CN113710690A - 与谷类联合的根瘤菌中的固氮的控制 - Google Patents

与谷类联合的根瘤菌中的固氮的控制 Download PDF

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Abstract

本文公开了具有nif簇的经工程改造的根瘤菌，所述根瘤菌能够在独立生存条件下固氮，以及在独立生存条件下耐铵和耐氧地固氮。还提供了使用这些经工程改造的根瘤菌产生氮以供谷类作物消耗的的方法。

Description

与谷类联合的根瘤菌中的固氮的控制
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2019年3月19日提交的美国临时申请序列号62/820,765的优先权，并且根据35 U.S.C.§120要求于2020年1月17日提交的美国申请第16/746,215号的优先权，这些美国临时申请的全部内容中的每一者以引用方式并入本文。
背景技术
在农业中，氮是一种限制性营养物质，需要作为肥料添加到那些不能自己产生氮的作物中，包括谷类稻、玉米和小麦。相比之下，豆科植物能够使用根瘤中驻留的固氮细菌从大气中获得氮。然而，世界上的热量中的大部分来自谷类；因此，将这种能力转移至这些作物一直是基因工程中的长期问题。这将减少对氮肥的需求及其带来的经济、环境和能源负担。
发明内容
本公开至少部分地基于根瘤菌和用于制造能够在有氧独立生存条件下固氮的根瘤菌的方法。本公开还提供了重构的nif簇，所述重构的nif簇赋予了在有氧独立生存条件下固氮的能力。
因此，本公开的一个方面提供了一种能够在有氧独立生存条件下固氮的根瘤菌，所述根瘤菌包括具有外源nif簇的共生根瘤菌，其中所述外源nif簇赋予共生根瘤菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述根瘤菌不是茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自独立生存的固氮生物。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自共生的固氮生物。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自光合α变形菌。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自γ变形菌。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自蓝细菌。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自厚壁菌。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。在一些实施方案中，所述外源nif簇来自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。在一些实施方案中，所述外源nif簇是诱导型重构的nif簇。在一些实施方案中，所述诱导型重构的nif簇是诱导型重构的克雷伯氏菌属(klebsiella)nif簇。在一些实施方案中，根瘤菌是IRBG74。在一些实施方案中，外源nif簇包含6个nif基因。在一些实施方案中，所述6个nif基因是nifHDK(T)Y、nifEN(X)、nifJ、nifBQ、nifF和nifUSVWZM。在一些实施方案中，外源nif簇的每个nif基因前面是T7启动子。在一些实施方案中，T7启动子是野生型启动子。在一些实施方案中，根瘤菌还包含内源nif簇。在一些实施方案中，nif簇具有nifV基因。在一些实施方案中，nifV基因是内源性的。在一些实施方案中，外源nif簇还包含终止子。在一些实施方案中，T7启动子具有终止子，并且所述终止子在T7启动子的下游。在一些实施方案中，外源nif簇是重构的v3.2nif簇，如图2H所示。
本公开的另一方面提供了一种能够在有氧独立生存条件下固氮的植物生长促进细菌，所述植物生长促进细菌包括具有外源nif簇的细菌，所述外源nif簇具有至少一个诱导型启动子，其中所述外源nif簇赋予所述细菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述细菌不是茎瘤固氮根瘤菌。在一些实施方案中，细菌是共生细菌。在一些实施方案中，细菌是内生菌。在一些实施方案中，内生菌是根瘤菌IRBG74。在一些实施方案中，细菌是附生菌(epiphyte)。在一些实施方案中，附生菌是防御假单胞菌(Pseudomonas protogens)PF-5。在一些实施方案中，植物生长促进细菌与经遗传修饰的谷类植物联合。在一些实施方案中，经遗传修饰的谷类植物包含编码化学信号的外源基因。在一些实施方案中，固氮处于化学信号的控制下。在一些实施方案中，化学信号是冠瘿碱(例如，章鱼碱、胭脂碱(nopaine)或甘露碱)、间苯三酚(phlorogluconol)或rhizopene。在一些实施方案中，外源nif簇包含6个nif基因。在一些实施方案中，6个nif基因是nifHDK(T)Y、nifEN(X)、nifJ、nifBQ、nifF和nifUSVWZM。在一些实施方案中，诱导型启动子是T7启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子是PA1lacO1启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子由选自包括IPTG、水杨酸钠、章鱼碱、胭脂碱、群体信号3OC6HSL、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸的组中的剂活化。在一些实施方案中，外源nif簇还包含终止子。在一些实施方案中，诱导型启动子具有终止子，并且所述终止子在诱导型启动子的下游。
本公开的另一个方面提供了能够在谷类作物中诱导非铵依赖性固氮的茎瘤固氮根瘤菌，所述茎瘤固氮根瘤菌包含：(i)经修饰的nif簇，其中内源nifA基因被缺失或改变；和(ii)至少一个包含nifA和RNA聚合酶σ因子(RpoN)的操纵子，其中所述操纵子包含含有诱导型启动子的调控元件。在一些实施方案中，诱导型启动子是PA1lacO1启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子由选自由IPTG、水杨酸钠、章鱼碱、胭脂碱、群体信号3OC6HSL、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸组成的组的剂活化。在一些实施方案中，内源nifA基因用以下取代中的至少一种改变：(i)L94Q、(ii)D95Q、和(iii)L94Q和D95Q两者。
本公开的另一个方面提供了一种工程改造能够在有氧独立生存条件下固氮的根瘤菌的方法，所述方法包括将外源nif簇转移至共生根瘤菌，其中所述外源nif簇赋予共生根瘤菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述根瘤菌不是茎瘤固氮根瘤菌。在一些实施方案中，外源nif簇包含6个nif基因。在一些实施方案中，所述6个nif基因是nifHDK(T)Y、nifEN(X)、nifJ、nifBQ、nifF和nifUSVWZM。在一些实施方案中，nif基因中的每个基因前面都有野生型T7启动子。在一些实施方案中，将外源nif簇在质粒中转移至根瘤菌。在一些实施方案中，外源nif簇还包含终止子。在一些实施方案中，野生型T7启动子具有终止子，并且所述终止子在野生型T7启动子的下游。在一些实施方案中，内源NifL基因被缺失。
本公开的另一方面提供了一种产生氮以供谷类植物消耗的的方法，所述方法包括提供能够在谷类植物附近在有氧独立生存条件下固氮的植物生长促进细菌，其中所述植物生长促进细菌是具有外源nif簇的共生细菌，其中所述外源nif簇赋予所述共生细菌固氮能力，从而使得能够在有氧独立生存条件下固氮。在一些实施方案中，植物生长促进细菌是根瘤菌。在一些实施方案中，植物生长细菌是本公开中所述的细菌。在一些实施方案中，谷类植物是经遗传修饰的谷类植物。在一些实施方案中，经遗传修饰的谷类植物包含编码化学信号的外源基因。在一些实施方案中，固氮处于化学信号的控制下。在一些实施方案中，化学信号是冠瘿碱、间苯三酚或rhizopene。在一些实施方案中，固氮处于化学信号的控制下。在一些实施方案中，化学信号是根渗出物、生物防治剂或植物激素。在一些实施方案中，根渗出物选自由以下组成的组：糖、激素、类黄酮和抗菌剂。在一些实施方案中，化学信号是香草酸盐。在一些实施方案中，化学信号是IPTG、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸、3,4-二羟基苯甲酸、3OC6HSL或3OC14HSL。
在一个方面中，本公开还提供了一种经遗传工程改造的植物，所述经遗传工程改造的植物能够产生正交的碳源，诸如冠瘿碱或不太常见的糖；以及具有对应分解代谢途径的细菌，所述细菌能够响应于这些信号。
在一个方面中，本公开提供了一种用于制备固氮细菌的方法，所述方法包括a)鉴定宿主细菌；b)基于宿主细菌与供体细菌之间的进化距离选择具有nif簇的供体细菌；以及c)将供体细菌的nif簇插入至宿主细菌，从而制备固氮细菌。在一些实施方案中，所述宿主细菌与所述供体细菌之间的所述进化距离是16S核糖体RNA基因序列中每个位点小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的取代。在一些实施方案中，宿主细菌和供体细菌属于相同的属、科、目或纲。在一些实施方案中，所述供体细菌选自克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、蓝丝菌属(Cyanothece)或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。在一些实施方案中，所述宿主细菌选自由以下组成的组：大肠杆菌、防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌IRBG74。在一些实施方案中，所述供体细菌选自由以下组成的组：产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、重氮营养葡糖醋杆菌(G.diazotrophicus)、巴西固氮螺菌(A.brasilense)、茎瘤固氮根瘤菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、蓝丝菌属和类芽孢杆菌。在一些实施方案中，宿主细菌是大肠杆菌，并且供体细菌是产酸克雷伯氏菌。在一些实施方案中，所述宿主细菌是防御假单胞菌Pf-5，并且所述供体细菌是施氏假单胞菌。在一些实施方案中，所述宿主细菌是根瘤菌IRBG74，并且所述供体细菌是类球红细菌。在一些实施方案中，所述宿主细菌是非共生细菌，例如固氮菌属、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)或梭菌属(Clostridium)细菌。在一些实施方案中，所述宿主细菌是共生细菌，例如根瘤菌属、弗兰克氏菌属(Frankia)或固氮螺菌属细菌。在一些实施方案中，所述宿主细菌与豆科植物、放线菌植物或谷类作物共生。在一些实施方案中，所述插入的nif簇处于诱导型控制下。
在一个方面中，本公开提供了一种选择与宿主细菌相容的供体细菌的nif簇的方法，所述方法包括a)对所述供体细菌和所述宿主细菌进行系统发生分析；b)基于所述系统发生分析确定所述供体细菌与所述宿主细菌之间的进化距离小于参考值；以及c)为所述宿主细菌选择所述供体细菌的所述nif簇。在一些实施方案中，所述系统发生分析通过使用距离矩阵、最大简约、最大似然或贝叶斯推理来执行。在一些实施方案中，所述系统发生分析通过分析核糖体RNA(例如，16srRNA)取代率来执行。在一些实施方案中，所述参考值是16S核糖体RNA基因序列中每个位点10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的取代。在一些实施方案中，参考值是5亿年、4亿年、3亿年、2亿年、1亿年、5000万年或1000万年。在一些实施方案中，所述方法还包括将nif簇插入至宿主细菌并评估固氮活性。在一些实施方案中，nif簇处于诱导型控制之下。
