхности. Варианты константной области включают те, которые изменяют эффекторный профиль, связывание с Fc-рецепторами и т.п.
В зависимости от аминокислотной последовательности Fc (константного домена) их тяжелых цепей, антитела и различные антигенсвязывающие белки могут быть определены в разные классы. Существует пять основных классов областей Fc тяжелой цепи: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, и IgA2. Константные домены Fc, которые соответствуют различным классам антител, могут обозначаться как а, δ, ε, γ и μ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Формы Ig включают шарнирные модификации или бесшарнирные формы (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). Легкие цепи антител от любых вида позвоночных можно отнести к одному из двух типов, называемых к (каппа) и λ (лямбда), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. Антитела в соответствии с вариантами осуществления изобретения могут содержать последовательности легкой каппа-цепи или последовательности легкой лямбда-цепи.
Функциональная область Fc обладает эффекторной функцией области Fc с нативной последовательностью. Неограничивающие примеры эффекторных функций включают связывание C1q; КЗЦ; связывание с Fc-рецептором; АЗКЦ; АЗКФ; снижение количества рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточного рецептора) и т.д. Такие эффекторные функции, как правило, требуют, чтобы область Fc взаимодействовала с рецептором, например, рецепторами FcyRI; FcyRIIA; FcyRIIBI; FcyRIIB2; FcyRIIIA; FcyRIIIB, и рецептором FcRn с низкой аффинностью; и могут быть оценены с помощью различных анализов, известных в данной области техники. Мертвый или подвергнутый сайленсингу Fc представляет собой Fc, который был мутирован для сохранения активности в отношении, например, продления периода полужизни в сыворотке, но который не активирует высокоаффинный Fc-рецептор или который имеет сниженную аффинность к Fc-рецептору.
Область Fc с нативной последовательностью содержит аминокислотную последовательность,
- 9 046268 идентичную аминокислотной последовательности области Fc, встречающейся в природе. Человеческие области Fc с нативной последовательностью включают, например, область Fc человеческого IgG1 с нативной последовательностью (не-А- и А-аллотипы); область Fc человеческого IgG2 с нативной последовательностью; область Fc человеческого IgG3 с нативной последовательностью; и область Fc человеческого IgG4 с нативной последовательностью, а также их природные варианты.
Вариант области Fc содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности области Fc с нативной последовательностью в силу по меньшей мере одной модификации аминокислоты, предпочтительно одной или более аминокислотных замен. Предпочтительно вариант области Fc имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с областью Fc с нативной последовательностью или с областью Fc исходного полипептида, например, от около одной до около десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных замен в области Fc с нативной последовательностью или в области Fc исходного полипептида. Вариант области Fc в данном документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере около 80% гомологией с областью Fc с нативной последовательностью и/или с областью Fc исходного полипептида, и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% гомологии с ними, более предпочтительно по меньшей мере около 95 % гомологии с ним.
Варианты последовательностей Fc могут содержать три аминокислотные замены в области СН2 для снижения связывания FcyRI в положениях 234, 235, и 237 согласно индексу EU (см. Duncan et al., (1988) Nature 332:563). Две аминокислотные замены в сайте связывания комплемента C1q в положениях 330 и 331 согласно индексу EU снижают фиксацию комплемента (см. Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) и Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). Замена на остатки человеческого IgG1 или IgG2 в положениях 233-236 и остатки IgG4 в положениях 327, 330 и 331 значительно снижает АЗКЦ и КЗЦ (см., например, Armour K.L. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; и Shields R.L. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604). Аминокислотная последовательность Fc IgG4 человека (UniProtKB № P01861) представлена в данном документе как SEQ ID NO: 76. Подвергнутый сайленсингу IgG1 описан, например, в Boesch, A.W., et al., Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions. MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27, описание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Возможны и другие варианты Fc, включая, без ограничения, вариант, в котором удалена область, способная образовывать дисульфидную связь, или в котором удалены определенные аминокислотные остатки на N-конце нативного Fc, или остаток метионина добавлен к нему. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления одна или более Fc-частей антитела могут содержать одну или более мутаций в шарнирной области для устранения дисульфидной связи. В еще одном варианте осуществления шарнирная область Fc может быть удалена полностью. В еще одном варианте осуществления антитело может содержать вариант Fc.
Кроме того, вариант Fc может быть сконструирован для удаления или существенного снижения эффекторных функций путем замены (мутации), удаления или добавления аминокислотных остатков для осуществления связывания комплемента или связывания Fc-рецептора. Например, без ограничения, делеция может происходить в сайте связывания комплемента, таком как сайт связывания C1q. Способы получения таких производных последовательностей Fc-фрагмента иммуноглобулина описаны в международных патентных публикациях №№ WO 97/34631 и WO 96/32478. Кроме того, Fc-домен может быть модифицирован фосфорилированием, сульфированием, ацилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием, ацетилированием, амидированием и т.п.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вариантную последовательность домена СН3 IgG4 человека, содержащую мутацию T366W, которая необязательно может называться в данном документе последовательностью выступа СН3 IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вариантную последовательность домена СН3 IgG4 человека, содержащую мутацию T366S, мутацию L368A и мутацию Y407V, которая необязательно может называться в данном документе последовательностью впадины СН3 IgG4. Описанные в данном документе мутации IgG4 СН3 можно использовать любым подходящим способом, чтобы поместить выступ в константную область первой тяжелой цепи первого мономера в димере антитела и впадину в константной области второй тяжелой цепи второго мономера в димере антитела, способствуя тем самым правильному спариванию (гетеродимеризации) желаемой пары полипептидных субъединиц тяжелой цепи в антителе.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит полипептидную субъединицу тяжелой цепи, содержащую вариантную область Fc IgG4 человека, содержащую мутацию S228P, мутацию F234A, мутацию L235A и мутацию T366W (выступ). В некоторых вариантах осуществления антитело содержит полипептидную субъединицу тяжелой цепи, содержащую вариантную область Fc IgG4 человека, содержащую мутацию S228P, мутацию F234A, мутацию L235A, мутацию T366S, мутацию L368A и мутацию Y407V (впадина).
Термин антитело, содержащее область Fc относится к антителу, которое содержит область Fc. Сконцевой лизин (остаток 447 в соответствии с системой нумерации EU) области Fc может быть удален, например, во время очистки антитела или путем конструирования рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело.
Соответственно, антитело, имеющее область Fc согласно данному изобретению, может включать
- 10 046268 антитело с или без K447.
Аспекты изобретения включают антитела, содержащие вариабельную область только тяжелой цепи, в одновалентной или двухвалентной конфигурации. Используемый в данном документе термин одновалентная конфигурация, используемый в отношении домена вариабельной области только тяжелой цепи, означает, что присутствует только один домен вариабельной области только тяжелой цепи, имеющий единственный сайт связывания (см. фиг. 5, панель А, правое плечо антитела). Напротив, термин двухвалентная конфигурация, используемый в отношении домена вариабельной области только тяжелой цепи, означает, что присутствуют два домена вариабельной области только тяжелой цепи (каждый из которых имеет один сайт связывания) и соединены линкерной последовательностью (см. фиг. 5, панели В и С, правые плечи антител). Неограничивающие примеры линкерных последовательностей дополнительно обсуждаются в данном документе и включают, без ограничения, последовательности GS-линкеров различной длины. Когда вариабельная область только тяжелой цепи имеет двухвалентную конфигурацию, каждый из двух доменов вариабельной области только тяжелой цепи может иметь аффинность связывания с одним и тем же антигеном или с разными антигенами (например, с разными эпитопами на одном и том же белке; с двумя разными белками и т.д.). Однако, если специально не указано иное, вариабельная область только тяжелой цепи, обозначенная как находящаяся в двухвалентной конфигурации, как предполагается, содержит два идентичных домена вариабельной области только тяжелой цепи, соединенные линкерной последовательностью, при этом каждая из двух идентичных доменов вариабельных областей только тяжелой цепи, обладают аффинностью связывания с одним и тем же целевым антиге ном.
Аспекты изобретения включают антитела, имеющие полиспецифические конфигурации, которые включают, без ограничения, биспецифические, триспецифические и т.д. Большое разнообразие способов и конфигураций белков известно и используется для получения биспецифических моноклональных антител (бсмкАт), триспецифических антител, и т.п.
Были разработаны различные способы получения поливалентных искусственных антител путем рекомбинантного слияния вариабельных доменов двух или более антител. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигенсвязывающий домен на полипептиде соединены полипептидным линкером. Одним неограничивающим примером такого полипептидного линкера является GS-линкер, имеющий аминокислотную последовательность из четырех остатков глицина, за которыми следует один остаток серина, и в котором последовательность повторяется п раз, где п представляет собой целое число от 1 до около 10, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или 9 (SEQ ID NO: 94). Неограничивающие примеры таких линкеров включают GGGGS (SEQ ID NO: 73) (n=1) и GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 74 (n=2). Также можно использовать другие подходящие линкеры, которые описаны, например, в Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65 (10): 1357-69, описание которого полностью включено в данный документ по средством ссылки.
Термин трехцепочечная антителоподобная молекула или ТСА используется в данном документе для обозначения антителоподобных молекул, включающих, состоящих по существу или состоящих из трех полипептидных субъединиц, две из которых содержат, состоят по существу из или состоят из одной тяжелой и одной легкой цепи моноклонального антитела, или функциональных антигенсвязывающих фрагментов таких цепей антитела, содержащих антигенсвязывающую область и по меньшей мере один домен СН. Данная пара тяжелая цепь / легкая цепь обладает специфичностью связывания в отношении первого антигена. Третья полипептидная субъединица включает, состоит по существу из или состоит из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего Fc-часть, содержащую домены СН2 и/или СН3, и/или СН4, в отсутствие домена СН1, и один или более антигенсвязывающих доменов (например, два антигенсвязывающих домена), который связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп пер вого антигена, причем такой связывающий домен получен из или имеет идентичность последовательности с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи антитела. Части такой вариабельной области могут кодироваться сегментами гена VH и/или VL, сегментами гена D и JH, или сегментами гена JL. Вариабельная область может кодироваться реаранжированными генными сегментами VHDJH, VLDJH, VHJL или
VLJL.
В соединении, связывающем ТСА, используется антитело, содержащее только тяжелые цепи, или антитело, состоящее из тяжелых цепей, или полипептид, содержащий только тяжелые цепи, которые, как используется в данном документе, означают одноцепочечное антитело, содержащее константные области тяжелой цепи СН2 и/или СН3, и/или СН4, но без домена СН1. В одном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и доменов СН2, и СН3. В другом варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена СН2. В дополнительном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена СН3.
Антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых домен СН2 и/или СН3 укорочен, также включены в данный документ. В другом варианте осуществления тяжелая цепь состоит из антигенсвязывающего домена и по меньшей мере одного домена СН (СН1, СН2, СН3 или СН4), но без шарнирной
- 11 046268 области. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может быть в форме димера, в котором две тяжелые цепи связаны дисульфидной связью, другие в противном случае ковалентно или нековалентно связаны друг с другом, и может необязательно включать асимметричную поверхность взаимодействия между одним или более доменами СН, чтобы облегчить правильное спаривание между полипептидными цепями. Антитело из тяжелых цепей может принадлежать к подклассу IgG, но сюда также включены антитела, принадлежащие к другим подклассам, таким как подкласс IgM, IgA, IgD и IgE. В конкретном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности подтипу IgG1 или подтипу IgG4. Неограничивающие примеры соединения, связывающего ТСА, описаны, например, в WO2017/223111 и WO2018/052503, описания которых полностью включены в данный документ посредством ссылки.
Антитела, состоящий только из тяжелых цепей составляют около четверти антител IgG, продуцируемых животными семейства верблюдовых, например, верблюдами и ламами (Hamers-Casterman С., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). Эти антитела образованы двумя тяжелыми цепями, но лишены легких цепей. Как следствие, вариабельный участок связывания антигена называется доменом VHH, и он представляет собой наименьший естественный, интактный антигенсвязывающий сайт, имеющий длину всего около 120 аминокислот (Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). Антитела, содержащие только тяжелые цепи, с высокой специфичностью и аффинностью могут создаваться против различных антигенов посредством иммунизации (van der Linden, R.H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), а часть VHH может быть легко клонирована и экспрессирована в дрожжах (Frenken, L.G.J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Их уровни экспрессии, растворимости и стабильности значительно выше, чем у классических фрагментов F(ab) или Fv (Ghahroudi, M.A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). Также было показано, что у акул есть один VH-подобный домен в своих антителах, называемый VNAR. (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).
Используемый в данном документе термин ПСМА относится к трансмембранному белку типа II, который обладает активностью N-ацетилированной альфа-связанной кислой дипептидазы, фолатгидролазы и дипептидилпептидазы. Термин ПСМА включает белок ПСМА человека и любого отличного от человека вида животных и, в частности, включает ПСМА человека, а также ПСМА отличных от человека млекопитающих.