在一个方面中，本公开提供了一种包含nif簇的细菌，其中nif簇处于外源控制遗传元件的控制下。在一些实施方案中，nif簇是内源或外源nif簇。在一些实施方案中，外源控制遗传元件响应于诱导剂(例如，化学信号)而引发启动子活性。在一些实施方案中，启动子活性通过下式测量：
Figure BDA0003307346880000061
其中m(i)是来自FPKM归一化转录组谱的每个位置i处的转录本数量，γ＝0.0067s-1是mRNA的降解速率，并且n是xtss之前和之后的窗口长度。在一些实施方案中，诱导剂通过化学递送或生物防治递送被递送至细菌。在一些实施方案中，诱导剂是种子中的化学信号(例如，枯茗酸)、天然根渗出物(例如，阿拉伯糖、水杨酸、香草酸或柚皮素)、来自细菌的化学信号(例如，3OC6HSL、3OC14HSL、DHBA或DAPG)、或来自经遗传修饰植物的化学信号(例如，胭脂碱或章鱼碱)。
本发明的一个或多个实施方案的细节在下面描述中阐述。本发明的其他特征或优点将从下面的附图和几个实施方案的详细描述以及从所附权利要求书变得显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个附图并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解这些方面。出于清楚的目的，并非每个部件都可以在每个附图中标记。应当理解，附图中所示的数据绝不限制本公开的范围。在附图中：
图1A至图1F包括显示nif簇跨物种的转移的图。(图1A)基于16S rRNA序列的系统发生关系，比对来自独立生存的固氮细菌的八个nif簇。基因和操纵子基于产酸克雷伯氏菌M5al。DNA线中的点表示从基因组DNA克隆多个区域并组合以形成一个大质粒携带的nif簇的位置。表3中提供了菌株基因型的完整列表。在三个物种中测量了来自天然nif簇转移的固氮酶活性。还在12个根瘤菌菌株中测量了沼泽红假单胞菌和类球红细菌的活性。星号指示乙烯产量低于检测极限(<10a.u.)。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。(图1B)天然产酸克雷伯氏菌nif簇在产酸克雷伯氏菌中的转录组谱，与从其转移至指定物种而获得的转录组谱进行比较。(图1C)跨物种的天然产酸克雷伯氏菌nif簇的转录水平(FPKM)。转录单位是加下划线的。(图1D)产酸克雷伯氏菌nif基因在产酸克雷伯氏菌(→克雷伯氏菌属)中的转录水平(FPKM)与当转移至新宿主时获得的转录水平的比较。(图1E)与(图1C)中相同，不同之处在于对翻译效率进行了比较，如使用核糖体谱分析计算的。(图1F)与(图ID)中相同，不同之处在于对核糖体密度(RD)进行了比较，如使用核糖体谱分析计算的。对数-对数曲线图中的R2是根据线(y＝x+b)计算的，其中b是宿主之间的表达变量。
图2A至图2M包括示出重构产酸克雷伯氏菌nif簇至根瘤菌属种IRBG74的转移的图。(图2A)示出了用于大肠杆菌MG1655(左)和根瘤菌属种IRBG74(右)的控制元件(controller)的遗传系统。T7 RNAP的变体(R6232S，N端lon标签，GTG起始密码子)用于大肠杆菌控制元件。几个遗传部分被取代来构建根瘤菌属种IRBG74控制元件(图16)。遗传部分的序列提供在表5中。(图2B)带有报告质粒pMR-79的控制元件的响应函数(表4和表5)。用于诱导固氮酶的IPTG浓度被圈出。(图2C)示出了用于构建重构v2.1 nif基因簇的遗传部分(表5)。(图2D)示出了重构nif基因簇v2.1在不同宿主中的活性。星号指示乙烯产量低于检测极限(<10a.u.)。(图2E)如从RNA-seq数据计算的v2.1启动子和终止子在大肠杆菌MG1655和根瘤菌属种IRBG74中的活性(参见材料和方法)。(图2F)如使用核糖体谱分析和RNA-seq计算的v2.1 nif基因在大肠杆菌MG1655和根瘤菌属种IRBG74中的翻译效率。线连接在同一操纵子中出现的点。(图2G)将新宿主(大肠杆菌MG155；根瘤菌属种IRBG74)中的重构v2.1nif基因的核糖体密度(RD)与来自产酸克雷伯氏菌(→克雷伯菌属)中的天然产酸克雷伯氏菌簇的nif基因的测量RD进行比较。对应于nifH的点标记为H。(图2H至图2L)与(图2C至图2G)相同，但具有重构nif簇v3.2。遗传部分提供在表5中。(图2M)固氮酶活性被示出为T7启动子强度的函数。重构nif簇v3.2由三个具有不同强度的控制元件菌株表达(图16)。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图3A至图3F包括示出茎瘤固氮根瘤菌ORS571中的固氮控制的图。(图3A)示出了控制元件，该控制元件被携带在pBBRl来源的质粒上(遗传部分提供在表5中)。NifA和RpoN共诱导基因组中三个位点的表达(通过共有NifA结合序列鉴定)。(图3B)使用荧光报告基因评估自nifH启动子的表达(参见材料和方法)。在基因组rpoN保持完整的茎瘤固氮根瘤菌ΔnifA中，NifA和RpoN单独或组合地被补充(+)。(图3C)示出了由控制元件诱导nifH启动子的响应函数。(图3D)示出了野生型茎瘤固氮根瘤菌ORS571的固氮酶活性与用控制元件质粒(+)和添加1mM IPTG(+)补充的ΔnifA的固氮酶活性的比较。(图3E)示出了不存在或存在10mM氯化铵的影响。将来自茎瘤固氮根瘤菌ORS571的WT NifA与具有附加RpN表达的氨基酸取代的不同组合进行了比较。对于含有控制元件质粒pMR-121、122、123和124(+)的ΔnifA菌株，通过1mM IPTG(+)诱导NifA/RpoN表达。星号指示乙烯产量低于检测极限(<10au)。(图3F)固氮酶活性示出为顶部空间中氧浓度的函数(参见材料和方法)。将天然nif簇(野生型茎瘤固氮根瘤菌ORS571)与包含控制元件质粒和1mM IPTG的诱导型进行比较。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图4A至图4F包括示出诱导型nif簇在防御假单胞菌Pf-5中的固氮酶活性的图。(图4A)将基于施氏假单胞菌NifA的控制元件用于所有三个簇。质粒和遗传部分提供在表4和表5中。(图4B)示出了来自产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌和棕色固氮菌的nif簇。标记了对应于NifLA调控元件的缺失区域。虚线指示来自基因组的多个区域被克隆并组合以形成nif簇。这些簇被携带在质粒pMR-4、pMR-6、pMR-8中(表4)。(图4C)示出了控制元件对来自每个物种的nifH启动子的诱导(0.5mM IPTG)(参见材料和方法)。(图4D)在存在和不存在0.5mMIPTG的情况下，天然簇(完整的nifLA)的固氮酶活性与诱导型簇的固氮酶活性的比较。虚线指示野生型环境中的天然簇的活性(从上到下，产酸克雷伯氏菌M5al、施氏假单胞菌A1501和棕色固氮菌DJ)。(图4E)比较了天然和诱导型(+0.5mM IPTG)nif簇对17.1mM醋酸铵的敏感性。星号指示乙烯产量低于检测极限(<10au)。(图4F)固氮酶活性示出为顶部空间中氧浓度的函数(参见材料和方法)。将天然nif簇与包括对照质粒和0.5mM IPTG的诱导型进行比较。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图5A至图5D包括示出用响应于根际中的不同的化学物质的感应元件(sensor)控制固氮酶活性的图。(图5A)示出化学物质来源的示意图。“引入的DNA”指的是对植物进行遗传修饰以产生胭脂碱和章鱼碱。(图5B)示出了针对茎瘤固氮根瘤菌构建的遗传感应元件。遗传部分的序列提供在表5中。(图5C)示出了感应元件的响应函数。感应元件表达T7 RNAP，所述T7 RNAP然后激活PT7，或者感应元件表达NifA(防御假单胞菌Pf-5)或NiFA/RpoN(茎瘤固氮根瘤菌)并活化nifH启动子(括号中为物种起源)。(图5D)固氮酶活性是在存在或不存在诱导剂的情况下测量的(参见材料和方法)。重构的克雷伯氏菌属nif簇v2.1和v3.2分别用于大肠杆菌MG1655和根瘤菌属种IRBG74中。诱导型棕色固氮菌nif簇用于防御假单胞菌Pf-5中。含nifA/rpoN的控制元件用于茎瘤固氮根瘤菌ΔnifA中。诱导剂浓度是：50μM香草酸、500μM DHBA、50μM枯茗酸、25nM 3OC6HSL、500nM3OC14HSL、33μM阿拉伯糖、100μM柚皮素、100nM DAPG、200μM水杨酸、1mM胭脂碱和1mM章鱼碱。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图6包括根瘤菌属种IRBG74在具有不同碳源的UMS基本培养基中的生长曲线的曲线图。将在30℃和250rpm下在15mL培养管中的2mL TY培养基中生长过夜的培养物稀释至为0.02的OD600，加入到96孔深孔板中的1mL UMS基本培养基加不同碳源中，并在30℃和900rpm孵育16小时。用分光光度法在OD600 nm处监测细菌生长。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图7A至图7F包括示出当将不同的诱导型nif簇转移至大肠杆菌MG1655时的固氮酶活性的图。(图7A)基于产酸克雷伯氏菌NifA的相同控制元件系统用于所有三个簇。表4和表5中提供了控制元件质粒pMR-99和遗传部分。(图7B)示出了来自产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌和棕色固氮菌的nif簇。标记了对应于NifLA调控元件的缺失区域。虚线指示来自基因组的多个区域被克隆并组合以形成nif簇。簇被携带质粒pMR-3、pMR-5、pMR-7(表4)。(图7C)示出了控制元件对来自每个物种的nifH启动子的诱导(50μM IPTG)(参见材料和方法)。(图7D)在存在和不存在50μM IPTG的情况下，天然簇(完整的nifLA)的固氮酶活性与诱导型簇的固氮酶活性的比较。虚线指示野生型环境中的天然簇的活性(从上到下，产酸克雷伯氏菌M5al、施氏假单胞菌A1501和棕色固氮菌DJ)。(图7E)氨对固氮酶活性的调节。在17.1mM乙酸铵存在下，测试了来自天然(黑色条形)和诱导型(灰条条形)系统的固氮酶的铵耐受性。星号指示乙烯产量低于检测极限(<10au)。(图7F)通过氧调节固氮酶活性。将天然nif簇与包括控制元件质粒和50μM IPTG的诱导型进行比较。固氮酶活性是在顶部空间中恒定氧浓度(0％至3％)下孵育3小时后测量的(参见材料和方法)。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图8A至图8B包括示出转移的nif簇的铵抑制的曲线图。在不存在(-)或存在(+)17.1mM乙酸铵的情况下，通过固氮酶测定测量固氮酶对铵的敏感性。大肠杆菌MG1655(图8A)和防御假单胞菌Pf-5(图8B)中天然和诱导型nif簇的敏感性。应注意数据来自图4A至图4F和图7A至图7F。在大肠杆菌MG1655和防御假单胞菌Pf-5中，分别用50μM和0.5mM IPTG诱导nif簇。星号指示乙烯产量低于检测极限(<10au)。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图9包括示出产酸克雷伯氏菌天然nif簇在产酸克雷伯氏菌M5al、大肠杆菌MG1655、防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌属种IRBG74中的核糖体谱分析数据的图(参见材料和方法)。
图10A至图10B包括示出NifA过表达对根瘤菌属种IRBG74中的nifH启动子活性的影响的图。(图10A)示出了用于测量nifH启动子活性的报告基因构建体。使用流式细胞术在根瘤菌属种IRBG74野生型背景中分析了nifH启动子活性。根瘤菌属种IRBG74的附加拷贝增加了根瘤菌属种IRBG74 nifH启动子的活性，但未能补充或增强其他nifH启动子，包括产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌和茎瘤固氮根瘤菌的nifH启动子活性。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。(图10B)用于评定NifA过表达在根瘤菌属种IRBG74中的影响的质粒图谱。WT表示野生型；Rsp表示根瘤菌属种IRBG74；Kox表示产酸克雷伯氏菌M5al；Pst表示施氏假单胞菌A1501；Aca表示茎瘤固氮根瘤菌ORS571
图11A至图11C包括示出根瘤菌属种IRBG74和防御假单胞菌Pf-5中的启动子表征的图。(图11A)组成型启动子按其强度进行等级排序。顶部描绘了用于测量启动子活性的质粒。(图11B)在1mM IPTG诱导下，分析在根瘤菌属种IRBG74和防御假单胞菌Pf-5的基因组上含有IPTG诱导型T7 RNAP的控制元件菌株中，野生型T7启动子及其变体的强度。右侧示出了用于测量T7启动子活性的报告质粒。(图11C)物种间T7启动子强度的相关性。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图12A至图12B包括示出根瘤菌属种IRBG74和防御假单胞菌Pf-5中的RBS表征的图。GFP的RBS文库是在最高分辨率模式下使用RBS文库计算器设计的。(图12A)分析了在1mMIPTG诱导下，在含有IPTG诱导型系统的质粒pMR-40中合成RBS在根瘤菌属种IRBG74中的强度。选择了跨越5,684倍表达范围的RBS中的33个RBS，并且它们的序列提供在表6中。(图12B)分析了在7μM阿拉伯糖诱导下，在含有阿拉伯糖诱导型系统的质粒pMR-65中合成RBS在防御假单胞菌Pf-5中的强度。选择了跨越1,075倍表达范围的RBS中的33个RBS，并且它们的序列提供在表6中。
图13A至图13B包括示出T7 RNAP的终止子在根瘤菌属种IRBG74(图13A)和防御假单胞菌Pf-5(图13B)中的表征的图。(图13A)分析了在1mM IPTG诱导下，在基因组上含有IPTG诱导型T7 RNAP的控制元件根瘤菌属种IRBG74菌株MR16中终止子的强度。(图13B)在右侧示出了用于测量终止子强度的质粒。遗传部分提供在表5中。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图14包括示出感应元件在根瘤菌属种IRBG74中的响应函数的图。用于表征感应元件的质粒示出在每个图的顶部，并提供在表4中。遗传部分提供在表5中。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。实验细节在方法中提供。
图15A至图15C包括示出感应元件在防御假单胞菌Pf-5中的响应函数的图。输出根据输入诱导剂的浓度变化。用于表征感应元件的质粒示出在每个图的顶部。(图15A)防御假单胞菌Pf-5中的诱导型启动子表征。(图15B)阿拉伯糖诱导型系统的优化。质粒携带的AraE转运体的组成型表达降低了阿拉伯糖的解离常数(深灰色)。PBAD启动子的-10区的突变(TACTGT至TATATT)增加了启动子强度(黑色)。(图15C)IPTG诱导型系统的优化。IPTG诱导型启动子由1mM IPTG诱导。Ptac启动子和LacI(Q18M/A47V/F161Y)蛋白的组合产生了110倍的表达范围。质粒和遗传部分提供在表4和表5中。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图16包括示出根瘤菌属种IRBG74中的调谐控制元件强度的图。将含有IPTG诱导型T7 RNAP的控制元件整合到根瘤菌属种IRBG74(顶部)的基因组中。通过调节质粒pMR-81、pMR-82和pMR-83中T7 RNAP的RBS来调整控制元件强度。使用报告质粒pMR-79(右)在根瘤菌属种IRBG74控制元件菌株MR16、MR17和MR18中测量T7启动子的响应函数。遗传部分和RBS序列提供在表5和表5中。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图17包括示出重构nif簇跨物种的固氮酶活性的曲线图。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图18包括分别示出在大肠杆菌MG1655和根瘤菌属种IRBG74中的RNA-seq(顶部)和核糖体谱分析(底部)数据的图。将nif基因用1mM IPTG诱导6小时(参见材料和方法)。
图19包括分别示出在大肠杆菌MG1655和防御假单胞菌Pf-5以及根瘤菌属种IRBG74中的RNA-seq(顶部)和核糖体谱分析(底部)数据的图。将nif基因分别在大肠杆菌MG1655、防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌属种IRBG74用1mM、0.1mM和0.5mM IPTG诱导6小时(参见材料和方法)。
图20A至图20F包括示出重构的nif簇v3.2在防御假单胞菌Pf-5中的转移的图。(图20A)描述了控制元件，所述控制元件的输出是来自防御假单胞菌Pf-5的基因组的T7 RNAP。与以红色突出显示的大肠杆菌MG1655中的控制元件模块pKT249相比，经取代的遗传部分包括用于控制元件优化的新的RBS和IPTG诱导型启动子。在防御假单胞菌Pf-5控制元件菌株MR7中测量了具有报告质粒pMR-80的控制元件的响应函数。通过T7启动子驱动GFP表达的控制元件通过IPTG实现了96倍的大动态激活。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。(图20B)示出了用于构建重构的v3.2 nif基因簇的遗传部分(表5)。(图20C)重构的nif簇v3.2的活性。由1mM IPTG诱导固氮酶表达。(图20D)通过RNA-seq分析簇v3.2的转录部分的功能(图19)。计算启动子(左)和终止子(右)的性能(参见材料和方法)。(图20E)nif基因v3.2的翻译效率，如使用核糖体谱分析和RNA-seq计算的。线连接在同一操纵子中出现的点。(图20F)将防御假单胞菌Pf-5中的重构的v3.2 nif基因的核糖体密度(RD)与来自产酸克雷伯氏菌(→克雷伯菌属)中的天然产酸克雷伯氏菌簇的nif基因的测量RD进行比较。
图21包括示出茎瘤固氮根瘤菌ORS571中诱导型启动子的响应函数的图。用于表征诱导型启动子的质粒示出在每个图的顶部，并提供在表4中。遗传部分提供在表5中。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图22包括示出使用MUSCLE2产生的茎瘤固氮根瘤菌ORS571与类球红细菌(R.spheroides)2.4.1的NifA多重序列比对。概述了用于类球红细菌中的铵耐受性的对应残基。茎瘤固氮根瘤菌链对应于SEQ ID NO:293，并且类球红细菌链对应于SEQ ID NO:292。
图23A至图23B包括示出活化nifH启动子的NifA同源物的功能测试的图。(图23A)在大肠杆菌MG 1655和防御假单胞菌Pf-5中用nifH启动子和NifA的成对组合测试各种NifA活化nifH启动子的能力。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。(图23B)表4中显示并提供了用于通过NifA过表达测量nifH启动子活性的质粒。遗传部分提供在表5中。Pst表示施氏假单胞菌A1501；Avi表示棕色固氮菌DJ；Kox表示产酸克雷伯氏菌M5al
图24A至图24B包括示出在防御假单胞菌Pf-5和大肠杆菌MG1655中诱导nifH启动子的控制元件的优化的图。(图24A)通过RBS替换设计具有不同强度的控制元件，并用报告质粒(pMR103-105)进行测试，在所述质粒中，三个nifH启动子中的每一个启动子都与sfgfp融合(方法)。用0.5mM IPTG诱导nifH启动子。遗传部分和RBS序列分别提供在表5和表6中。(图24B)用报告质粒pMR106-108测试含有控制元件质粒pMR102的大肠杆菌MG1655中nifH启动子的活化。用防御假单胞菌Pf-5控制元件菌株MR10驱动产酸克雷伯氏菌的nifH启动子的表达，并用控制元件菌株MR9驱动施氏假单胞菌和棕色固氮菌的nifH启动子的表达。用0.05mM IPTG和0.5mM IPTG分别在大肠杆菌MG1655和防御假单胞菌Pf-5中诱导nifH启动子。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图25包括示出氧对nifH启动子的活性的影响的图。在顶部空间中的不同初始氧水平下，在含有控制元件质粒pMR102、防御假单胞菌Pf-5 MR10(对于产酸克雷伯氏菌)和MR9(对于施氏假单胞菌和棕色固氮菌)的大肠杆菌MG1655中分析自nifH启动子的表达。这三种nifH启动子分别在大肠杆菌MG1655和防御假单胞菌Pf-5中用0.05mM IPTG和0.5mM IPTG诱导，并在不同的初始氧浓度下孵育。氧对两种菌株中的nifH表达没有影响。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图26A至图26B包括描述固氮酶活性测定的图。(图26A)在顶部空间中的恒定氧水平下的固氮酶活性测定。本研究中用于分析固氮酶的耐氧性的实验设置。在低氧条件下使用预孵育进行固氮酶的表达诱导后，在用氧监测系统进行监测的同时，通过氧掺入(oxygenspiking)维持顶部空间中的目标氧浓度(方法)。(图26B)在大肠杆菌MG1655和防御假单胞菌Pf-5中在三个小时的时段内的固氮酶活性。
图27包括示出rnf和fix复合物对固氮酶活性的影响的图。在控制元件菌株防御假单胞菌Pf-5 MR9中分析质粒pMR25-28上的棕色固氮菌的经修饰的nif簇。表4中提供了从簇中缺失的区域。用0.5mM IPTG诱导固氮酶。从簇中去除rnf复合污会消除活性。不含fixABCX复合物的簇显示出与含复合物的簇相同的氧耐受性。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图28A至图28C包括示出大肠杆菌MG1655“Marionette”菌株5中的固氮酶活性调节的图。(图28A)用于驱动T7启动子表达的控制元件质粒。(图28B)用报告质粒pMR121(右)测试在12种感应元件的调控下的编码T7 RNAP的控制元件质粒对T7启动子的诱导性。(图28C)用携带pBBRl来源的重构的nif簇v2.1的质粒pMR136(右)对响应于12种诱导剂的固氮酶活性的诱导型控制。因为系统不是诱导型的，所以活性测定中省略了氯化胆碱诱导型系统。对于DAPG诱导型系统、DHBA诱导型系统和香草酸诱导型系统，重构的簇被携带在较低拷贝数的质粒pMR31(右)上，因为质粒pMR29的转化不产生菌落形成。诱导剂浓度是：400μM阿拉伯糖、1mM氯化胆碱、500nM3OC14HSL、50μM枯茗酸、25nM 3OC6HSL、25μM DAPG、500μMDHBA、1mMIPTG、100nM aTc、250μM柚皮素、50μM香草酸和250μM水杨酸。质粒和遗传部分提供在表4和表5中。误差棒表示来自三次单独实验的标准偏差。
图29包括用于评估NifA/RpoN的诱导型表达对茎瘤固氮根瘤菌ORS571中nifH启动子活性的影响的示意性质粒图谱。
图30A至图30B包括显示基于16S核糖体RNA序列的10种固氮细菌的系统发生关系的图。比例尺指示每个位点有2％的替代。基于进化接近度的簇被圈出。图30B示出了携带10个nif簇中的每一个nif簇的三种宿主菌株(大肠杆菌、防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌属种IRBG74)的相对固氮酶活性。结果表明，系统发生接近度对在缺乏内源nif簇的新宿主中实现最高固氮酶活性具有预测能力。
具体实施方式
豆科植物根瘤中的固氮是世界粮食生产的主要贡献者，因此该领域的实际应用引起了极大兴趣。豆科植物通过根瘤中驻留的细菌从空气中获得氮，所述细菌中的一些种也与谷类联合，但在这些条件下不固氮。禁用天然调节可以打开表达，即使存在氮肥和低O2的情况下也如此，但是连续的固氮酶生产赋予了能量负担。
本公开在一些方面中描述了以下令人惊讶的发现：细菌可以以将使细菌能够向谷类作物输送固定的氮的方式被遗传改变。描述了几种用于实施对生存在谷类的根部上或根部内的细菌中的固氮的控制的策略。可以采取至少两种方法。在一个实施方案中，天然调节被替换。在替代实施方案中，将nif簇从另一物种转移并置于诱导型控制之下。下面的实施例部分包括使用多种构建体对这两种方法在多个物种中的实现的描述。例如，对于茎瘤固氮根瘤菌，非铵依赖性控制可以使用感应元件来实现，所述感应元件驱动NifA突变体和RpoN在ΔnifA菌株中的共表达。根瘤菌属种IRBG74可以通过转移来自红细菌属的天然nif簇或来自克雷伯氏菌属的重构的簇，而被工程改造以在独立生存条件下表达功能性固氮酶。多种途径使防御假单胞菌Pf-5能够表达功能性固氮酶，所述功能性固氮酶从棕色固氮菌DJ转移nif簇产生了最高的活性和O2耐受性。