Используемый в данном документе термин ПСМА человека включает любые варианты, изоформы и видовые гомологи ПСМА человека (UniProt Q04609), независимо от его источника или способа получения. Таким образом, ПСМА человека включает ПСМА человека, естественно экспрессируемый клетками, и ПСМА, экспрессируемый на клетках, трансфицированных геном ПСМА человека.
Термины антитело, содержащее только тяжелые цепи, к ПСМА, антитело, состоящее только из тяжелых цепей, к ПСМА, анти-ПСМА антитело, содержащее только тяжелые цепи и антитело к ПСМА, состоящее только из тяжелых цепей используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, содержащего только тяжелые цепи, как определено выше, для иммуноспецифического связывания с ПСМА, включая ПСМА человека, как определено выше. Определение включает, без ограничения, человеческие антитела, содержащие только тяжелые цепи, продуцируемые трансгенными животными, такими как трансгенные крысы или трансгенные мыши, экспрессирующие иммуноглобулин человека, включая UniRat™, продуцирующие человеческие антитела UniAb™ к ПСМА, как определено выше.
Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей относительно эталонной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимальной идентичности последовательностей, но без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может осуществляться различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программные обеспечения BLAST, BLAST2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей данного изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей генерируются с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2.
Выделенным антителом является такое, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонента его естественной среды. Загрязняющий компонент естественного окружения представляет собой вещества, которые влияют на диагностическое или терапевтическое применение антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до более 95 мас.% антитела, как определено методом Лоури, и наиболее предпочтительно более 99 мас.%, (2) до степени, достаточ
- 12 046268 ной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, используя секвенатор с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности путем ДСНПААГ-электрофореза в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием красителя Кумасси синего или, предпочтительнее, красителя на основе серебра. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент естественной среды антитела будет отсутствовать. Обычно, однако, выделенное антитело будет получено с помощью по меньшей мере одного этапа очистки.
Антитела по изобретению включают полиспецифические антитела. Полиспецифические антитела имеют более чем одну специфичность связывания. Термин полиспецифический, в частности, включает биспецифический и триспецифический, а также аффинность независимого специфического связывания высшего порядка, такую как полиэпитопная специфичность высшего порядка, а также тетравалентные антитела и фрагменты антител. Термины полиспецифическое антитело, полиспецифическое антитело, содержащее только тяжелые цепи, полиспецифическое антитело, состоящее только из тяжелых цепей и полиспецифическое UniAb™ используются в данном документе в самом широком смысле и охватывают все антитела с более чем одной специфичностью связывания. Полиспецифические антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА по настоящему изобретению, в частности, включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с двумя или более неперекрывающимися эпитопами на белке ПСМА, таком как ПСМА человека (т.е. двухвалентные и бипаратопные). Полиспецифические антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА согласно настоящему изобретению также конкретно включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с эпитопом белка ПСМА, таким как ПСМА человека, и эпитопом другого белка, такого как, например, белок CD3, такой как CD3 человека (т.е. двухвалентные и бипаратопные). Полиспецифические антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА по настоящему изобретению также конкретно включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с двумя или более неперекрывающимися или частично перекрывающимися эпитопами на белке ПСМА, таком как белок ПСМА человека, и с эпитопом на другом белке, таком как, например, белок CD3, такой как белок CD3 человека (т.е. трехвалентный и бипаратопный).
Антитела согласно изобретению включают моноспецифические антитела, имеющие одну специфичность связывания. Моноспецифические антитела, в частности, включают антитела, обладающие одной специфичностью связывания, а также антитела, содержащие более одной единицы связывания, имеющие одинаковую специфичность связывания. Термины моноспецифическое антитело, моноспецифическое антитело, содержащее только тяжелые цепи, моноспецифическое антитело, состоящее из тяжелых цепей и моноспецифическое UniAb™ используются в данном документе в самом широком смысле и охватывают все антитела с одной специфичностью связывания. Моноспецифические антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА по настоящему изобретению, в частности, включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с одним эпитопом на белке ПСМА, таким как ПСМА человека (одновалентный и моноспецифический). Моноспецифические антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА по настоящему изобретению также конкретно включают антитела, имеющие более одной связывающей единицы (например, поливалентные антитела), иммуноспецифически связывающиеся с эпитопом на белке ПСМА, таком как ПСМА человека. Например, моноспецифическое антитело в соответствии с вариантами осуществления изобретения может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую два антигенсвязывающих домена, где каждый антигенсвязывающий домен связывается с одним и тем же эпитопом на белке ПСМА (т.е. двухвалентным и моноспецифическим).
Эпитоп представляет собой участок на поверхности молекулы антигена, с которым связывается одна молекула антитела. Обычно антиген имеет несколько или много разных эпитопов и вступает в реакцию со многими различными антителами. Термин, в частности, включает линейные эпитопы и конформационные эпитопы.
Эпитопное картирование представляет собой процесс идентификации сайтов связывания или эпитопов антител на их целевых антигенах. Эпитопы антител могут быть линейными или конформационными эпитопами. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот в белке. Конформационные эпитопы образуются из аминокислот, которые являются прерывистыми в последовательности белка, но которые объединяются при сворачивании белка в его трехмерную структуру.
Термин полиэпитопная специфичность относится к способности специфически связываться с двумя или более различными эпитопами на одной или разных мишенях. Как отмечалось выше, настоящее изобретение, в частности, включает антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА с полиэпитопной специфичностью, то есть антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА, связывающиеся с одним или более неперекрывающимися эпитопами на белке ПСМА, таком как ПСМА человека; и антитела, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА, связывающиеся с одним или более эпитопами на белке ПСМА и с эпитопом на другом белке, таком как, например, белок CD3. Термин неперекрывающийся эпитоп(ы) или неконкурентный эпитоп(ы) антигена определяется в данном документе как означающий эпитоп(ы), которые распознаются одним членом пары антигенспецифических антител, но не другим членом. Пары антител или антигенсвязывающие области, нацеленные на один и тот же антиген
- 13 046268 на полиспецифическом антителе, распознающие неперекрывающиеся эпитопы, не конкурируют за связывание с этим антигеном и способны одновременно связывать этот антиген.
Антитело связывает по существу тот же эпитоп, что и эталонное антитело, когда два антитела распознают идентичные или стерически перекрывающиеся эпитопы. Наиболее широко используемыми и быстрыми способами для определения того, связываются ли два эпитопа с идентичными или стерически перекрывающимися эпитопами, являются анализы конкурентного связывания, которые могут быть сконфигурированы во всем количестве различных форматов с использованием либо меченого антигена, либо меченого антитела. Обычно антиген иммобилизуют в 96-луночном планшете, и способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют с использованием радиоактивных или ферментных меток.
Термин валентный, в контексте данного документа, относится к указанному количеству сайтов связывания в молекуле антитела.
Моновалентное антитело имеет один сайт связывания. Таким образом, одновалентное антитело также является моноспецифическим.
Поливалентное антитело имеет два или более сайтов связывания. Таким образом, термины двухвалентный, трехвалентный и четырехвалентный относятся к наличию двух сайтов связывания, трех сайтов связывания и четырех сайтов связывания, соответственно. Таким образом, биспецифическое антитело по изобретению является по меньшей мере двухвалентным и может быть трехвалентным, четырехвалентным или иным образом многовалентным. Двухвалентное антитело в соответствии с вариантами осуществления изобретения может иметь два сайта связывания с одним и тем же эпитопом (т.е. двухвалентное, монопаратопное) или с двумя разными эпитопами (т.е. двухвалентное, бипаратопное).
Известно большое разнообразие способов и конфигураций белка и используется для получения биспецифических моноклональных антител (бсмкАт), триспецифических антител и тому подобного.
Термин биспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула или ТСА используется в данном документе для обозначения антителоподобных молекул, включающих, состоящих по существу или состоящих из трех полипептидных субъединиц, две из которых содержат, состоят по существу из или состоят из одной тяжелой цепи и одной легкой цепи моноклонального антитела, или функциональных антигенсвязывающих фрагментов таких цепей антитела, содержащих антигенсвязывающую область и по меньшей мере один домен СН. Данная пара тяжелая цепь / легкая цепь обладает специфичностью связывания в отношении первого антигена. Третья полипептидная субъединица содержит, состоит по существу или состоит из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего Fc-часть, содержащий домены СН2 и/или СН3, и/или СН4, в отсутствие домена СН1, и антигенсвязывающий домен, который связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп первого антигена, причем такой связывающий домен происходит из или имеет идентичность последовательности с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи антитела. Части такой вариабельной области могут кодироваться сегментами гена VH и/или VL, сегментами гена D и JH, или сегментами гена JL. Вариабельная область может кодироваться реаранжированными генными сегментами VHDJH, VLDJH, VHJL или VLJL. В белке ТСА используется антитело, содержащее только тяжелые цепи, как определено выше.
Термин химерный антигенный рецептор или CAR используется в данном описании в самом широком смысле для обозначения сконструированного рецептора, который прививает желаемую специфичность связывания (например, антигенсвязывающую область моноклонального антитела или другого лиганда) к охватывающему мембрану и внутриклеточному сигнальному доменам. Как правило, рецептор используется для прививки специфичности моноклонального антитела Т-клетке для создания химерных антигенных рецепторов (CAR). (J Natl Cancer Inst, 2015; 108(7):dvj439; and Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383). CAR-Т-клетки представляют собой Т-клетки, которые были генетически модифицированы для продукции искусственного Т-клеточного рецептора для применения в иммунотерапии. В одном варианте осуществления CAR-T-клетка означает терапевтическую Т-клетку, экспрессирующую трансген, кодирующий один или более химерных антигенных рецепторов, состоящих минимально из внеклеточного домена, трансмембранного домена и по меньшей мере одного цитозольного домена.
Термин человеческое антитело используется в данном документе для включения антител, имеющих вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Человеческие антитела по данному документу могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека, например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или с помощью соматической мутации in vivo. Термин человеческое антитело, в частности, включает антитела, содержащие только тяжелые цепи, имеющие последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, продуцируемые трансгенными животными, такими как трансгенные крысы или мыши, в частности UniAb™, продуцируемые UniRat™, как определено выше.
Под химерным антителом или химерным иммуноглобулином подразумевается молекула иммуноглобулина, содержащая аминокислотные последовательности по меньшей мере из двух разных локусов Ig, например, трансгенное антитело, содержащее часть, кодируемую локусом Ig человека, и часть,
- 14 046268 кодируемую локусом Ig крысы. Химерные антитела включают трансгенные антитела с нечеловеческими областями Fc или искусственными областями Fc, и человеческие идиотипы. Такие иммуноглобулины могут быть выделены из животных согласно изобретению, которые были сконструированы для получения таких химерных антител.
Используемый в данном документе термин эффекторная клетка относится к иммунной клетке, которая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в отличие от когнитивной и активационной фаз иммунного ответа. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы и выполняют специфические иммунные функции. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка, такая как естественная клетка-киллер, способна индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). Например, моноциты и макрофаги, которые экспрессируют FcR, участвуют в специфическом уничтожении клеток-мишеней и презентации антигенов другим компонентам иммунной системы или связывании с клетками, которые презентуют антигены. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка может фагоцитировать антиген-мишень или клетку-мишень.
Эффекторные клетки человека представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют рецепторы, такие как Т-клеточные рецепторы или FcR, и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, такие клетки экспрессируют по меньшей мере FcyRIII и осуществляют эффекторную функцию АЗКЦ. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют АЗКЦ, включают, естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; причем NK-клетки являются предпочтительными. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника, например, из крови или МКПК, как описано в данном документе.
Термин иммунная клетка используется в данном документе в самом широком смысле, включая, без ограничения, клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоциты (такие как В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Т-клетки (ЦТЛ)), клетки-киллеры, естественные клетки-киллеры (NK), макрофаги, моноциты, эозинофилы, полиморфно-ядерные клетки, такие как нейтрофилы, гранулоциты, тучные клетки и базофилы.
Эффекторные функции антитела относятся к той биологической активности, которая относится к области Fc (нативной последовательности области Fc или варианта аминокислотной последовательности области Fc) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов поверхности клетки, (например, В-клеточный рецептор, BCR) и т.д.
Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность и АЗКЦ соответствуют опосредованной клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на целевой клетке и, таким образом, приводят к лизису клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие АЗКЦ, естественные клетки-киллеры, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках приведена в таблице 3 на с. 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки активности АЗКЦ представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ АЗКЦ in vitro, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные клетки-киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнения, АЗКЦ-активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, в животной модели, например, согласно описанию в публикации dynes et al.. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
Комплементзависимая цитотоксичность или КЗЦ относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с распознаваемым антигеном. Для оценки активации комплемента, может быть выполнен анализ КЗЦ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Аффинность связывания относится к силе суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом) и ее связывающим партнером (например, антигеном). Если не указано иное, используемый в данном документе термин аффинность связывания относится к действительной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие в соотношении 1:1 между членами связывающей пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y в целом можно выразить константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена общепринятыми способами, известными в данной области техники. Низкоаффинные антитела обычно связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела, как правило, связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными.