到目前为止，尚未证明当根瘤菌属菌株不能自然固氮时，其可以经工程改造以在独立生存条件下固氮。从豆科根瘤中分离的一些根瘤菌也是谷类内生菌，然而大多数根瘤菌在独立生存条件下(根瘤外部)不能固氮(Ramachandran,V.K.,East,A.K.,Karunakaran,R.,Downie,J.A.&Poole,P.S.Adaptation of Rhizobium leguminosarum to pea,alfalfaand sugar beet rhizospheres investigated by comparativetranscriptomics.Genome biology 12,R106(2011)；Frans,J.等人，Nitrogen Fixation33-44(Springer,1990))。已经有由于这些细菌导致的谷类产量提高的报道，包括根瘤菌属种IRBG74使稻增产20％，但这可能是由于其他生长促进机制，诸如改善养分摄取或根形成(Ramachandran,V.K.,East,A.K.,Karunakaran,R.,Downie,J.A.&Poole,P.S.Adaptationof Rhizobium leguminosarum to pea,alfalfa and sugar beet rhizospheresinvestigated bycomparative transcriptomics.Genome biology 12,R106(2011)；Delmotte,N.等人，An integrated proteomics and transcriptomics reference dataset provides new insights into the Bradyrhizobium japonicum bacteroidmetabolism in soybean root nodules.Proteomics 10,1391-1400(2010)；Hoover,T.R.,Imperial,J.,Ludden,P.W.&Shah,V.K.Homocitrate is a component of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase.Biochemistry 28,2768-2771(1989))。茎瘤固氮根瘤菌ORS571是一个例外，因为它能够在有氧独立生存和共生状态下固氮，已被证明是一种稻和小麦内生菌，并且不依赖植物代谢产物来产生功能性固氮酶。然而，当根瘤菌或固氮根瘤菌属种生存在谷类根部中时，有很低的固氮酶表达，并且15N2转移率表明任何报道的摄入都是由于细菌死亡。
谷类作物、固氮和细菌
谷类作物被广泛定义为因其谷粒(也称为颖果)的可食用组分而被种植的任何草，所述谷粒由胚乳、胚芽和麸皮组成。在世界的许多地方，谷类作物被认为是主要作物。它们以更大的量生长并且提供比世界上任何其他类型的作物更多的食物能量。谷类作物的非限制性示例包括玉米、黑麦、大麦、小麦、高粱、燕麦、粟和稻。如本文所用，术语“谷类作物”和“谷类植物”可互换使用。
固氮是大气中的氮作为氮循环的一部分被吸收到有机化合物中的过程。与特定豆科植物相关的大气氮的固定是与根瘤菌的高度特异性共生关系的结果。这些固有细菌生活在土壤中，负并且责在豆科植物的根部中形成根瘤作为用于固氮的部位。大多数根瘤菌共生仅限于豆科植物。此外，与农业上重要的温带豆科植物联合固氮的根瘤菌属菌株在其宿主范围方面通常被限制在单个豆科植物属。
nif基因是编码参与将大气氮固定为活生物体可利用的氮的形式的酶的基因。由nif基因编码的主要酶是固氮酶复合物，所述固氮酶复合物将大气中的氮(N2)转化为生物体可以处理的其他氮形式(例如氨)。如本文所用，术语“nif簇”是指包含nif基因的基因簇。如本文所用，术语“重构的”是指经工程改造的基因簇，即其基因以某种方式被重新排序、缺失或改变。
根瘤菌是固氮细菌。一般来说，它们是革兰氏阴性的、能动的、非孢子化的杆状。就分类学而言，它们分为两类：α变形菌和β变形菌。根瘤菌的非限制性示例包括茎瘤固氮根瘤菌、根瘤菌属种IRBG74、放射形根瘤菌(R.radiobacter)、发根根瘤菌(R.rhizogenes)、红根瘤菌(R.rubi)、葡萄根瘤菌(R.vitis)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、鹰嘴豆根瘤菌(根瘤菌属种)、大豆根瘤菌(慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum))、银合欢根瘤菌(根瘤菌属种)、三叶草根瘤菌(R.leguminosarum by trifolii)、菜豆根瘤菌(R.leguminosarumby phaseoli)和蚕豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum by viciae)(参见例如美国专利7,888,552，该美国专利以引入方式并入本文)。在一些实施方案中，本发明的根瘤菌是茎瘤固氮根瘤菌。在一些实施方案中，本发明的根瘤菌不是茎瘤固氮根瘤菌。
如本文所用，术语“独立生存条件”是指不在豆科根瘤内的细菌(例如根瘤菌)。它通常是指没有与另一种生物形成寄生(或依赖)关系或不在基质上的东西。如本文所用，术语“共生”是指生存在非常接近处的两个生物之间的相互作用。非常接近可以是约0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm、1μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm、500μm、1mm、1cm、5cm、10cm。非常接近也可以小于0.2μm。在许多情况下，共生关系是指互利的相互作用。
如本文所用，“有氧独立生存条件”是指细菌不在豆科根瘤内并且细菌在氧存在下的条件。有氧独立生存条件也可以称为在氧存在下的非共生或非寄生条件。如上所定义的，细菌可以非常接近于作物。
如本文所用，术语“内生菌”是指一组生物体，通常是真菌和细菌，它们在其生命周期的至少一部分中生存在活植物细胞内，而对植物细胞没有明显的有害影响。这与附生植物形成对比，附生植物是生长在另一种植物上的植物，不是寄生的。
如本文所用，术语“固氮生物”是指能够在没有外部固定氮源的情况下生长的微生物。该组包括一些细菌和一些古细菌。存在独立生存和共生的固氮生物。独立生存的固氮生物的示例是肺炎克雷伯氏菌。肺炎克雷伯氏菌是兼性厌氧菌—这些种可以在有或没有氧的情况下生长，但它们只能厌氧地固氮。
如本文所用，术语“α变形菌”是指属于变形菌门的不同种类的细菌。α变形菌的非限制性示例包括种类球红细菌和沼泽红假单胞菌。如本文所用，术语“γ变形菌”是指属于变形菌门的另一类细菌。所有变形菌都是革兰氏阴性的。如本文所用，术语“蓝细菌”是指通过光合作用获得其能量的细菌门。它们也被称为蓝藻。它们有特征性的内膜和类囊体，所述类囊体用于光合作用目的。如本文所用，术语“厚壁菌门”是指细菌门。该门包括杆菌纲、梭状芽孢杆菌和热石杆菌纲。
Nif基因
通常，固氮所需的基因一起出现在基因簇中，所述基因簇包括固氮酶亚基、金属原子子簇簇的生物合成、电子转运和调节蛋白。Nif基因是编码参与固氮的酶的基因。在大多数情况下，nif基因作为操纵子出现。这些基因中的一些基因编码固氮酶复合物的亚基，所述固氮酶复合物是赋予将大气中的氮(N2)转化为活生物体可利用的氮形式的能力的主要酶。在大多数基因中，nif基因转录的调控是由NifA蛋白进行的，所述NifA蛋白响应于氮水平。当氮缺乏时，NtrC激活NifA表达，NifA表达进而导致剩余nif基因的活化。当氮水平足够或过量时，由NifL编码的NifL蛋白抑制NifA活性。
Nif基因通路通常对小的表达变化很敏感。重要的基因包括形成固氮酶亚基的nifHDK。需要伴侣蛋白NifY来实现完全活性并扩大对表达水平变化的耐受性。NifJ和nif调控电子转运。nifUSVWZM操纵子编码用于早期Fe-S簇形成的蛋白质(NifUS)和用于组分成熟的蛋白质(用于组分I的NifVWZ，和用于组分II的NifM)，而nifBQ编码用于FeMo-co核心合成(NifB)和钼整合(NifQ)的蛋白质。NifEN耐受不同的表达水平。
表5中提供了各种nif基因的示例性序列。nif基因的非限制性示例包括nifH、nifD、nifK、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifX、nifB、nifQ、nifY、nifT、nifJ、nifF、nifX、nifU和nifS。
固氮和调控元件
固氮(nif)基因被组织成基因组簇，范围从类芽孢杆菌中的10.5kb单操纵子到分属于茎瘤固氮根瘤菌中的三个基因组位置的64kb。保守基因包括编码固氮酶(nifHDK)、FeMoCo生物合成和伴侣蛋白的保守基因。能够在更多条件下固氮的物种趋于具有较大的基因簇，所述较大的基因簇包括环境特异性的旁系同源物、替代电子转运途径和氧保护机制。往往，在更大的簇中的许多基因的功能是未知的。
有物种之间的nif簇的横向转移的进化证据(Pascuan,C.,Fox,A.R.,Soto,G.&Ayub,N.D.Exploring the ancestral mechanisms of regulation of horizontallyacquired nitrogenases.Journal of molecular evolution 81,84-89(2015)；Kechris,K.J.,Lin,J.C.,Bickel,P.J.&Glazer,A.N.Quantitative exploration of theoccurrence of lateral gene transfer by using nitrogen fixation genes as acase study.Proceedings of the National Academy of Sciences 103,9584-9589(2006))。然而，通过基因工程实现这种转移带来了挑战，因为许多事情可能会出错，包括调控、缺失基因和细胞内环境的差异(Frans,J.等人，Nitrogen Fixation33-44(Springer,1990)；Poudel,S.等人，Electron transfer to nitrogenase in different genomic andmetabolic backgrounds.Journal of bacteriology200,e00757-00717(2018)；Thony,B.,Anthamatten,D.&Hennecke,H.Dual control of the Bradyrhizobium japonicumsymbiotic nitrogen fixation regulatory operon fixR nifA:analysis of cis-andtrans-acting elements.Journal of bacteriology 171,4162-4169(1989)；Han,Y.等人，Interspecies Transfer and Regulation of Pseudomonas stutzeri A1501NitrogenFixation Island in Escherichia coli.Journal of microbiology and biotechnology25,1339-1348(2015))。固氮酶受到严格的控制，因为它对氧气敏感，并且能量上昂贵：它可以占细胞质量的高达20％，并且每个NH3需要约40个ATP。它也被氧气不可逆地钝化。nif基因的跨物种转录被固定的氮(氨)和氧强烈抑制，其中这些信号集中在与σ因子RpoN协同工作的NifA调节蛋白上。多样的、物种特异性、并且通常不为人理解的信号控制着这些调节物，包括植物产生的化学物质、ATP、还原力、温度和碳源。那些能够在更大范围的环境条件下固氮的细菌趋于受更复杂的调节网络的控制。
当nif簇从一个物种转移到另一个物种时，它通过环境刺激保持其调节，或者具有不受调节的组成型表型。维持天然调节，特别是铵抑制，限制了它们在农业中的使用，因为这种水平可能根据土壤类型、灌溉和施肥而波动。固氮生物已经工程改造以通过破坏NifL或突变NifA并将整个簇置于T7 RNA聚合酶(RNAP)的控制之下来降低氨敏感性。固氮酶的组成型表达也是非期望的，因为它给细胞带来了适应性负担。例如，当来自施氏假单胞菌A1501的nif簇被转移到防御假单胞菌Pf-5时，据报道这导致足够的氨产量来支持玉米和小麦的生长，但是当与土壤中的其他物种竞争时，所述细菌在一个月后迅速下降。即使在细菌被引入土壤之前，组成型活性也是有害的，这会影响产量、配方和长期存储。因此，不受控制的固氮酶产生可能导致更昂贵的生产、更短的保质期和更多的田间可变性。
本公开的nif簇或nif基因的重要方面是它们可以各自处于调控元件的控制下。在一些实施方案中，2个或更多个基因处于调控元件的控制下。在一些实施方案中，所有基因都处于调控元件的控制下。调控元件也可以是活化元件或抑制元件。活化元件是这样的核酸序列，所述核酸序列当与待表达的核酸一起出现在情境中时，将引起该核酸在活化信号存在下的表达。抑制信号是这样的核酸序列，所述核酸序列当与待表达的核酸一起出现在情境中时，将导致该核酸的表达，除非存在抑制信号。活化元件和抑制元件中的每个元件可以是启动子，诸如噬菌体T7启动子、σ70启动子、σ54启动子、lac启动子等。如本文所用，术语“启动子”旨在是指那些足以使可操作连接的DNA分子转录的调控序列。启动子可以是组成型的或诱导型的。如本文所用，术语“组成型启动子”是指始终开启的启动子(即导致恒定水平的转录)。组成型启动子的示例包括但不限于σ70启动子、bla启动子、lacI.启动子等。诱导型启动子的非限制性示例显示在表1中。PAllacO1启动子是可用于本发明中的诱导型启动子的另一个示例。
表1：调控元件(例如诱导型启动子、阻遏物)的示例。
Figure BDA0003307346880000231
诱导型启动子允许调控基因表达，并且可以由外源供应的化合物、环境因素诸如温度或特定生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态)的存在来调节，或者仅在复制细胞中调节。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad获得。许多其他系统已经进行了描述，并且可以由本领域技术人员容易地选择。由外源供应的启动子调控的诱导型启动子的示例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统[WO98/10088]；蜕皮激素昆虫促进剂[No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)]、四环素抑制系统[Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)]、四环素诱导系统[Gossen等人，Science,268:1766-1769(1995),还参见Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998)]、RU486诱导系统[Wang等人，Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人，Gene Ther.,4:432-441(1997)]和雷帕霉素诱导系统[Magari等人，J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997)]。在本上下文中可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中调控的启动子。
如本文所用，术语“终止子”(称为转录终止子)是在转录期间标记基因组DNA中基因或操纵子的末端的一段核酸序列。它们会停止聚合酶的转录。终止子可以分为几组。在第一组终止信号处，核心酶可以在没有任何其他因素(如在体外测试的)的情况下在体外在某些位点处终止。这些终止位点被称为内在终止子或也称为I类终止子。内在终止子通常共享一个共同的结构特征，即所谓的发夹或茎环结构。在一个方面，发夹包含由具有二联体对称结构的富含dG-dC的序列编码的茎结构。另一方面，终止子也在直接跟在茎结构之后的3'末端显示出富含dA-dT的区。当RNA聚合酶停留在发夹结构处时，3'末端处的富含尿苷的区域被认为有助于转录物的释放。如果两个或更多个终止子彼此定位为提供先前编码序列的协同终止，则它们可以可操作地连接。特别优选地，终止子序列在编码序列的下游，即在编码序列的3'位置上。终止子可以是例如在编码序列下游或与编码序列直接相邻的至少1个、至少10个、至少30个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个核苷酸。终止子的示例包括但不限于T7终止子、rrnBTl、L3S2P21、tonB、rrnA、rrnB、rrnD、RNAI、crp、his、ilvλ、M13、rpoC和trp(参见例如美国专利9,745,588，该美国专利以引用方式并入本文)。
RpoN
如本文所用，“RpoN”是指编码大肠杆菌和其他细菌物种的蛋白质σ因子σ-54(o54，σN，或称RpoN)的基因。σ因子是促进RNA聚合酶至特定起始位点的附接然后释放的起始因子。细菌通常只有一个替代σ因子σ54或RpoN的功能性拷贝，该替代σ因子调节复杂的遗传网络，该复杂的遗传网络延伸到细菌生理学的各个方面，包括新陈代谢、在艰苦环境中的生存、毒力因子的产生和生物膜的形成。RpoN是大肠杆菌中启动子引发的转录所需的七个RNA聚合酶σ亚基之一，并且RpoN在大肠杆菌对氮限制条件的响应中起主要作用。在此类条件下，RpoN指导氮调节(Ntr)反应中至少14个大肠杆菌操纵子/调节物的转录。RpoN在细菌的抗胁迫(如抗渗透胁迫)和毒力方面也起着重要作用。RpoN在结构和功能上不同于其他大肠杆菌σ因子。它能够在没有核心RNA聚合酶的情况下结合启动子DNA，并且它识别具有位于转录起始位点上游-24至-12个核苷酸的保守GG和GC元件的启动子序列。此外，如NtrB和NtrC的调节蛋白可以活化σ54全酶。
不受理论或机制的束缚，据信RpoN与NifA协同工作以开启nif簇的转录。表5中提供了RpoN的示例性序列。
基因簇核酸
如本文所用，“基因簇”或“遗传簇”是指编码基因产物的两个或更多个基因的集合。目标、天然存在的或野生型遗传簇可以用作用于重构的原始模型。在一些实施方案中，基因产物是酶。在一些实施方案中，遗传簇的基因产物在生物合成途径中起作用。在一些实施方案中，基因簇编码nif固氮途径的蛋白质。
遗传簇可以编码生物合成途径的蛋白质。如本文所用的生物合成途径是指在生物系统中发现的涉及多于一种蛋白质的任何途径。在一些情况下，这些途径涉及2-1,000种蛋白质。在其他情况下，生物合成途径中涉及的蛋白质数量可以是2-500个、2-100个、5-1000个、5-500个、5-100个、5-10个、10-1,000个、10-900个、10-800个、10-700个、10-600个、10-500个、10-400个、10-300个、10-200个、10-100个、50-1,000个、50-500个、50-100个、100-1,000个或100-500个。生物合成途径的示例包括但不限于固氮途径。
在一些情况下，重构的遗传簇具有天然存在的非编码DNA、天然存在的调控序列、和/或非必需基因，所述非必需基因已经从至少一个或在一些情况下所有的转录单位中去除。这些可以被合成的调控序列替代，根本不被替代或被间隔区替代。间隔区只是指一组核苷酸或其类似物，所述一组核苷酸或其类似物不具有诸如编码蛋白质或以任何方式调控基因簇活性的功能。
遗传簇中的遗传组分通常将包括至少一个调控元件。合成调控元件是在调控基因表达中起作用并且不同于天然存在的调控元件的任何核酸序列。例如，它可能与天然存在的元件相差单个核苷酸。在一些情况下，它是外源性调控元件(即与天然存在的形式不相同)。因此，“调控元件”是指具有影响转录或翻译起始或速率，或转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、核酶、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(UTR)、转录起始位点、转录终止子序列、多腺苷酸化序列、内含子，以及它们的组合。
遗传簇可以在生物体内表达，或在体外在细胞中表达。生物体或细胞可以是任何可以引入DNA的生物体或细胞。例如，生物和细胞可以包括原核生物和真核生物(即酵母、植物)。原核生物包括但不限于蓝细菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、梭菌属和红球菌属。真核生物包括例如藻类(微拟球藻)，酵母诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、植物细胞、哺乳动物细胞。因此，本公开的一些方面涉及工程改造细胞以表达来自经修饰的遗传簇的蛋白质。
在本公开的一些实施方案中，提供了一种遗传簇，所述遗传簇包括与天然存在的遗传簇序列的全长具有至少约85％或更多同源性或同一性，例如与全长天然存在的遗传簇序列具有至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％或更多同源性或同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与天然存在的遗传簇序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性或同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与遗传簇序列在其片段或更保守(诸如关键)的区域中具有至少约85％，例如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性或同一性，但在该区域之外具有较低的序列同一性。本公开还提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少约85％，例如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；或者一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与如本文所述的任何氨基酸具有至少约85％，例如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
序列之间的同源性或序列同一性的计算(这些术语在本文中可互换使用)如下执行。为了确定两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位，并且为了比较目的，可以忽略非同源序列)。为了比较的目的而比对的参考序列的长度是参考序列的长度的至少80％，并且在一些实施方案中是参考序列的长度的至少90％或100％。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸占据时，则该位置处的分子是相同的(如本文所用，核酸“同一性”等同于核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位的数量和每个空位的长度，所述空位为了两个序列的最佳比对而需要引入。
在一些实施方案中，基因簇是天然基因簇。在一些实施方案中，基因簇是重构的基因簇。在一些情况下，核酸可包括非天然存在的核苷酸和/或取代，即糖或碱基取代或修饰。
一个或多个取代的糖部分包括例如在2'位置处的以下中的一者：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)n CH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)n CH3，其中n是1至约10；Ci至C10是低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告基因基团；嵌入剂；用于改善核酸的药代动力学性质的基团；或用于改善核酸和其他具有类似性质的取代基的药效学性质的基团。也可以在核酸的其他位置处，特别是3'末端核苷酸上糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置处进行类似的修饰。核酸也可以具有糖模拟物，诸如环丁基代替戊呋喃糖基。