Используемый в данном документе термин Kd или значение Kd относится к константе диссоциации, определенной методом интерферометрии BioLayer, с использованием прибора Octet QK384 (Fortebio Inc., Menlo Park, СА) в режиме кинетики. Например, сенсоры с антителом к Fc мыши загружают
- 15 046268 со слитым Fc-антигеном мыши и затем погружают в лунки, содержащие антитела, для измерения зависимых от концентрации скоростей (kon). Скорости диссоциации антител (koff) измеряют на последней стадии, когда сенсоры погружают в лунки, содержащие только буфер. Kd представляет собой соотношение koff/kon (подробнее см. Conception, J., et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009).
Термины лечение, лечить и тому подобное используются в данном документе для обозначения достижения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптомов и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного явления, связанного с этим заболеванием. Используемый в данном документе термин лечение охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего и включает: (а) предотвращение появления заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого это заболевание еще не диагностировано; (b) подавление заболевания, то есть прекращение его развития; или (с) облегчение заболевания, т.е. вызывание регресса заболевания. Терапевтический агент может быть введен до, во время или после начала заболевания или травмы. Лечение продолжающегося заболевания, при котором лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы пациента, представляет особый интерес. Такое лечение желательно проводить до полной потери функции в пораженных тканях. Терапия у субъекта может быть проведена во время симптоматической стадии заболевания, и в некоторых случаях после симптоматической стадии заболевания.
Термин терапевтически эффективное количество означает количество активного агента, которое необходимо для придания терапевтического эффекта у субъекта. Например, терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое вызывает, ослабляет или иным образом вызывает улучшение патологических симптомов, прогрессирования заболевания или физиологических состояний, связанных с заболеванием, или которое повышает устойчивость к расстройству.
Используемый в данном документе термин злокачественное новообразование предстательной железы относится к злокачественной опухоли железистого происхождения в предстательной железе.
Термин характеризуется экспрессией ПСМА в широком смысле относится к любому заболеванию или расстройству, при котором экспрессия ПСМА связана или вовлечена в один или более патологических процессов, которые характерны для данного заболевания или расстройства. Такие расстройства включают, но не ограничиваются ими, злокачественное новообразование предстательной железы.
Термины субъект, индивидуум и пациент используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения млекопитающего, которого оценивают на предмет лечения и/или которое подвергается лечению. В одном варианте осуществления млекопитающее является человеком. Термины субъект, индивидуум и пациент охватывают, без ограничения, индивидуумов, имеющих злокачественное новообразование, индивидуумов с аутоиммунными заболеваниями, патогенными инфекциями и тому подобное. Субъектами могут быть люди, но также могут быть и другие млекопитающие, в частности те млекопитающие, которые могут быть использованы в качестве лабораторных моделей заболеваний человека, например, мышь, крыса и т.д.
Термин фармацевтический состав относится к составу, который находится в такой форме, чтобы обеспечить биологическую активность активного ингредиента, чтобы быть эффективным, и который не содержит каких-либо дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться состав. Такие составы являются стерильными. Фармацевтически приемлемые эксципиенты (носители, адьюванты) являются таковыми, которые резонно могут вводиться субъекту-млекопитающему и обеспечивать эффективную дозу используемого активного ингредиента.
Стерильная композиция является асептической или свободной от, или практически не содержит любых живых микроорганизмов и их спор. Замороженная композиция является композицией при температуре ниже 0°С.
Стабильная композиция является таковой, в которой белок практически полностью сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность во время хранения. Предпочтительно, композиция практически полностью сохраняет свою физическую или химическую стабильность, а также свою биологическую активность. Период хранения в общем выбран на основании срока годности состава. Разнообразные техники для измерения стабильности белка известны в данной области техники и рассмотрены, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 2990) (1993). Стабильность может быть измерена при выбранной температуре для выбранного периода времени. Стабильность может быть оценена качественно и/или количественно различными способами, включая оценку образования агрегатов (например, с использованием эксклюзионной хроматографии, путем измерения мутности и/или путем визуального контроля); путем оценки гетерогенности заряда с помощью катионообменной хроматографии, капиллярного изоэлектрического фокусирования с детектированием непосредственно в капилляре (icIEF) или электрофореза в капиллярной зоне; анализ Nконцевой или С-концевой последовательности; масс-спектрометрический анализ; анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия для сравнения восстановленного и ин
- 16 046268 тактного антитела; анализ пептидной карты (например, триптический или LYS-C); оценку биологической активности или антигенсвязывающей функции антитела; и т.п. Нестабильность может включать в себя одно или более из следующего: агрегация, дезамидирование (например, дезамидирование Asn), окисление (например, окисление Met), изомеризация (например, изомеризация Asp), отсечение / гидролиз / фрагментация (например, фрагментация шарнирной области), образование сукцинимида, неспаренный цистеин(ы), удлинение N-конца, обработка С-конца, различия гликозилирования, и т.п.
II. Подробное описание.
Антитела к ПСМА.
Настоящее изобретение относится к семейству близкородственных антител, которые связываются с ПСМА человека. Антитела этого семейства содержат набор последовательностей CDR, как определено в данном документе и показано в табл. 1, и проиллюстрированы предложенными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 24-54, приведенными в таблице 2. Семейство антител обеспечивает ряд преимуществ, которые благоприятствуют применению их в качестве клинического(их) терапевтического(их) агента(ов). Антитела включают членов с диапазоном аффинностей связывания, позволяющих выбирать конкретную последовательность с желаемой аффинностью связывания.
Таблица 1
Уникальные аминокислотные последовательности CDR антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА
SEQ aa CDR1 | SEQ aa CDR2 | SEQ aa CDR3 |
GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 1) | IDYSGYT (SEQ ID NO: 11) | ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 18) |
GGSISSSNYF (SEQ ID NO: 2) | VDYSGYT (SEQ ID NO: 12) | AREPRIGYYYESSGYDSLDY (SEQ ID NO: 19) |
GGSISSNSYY (SEQ ID NO: 3) | IYDSGST (SEQ ID NO: 13) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
GFSFRSYG (SEQ ID NO: 4) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYDSSGYDSLDY (SEQ ID NO: 21) |
GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYDSSGYYSLDY (SEQ ID NO: 22) |
GFIFRSYG (SEQ ID NO: 6) | ISYDGSNK (SEQ ID NO: 16) | AREPRVGYYYETSGYYSLDY (SEQ ID NO: 23) |
GFSFSRYG (SEQ ID NO: 7) | ISYDGSNR (SEQ ID NO: 17) | |
GFSFTSYG (SEQ ID NO: 8) | ||
GFTFISYG (SEQ ID NO: 9) | ||
GFTFSSYG (SEQ ID NO: 10) |
Таблица 2
Аминокислотные последовательности вариабельного домена антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА
ID № клона | SEQ aa_FRl FR4 | SEQ ID NO. |
325920 | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIG SIDYSGYTYYNPSLQSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYNCARHK AATADFD YRGQGTLVTVS S | 24 |
346181 | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYFWGWIRQSPGKGLEWIG SIDYSGYTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYNCARHK AATADFD YRGQGTLVTVS S | 25 |
346165 | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIG SVDYSGYTYYNPSLQSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYNCARHK AATADFD YRGQGTLVTVS S | 26 |
346172 | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIG SIDYSGYTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYNCARHK AATADFD YRGQGTLVTVS S | 27 |
326109 | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNSYYWGWIRQSPGKGLEWLG SIYDSGSTHYNPSLKSRVIISGDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHKA ATADFD YRGQGTLVTVS S | 28 |
325867 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFRSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDYSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYDSLD YRGQGTLVTVS S | 29 |
325742 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV | 30 |
- 17 046268
AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDYSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYDSLDYRGQGTLVTVS S | ||
325748 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 31 |
325940 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFRSYGMHWVRQAPGKGPEWVA VIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 32 |
325836 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFRSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDYSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYDSSGYDSLDYRGQGTLVTVSS | 33 |
326027 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFRSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYDSSGYDSLDYRGQGTLVTVSS | 34 |
326087 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFRSYGMHWVRQAPGKGPEWVA VIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYDSSGYDSLDYRGQGTLVTVSS | 35 |
326084 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYDS SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 36 |
326028 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFRSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDYSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYDSSGYDSLDYRGQGTLVTVSS | 37 |
345497 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEGV AVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 38 |
326029 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEWV AVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRVGYYYETSGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 39 |
345461 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFTSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 40 |
345493 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 41 |
345436 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEGV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 42 |
345443 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 43 |
345490 | QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 44 |
345482 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 45 |
345485 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFRSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYC AREPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 46 |
345463 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFRSYGMHWVRQAPGKGPEWVA VIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 47 |
325932 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA | 48 |
- 18 046268
VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | ||
345505 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFISYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 49 |
345508 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGPEWV AVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 50 |
345480 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 51 |
326116 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEGV AVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDYSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYDSSGYDSLDYRGQGTLVTVSS | 52 |
345509 | QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 53 |
345444 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 54 |
345421 | QVQLVESVGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 55 |
345447 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEGVA VISYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARE PRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 56 |
345510 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYC AREPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 57 |
345438 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGPEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA REPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS S | 58 |
Подходящее антитело может быть выбрано из представленных в данном документе антител для разработки и терапевтического или другого применения, включая, без ограничения, применение в качестве биспецифического, например, как показано на фиг. 5, панелях А-С, или триспецифического антитела или части структуры CAR-T. На фиг. 5 панели А-С представлены иллюстрации полиспецифических антител к CD3 х ПСМА, где домен к ПСМА является одновалентным и моноспецифическим, двухвалентным и моноспецифическим или двухвалентным и биспецифическим (бипаратопным). Домен к CD3 содержит домен СН1 и спарен с легкой цепью, в то время как домены к ПСМА получены из антител, состоящих только из тяжелых цепей, и не содержат домен СН1 и не взаимодействуют с легкой цепью. В некоторых вариантах осуществления две тяжелые цепи разделяют с использованием, например, технологии выступы-во-впадины. Ссылаясь на антитела, изображенные на фиг. 5, на панели А показано биспецифическое антитело к CD3 х ПСМА, в котором связывающее плечо к ПСМА является одновалентным и моноспецифическим, а антигенсвязывающий домен плеча к ПСМА находится в одновалентной конфигурации, что означает, что присутствует только один антигенсвязывающий домен. На панели В изображено биспецифическое антитело CD3 х ПСМА, в котором связывающее плечо к ПСМА является двухвалентным и моноспецифическим, а антигенсвязывающий домен плеча к ПСМА находится в двухвалентной конфигурации, что означает, что есть два идентичных антигенсвязывающих домена, размещенных в тандеме. На панели С изображено биспецифическое антитело к CD3 х ПСМА, в котором связывающее плечо к ПСМА является двухвалентным и бипаратопным, а антигенсвязывающие домены плеча к ПСМА находятся в двухвалентной конфигурации.
Определение аффинности к белку-кандидату может быть выполнено с использованием способов, известных в данной области техники, таких как измерения Biacore. Члены семейства антител могут иметь аффинность к ПСМА с Kd, равным от около 10-6 до около 10’11, включая, без ограничения: от около 10-6 до около 10-10; от около 10-6 до около 10-9; от около 10-6 до около 10-8; от около 10-8 до около 10’11; от около 10-8 до около 10-10; от около 10-8 до около 10-9; от около 10-9 до около 10-11; от около 10-9 до около 10-10; или любому значению в этих диапазонах. Выбор аффинности может быть подтвержден при помощи биологической оценки в отношении модуляции, например, блокирования, биологической активности ПСМА, включая анализы in vitro, доклинические модели и клинические исследования, а также оценку потенциальной токсичности.
Члены семьи антител, описанные в данном документе, не являются перекрестно-реактивными с белком ПСМА яванского макака, но могут быть сконструированными для обеспечения перекрестной-реактивности с белком ПСМА яванского макака или белками ПСМА других видов животных, при необходимости.
Семейство ПСМА-специфических антител в данном документе включает домен VH, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека. Последовательности CDR могут быть
- 19 046268 расположены, например, в области около аминокислотных остатков 26-33; 51-58; и 97-116 для CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, предоставленных иллюстративных последовательностей вариабельной области, указанных в SEQ ID NO: 24-58. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что последовательности CDR могут находиться в других положениях, если выбрана другая каркасная последовательность, хотя, как правило, порядок последовательностей остается неизменным.
Последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 антител к ПСМА по данному изобретению могут охватываться следующими структурными формулами, где X обозначает вариабельную аминокислоту, которая может представлять собой вариабельную аминокислоту, как указано ниже.