核酸还可以另外地或替代地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括在天然核酸中很少或短暂发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，并且在本领域中通常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC、异胞嘧啶、假异胞嘧啶；以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤和2,6-二氨基嘌呤或其他二氨基嘌呤。参见例如Kornberg,“DNA Replication,”W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,1980，第75-'7'7页；和Gebeyehu,G.等人，Nucl.Acids Res.,15:4513(1987))。也可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。
将表达载体或表达构建体递送到细胞中，例如递送到细菌、酵母或植物细胞中的方法是本领域技术人员熟知的。核酸，包括表达载体，可以通过相关生物领域中的技术人员熟知的各种方法递送至原核和真核细胞。用于将核酸递送至细胞的方法包括但不限于不同的化学、电化学和生物学方法，例如热休克转化、电穿孔、转染，例如脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或磷酸钙转染。在一些实施方案中，使用用于转移遗传物质的媒介物或载体将核酸构建体，例如包含融合蛋白核酸序列的表达构建体引入宿主细胞中。用于将遗传物质转移至细胞的载体是本领域技术人员所熟知的，并且包括例如质粒、人工染色体和病毒载体。用于构建核酸构建体，包括包含组成型或诱导型异源启动子的表达构建体、敲除和敲低构建体、以及用于将核酸或核酸构建体递送至细胞的方法和载体是本领域技术人员熟知的，并且描述于例如J.Sambrook和D.Russell,Molecular Cloning:ALaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；第3版(2001年1月15日)；DavidC.Amberg,Daniel J.Burke；和Jeffrey N.Strathern,Methods in Yeast Genetics:ACold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2005年4月)；John N.Abelson,Melvin I.Simon,Christine Guthrie和GeraldR.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，部分A，第194卷(Methods inEnzymology Series,194),Academic Press(2004年3月11日)；Christine Guthrie和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology，部分B，第350卷(Methods in Enzymology，第350卷),Academic Press；第1版(2002年7月2日)；Christine Guthrie和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular andCell Biology，部分C，第351卷，Academic Press；第1版(2002年7月9日)；GregoryN.Stephanopoulos,Aristos A.Aristidou和Jens Nielsen,Metabolic Engineering:Principles and Methodologies,Academic Press；第1版(1998年10月16日)；和ChristinaSmolke,The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Fundamentals,CRC Press；第1版(2009年7月28日)中，所有这些以引用方式并入本文。
系统发生分析
本公开还提供了选择与宿主细菌相容的供体细菌的nif簇的方法。这些方法涉及对供体细菌和宿主细菌进行系统发生分析。
系统发生分析是一种估计进化关系的方法。在分子系统发生分析中，共同基因或蛋白质的序列可以用来评定物种的进化关系。在一些实施方案中，系统发生分析是基于rRNA(例如，全长16S rRNA基因)序列执行的。这些序列包括例如产酸克雷伯氏菌BWI76_05380；棕色固氮菌Avin_55000；类球红细菌DQL45_00005；蓝丝菌属ATCC51142、cce_RNA045；巴西固氮螺菌AMK58_25190；沼泽红假单胞菌RNA_55；防御假单胞菌PST_0759；类芽孢杆菌属种WLY78、JQ003557。在一些实施方案中，可以使用MUSCLE生成多重序列比对(Edgar,R.C.J.N.a.r.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy andhigh throughput.32,1792-1797(2004))。然后使用Jukes-Cantor距离模型和UPGMA作为树构建方法来构建系统发生树。
如图30A和图30B所示，系统发生接近度具有对在新宿主中转移nif簇的固氮酶活性的预测能力。在一些实施方案中，宿主细菌和供体细菌属于相同的属、科、目或纲。在一些实施方案中，所述供体细菌选自克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、蓝丝菌属(Cyanothece)或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。
在一些实施方案中，基于供体细菌与宿主细菌之间的系统发生分析的进化距离小于参考值。例如，所述参考值是16S核糖体RNA基因序列中每个位点10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的取代。在一些实施方案中，参考值是系统发生树上的5亿年、4亿年、3亿年、2亿年、1亿年、5000万年或1000万年。
这些方法还可涉及将nif簇转移到宿主细菌并确定固氮酶活性。
经遗传修饰的植物
在一些实施方案中，本公开的特征在于包含至少一种本文所述的重组核酸构建体的经遗传修饰的植物细胞和植物(例如，经遗传修饰的谷类植物或细胞)。在一些实施方案中，核酸构建体可编码例如化学信号合成肽，所述化学信号合成肽在有义取向上可操作地连接至一个或多个调控区。在一些实施方案中，化学信号合成肽是冠瘿碱生物合成多肽(例如，来自根癌农杆菌(A.tumefaciens))，诸如章鱼碱合酶或胭脂碱合酶。在一些实施方案中，化学信号合成肽可以产生化学信号，经遗传工程改造的细菌可以响应于该化学信号。应当理解的是，由于遗传密码简并性，许多核酸可以编码特定的冠瘿碱生物合成多肽；即，对于许多氨基酸来说，有多于一个核苷酸三联体作为氨基酸的密码子。因此，给定的冠瘿碱生物合成多肽的编码序列中的密码子可以经修饰，使得使用用于该特定植物物种的合适密码子偏好表获得了该物种中的表达。
在一些情况下，调控区是组成型启动子。在一些情况下，调控区是诱导型启动子。在一些情况下，调控区是根活性启动子，所述根活性启动子可以赋予在根组织，例如根内皮、根表皮或根维管组织中的转录。在一些实施方案中，根活性启动子可包括CaMV 35S启动子的根特异性亚结构域(Lam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:7890-7894(1989))，Conkling等人，Plant Physiol.,93:1203-1211(1990)的根细胞特异性启动子，或烟草RD2启动子。
如本文所述，谷类植物或植物细胞可以通过具有整合到其基因组中的核酸构建体来转化，即可以稳定地转化。稳定转化的细胞通常在每次细胞分裂时保留引入的核酸。也可以瞬时转化植物或植物细胞，使得构建体不整合到其基因组中。瞬时转化的细胞通常随着每次细胞分裂丢失全部或某一部分引入的核酸构建体，使得在足够数量的细胞分裂后，无法在子细胞中检测到导入的核酸。瞬时转化和稳定转化的转基因植物和植物细胞都可用于本文所述的方法中。
本文所述的方法中使用的经遗传修饰的植物细胞可以构成整个植物的一部分或全部。此类植物可以在生长室、温室或田间以适合所考虑物种的方式生长。如本文所用，经遗传修饰的植物也指经初始工程改造的植物的子代，前提条件是该子代继承该构建体。由经修饰的植物产生的种子可以生长，然后自交(或异交和自交)以获得对于核酸构建体纯合的种子。
经修饰的植物可以在悬浮培养物、或组织或器官培养物中生长。当使用固体培养基时，经修饰的植物细胞可以直接放在培养基上，或者放在过滤器上，然后将过滤器放置成与培养基接触。当使用液体培养基时，经修饰的植物细胞可以放置到浮选装置，例如接触液体培养基的多孔膜上。固体培养基可以是例如含有琼脂和合适浓度的生长素(例如，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D))和合适浓度的细胞分裂素(例如，激动素)的Murashige和Skoog(MS)培养基。
当使用经瞬时转化的植物细胞时，编码具有报告分子活性的报告分子多肽的报告基因序列可被包括在转化工序中，并且用于报告分子活性或表达的测定可以在转化后的合适时间执行。用于进行测定的合适时间通常是转化后约1-21天，例如约1-14天、约1-7天、或约1-3天。瞬时测定的使用对于不同物种中的快速分析特别方便，或者用于确认多肽的表达，所述多肽的表达先前尚未在特定的受体细胞中确认。
用于将核酸引入植物的技术是已知的，并且包括但不限于农杆菌属介导的转化、病毒载体介导的转化、电穿孔和粒子枪转化，例如美国专利第5,538,880号；第5,204,253号；第6,329,571号和第6,013,863号。如果细胞或培养的组织用作转化的受体组织，则如果需要的话，可以通过本领域技术人员已知的技术使植物从转化的培养物再生。
可以筛选和/或选择经修饰的植物群体中在由转基因表达所赋予的期望位置处(例如，在根中)产生所述化学信号(例如，冠瘿碱)的群体成员。例如，可以筛选单一转化事件的子代群体中的那些具有所需多肽或核酸表达水平的植物。
固氮酶活性的控制
在一些实施方案中，本公开提供了一种经遗传工程改造的细菌，所述经遗传工程改造的细菌包含响应于化学信号(例如，环境信号或人工信号)调节固氮酶活性的调控序列或遗传感应元件。在一些实施方案中，化学信号可以是环境信号，诸如氨、IPTG或氧。在一些实施方案中，nif簇被置于能够响应于化学信号的遗传感应元件的控制之下。在一些实施方案中，遗传感应元件可以响应于生物防治剂或所添加的肥料和其他处理的组分(例如，DAPG)。在一些实施方案中，遗传感应元件可以响应于来自植物的根渗出物，包括例如糖诸如阿拉伯糖，激素诸如水杨酸、类黄酮诸如柚皮素、抗菌剂诸如香草酸，以及各种可以重塑微生物群落的化学物质(例如，枯茗酸)。在一些实施方案中，遗传感应元件可以响应于由其他细菌释放的化学物质，包括例如3,4-二羟基苯甲酸(DHBA)、3OC6HSL或3OC14HSL。
在一些实施方案中，使用针对化学物质的感应元件来构建控制元件。在一些实施方案中，使用大肠杆菌的“Marionette”菌株来作为nif簇的宿主，所述菌株在基因组中包括针对例如香草酸、DHBA、枯茗酸、3OC6HSL和3OC14HSL的感应元件。在一些实施方案中，使用感应元件的输出启动子来表达T7 RNA聚合酶。在一些实施方案中，阿拉伯糖和柚皮素感应元件用于表达NifA，这导致nifH启动子和固氮酶活性的诱导。在一些实施方案中，阿拉伯糖和柚皮素感应元件用于表达NifA，这导致在防御假单胞菌Pf-5中nifH启动子和固氮酶活性的诱导。在一些实施方案中，使用DAPG感应元件来驱动T7 RNAP，所述T7 RNAP然后诱导固氮酶活性。在一些实施方案中，使用DAPG感应元件来驱动T7 RNAP，所述T7 RNAP然后诱导根瘤菌属中IRBG74中的固氮酶活性。在一些实施方案中，使用水杨酸感应元件来控制NifAL94Q /D95Q/RpoN表达，所述NifAL94Q/D95Q/RpoN然后激活固氮酶活性。在一些实施方案中，使用水杨酸感应元件来控制NifAL94Q/D95Q/RpoN表达，所述NifAL94Q/D95Q/RpoN然后激活茎瘤固氮根瘤菌中的固氮酶活性。
在一些实施方案中，植物经工程改造以释放正交化学信号，所述正交化学信号可以被对应的经工程改造细菌感测到。这将具有的益处是只有在经工程改造的作物存在下才能诱导固氮酶。在一些实施方案中，豆科植物和拟南芥经工程改造以产生冠瘿碱，包括胭脂碱和章鱼碱。在一些实施方案中，经工程改造的细菌包含针对胭脂碱和章鱼碱的感应元件。在一些实施方案中，经工程改造的细菌包含LysR型转录激活物OccR(章鱼碱)和NocR(胭脂碱)以及它们的对应启动子。在一些实施方案中，使用针对胭脂碱和章鱼碱的感应元件来控制NifAL94Q/D95Q/RpoN的表达，所述NifAL94Q/D95Q/RpoN然后活化固氮酶活性。
本公开还提供了选择nif簇或用于nif簇的调控元件的方法。这些方法包括基于测序数据计算遗传部分的强度。在一些实施方案中，根据本文所述的方法进行RNA-seq和核糖体足迹谱分析。在一些实施方案中，为了生成每个nif簇的RNA-seq读段谱，可以将原始迹线谱乘以例如至少或约105、106、107、108或109，并通过来自每个物种的编码序列的相应总读段进行归一化。在一些实施方案中，使用映射到基因上的总测序读段来估计每个基因的mRNA表达水平，表示每百万个片段映射单位每千碱基转录物的片段(FPKM)。
在一些实施方案中，启动子的活性被定义为转录起始位点vtss周围的RNAP通量δJ的变化。在一些实施方案中，使用以下等式计算启动子强度或调控元件强度：
Figure BDA0003307346880000351
其中m(i)是来自FPKM归一化转录组谱的每个位置i处的转录本数量，γ＝0.0067s-1是mRNA的降解速率，并且n是xtss之前和之后的窗口长度。在一些实施方案中，窗口长度被设置为十。在一些实施方案中，Ts被定义为终止子之前和之后转录的减少倍数，所述减少倍数可以从FPKM归一化的转录组谱量化为：
Figure BDA0003307346880000352
其中xo和x1分别是终止子部分的开始和结束位置。翻译效率通过核糖体密度除以FPKM来计算。
定义
如本文所用，等同术语“表达”或“基因表达”是指将DNA分子转录成RNA，并将这种RNA翻译成多肽。
如本文所用，“基因簇”是指编码基因产物的一组两个或更多个基因。如本文所用，“nif基因簇”是指编码固氮基因的一组两个或更多个基因。
关于基因的“外源性”指示核酸或基因不处于其天然(自然)环境中。例如，外源基因可以指来自不同物种的基因。相比之下，关于基因的“内源性”指示基因处于其天然环境中。如本文所用，术语“内源性”和“天然的”可互换使用。
如本文所用，术语“缺失”或“缺失的”是指从序列或簇中去除基因(例如内源基因)。如本文所用，术语“改变”或“改变的”是指基因中一个或多个核苷酸的修饰或基因中一个或多个碱基对的缺失。这种改变可能会使基因发生功能障碍。本文中，“ΔnifA”指其中NifA被缺失或改变的菌株或簇。在基因的情形中，缺失和改变的方法是本领域中已知的。
如本文所用，术语“化学信号”是指化合物。任何由两种或更多种不同类型的原子(化学元素)以固定的化学计量比组成的物质都可以称为化合物。化学信号可以是合成的或天然的化合物。在本发明的一些实施方案中，本公开的细菌或本公开的感应元件处于化学信号的控制之下。在一些实施方案中，该信号是天然生物信号(例如根渗出物、生物防治剂等)。在一些实施方案中，化学信号是来自细菌的群体感应信号。化学信号的非限制性示例包括根渗出物(如下文所定义)、生物防治剂(如下文所定义)、植物激素、香草酸盐、IPTG、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸，3,4-二羟基苯甲酸、3OC6HSL和3OC14HSL。
如本文所用，术语“根渗出物”是指植物根响应于其环境而分泌或散发的化学物质。这些允许植物操纵或改变它们的直接环境，特别是它们的根际。根渗出物是可溶性有机物质的复杂混合物，所述复杂混合物可包含糖、氨基酸、有机酸、酶和其他物质。根渗出物包括但不限于离子、基于碳的化合物、氨基酸、甾醇、糖、激素(植物激素)、类黄酮、抗菌剂和许多其他化合物。渗出物可以用作阳性调节剂，或阴性调节剂。
如本文所用，术语“植物激素”是指植物激素，并且它们是由植物产生的影响植物中的诸如发芽、生长和代谢的过程的各种激素中的任何一种。
如本文所用，术语“香草酸盐”是指甲氧基苯甲酸盐，所述甲氧基苯甲酸盐是香草酸的共轭碱。它是一种植物代谢产物。
生物防治是一种使用其他生物防治害虫诸如昆虫、螨虫、杂草和植物病害的方法。昆虫害虫的天敌，也称为生物防治剂，包括捕食者、寄生物、病原体和竞争者。植物病害的生物防治剂最常被称为拮抗剂。杂草的生物防治剂包括种子捕食者、食草动物和植物病原体。本发明的诱导型簇或启动子可以通过生物防治剂的分泌(或以其他方式与之相关的化学物质)来调节。在此，它被称为“生物防治剂”。
无需进一步阐述，据信本领域技术人员能够基于以上描述来最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物均出于本文提及的目的或主题以引用方式并入。
实施例
在此，将诱导型固氮酶活性在两种谷类内生菌(茎瘤固氮根瘤菌ORS571和根瘤菌属种IRBG74)和附生菌防御假单胞菌Pf-5(一种玉米种子接种物)中进行工程改造。对于每种生物体，采取不同的策略来消除铵抑制并将固氮酶的表达置于农业相关信号，包括根渗出物、生物防治剂和植物激素的控制之下。本公开证明了根瘤菌属种(例如，IRBG74)可以经工程改造以在独立生存条件下固氮，特别是通过转移来自红细菌属或克雷伯氏菌属的nif簇。对于防御假单胞菌Pf-5来说，从棕色固氮菌转移诱导型簇产生了最高的氨和氧耐受性。总的来说，来自12个nif基因簇在不同物种(包括大肠杆菌和12个附加根瘤菌属)之间转移的数据有助于鉴定出必须克服的障碍，以工程改造细菌来向谷类作物递送高氮通量并提供解决方案，使得根瘤菌能够经工程改造以在独立生存条件下固氮。
材料和方法
细菌菌株和生长培养基。本研究中使用的所有细菌菌株及其衍生物列于表2中。使用大肠杆菌DH10-β(New England Biolabs,MA,目录号C3019)进行克隆。使用大肠杆菌K-12MG1655进行固氮酶测定。防御假单胞菌Pf-5从ATCC获得(BAA-477)。本研究中使用的菌株列于表3中。对于富培养基，使用LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl)、LB-Lennox培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl))和TY培养基(5g/L胰蛋白胨、3g/L酵母提取物、0.87g/L CaCl2·2H2O)。对于基本培养基，使用BB培养基(0.25g/LMgSO4·7H2O、1g/L NaCl、0.1g/L CaCl2·2H2O、2.9mg/L FeCl3、0.25mg/L Na2MoO4-2H2O、1.32g/L NH4CH3CO2、25g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4 pH[7.4])、UMS培养基(0.5g/L MgSO4·7H2O、0.2g/LNaCl、0.375mg/L EDTA-Na2、0.16ZnSO4·7H2O、0.2mg/LNa2MoO4-2H2O、0.25mg/LH3BO3、0.2mg/L MnSO4H2O、0.02mg/LCuSO4-5H2O、1mg/L COCl2-6H2O、75mg/L CaCl2-2H2O、12mg/LFeSO4-7H2O、1mg/L盐酸硫胺素、2mg/L D-泛酸半钙盐、0.1mg/L生物素、87.4mg/LK2HPO、4.19g/L MOPS pH[7.0])、和Burk培养基(0.2g/L MgSO4-7H2O、73mg/L CaCl2.2H2O、5.4mg/L FeCl3·6H2O、4.2mg/L Na2MoO4-2H2O、0.2g/L KH2PO4、0.8g/L K2HPO4 pH[7.4])。以以下浓度(μg/mL)使用抗生素：大肠杆菌(卡那霉素，50；壮观霉素，100；四环素，15；庆大霉素，15)。防御假单胞菌Pf-5(卡那霉素，30；四环素，50；庆大霉素，15；羧苄青霉素，50)。根瘤菌属种IRBG74(新霉素，150；庆大霉素，150；四环素，10；呋喃妥因，10)。茎瘤固氮根瘤菌(卡那霉素，30；庆大霉素，15；四环素，10；呋喃妥因，10)。表7中列出了本研究中使用的包括诱导剂在内的化学物质。
菌株构建。为了提高根瘤菌属种IRBG74中的转化效率，通过缺失hsdR使I型限制性修饰系统失活，所述hsdR编码用于外源DNA的限制性酶(该菌株是所有实验的基础)(Ferri,L.,Gori,A.,Biondi,E.G.,Mengoni,A.&Bazzicalupo,M.J.P.Plasmid electroporationof Sinorhizobium strains:The role of the restriction gene hsdR in type strainRml021.63,128-135(2010))。利用sacB无标记插入法以允许通过同源重组用合成部分替换天然基因座。通过PCR扩增hsdR基因侧翼约500bp的两个同源臂，克隆并产生自杀质粒pMR-44。通过三亲本杂交将自杀质粒动员到根瘤菌属种IRBG74中。选择对庆大霉素有抗性的单交换重组体，随后使其生长并铺板在补充有15％蔗糖的LB平板上，以诱导含有将蔗糖转化为毒性产物(果聚糖)的反向选择性标记物sacB的载体DNA部分的缺失。使用pMR45-46顺序地使根瘤菌属种IRBG74的包含nifHDKENX(基因组位置219.579-227,127)和nifSW-fixABCX-nifAB-fdxN-nifTZ(基因组位置234,635-234,802)在内的两个天然nif基因簇缺失。为了提高遗传稳定性，使用质粒pMR47使recA基因缺失。除非另外指明，否则根瘤菌属种IRBG74Δnif hsdR,recA菌株是所有实验的基础。通过PCR扩增nifA基因侧翼约900bp的两个同源臂，克隆并产生自杀质粒pMR-47以在茎瘤固氮根瘤菌ORS571中产生nifA缺失。将大肠杆菌中的自杀质粒pMR47通过三亲杂交动员到茎瘤固氮根瘤菌中。选择单交换重组体的庆大霉素抗性，随后使其生长并铺板在补充有15％蔗糖的普通TY平板上以诱导载体DNA部分的缺失。通过庆大霉素敏感性和诊断性PCR证实所有无标记缺失。表3中提供了突变株的列表。
质粒系统。具有pBBRl来源的质粒来源于pMQ131和pMQ132。具有pRO1600来源的质粒来源于pMQ80。具有RK2来源的质粒来源于pJP2。具有RSF1010来源的质粒来源于pSEVA651。具有IncW来源的质粒来源于pKT249。本研究中使用的质粒提供于表4中。
nif簇的系统发生分析。基于全长16S rRNA基因序列执行系统发生分析(产酸克雷伯氏菌BWI76_05380；棕色固氮菌Avin_55000；类球红细菌DQL45_00005；蓝丝菌属ATCC51142、cce_RNA045；巴西固氮螺菌AMK58_25190；沼泽红假单胞菌RNA_55；防御假单胞菌PST_0759；类芽孢杆菌属种WLY78、JQ003557)。使用MUSCLE生成多重序列比对(Edgar,R.C.J.N.a.r.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and highthroughput.32,1792-1797(2004))。使用Geneious软件(R9.0.5)，以及Jukes-Cantor距离模型和UPGMA作为树构建方法，以及来自1000个重复的自展值构建系统发生树。