CDR1
G G S I S S X1 X2 Y Х3 (SEQ ID NO: 67) где X1 представляет собой S или N;
Х2 представляет собой S или N; и
Х3 представляет собой Y или F; и
CDR2
Х4 Х5 X, S G X7 T (SEQ ID NO: 68) где Х4 представляет собой I или V;
Х5 представляет собой D или Y;
Х6 представляет собой Y или D; и
Х7 представляет собой Y или S; и
CDR3
ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 69).
Последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 антител к ПСМА по данному изобретению могут охватываться следующими структурными формулами, где X обозначает вариабельную аминокислоту, которая может представлять собой вариабельную аминокислоту, как указано ниже.
CDR1
G F X1 F Х2 Х3 Y G (SEQ ID NO: 70) где X1 представляет собой S или I, или Т;
Х2 представляет собой S или Т, или R, или I; и
Х3 представляет собой R или S; и
CDR2
I Х4 Y D G S N Х5 (SEQ ID NO: 71) где Х4 представляет собой W или S; и
Х5 представляет собой R или K; и
CDR3
AREPRX6GYYYX7X8SGYX9SLDY (SEQ ID NO: 72) где Х6 представляет собой I или V;
Х7 представляет собой Е или D;
Х8 представляет собой S или Т; и
Х9 представляет собой Y или D.
Типичные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 показаны в табл. 1 и 3.
- 20 046268
Таблица 3
Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 антитела, содержащего только тяжелые цепи, к ПСМА
ID № клона | SEQaaCDRl | SEQ_aa_CDR2 | SEQ_aa_CDR3 |
325920 | GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 1) | IDYSGYT (SEQ ID NO: 11) | ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 18) |
346181 | GGSISSSNYF (SEQ ID NO: 2) | IDYSGYT (SEQ ID NO: 11) | ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 18) |
346165 | GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 1) | VDYSGYT (SEQ ID NO: 12) | ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 18) |
346172 | GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 1) | IDYSGYT (SEQ ID NO: 11) | ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 18) |
326109 | GGSISSNSYY (SEQ ID NO: 3) | IYDSGST (SEQ ID NO: 13) | ARHKAATADFDY (SEQ ID NO: 18) |
325867 | GFSFRSYG (SEQ ID NO: 4) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYESSGYDSLDY (SEQ ID NO: 19) |
325742 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYESSGYDSLDY (SEQ ID NO: 19) |
325748 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
325940 | GFIFRSYG (SEQ ID NO: 6) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
325836 | GFSFRSYG (SEQ ID NO: 4) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYDSSGYDSLDY (SEQ ID NO: 21) |
326027 | GFSFRSYG (SEQ ID NO: 4) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYDSSGYDSLDY (SEQ ID NO: 21) |
326087 | GFIFRSYG (SEQ ID NO: 6) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYDSSGYDSLDY (SEQ ID NO: 21) |
326084 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYDSSGYYSLDY (SEQ ID NO: 22) |
326028 | GFSFRSYG (SEQ ID NO: 4) | ISYDGSNK (SEQ ID NO: 16) | AREPRIGYYYDSSGYDSLDY (SEQ ID NO: 21) |
345497 | GFSFSRYG (SEQ ID NO: 7) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
326029 | GFSFSRYG (SEQ ID NO: 7) | ISYDGSNK (SEQ ID NO: 16) | AREPRVGYYYETSGYYSLDY (SEQ ID NO: 23) |
345461 | GFSFTSYG (SEQ ID NO: 8) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345493 | GFSFSRYG (SEQ ID NO: 7) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345436 | GFSFSRYG (SEQ ID NO: 7) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345443 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345490 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345482 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345485 | GFSFRSYG (SEQ ID NO: 4) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345463 | GFIFRSYG (SEQ ID NO: 6) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
325932 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
- 21 046268
345505 | GFTFISYG (SEQ ID NO: 9) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345508 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345480 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
326116 | GFSFSRYG (SEQ ID NO: 7) | ISYDGSNK (SEQ ID NO: 16) | AREPRIGYYYDSSGYDSLDY (SEQ ID NO: 21) |
345509 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345444 | GFTFSSYG (SEQ ID NO: 10) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345421 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNR (SEQ ID NO: 15) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345447 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | ISYDGSNR (SEQ ID NO: 17) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345510 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
345438 | GFSFSSYG (SEQ ID NO: 5) | IWYDGSNK (SEQ ID NO: 14) | AREPRIGYYYES SGYYSLDY (SEQ ID NO: 20) |
В некоторых вариантах осуществления антитело к ПСМА содержит последовательность CDR1 любой из SEQ ID NO: 1-10. В конкретном варианте осуществления последовательность CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 2 или 7.
В некоторых вариантах осуществления антитело к ПСМА содержит последовательность CDR2 с любой из SEQ ID NO: 11-17. В конкретном варианте осуществления последовательность CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 11 или 15.
В некоторых вариантах осуществления антитело к ПСМА содержит последовательность CDR3 с любой из SEQ ID NO: 18-23. В конкретном варианте осуществления последовательность CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 18 или 20.
В дополнительном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, к ПСМА содержит последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2; последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11; и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18.
В дополнительном варианте осуществления антитело к ПСМА содержит последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7; последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15; и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20.
В дополнительном варианте осуществления антитело к ПСМА содержит любую из аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи с SEQ ID NO: 24-58 (табл. 2).
В еще одном варианте осуществления антитело к ПСМА содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи с SEQ ID NO: 25.
В еще одном варианте осуществления антитело к ПСМА содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи с SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления последовательность CDR в антителе к ПСМА по изобретению содержит одну или две аминокислотные замены относительно последовательности CDR1, CDR2 и/или CDR3 или набора последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 в любой из SEQ ID NO: 1-23 (табл. 1).
В некоторых вариантах осуществления антитело к ПСМА предпочтительно содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), в котором последовательность CDR3 имеет более или равную 80%, например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99% идентичность последовательности на аминокислотном уровне с последовательностью CDR3 любого из антител, чьи последовательности CDR3 представлены в табл. 1, и связывается с ПСМА.
В некоторых вариантах осуществления антитело к ПСМА предпочтительно содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), в котором полный набор CDR 1, 2 и 3 (объединенный) имеет более или равную восьмидесяти пяти процентам (85%) идентичность последовательности на аминокислотном уровне с CDR 1, 2 и 3 (объединенный) антител, чьи последовательности CDR представлены в таблице 1, и связывается с ПСМА.
В некоторых вариантах осуществления антитело к ПСМА предпочтительно содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), в котором полный набор CDR 1, 2 и 3 (объединенный) имеет более или равную восьмидесяти пяти процентам (85%) идентичность последовательности на аминокислотном уровне с CDR 1, 2 и 3 (объединенных) антител, чьи последовательности CDR представлены в таблице 3, и связывается с ПСМА.
В некоторых вариантах осуществления антитело к ПСМА содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи с по меньшей мере около 80% идентичности, по меньшей мере 85% идентичности, по меньшей мере 90% идентичности, по меньшей мере 95% идентичности, по меньшей мере 98% идентичности или по меньшей мере 99% идентичности с любой из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 24-58 (показано в табл. 2) и связывается с ПСМА.
- 22 046268
В некоторых вариантах осуществления представлены биспецифические или полиспецифические антитела, которые могут иметь любую из конфигураций, обсуждаемых в данном документе, включая, без ограничения, биспецифическую трехцепочечную антителоподобную молекулу (ТСА). В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело может содержать по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, обладающую специфичностью связывания в отношении ПСМА, и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую специфичность связывания в отношении белка, отличного от ПСМА. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую по меньшей мере два антигенсвязывающих домена, где каждый из антигенсвязывающих доменов имеет специфичность связывания в отношении ПСМА. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело может содержать пару тяжелая цепь / легкая цепь, которая имеет специфичность связывания в отношении первого антигена (например, CD3), и тяжелую цепь из антитела, содержащего только тяжелые цепи. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержит Fc-часть, содержащую домены СН2 и/или СН3 и/или СН4, в отсутствие домена СН1. В одном конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит пару тяжелая цепь / легкая цепь, которая имеет специфичность связывания в отношении антигена на эффекторной клетке (например, белок CD3 на Тклетке), и тяжелую цепь из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего антигенсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении ПСМА.
В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело содержит CD3-связывающий домен VH, который спарен с вариабельным доменом легкой цепи. В определенных вариантах осуществления легкая цепь представляет собой фиксированную легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающий домен VH содержит последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 61 в каркасе VH человека. В некоторых вариантах осуществления фиксированная легкая цепь содержит последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 64 в каркасе VL человека. Вместе CD3-связывающий домен VH и вариабельный домен легкой цепи имеет аффинность связывания в отношении CD3. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающий домен VH содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающий домен VH содержит последовательность, имеющую по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или по меньшей мере около 99% идентичности с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления фиксированная легкая цепь содержит последовательность вариабельной области легкой цепи с SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления фиксированная легкая цепь содержит последовательность, имеющую по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или по меньшей мере около 99% идентичности с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи с SEQ ID NO: 66.
Полиспецифические антитела, содержащие описанный выше CD3-связывающий домен VH и вариабельный домен легкой цепи, обладают полезными свойствами, например, как описано в опубликованной публикации заявки РСТ № WO2018/052503, описание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки. Любые из описанных в данном документе полиспецифических антител и антигенсвязывающих доменов, имеющих аффинность связывания в отношении ПСМА, могут быть объединены с CD3-связывающими доменами и фиксированными доменами легкой цепи, описанными в данном документе (см., например, табл. 4 и табл. 5), как а также дополнительные последовательности, такие как представленные в табл. 6 и табл. 7, для создания полиспецифических антител, имеющих аффинность связывания в отношении одной или более эпитопов ПСМА, а также в отношении CD3.
Таблица 4
Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелых и легких цепей к CD3
SEQ aa CDR1 | SEQ aa CDR2 | SEQ aa CDR3 | |
Тяжелая цепь | GFTFDDYA (SEQ ID NO: 59) | ISWNSGSI (SEQ ID NO: 60) | AKDSRGYGDYRLGGAY (SEQ ID NO: 61) |
Легкая цепь | QSVSSN (SEQ ID NO: 62) | GAS (SEQ ID NO: 63) | QQYNNWPWT (SEQ ID NO: 64) |
Таблица 5
Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи к CD3
VH | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYC AKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) |
VL | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 66) |
- 23 046268
Таблица 6
Последовательности областей Fc человеческих IgG1 и IgG4
IgGl человека (UniProt № Р01857) | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 75) |
IgG4 человека (UniProt №Р01861) | ASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO: 76) |
Человеческий IgGl с молчащей мутацией (область Fc) | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQIYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 77) |
Человеческий IgG4 с молчащей мутацией (область Fc) | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKIYTCNVDHKPSNTKVDK RVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 78) |
Таблица 7
Дополнительные последовательности
Последовательност ь константной области легкой цепи к CD3 (легкая каппа-цепь) | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKWACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 79) |
Последовательност ь тяжелой цепи к CD3 (VH + Fc IgGl ДТ) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLE WVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 80) |
- 24 046268
Последовательност ь тяжелой цепи к CD3 (с подвергутым сайленсингу Fc IgGl) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLE WVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 81) |
Последовательност ь константной области тяжелой цепи к CD3 (с Fc IgG4 ДТ) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLE WVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 82) |
Последовательност ь константной области тяжелой цепи к CD3 (с подвергутым сайленсингу Fc IgG4) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLE WVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 83) |
Подвергнутый сайленсингу IgG4 (шарнир - СН2 СНЗ; впадина (S228P, F234A, L235A; T366S, L368A, Y407V)) | ESI<YGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPI<PI<DTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 84) |
Подвергнутый сайленсингу IgG4 (шарнир - СН2 СНЗ; выступ (S228P, F234A, L235A; T366W)) | ESI<YGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPI<PI<DTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 85) |
Полноразмерная легкая цепь к CD3 (VL + каппа CL) | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLI YGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPW TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 86) |
- 25 046268
Полноразмерная тяжелая цепь к CD3 (VH + подвергнутая сайленсингу Fc IgG4 + выступ (S228P, F234A, L235A; T366W)) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLE WVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 87) |
Моновалентная тяжелая цепь к ПСМА (ID клона 346181) + подвергнутый сайленсингу Fc IgG4, впадина (S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYFWGWIRQSPGKGLE WIGSIDYSGYTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYN CARHKAATADFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 88) |
Двухвалентный тяжелая цепь к ПСМА (ID клона 346181) + подвергнутый сайленсингу Fc IgG4, впадина (S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYFWGWIRQSPGKGLE WIGSIDYSGYTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYN CARHKAATADFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQLQLQESGPGLV KPSETLSLTCTVSGGSISSSNYFWGWIRQSPGKGLEWIGSIDYSGYTYY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYNCARHKAATADFD YRGQGTLVTVSSESI<YGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPI<PI<DTLMISR TPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLGK (SEQ ID NO: 89) |
Моновалентная тяжелая цепь к ПСМА (ID клона 345497) + подвергнутый сайленсингу Fc IgG4, впадина (S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLE GVAVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYC AREPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS SESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWW DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 90) |
Двухвалентная тяжелая цепь к ПСМА (ID клона 345497) + подвергнутый сайленсингу Fc IgG4, впадина (S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLE GVAVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREPRIGYYYESSGYYSLDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQV QLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEGV AVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YC AREPRIGYYYES SGYYSLDYRGQGTLVTVS SESKYGPPCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 91) |
- 26 046268
Двухвалентная тяжелая цепь к ПСМА (ID клона 346181 х ID клона 345497) + подвергнутый сайленсингу Fc IgG4, впадина (S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYFWGWIRQSPGKGLE WIGSIDYSGYTYYNPSL1<SRVTISVDTSI<NQFSL1<LSSVTAADTAVYN CARHKAATADFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVV QPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEGVAVIWYDGSNR YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPRIGYY YESSGYYSLDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 92) |
Двухвалентная тяжелая цепь к ПСМА (ID клона 345497 х ID клона 346181) + подвергнутый сайленсингу Fc IgG4, впадина (S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSRYGMHWVRQAPGKGLE GVAVIWYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREPRIGYYYESSGYYSLDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQL QLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYFWGWIRQSPGKGLEWIG SIDYSGYTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYNCAR HKAATADFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 93) |
В некоторых вариантах осуществления представлены биспецифические или полиспецифические антитела, которые могут иметь любую из конфигураций, обсуждаемых в данном документе, включая, без ограничения, биспецифическую трехцепочечную антителоподобную молекулу (ТСА). В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело может содержать по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, обладающую специфичностью связывания в отношении ПСМА и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую специфичность связывания в отношении белка, отличного от ПСМА. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело может содержать пару тяжелая цепь/легкая цепь, которая обладает специфичностью связывания в отношении первого антигена, и тяжелую цепь из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего Fc-часть, содержащую СН2 и/или СН3 и/или домены СН4, в отсутствие домена СН1, и антигенсвязывающего домена, который связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп первого антигена. В одном конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит пару тяжелая цепь/легкая цепь, которая имеет специфичность связывания в отношении антигена на эффекторной клетке (например, белок CD3 на Т-клетке), и тяжелую цепь из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего антигенсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении ПСМА.
В некоторых вариантах осуществления, когда антитело по изобретению представляет собой биспецифическое антитело, одно плечо антитела (один связывающий фрагмент или одна связывающая единица) является специфичным в отношении ПСМА человека, в то время как другое плечо может быть специфичным в отношении клеток-мишеней, ассоциированных с опухолью антигенов, нацеливающих антигенов, например, интегринов и т.д., антигенов патогенов, белков контрольных точек и т.п. Клеткимишени, в частности, включают раковые клетки, включая, без ограничения, клетки солидных опухолей, например, опухолей предстательной железы, как обсуждается ниже. В некоторых вариантах осуществления одно плечо антитела (один связывающий фрагмент или одна связывающая единица) является специфичным в отношении ПСМА человека, тогда как другое плечо является специфичным в отношении CD3.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит полипептид легкой цепи к CD3, содержащий последовательность SEQ ID NO: 66, связанную с последовательностью SEQ ID NO: 79, полипептид тяжелой цепи к CD3, содержащий последовательность любой из SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 84 или 85, и полипептид тяжелой цепи к ПСМА, содержащий последовательность любой из SEQ ID NO: 24-58, в одновалентной или двухвалентной конфигурации, связанную с последовательностью любой из SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 84 или 85. Эти последовательности можно комбинировать различными способами для получения биспецифического антитела желаемого подкласса IgG, например, IgG1, IgG4, подвергнутого сайленсингу IgG1, подвергнутого сайленсингу IgG4. В одном предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой ТСА, содержащую первый полипептид, содержащий SEQ ID NO: 86, второй полипептид, содержащий SEQ ID NO: 87, и третий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91, 92 или 93. В одном предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой ТСА, состоящую из первого полипептида, состоящего из SEQ ID NO: 86, второго полипептида, состоящего из SEQ ID NO: 87, и третьего полипептида, состоящего из SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91, 92 или 93.
В объем изобретения входят различные форматы полиспецифических антител, включая, без ограничения, одноцепочечные полипептиды, двухцепочечные полипептиды, трехцепочечные полипептиды, четырехцепочечные полипептиды и их кратные им полипептиды. Полиспецифические антитела в данном документе, в частности, включают полиспецифические (например, биспецифические) Т-клеточные антитела, связывающиеся с ПСМА и CD3 (антитела к ПСМА х CD3). Такие антитела вызывают сильное опосредованное Т-клетками уничтожение клеток, экспрессирующих ПСМА.
- 27 046268
Получение антител к ПСМА.
Антитела по настоящему изобретению можно получить способами, известными в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела продуцируются трансгенными животными, включая трансгенных мышей и крыс, предпочтительно крыс, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов нокаутированы или отключены. В предпочтительном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению продуцируются в UniRat™. У UniRat™ гены эндогенного иммуноглобулина подвергнуты сайленсингу, и используется транслокус тяжелой цепи иммуноглобулина человека для экспрессии разнообразного, оптимизированного естественным образом репертуара полностью человеческих HCAb. В то время как эндогенные локусы иммуноглобулина у крыс могут быть нокаутированы или подвергнуты сайленсингу с использованием различных технологий, в UniRat™ для инактивации эндогенного J-локуса тяжелой цепи крысы, локуса Ск легкой цепи и локуса Ολ легкой цепи была использована технология с использованием (эндо)нуклеазы с цинковыми пальцами (ZNF). Конструкции ZNF для микроинъекций в ооциты могут продуцировать нокаутные (KO) по IgH и IgL линии. Подробнее см., например, Geurts et al., 2009, Science 325:433. Characterization of Ig heavy chain knockout rats has been reported by Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941. Преимущества технологии ZNF заключаются в том, что негомологичное соединение концов для сайленсинга гена или локуса посредством делеций до нескольких т.п.н. также может обеспечивать сайт-мишень для гомологичной интеграции (Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67). Человеческие антитела, содержащие только тяжелые цепи, продуцируемые в UniRat™, называются UniAb™ и могут связывать эпитопы, которые нельзя атаковать с помощью обычных антител. Их высокая специфичность, аффинность и небольшой размер делают их идеальными для моно- и полиспецифических применений.
В дополнение к UniAb™, в частности, в данный документ включены антитела, содержащие только тяжелые цепи, лишенные верблюжьего каркаса и мутаций VHH, и их функциональные области VH. Такие антитела, содержащие только тяжелые цепи, могут, например, быть продуцированы у трансгенных крыс или мышей, которые содержат локусы генов, полностью состоящих только из тяжелых цепей человека, как описано, например, в WO2006/008548, но и у других трансгенных млекопитающих, таких как кролик, морская свинка, также можно использовать крыс, причем предпочтительны крысы и мыши. Антитела, содержащие только тяжелые цепи, включая их функциональные фрагменты VHH или VH, также могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК путем экспрессии кодирующей нуклеиновой кислоты в подходящем эукариотическом или прокариотическом хозяине, включая, например, клетки млекопитающих (например, клетки СНО), Е. coli или дрожжи.
Домены антител, содержащих только тяжелые цепи, сочетают в себе преимущества антител и низкомолекулярные лекарственные средства: могут быть одновалентными или многовалентными; обладают низкой токсичностью; и экономически эффективны в производстве. Из-за их небольшого размера эти домены просты в применении, включая пероральное или местное введение, характеризуются высокой стабильностью, включая стабильность в желудочно-кишечном тракте; и их период полужизни может быть адаптирован к желаемому применению или показаниям. Кроме того, домены VH и VHH HCAb могут быть получены экономически эффективным способом.
В конкретном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, согласно данному изобретению, включая UniAb™, имеют нативный аминокислотный остаток в первом положении области FR4 (аминокислотное положение 101 согласно системе нумерации Kabat), замещенный другим аминокислотным остатком, который способен разрушать экспонированный на поверхности гидрофобный участок, содержащий или связанный с нативным аминокислотным остатком в этом положении. Такие гидрофобные участки, как правило, скрыты на поверхности взаимодействия с константной областью легкой цепи антитела, но становятся доступными на поверхности в HCAb и, по меньшей мере частично, служат для нежелательной агрегации и ассоциации легкой цепи HCAb. Замещенный аминокислотный остаток предпочтительно является заряженным и более предпочтительно положительно заряженным, например, лизином (Lys, K), аргинином (Arg, R) или гистидином (His, H), предпочтительно аргинином (R). В предпочтительном варианте осуществления антитела, содержащие только тяжелые цепи, полученные от трансгенных животных, содержат мутацию Trp в Arg в положении 101. Получаемые в результате HCAb предпочтительно обладают высокой аффинностью связывания с антигеном и растворимостью в физиологических условиях в отсутствие агрегации.
В рамках настоящего изобретения были идентифицированы человеческие антитела IgG, содержащие только тяжелые цепи, к ПСМА с уникальными последовательностями от животных UniRat™ (UniAb™), которые связываются с ПСМА человека в анализах белков и связывания клеток на основе ИФА. Идентифицированные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) положительны в отношении связывания белка ПСМА человека и/или связывания с ПСМА+ клетками, и все они отрицательны в отношении связывания с клетками, которые не экспрессируют ПСМА; см., например, табл. 8.
Антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые связываются с неперекрывающимися эпитопами на белке ПСМА, например, UniAb™, можно идентифицировать с помощью анализов конкурентно
- 28 046268 го связывания, таких как иммуноферментные анализы (ИФА) или анализы конкурентного связывания на основе проточной цитометрии. Например, можно использовать конкуренцию между известными антителами, связывающимися с антигеном-мишенью, и представляющим интерес антителом. Используя этот подход, можно разделить набор антител на те, которые конкурируют с эталонным антителом, и те, которые не конкурируют. Неконкурирующие антитела идентифицируются как связывающиеся с отдельным эпитопом, который не перекрывается с эпитопом, связанным эталонным антителом. Часто одно антитело иммобилизуют, антиген связывается, а второе, меченое (например, биотинилированное) антитело тестируют в анализе на основе ИФА на способность связывать захваченный антиген. Это также можно сделать с помощью платформ для поверхностного плазмонного резонанса (НИР), включая ProteOn XPR36 (BioRad, Inc), Biacore 2000 и Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences) и системе визуализации для НИР МХ96 (Ibis technologies BV), a также на других платформах для биослойной интерферометрии, таких как Octet Red384 и Octet HTX (ForteBio, Pall Inc). Для получения дополнительных сведений см. Примеры в данном документе.
Как правило, антитело конкурирует с эталонным антителом, если оно вызывает примерно 15100% снижение связывания эталонного антитела с антигеном-мишенью, как определено стандартными методами, например, с помощью анализов конкурентного связывания, описанных выше. В различных вариантах осуществления относительное ингибирование составляет по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или выше.
Фармацевтические композиции, применение и способы лечения
Другим аспектом данного изобретения является предложение фармацевтических композиций, содержащих одно или более антител по настоящему изобретению в смеси с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемые носители, используемые в данном документе, например, но не ограничиваются ими, адъюванты, твердые носители, вода, буферы или другие носители, используемые в данной области для хранения терапевтических компонентов или их комбинаций.
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело, содержащее только тяжелые цепи, (например, UniAb™), которое связывается с НСМА. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит полиспецифическое (включая биспецифическое) антитело, содержащее только тяжелые цепи, (например, UniAb™) со специфичностью связывания в отношении двух или более неперекрывающихся эпитопов на белке НСМА. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит полиспецифическое (включая биспецифическое и ТСА) антитело, содержащее только тяжелые цепи, (например, UniAb™) со специфичностью связывания с НСМА и со специфичностью связывания с мишенью связывания на эффекторной клетке (например, мишенью связывания на Т-клетке, такой как, например, белок CD3 на Т-клетке).
Фармацевтические композиции антител, используемые в соответствии с настоящим изобретением, получают для хранения путем смешивания белков, имеющих желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), например, в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Нриемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (НЭГ).
Фармацевтические композиции для парентерального введения предпочтительно стерильны и по существу изотоничны и произведены согласно условиям правил производства и контроля качества лекарственных средств (GMP). Фармацевтические композиции могут быть предложены в единичной дозированной форме (например, дозировка для единичного введения). Состав зависит от выбранного пути введения. Антитела описанные в данном документе могут вводиться посредством внутривенной инъекции или инфузии, или подкожно. Для инъекционного введения, антитела описанные в данном документе могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически-совместимых буферах
- 29 046268 для уменьшения дискомфорта в месте инъекции. Раствор может содержать носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы как описано выше. В качестве альтернативы, антитела могут быть лиофилизированы для смешивания с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед использованием.
Составы антител описаны, например, в патенте США № 9034324. Подобные составы могут быть использованы для антител, содержащих только тяжелые цепи, включая UniAb™, по данному изобретению. Составы антител для подкожного введения описаны, например, в патентах US20160355591 и US20160166689.
Способы применения.
Антитела к ПСМА и фармацевтические композиции, описанные в данном документе, можно применять для лечения заболеваний и патологических состояний, характеризующихся экспрессией ПСМА, включая, без ограничения, патологические состояния и заболевания, описанные далее в данном документе.
ПСМА представляет собой трансмембранный белок типа II, который экспрессируется в ткани эпителия предстательной железы и его экспрессия усиливается в злокачественном новообразовании предстательной железы и в новой сосудистой сети солидных опухолей. Он также экспрессируется на низких уровнях в нормальных тканях, таких как мозг, почки и слюнные железы, но его избыточная экспрессия в злокачественной ткани предстательной железы делает его привлекательной мишенью для терапевтического лечения злокачественного новообразования предстательной железы. Он также может быть актуален для терапии или визуализации солидных опухолей, учитывая его высокую экспрессию в злокачественных новообразованных сосудах. Моноклональные антитела, конъюгаты антитело-лекарственное средство и Т-клетки с химерным антигенным рецептором, нацеленные на ПСМА, были описаны для лечения метастатического злокачественного новообразования предстательной железы (Hernandez-Hoyos et al., 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al., 2014, PMID: 25327986, Serganova et al., 2016, PMID: 28345023). Кроме того, радионуклидные конъюгаты, специфичные для ПСМА, исследуют в отношении визуализации и лечения злокачественного новообразования предстательной железы (например, Hofman et al., 2018 PMID: 29752180).
В одном аспекте указанные в данном документе антитела к ПСМА (например, UniAb™) и фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения расстройств, характеризующихся экспрессией ПСМА, включая, без ограничения, злокачественное новообразование предстательной железы и солидные опухоли.
Эффективные дозы композиций согласно данному изобретению для лечения заболевания варьируются в зависимости от многих различных факторов, включая способы введения, место назначения, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, вводятся ли другие лекарственные препараты, и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, но млекопитающие, отличные от человека, также могут поддаваться лечению, например, домашние животные, такие как собаки, кошки, лошади и т.д., лабораторные млекопитающие, такие как кролики, мыши, крысы и т.д., и тому подобное. Для оптимизации безопасности и эффективности можно подбирать лекарственные дозировки.
Уровни дозировки могут быть легко определены обычным квалифицированным врачом и могут быть изменены при необходимости, например, при необходимости изменения реакции субъекта на терапию. Количество действующего вещества, которое можно комбинировать с материалами носителя для получения единичной лекарственной формы, варьируется в зависимости от хозяина, который поддается лечению, и конкретного способа введения. Стандартные лекарственные формы обычно содержат от около 1 мг до около 500 мг действующего вещества.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическая дозировка агента может составлять от около 0,0001 до 100 мг/кг и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг от массы тела хозяина. Например, дозировка может составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в пределах 1-10 мг/кг. Иллюстративный режим лечения включает введение один раз каждые две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев. Терапевтические вещества по настоящему изобретению обычно вводят несколько раз. Интервалы между однократными дозами могут быть еженедельными, ежемесячными или ежегодными. Интервалы также могут быть нерегулярными, на что указывает измерение уровня терапевтического вещества в крови пациента. Альтернативно, терапевтические вещества по настоящему изобретению можно вводить в виде композиции с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полужизни полипептида у пациента.
Как правило, композиции готовят в виде инъекционных препаратов, либо в виде жидких растворов, либо суспензий; также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Фармацевтические композиции описанные в данном документе подходят для внутривенного или подкожного введения, непосредственно или после восстановления из твердой (т.е., лиофилизированной) композиции. Препарат также может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы или микрочастицы, такие как полилактид, полигликолид или сополи
- 30 046268 мер, для усиления адъювантного эффекта, как описано выше. Langer, Science 249: 1527, 1990 и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Агенты согласно данному изобретению можно вводить в форме депо-инъекции или препарата имплантата, который может быть составлен таким образом, чтобы обеспечить длительное или пульсирующее высвобождение действующего вещества. Фармацевтические композиции, как правило, составлены как стерильные, практически изотонические и полностью соответствующие всем нормам Правил производства и контроля качества лекарственных средств (GMP) Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
Токсичность антител и структур антител, описанных в данном документе, может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, путем определения LD50 (доза, летальная для 50% популяции) или LD100 (доза, летальная для 100% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектом является терапевтическим показателем. Данные, полученные из этих анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы при составлении диапазона доз, который не токсичен для применения у людей. Дозировка антител, описанных в данном документе, предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают эффективную дозу с небольшой токсичностью или без нее. Дозировка может варьироваться в пределах данного диапазона в зависимости от используемой дозы и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны индивидуально врачом с учетом состояния пациента.
Композиции для введения обычно содержат антитело или другой абляционный агент, растворенный в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Могут быть использованы различные водные носители, например, забуференный солевой раствор и тому подобное. Данные растворы являются стерильными и, как правило, не содержат нежелательных веществ. Данные композиции могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными способами стерилизации. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения их к физиологическим условиям, такие как регулирующие рН агенты и буферные агенты, регулирующие токсичность агенты и тому подобное, например ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и тому подобное. Концентрация активного агента в данных составах может варьироваться в широких пределах и будет выбираться в основном на основе объемов жидкости, вязкости, массы тела и тому подобного в соответствии с конкретным выбранным способом введения и потребностями пациента (например, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980) и Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al, eds., 1996)).
Также в объем изобретения входят наборы, содержащие активные агенты и их составы, изобретения и инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный компонент, например, химиотерапевтический препарат и др. Наборы, как правило, включают этикетку, указывающую на предполагаемое применение содержимого набора. Используемый в данном документе термин этикетка включает любые письменные или записанные материалы, поставляемые в наборе или вместе с ним, или иным образом сопровождающие набор.
Теперь, когда изобретение полностью описано, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от сущности или объема изобретения.
Примеры
Материалы и способы.
Пример 1. Иммунизация UniRat™ рекомбинантным человеческим ПСМА.
Двенадцать животных UniRat™ иммунизировали рекомбинантным человеческим белком ПСМА, слитым с His-меткой (R&D Systems, кат. №: 4234-ZN). Животных иммунизировали дважды в неделю в течение восьми недель. После 35-дневного курса иммунизации у крыс собирали сыворотку для определения титров в сыворотке.
Результаты для титров в сыворотке.
Сводная информация о титрах в сыворотке приведена на фиг. 1, панелях А-В. На графиках, изображенных на фиг. 1, панелях А-В, каждая линия представляет отдельное животное. На легендах графиков показан идентификационный номер каждого отдельного животного. Связывающую активность для серии разведений сыворотки по 12 точкам тестировали с помощью ИФА против белка ПСМА человека с Hisметкой и нецелевого белка с His-меткой. Среди этой группы животных наблюдали ряд уровней реактивности сыворотки с белком ПСМА человека. Не наблюдали сывороточного ответа на нецелевой белок с His-меткой.
Пример 2. Анализ методом проточной цитометрии связывания с положительными и отрицательными по ПСМА клетками UniAb™ к ПСМА.
Связывание с ПСМА-положительными клетками оценивали с помощью проточной цитометрии (Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore) с использованием линии клеток LNCaP (АТСС: CRL-1740), линии клеток 22Rv1 (ATCC CRL-2505), линии клеток РС3 (АТСС CRL-1435), стабильно трансфицированной для экспрессии ПСМА человека, или линии клеток DU-145 (АТСС НТВ-81). Вкратце, 50000 клеток
- 31 046268 мишеней окрашивали серией разведений очищенного UniAb™ в течение 30 минут при 4°С. После инкубации клетки дважды промывали буфером для проточной цитометрии (1X PBS, 1 % БСА, 0,1 % NaN3) и окрашивали козьим F(ab')2 антителом к человеческому IgG, конъюгированным с R-фикоэритрином (РЕ) (Southern Biotech, кат. № 2042-09) для обнаружения связанных с клетками антител. После 20-минутной инкубации при 4°С клетки дважды промывали буфером для проточной цитометрии и измеряли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) с помощью проточной цитометрии. СИФ клеток, окрашенных только вторичным антителом, использовали для определения фонового сигнала, а связывание каждого антитела преобразовывали в значение кратности превышения фонового сигнала. Связывание с положительными по ПСМА яванского макака определяли с использованием того же протокола со следующими модификациями: клетки-мишени были получены из клеток Freestyle 293-F (ThermoFisher R79007), транзиентно трансфицированных для экспрессии внеклеточного домена ПСМА яванского макака. В некоторых экспериментах значения ЕС50 рассчитывали с помощью GraphPad Prism 7.
В табл. 8 приведена активность связывания с мишенью нескольких антител, содержащих только тяжелые цепи, к ПСМА (HCAb), описанных в данном документе. В столбце 1 показан ID клона HCAb. В столбце 2 показано связывание с клетками LNCaP, измеренное виде кратности превышения фонового сигнала СИФ.
Таблица 8
Связывание с линией клеток, экспрессирующих ПСМА
Столбец 1: ID КЛОНА | Столбец 2: LNCaP |
325920 | 282 |
346181 | 264 |
346165 | 243 |
346172 | 216 |
326109 | 25 |
325867 | 210 |
325742 | 200 |
325748 | 193 |
325940 | 169 |
325836 | 163 |
326027 | 138 |
326087 | 129 |
326084 | 125 |
326028 | 117 |
345497 | 112 |
326029 | 109 |
345461 | 102 |
345493 | 101 |
345436 | 87 |
345443 | 84 |
345490 | 80 |
345482 | 80 |
345485 | 71 |
345463 | 68 |
325932 | 64 |
345505 | 59 |
345508 | 55 |
345480 | 47 |
326116 | 38 |
345509 | 37 |
345444 | 23 |
345421 | 22 |
345447 | 14 |
345510 | 13 |
345438 | 13 |
Различия в связывании с ПСМА яванского макака, как показано на фиг. 2, панели А и В, подтверждает различие в эпитопе ПСМА человека, распознаваемом HCAb 346181 и 345497.
Пример 3. Связывание рекомбинантных белков с помощью биослойной интерферометрии (BLI).
Используя биослойную интерферометрию, оценивали конкуренцию за связывание между двумя семействами антител, членами которых являются клон ID 345497 и клон ID 346181. Анализ методом эпитоп-специфической сортировки антиген-антитело выполняли на Octet QK-384 (ForteBio). Вкратце, сенсоры для захвата пентагистидиновой последовательности (HIS1K) (Пента-HIS, описанные как SEQ ID NO: 95) использовали для иммобилизации антигена - рекомбинантного человеческого ПСМА (R&D Systems, кат. №: 4234-ZN) в течение 120 секунд. После определения базового уровня сенсоры погружали в растворы, содержащие антитело 1 (325867), на 300 с, а другой базовый уровень устанавливали в течение
- 32 046268 секунд. Затем сенсоры погружали в лунки, содержащие либо антитело 1 в качестве положительного контроля для блокирования, либо антитело 2 (325920). Скорости ассоциации и диссоциации измеряли в течение 300 и 600 секунд, соответственно. Анализ данных выполняли с помощью Octet Data Analysis HT v11.0 (ForteBio). Как показано на фиг. 3, 325920 связывает белок ПСМА, предварительно связанный с антителом 325867, что свидетельствует о том, что эти два антитела распознают неперекрывающиеся эпитопы на ПСМА. Сдвиг сигнала связывания выражается в нанометрах.
Пример 4. Композиция бипаратопных и двухвалентных антител к ПСМА.
Как показано в табл. 9, клон ID 350123 состоит из последовательности клона ID 346181, связанной с последовательностью клона ID 345497 через мостиковую последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 74). Клон ID 350122 состоит из двух повторов клона ID 346181, соединенных одной и той же линкерной последовательностью. Клон ID 350123 является бипаратопным, поскольку он состоит из двух доменов к ПСМА, распознающих разные эпитопы на ПСМА. Клон ID 350122 является двухвалентным, но не бипаратопным, поскольку он состоит из одного и того же домена к ПСМА в тандеме. Схематические иллюстрации различных антител к ПСМА х CD3 показаны на фиг. 5, панели А-С.
Таблица 9
Описание аминокислотной последовательности бипаратопных и двухвалентных антител к ПСМА
ID клона | Последовательность 1 | Линкерная последовательность | Последовательность 2 |
350123 | 346181 | GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 74) | 345497 |
350122 | 346181 | GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 74) | 346181 |
Пример 5. Определение аффинности к ПСМА человека, экспрессируемому на клеточной поверхности.
Аффинность к ПСМА клеточной поверхности определяли при помощи анализа Скэтчарда с использованием линии клеток карциномы предстательной железы человека 22Rv1. Сначала полиспецифические антитела к ПСМА х CD3 были помечены Alexa Fluor 488 с использованием набора Alexa Fluor 488 5-SDP Ester (ThermoFisher A30052). Связывание с 22Rvl затем оценивали с помощью проточной цитометрии (Guava easyCyte 8НТ, EMD Millipore). Вкратце, 100000 клеток-мишеней окрашивали серией разведений полиспецифических антител, меченных Alexa Fluor 488, в течение 1 ч при 4°С. После инкубации клетки дважды промывали буфером для проточной цитометрии и измеряли среднюю интенсивность флуоресценции с помощью проточной цитометрии.
Чтобы получить стандартную кривую для расчета молекул эквивалентного растворимого флуорохрома (MESF), совокупности шариков с MESF от Bangs Lab Quantum Alex Fluor 488 с 1 по 4 объединяли в одной пробирке и запускали на Guava easyCyte 8HT. Пустые шарики анализировали в отдельной пробирке. СИФ каждой совокупности шариков измеряли в FITC-канале. Линейная регрессия Log10 (СИФ) против Log10 (MESF) была построена с использованием GraphPad Prism 7.
СИФ каждого экспериментального образца интерполировали на калибровочную кривую, и MESF определяли для каждого образца. Затем рассчитывали среднее количество антител, связанных на клетку (ABC), путем деления среднего MESF на степень мечения (DOL) антитела. Число ABC умножали на концентрацию клеток, чтобы определить общую концентрацию связанного антитела. Концентрацию свободных антител рассчитывали путем вычитания концентрации связанных антител из окрашивающей концентрации (начальная доза). Концентрация свободных антител была построена против концентрации связанных антител в GraphPad Prism 7. Полученный график был аппроксимирован к нелинейной регрессии, функции связывания, специфичной для одного сайта, для определения аффинности, как показано на фиг. 4, панели А и В.
Пример 6. Опосредованное полиспецифическим антителом уничтожение ПСМА-положительных клеток опухоли предстательной железы посредством перенаправления Т-клеток.
Анализы с использованием покоящихся Т-клеток.
Клетки-мишени высевали из расчета 15000 клеток на лунку в 96-луночный планшет и культивировали в течение ночи при 37°С. После инкубации увеличивающиеся количества полиспецифического антитела добавляли вместе с покоящимися Т-клетками человека при соотношении эффекторных клеток к клеткам-мишеням 10:1 и инкубировали в течение дополнительных 48 или 72 ч при 37°С (48 ч для анализов с клетками LNCaP, MDA-PCa-2b и PC3-PSMA и 72 часа для анализов с клетками 22Rv1). Гибель клеток измеряли с использованием реагента для пролиферации клеток WST-1 (Sigma кат. №: 11644807001) или при помощи проточной цитометрии. В некоторых экспериментах небольшой образец каждого супернатанта собирали после инкубации, но до анализа жизнеспособности клеток-мишеней, и сохраняли для анализа продукции цитокинов. Когда жизнеспособность клеток анализировали с помощью реагента WST-1, исходный реагент добавляли в каждую лунку в разведении 1:10 и инкубировали в течение 90 мин при 37°С. Затем измеряли оптическую плотность при 450 нм (эталонная длина волны 690 нм) и рассчитывали процент специфического лизиса.
Если жизнеспособность клеток-мишеней анализировали с помощью проточной цитометрии, то клетки-мишени метили перед началом анализа мембранным красителем DiR (ThermoFisher D12731). После инкубации с Т-клетками и антителами супернатанты либо сохраняли для анализа цитокинов, либо
- 33 046268 утилизировали. Затем лунки промывали один раз для сбора мертвых клеток опухоли и Т-клеток, которые переносили в планшет для проточной цитометрии. Оставшиеся прикрепленные клетки опухоли обрабатывали трипсином и затем добавляли в соответствующие лунки планшета для проточной цитометрии. Реагент аннексин-V использовали для окрашивания мертвых клеток, и проводили проточную цитометрию (BD FACSCelesta) для количественного определения процента мертвых опухолевых клеток в каждом образце, гейтируемых по окрашиванию DiR. Лунки, содержащие необработанные клетки-мишени, использовали для нормализации спонтанной гибели клеток. В некоторых экспериментах использовали антитело отрицательного контроля, состоящее из того же нацеленного на CD3 плеча, что и в полиспецифических молекулах к ПСМА х CD3, но заменой нацеленного на опухоль плеча на VH, специфичную к белку gp120 ВИЧ.
На фиг. 7 показан опосредованный Т-клетками лизис ПСМА-положительных клеток с использованием нестимулированных Т-клеток. Нестимулированные человеческие Т-клетки инкубировали с клетками, экспрессирующими ПСМА (LNCaP), и различными концентрациями полиспецифических антител. Бипаратопное антитело к ПСМА х CD3 (350123xCD3) превзошло монопаратопное антитело к ПСМА х CD3 (346181xCD3).
Анализы с использованием предварительно активированных Т-клеток.
Пан-Т-клетки человека предварительно активировали связанными с планшетом ОКТ3 и ИЛ-2 в течение трех дней с последующим дополнительным днем инкубации со свежим ИЛ-2. Клетки-мишени трипсинизировали, нагружали кальцеином-АМ (ThermoFisher C3100MP), смешивали с активированными Т-клетками до соотношения Е:Т 20:1 и добавляли в лунки 96-луночного планшета. Добавляли серии разведений различных полиспецифических антител с последующей инкубацией в течение 4 ч при 37°С. Затем супернатанты переносили в черные 96-луночные планшеты и измеряли оптическую плотность при 480 нм / 520 нм возбуждения/испускания для количественного определения высвобождения кальцеина. Клетки-мишени, инкубированные без Т-клеток, использовали для нормализации спонтанного высвобождения кальцеина интактными клетками опухоли. Добавление 2% Тритона-Х в контрольные лунки, содержащие клетки-мишени, позволило рассчитать сигнал кальцеина, соответствующий максимальному лизису клеток. Используя это значение, каждая экспериментальная лунка была представлена в виде процента максимального лизиса клеток. Анализ данных проводили с использованием GraphPad Prism 7.
На фиг. 6 показан опосредованный Т-клетками лизис ПСМА-положительных клеток с использованием предварительно активированных Т-клеток. Предварительно активированные Т-клетки человека инкубировали с клетками, экспрессирующими ПСМА человека, (LNCaP) и различными концентрациями полиспецифических антител. Гибель опухолевых клеток измеряли по высвобождению кальцеина и нормализовали по спонтанному высвобождению опухолевых клеток в отсутствие Т-клеток. Бипаратопное антитело к ПСМА х CD3 (350123xCD3) превзошло оба монопаратопных антитела к ПСМА х CD3.
На фиг. 8 показано, что полиспецифические антитела не лизируют ПСМА-отрицательные клетки. Предварительно активированные человеческие Т-клетки инкубировали с ПСМА-отрицательными клетками злокачественного новообразования предстательной железы (DU145) и различными концентрациями полиспецифических антител. Ни одно из протестированных антител не привело к лизису этих клеток.
На фиг. 9 показано связывание полиспецифических антител к ПСМА х CD3 с положительными и отрицательными по ПСМА клетками. Полиспецифические антитела к ПСМА х CD3 демонстрируют связывание с ПСМА-положительными клетками опухоли предстательной железы (22Rv1), но не связываются с ПСМА-отрицательными клетками опухоли предстательной железы (DU145). Бипаратопная молекула (350123) показала самое сильное связывание с клеткой-мишенью.
На фиг. 10 показан опосредованный Т-клетками лизис ПСМА-положительных клеток. Данные на фиг. 10 демонстрирует, что связывание с ПСМА через два разных эпитопа приводит к увеличению гибели клеток по сравнению с двухвалентной, но моноспецифической версией антитела.
Пример 7. Монопаратопное биспецифическое антитело к ПСМА х CD3 индуцирует меньшую продукцию цитокинов, чем бипаратопное полиспецифическое антитело к ПСМА х CD3
Продукцию цитокинов анализировали в анализах цитотоксичности опухоли с покоящимися Тклетками. Дизайн этих анализов подробно описан в другом месте данного документа. Супернатанты собирали после завершения анализов (после 72 часов инкубации для анализов с использованием клеток 22Rv1, 48 часов для всех других линий клеток). Наборы для ИФА использовали для обнаружения ИЛ-2 (Biolegend 431804) и ИФН-γ (Biolegend 430104) в соответствии с протоколом производителя. Экспериментальные супернатанты разбавляли перед анализом на основе ИФА так, чтобы уровни цитокинов попадали в линейную часть стандартной кривой, поставляемой с каждым набором. В некоторых случаях цитокины не могли быть обнаружены в экспериментальных лунках, и значения были указаны как меньшие или равные нижнему пределу количественного определения для анализа.
На фиг. 12, панели А-С, показан опосредованный Т-клетками лизис ПСМА-положительных клеток и сравнение с продукцией цитокинов. Полиспецифические антитела к ПСМА х CD3 индуцируют опосредованный Т-клетками лизис ПСМА-положительной линии клеток злокачественного новообразования предстательной железы LNCaP. Бипаратопная молекула (350123) стимулировала более сильное уничтожение опухолевых клеток по сравнению с монопаратопной молекулой (346181), но также вызывала вы
- 34 046268 работку более высоких уровней цитокинов, гамма-интерферона (ИФН-γ) и интерлейкина 2 (ИЛ-2), как показано на фиг. 12, панели В и панели С.
В табл. 10 показан опосредованный Т-клетками лизис и продукция цитокинов против четырех линий ПСМА-положительных клеток опухоли предстательной железы. Полиспецифические антитела к ПСМА х CD3 тестировали в анализах цитотоксичности опухолевых клеток in vitro с использованием нестимулированных Т-клеток и серии доз антитела против панели из четырех линий ПСМАположительных клеток опухоли. Через 72 часа (22Rv1) или 48 часов (MDA-PCa-2b, LNCAP, PC3-PSMA) рассчитывали процент гибели клеток опухоли и регистрировали с помощью ЕС50, а также если достигали наивысшего процента уничтожения. Супернатанты из этих экспериментальных лунок собирали и анализировали с помощью ИФА на цитокины, гамма-интерферон (ИФН-γ) или интерлейкин-2 (ИЛ-2). Монопаратопная молекула (3461881) индуцировала приблизительно эквивалентные уровни противоопухолевой цитотоксичности в отношении всех четырех тестируемых линий клеток по сравнению с бипаратопной молекулой, но имела более высокие ЕС50 в отношении продукции цитокинов и в большинстве случаев стимулировала более низкие уровни максимальной продукции цитокинов.
Таблица 10
Т-клеточный лизис и продукция цитокинов против четырех линий ПСМА-положительных клеток опухоли предстательной железы
Линия клеток | Антитело | Связывание клеток, ЕС50 (нМ) | Максимальная цитотоксичность (% лизиса) | У ничтожение, ЕС50 (нМ) | Макс. ИФН-γ (пг/мл) | ИФН- 7, ЕС50 (нМ) | Макс. ИЛ-2 (пг/мл) | ИЛ2, ЕС50 (нМ) |
22Rvl | 346181Х CD3 | 58 | 45 | 52,8 | 21 150 | 173,8 | <НПКО | Н/Д |
350123х CD3 | 3 | 53 | 0,42 | 73 031 | 380,2 | <НПКО | Н/Д | |
MDA- РСа-2Ь | 346181Х CD3 | 28 | 26 | 23,6 | 14 309 | 116,5 | 524 | 38,5 |
350123х CD3 | 2 | 29 | 0,41 | 12 026 | 0,90 | 1111 | 1,11 | |
LNCAP | 346181Х CD3 | 17 | 79 | 14,6 | 32 237 | 63,0 | 183 | 575 |
350123х CD3 | 2 | 75 | 0,84 | 60 397 | 3,29 | 1057 | 3,73 | |
РСЗPSMA | 346181Х CD3 | 30 | 42 | 3,7 | 7 340 | 10,1 | 1569 | 4,1 |
350123х CD3 | 6 | 51 | 0,40 | 10 136 | 1,01 | 3480 | 1,1 |
Пример 8. Полиспецифические антитела к ПСМА х CD3 индуцируют пролиферацию Т-клеток.
ПСМА-положительные клетки опухоли высевали из расчета 25000 клеток на лунку в 96-луночный планшет и культивировали в течение ночи при 37°С. Пан-Т-клетки человека, выделенные из покоящихся МКПК (Miltenyi 130-096-535), метили красителем CFSE для отслеживания линии дифференцировки в соответствии с инструкциями производителя (ThermoFisher C34554). Затем в лунки, содержащие клетки опухоли, добавляли 100000 меченых пан-Т-клеток с последующей серией разведений антител и инкубировали при 37°С, 8% CO2. После 5 дней инкубации клетки осторожно перемешивали и переносили в планшет для проточной цитометрии. Клетки осаждали и супернатант удаляли с последующим окрашиванием анти-CD8, конъюгированным с АРС, (Biolegend 301049), и анти-CD4, конъюгированным с РЕ, (Biolegend 317410), в течение 20 мин на льду. Затем клетки промывали и ресуспендировали в буфере для проточной цитометрии для анализа (BD FACSCelesta). Клетки гейтировали по прямому и боковому рассеянию, а также по экспрессии CD4 или CD8. Процент Т-клеток, которые пролиферировали, на что указывает положительное окрашивание CD4 или CD8 и низкий или отрицательный сигнал CFSE, рассчитывали для всей популяции Т-клеток, а также для субпопуляций CD4 и CD8. Данные проточной цитометрии анализировали с помощью FlowJo и наносили на график в GraphPad Prism 7.
На фиг. 11, панели A-D, показано, что полиспецифические антитела к ПСМА х CD3 стимулировали пролиферацию Т-клеток в присутствии ПСМА-положительных клеток опухоли, и что монопаратопные биспецифические антитела к ПСМА предпочтительно активируют CD3 Т-клетки. Полиспецифические антитела инкубировали вместе с клетками опухоли, экспрессирующими ПСМА, и Т-клетками, меченными красителем CFSE для отслеживания линии дифференцировки. После 5 дней инкубации пролиферацию Т-клеток и состав пролиферированных Т-клеток (CD8+ и CD4+) анализировали с помощью проточной цитометрии. На панелях А и В показана общая пролиферация Т-клеток, тогда как на панелях С и D показано соотношение CD8+ и CD4+ Т-клеток в лунках с пролиферацией. Пунктирная горизонтальная линия демонстрирует соотношение CD8: CD4 нестимулированных Т-клеток и составляет приблизительно 1:2 (фактическое значение = 0,64). Монопаратопное биспецифическое антитело к ПСМА х CD3 (346181) предпочтительно активирует CD8 Т-клетки (соотношение CD8:CD4 после экспансии около 2:1), тогда как бипаратопное полиспецифическое антитело к ПСМА х CD3 (350123) в меньшей степени активирует CD8+ Т-клетки (соотношение CD8:CD4 составляет около 1:1).
-
Claims (34)
- Пример 9. Полиспецифическое антитело вызывает подавление роста опухоли предстательной железы в модели ксенотрансплантата.Самцам мышей CIEA-NOG с иммунодефицитом в возрасте 5-6 недель (Taconic) имплантировали 10 миллионов клеток 22Rv1 подкожно в их нижнюю часть правого бока с последующим добавлением 10 миллионов МКПК человека посредством инъекции в хвостовую вену через один день после имплантации опухоли. Животные получали лечение 100 мкг полиспецифического антитела или носителя путем инъекции в хвостовую вену, начиная через один день после имплантации опухоли на 1, 5, 9 и 13 дни. Объем опухоли определяли с помощью штангенциркуля и регистрировали в течение 25 дней.На фиг. 13 показаны результаты модели ксенотрансплантата опухоли 22Rv1.Бипаратопная молекула к ПСМА х CD3 (350123) продемонстрировала ингибирование роста опухоли 22Rv1 в модели ксенотрансплантата опухоли. Для каждой группы лечения тестировали трех мышей, и изменение объема опухоли для каждого животного наносили на график в миллиметрах. Животные получали МКПК на 1 день после имплантации опухоли и получали лечение антителами на 1, 5, 9 и 13 дни. У двух из трех животных, получавших полиспецифические антитела, отмечалось замедление прогрессирования опухоли.Несмотря на то что в данном документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что данные варианты осуществления приведены исключительно с целью иллюстрации. Множество вариаций, изменений и замен будут очевидны специалистам в данной области техники без отхода от объема и сущности настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, могут применяться при практической реализации настоящего изобретения. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем изобретения и, что таким образом охватываются способы и структуры в пределах объема данной формулы изобретения и их эквивалентов.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула, которая связывается с белком ПСМА и белком CD3, содержащая:(a ) первую полипептидную субъединицу, включающую CD3-связывающий домен вариабельной области тяжелой цепи (VH);(b) вторую полипептидную субъединицу, содержащую вариабельный домен легкой цепи, где CD3связывающий домен VH первой полипептидной субъединицы спарен с указанным вариабельным доменом легкой цепи второй полипептидной субъединицы; и (c) третью полипептидную субъединицу, содержащую вариабельную область тяжелой цепи антиПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, где вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы содержит:i) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 11 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 18; или ii ) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 12 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 18; или iii ) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 2, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 11 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 18; или iv) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 3, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 13 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 18; илиv) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 19; или vi) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или vi i) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 21; или vii i) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 21; или ix) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 19; илиx) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или xi) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 15 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или xii ) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 15 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 22; или xiii ) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 17 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или- 36 046268 xiv) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 6, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или xv) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 6, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 21; или xvi) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 14 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или xvi i) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 15 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или xvii i) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 21; или xix) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 23; или xx) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 8, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 15 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или xxi) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 9, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 15 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20; или xxii ) CDR1 последовательности SEQ ID NO: 10, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 15 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20.
- 2. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1, в которой последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы присутствуют в человеческом каркасе.
- 3. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1 или 2, где вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы содержит:(a) последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 18; или (b) последовательность CDR1 с SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 с SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 с SEQ ID NO: 20.
- 4. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1 или 2, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 24-58.
- 5. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1 или 2, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24-58.
- 6. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.5, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы представляет собой SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 38.
- 7. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1 или 2, в которой вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 18 в каркасе человеческой VH.
- 8. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1 или 2, в которой вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 18 в каркасе человеческой VH в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
- 9. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1 или 2, в которой вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 20 в каркасе человеческой VH.
- 10. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.1 или 2, в которой вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 20 в каркасе человеческой VH в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
- 11. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула, которая связывает белок ПСМА и белок CD3, содержащая:(a) первую полипептидную субъединицу, включающую CD3-связывающий домен вариабельной области тяжелой цепи (VH);(b) вторую полипептидную субъединицу, содержащую вариабельный домен легкой цепи, где CD3связывающий домен VH первой полипептидной субъединицы спарен с указанным вариабельным доменом легкой цепи второй полипептидной субъединицы; и- 37 046268 (c) третью полипептидную субъединицу, содержащую первую вариабельную область тяжелой цепи анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, и вторую вариабельную область тяжелой цепи анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, где:i) первая вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 18 в каркасе человеческой VH; a ii) вторая вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 20 в каркасе человеческой VH.
- 12. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.11, в которой первая вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы расположена ближе к N-концу относительно второй вариабельной области тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы.
- 13. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.11, в которой первая вариабельная область тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы расположена ближе к С-концу относительно второй вариабельной области тяжелой цепи третьей полипептидной субъединицы.
- 14. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что:CD3-связывающий домен VH первой полипептидной субъединицы содержит последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 65; и вариабельный домен легкой цепи второй полипептидной субъединицы содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 66.
- 15. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, чтоCD3-связывающий домен VH первой полипептидной субъединицы содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 65; и вариабельный домен легкой цепи второй полипептидной субъединицы содержит вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 66.
- 16. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула, которая связывается с белком ПСМА и белком CD3, содержащая первую полипептидную субъединицу, содержащую последовательность SEQ ID NO: 87;вторую полипептидную субъединицу, содержащую последовательность SEQ ID NO: 86; и третью полипептидную субъединицу, содержащую последовательность SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91, 92 или 93.
- 17. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по п.16, где третья полипептидная субъединица содержит последовательность SEQ ID NO: 88.
- 18. Биспецифическое антитело, которое связывается с белком ПСМА и белком CD3, содержащее:(i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 61 в каркасе человеческой VH;(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 64 в каркасе VL человека; и (iii) антигенсвязывающий домен анти-ПСМА анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащий последовательность CDR1 SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 18 в каркасе человеческой VH.
- 19. Биспецифическое антитело, которое связывается с белком ПСМА и белком CD3, содержащее:(i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 61 в каркасе человеческой VH;(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 64 в каркасе человеческой VL; и (iii) антигенсвязывающий домен анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащий последовательность CDR1 SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 18 в каркасе человеческой VH в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
- 20. Биспецифическое антитело, которое связывается с белком ПСМА и белком CD3, содержащее:(i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 61 в каркасе человеческой VH;- 38 046268 (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 64 в каркасе человеческой VL; и (iii) антигенсвязывающий домен анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащий последовательность CDR1 SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 20 в каркасе человеческой VH.
- 21. Биспецифическое антитело, которое связывается с белком ПСМА и белком CD3, содержащее:(i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 61 в каркасе человеческой VH;(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 64 в каркасе человеческой VL; и (iii) антигенсвязывающий домен анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащий последовательность CDR1 SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 20 в каркасе человеческой VH в одновалентной или двухвалентной конфигурации.
- 22. Полиспецифическое антитело, которое связывается с белком ПСМА и белком CD3, содержащее:(i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аффинность связывания с CD3, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 59, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 60 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 61 в каркасе человеческой VH;(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 62, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 63 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 64 в каркасе человеческой VL; и (iii) антигенсвязывающий домен анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, при этом антигенсвязывающий домен содержит первую и вторую антигенсвязывающие области в двухвалентной конфигурации, где первая антигенсвязывающая область содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 2, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 18 в каркасе человеческой VH; a вторая антигенсвязывающая область содержит последовательность CDR1 SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 SEQ ID NO: 15 и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 20 в каркасе человеческой VH.
- 23. Полиспецифическое антитело по п.22, в котором первая антигенсвязывающая область расположена ближе к N-концу относительно второй антигенсвязывающей области.
- 24. Полиспецифическое антитело по п.22, в котором первая антигенсвязывающая область расположена ближе к С-концу относительно второй антигенсвязывающей области.
- 25. Полиспецифическое антитело по любому из пп.22-24, в котором первая и вторая антигенсвязывающие области антигенсвязывающего домена анти-ПСМА антитела, содержащего только тяжелые цепи, соединены полипептидным линкером.
- 26. Полиспецифическое антитело по п.25, в котором полипептидный линкер представляет собой GS-линкер.
- 27. Полиспецифическое антитело по п.26, в котором GS-линкер состоит из последовательности SEQ ID NO: 73 или SEQ ID NO: 74.
- 28. Фармацевтическая композиция, содержащая полиспецифическую трехцепочечную антителоподобную молекулу по любому из пп.1-17, или полиспецифическое антитело по любому из пп.22-27, или биспецифическое антитело по любому из пп.18-21.
- 29. Способ лечения расстройства, характеризующегося экспрессией ПСМА, включающий введение субъекту с указанным расстройством полиспецифическую трехцепочечную антителоподобную молекулу по любому из пп.1-17, или полиспецифическое антитело по любому из пп.22-27, или биспецифическое антитело по любому из пп.18-21, или фармацевтической композиции по п.28.
- 30. Способ по п.29, где расстройство представляет собой злокачественное новообразование предстательной железы.
- 31. Применение полиспецифической трехцепочечной антителоподобной молекулы по любому из пп.1-17, или полиспецифического антитела по любому из пп.22-27, или биспецифического антитела по любому из пп.18-21 в изготовлении лекарственного препарата для лечения расстройства, характеризующегося экспрессией ПСМА.
- 32. Применение по п.31, где расстройство представляет собой злокачественное новообразование предстательной железы.
- 33. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула по любому из пп.1-17, или полиспецифическое антитело по любому из пп.22-27, или биспецифическое антитело по любому из пп.1821 для лечения расстройства, характеризующегося экспрессией ПСМА.
- 34. Полиспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула, или полиспецифическое антитело, или биспецифическое антитело по п.33, где расстройство представляет собой злокачественное новообразование предстательной железы.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/830,130 | 2019-04-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA046268B1 true EA046268B1 (ru) | 2024-02-21 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220195068A1 (en) | Heavy chain antibodies binding to psma | |
CN112351997B (zh) | 与cd19结合的重链抗体 | |
AU2022259766B2 (en) | Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions | |
CA3214992A1 (en) | Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions | |
US20240117063A1 (en) | Anti-cd20 antibodies and car-t structures | |
US20240131074A1 (en) | Anti-psma antibodies and car-t structures | |
US20240002498A1 (en) | Heavy chain antibodies binding to folate receptor alpha | |
CA3211142A1 (en) | Anti-muc1-c antibodies and car-t structures | |
CN113710707B (zh) | 结合于psma的重链抗体 | |
EA046268B1 (ru) | Антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые связываются с псма | |
JP2024073430A (ja) | Cd19に結合する重鎖抗体 |