nif簇构建。为了获得在携带用于质粒接合转移的转移起点(oriT)的可移动质粒上的大nif簇，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒，按照用于革兰氏阴性细菌的分离方案(Promega，目录号A1120)纯化来自产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌、棕色固氮菌、茎瘤固氮根瘤菌和类球红细菌的基因组DNA。蓝丝菌属ATCC51142、巴西固氮螺菌ATCC29729、沼泽红假单胞菌ATCC BAA-98和重氮营养葡糖醋杆菌ATCC49037的基因组DNA从ATCC获得。通过PCR使用引物组(表2)将每个nif簇扩增成在簇的5'和3'最末端在上游和下游有45bp接头的几个片段(4-10kb)，并使用酵母重组工程装配到用于大肠杆菌和根瘤菌的线性化大肠杆菌-酵母穿梭载体pMR-1和用于防御假单胞菌Pf-5的pMR-2上。对于类芽孢杆菌属种WLY78的nif簇，从重叠群ALJV01收集DNA序列信息，并通过GeneArt基因合成(Thermo FisherScientific,MA)合成nif簇的DNA为四个片段，所述四个片段用作用于PCR扩增和装配的模板。通过一锅酵母装配工序，将两个至八个扩增的片段(表2)与线性化的载体装配成单个大质粒(Shanks,R.M.等人，Saccharomyces cerevisiae-based molecular tool kit formanipulation of genes from gram-negative bacteria.72,5027-5036(2006))。一旦装配，就使用Zymoprep酵母迷你制备试剂盒(Zymo Research目录号D2004)从酵母中分离出nif簇质粒，并转化到大肠杆菌中。从大肠杆菌中分离出纯化的质粒，并测序以验证正确的装配和序列(MGH CCIB DNA Core facility,Cambridge,MA)。存储含有无突变质粒的大肠杆菌以供用于进一步实验。表4中提供了含有nif簇的质粒。
重构的nif v3.2的构造。从具有天然克雷伯氏菌属nif簇的质粒pMR-3扩增出六个转录单位(nifHDKTY、nifENX、nifJ、nifBQ、nifF、nifUSVWZM)。将每个单位分成6个1级模块质粒，其中nif基因前面是终止子。将T7启动子野生型或T7启动子变体PT7.P2放置在终止子与转录单位的第一基因之间。将装配接头(约45bp)放置在单位的两端处。表4和表5中提供了1级质粒(pMR32-37)。通过用限制性酶消化将六个质粒中的每一个线性化，并通过一锅酵母装配工序与线性化的pMR-1或pMR-2载体装配成单个大质粒，从而产生pMR38和pMR39。
转化。使用电穿孔将质粒转移到防御假单胞菌Pf-5中。将单个菌落接种在4mL的LB培养基中，并在30℃以250rpm振荡培养16小时。将细胞沉淀用2mL的300mM蔗糖洗涤两次，并在室温下溶于100μl的300mM蔗糖中。将总共50-100ng的DNA进行电穿孔，并在1mL的LB培养基中回收1小时，然后铺板在选择性LB平板上。使用三亲杂交将来自大肠杆菌的DNA转移至根瘤菌。将40μl的晚对数生长期(OD600为约0.6)供体细胞和40μl的包含pRK7013的晚对数生长期噬菌体辅助细胞的等分试样与200μl的晚对数生长期(OD600为约0.8)受体根瘤菌细胞混合，并在200μl的TY培养基中洗涤。通过在TY平板上点样20pl的混合细胞开始杂交，并在30℃孵育6小时。将杂交混合物铺板在补充有呋喃妥因的TY培养基上，以分离根瘤菌转移接合子。
用于根瘤菌的遗传部分的构建和表征。使用Gibson组件(New England Biolabs,目录号E2611)在pBBRl-ori质粒pMR-1上构建遗传部分文库。将荧光蛋白GFPmut3b和mRFPl用作报告分子。利用BioBricks Registry上的Anderson启动子文库(Anderson,J.等人，BglBricks:A flexible standard for biological part assembly.4,1(2010))进行组成型启动子的表征(图11A至图11C)。为了表征诱导型启动子，由Placlq启动子组成型地表达调节蛋白，并且通过同源诱导型启动子从相反方向驱动GFP表达，从而促进用感兴趣的基因(例如，T7 RNAP和nifA)替换报告基因和跨不同微生物的不同质粒主链转移控制元件单元。表征了同源调节物和诱导型启动子的以下组合。针对根瘤菌属种IRBG74优化IPTG诱导型LacI-AllacOl、DAPG诱导型PhlF-PPhl、aTc诱导型TeR-PTet、3OC6HSL诱导型LuxR-PLux、水杨酸诱导型NahR-Psal和枯茗酸诱导型CymR-Pcym系统(图14)。针对茎瘤固氮根瘤菌优化冠瘿碱诱导型OccR-Pocc和胭脂碱诱导型NocR-Pnoc系统(图20A至图20F和表4和表5)。对于RBS表征，使用IPTG诱导型GFP表达质粒pMR-40，并用1mM IPTG将GFP表达至最高水平(图12A至图12B)。GFP的RBS文库是使用RBS文库计算器在最高分辨率模式下设计的，并根据物种调节16S rRNA序列的3'末端(根瘤菌属种IRBG74的3'-ACCTCCTTC-5')。T7 RNAP的终止子通过以下方式进行表征：将终止子置于从位于第一荧光蛋白GFP上游的单个T7野生型启动子表达的两个荧光报告分子之间。这两种荧光蛋白的表达是通过编码由1mM IPTG诱导的IPTG诱导型T7 RNAP系统的控制元件菌株MR18实现的(图13A至图13B)。终止子强度(Ts)是通过用参考构建体pMR-66归一化终止子构建体的荧光水平确定的，其中在报告分子之间放置40bp的间隔区。根瘤菌的所有遗传部分表征如下。将单个菌落接种到96深孔板(USA Scientific,目录号18962110)中补充有抗生素的0.5ml TY中，并在Multitron培养箱(INFORS HT,MD)中在30℃下以900rpm生长过夜。在96孔板(Thermo Scientific,目录号12565215)中将1.5μl过夜培养物用抗生素和合适的诱导剂稀释至200μl的TY，并在ELMIDTS-4摇床(ELMI,CA)中在30℃下以1000转/分的速度培养7小时。生长后，用2mg/mL卡那霉素将8μl的培养样品稀释到150μl的PBS中，用于流式细胞术分析。质粒和遗传部分列于表4和表5。
用于防御假单胞菌的遗传部分的构建和表征。使用Gibson组件(New EnglandBiolabs,目录号E2611)在pRO1600起点质粒pMR-2上构建遗传部分文库。将荧光蛋白GFPmut3b和mRFPl用作报告分子。利用BioBricks Registry上的Anderson启动子文库进行组成型启动子的表征(图11A至图11C)。表征了同源调节物和诱导型启动子的以下组合。优化了IPTG诱导型Lacl-Ptac、DAPG诱导型PhlF-Pphl,aTc诱导型TetR-PTet、3OC6HSL诱导型LuxR-PLux、阿拉伯糖诱导型AraC-PBAD、枯茗酸诱导型CymR-PCym和柚皮素诱导型FdeR-PFde(图15A至图15C)。对于RBS表征，使用阿拉伯糖诱导型GFP表达质粒PMR-65，并用1mM IPTG表达GFP(图12A至图12B)。GFP的RBS文库是使用RBS文库计算器在最高分辨率模式下设计的，并根据物种调节16S rRNA序列的3'末端(防御假单胞菌Pf-5的3'-ACCTCCTTA-5')。T7 RNAP终止子的特征在于将终止子置于从位于第一荧光蛋白GFP上游的单个T7野生型启动子表达的两个荧光报告分子之间。两种荧光蛋白的表达是通过控制元件菌株MR7的IPTG诱导型T7RNAP表达系统实现的(图13A至图13B)。防御假单胞菌Pf-5的所有遗传部分表征如下。将单个菌落接种到96深孔板(USA Scientific，目录号18962110)中补充有抗生素的1ml LB中，并在Multitron培养箱(INFORS HT,MD)中在30℃下以900rpm生长过夜。将0.5μl过夜培养物稀释到96孔板(Thermo Scientific，目录号12565215)中具有抗生素和合适诱导剂的200μlLB中，并在ELMIDTS-4摇床(ELMI,CA)中以1,000rpm在30℃下孵育7小时。在生长后，用2mg/mL卡那霉素将10μl的培养样品稀释到150μl的PBS中以用于流式细胞术分析。质粒和遗传部分列于表4和表5中。
控制元件的基因组整合和表征。使用迷你Tn7插入系统以将控制元件引入防御假单胞菌Pf-5的基因组中。将IPTG诱导型T7 RNAP表达系统和四环素抗性标志物tetA置于两个Tn7末端(Tn7L和Tn7R)之间。将控制元件质粒pMR-85通过用编码TnsABCD转座酶的pTNS3进行双重转化而引入防御假单胞菌Pf-5中。通过PCR和测序证实了位于glmS的终止密码子下游25bp的基因组整合的控制元件。在根瘤菌属种IRBG74中采用使用同源重组的无标记插入方法。将侧翼有使得能够替换recA的两个同源片段的编码诱导型T7 RNAP系统的控制元件克隆到自杀质粒中。通过三亲杂交将大肠杆菌中的这些控制元件质粒(IPTG诱导型，pMR82-84；DAPG诱导型，pMR85)动员到根瘤菌属种IRBG74 MR18(ΔhsdR.Δnif)中，从而产生控制元件菌株(分别是MR19、MR20、MR21和MR22)。通过庆大霉素敏感性和诊断性PCR证实基因组中的控制元件整合。所有控制元件以与遗传部分表征中描述的相同方式进行表征。
基于Marionette的控制元件的构建和表征。为了调控大肠杆菌Marionette MG1655中的固氮酶表达，将12个报告质粒中的yfp替换为T7 RNAP，与此同时保持其他遗传部分(例如，启动子和RBS)不变(图28A至图28C)。将其中gfpmut3b与PT7(P2)启动子融合的报告质粒pMR-120(图28A至图28C)共转化以分析12个T7 RNAP控制元件质粒中的每一者的响应函数。为了表征控制元件，将单个菌落接种到96深孔板(USA Scientific，目录号18962110)中补充有抗生素的1ml LB中，并在Multitron培养箱(INFORS HT,MD)中在30℃下以900rpm生长过夜。将0.5μl过夜培养物稀释到96孔板(Thermo Scientific，目录号12565215)中具有抗生素和合适诱导剂的200μl LB中，并在ELMI DTS-4摇床(ELMI,CA)中在30℃下以1,000rpm孵育6小时。在生长后，用2mg/mL卡那霉素将4μl的培养样品稀释到150μl的PBS中以用于流式细胞术分析。
流式细胞术。使用BD Biosciences LSRII Forterssa分析仪通过流式细胞术分析具有荧光蛋白的培养物，该分析仪具有用于GFP的488nm激光器和510/20nm带通滤波器，以及用于mCherry和mRFPl的561nm激光器和610/20nm带通滤波器。在孵育后，将细胞稀释到含有补充有2mg/mL卡那霉素的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)的96孔板中。使用FlowJo(TreeStarInc.,Ashland,OR)，针对20,000个事件收集细胞，所述事件使用正向散射和侧向散射进行设门以去除背景事件。计算所有样品的来自血细胞计数直方图的中值荧光。从中值荧光中减去中值自发荧光，并以任意单位(au)报告作为荧光值。
固氮酶测定(大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌)。通过将单个菌落接种到96深孔板(USAScientific,目录号18962110)中补充有适当抗生素的1mL LB中来开始培养，并使培养物在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm生长过夜。将5μl过夜培养物稀释到96深孔板中含有17.1mM NH4CH3CO2和适当抗生素的500μl BB培养基中，并在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm孵育24小时。将培养物稀释到在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶(Supelco Analytical，目录号SU860103)中补充有适当的抗生素、1.43mM用于促进固氮酶抑制的丝氨酸和诱导剂(如有必要)的2mL BB培养基中至OD600为0.4。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间替换为100％氩气。将在Burris瓶中从CaC2新鲜产生的乙炔以10％(体积/体积)注入每个培养小瓶中以开始反应。在Innova 44振荡培养箱(New Brunswick)中在250rpm振荡下在30℃进行乙炔还原20小时，以防止细胞聚集，之后通过向每个小瓶中加入0.5mL 4M NaOH进行猝灭。
固氮酶测定(防御假单胞菌Pf-5)。通过将单个菌落接种到96深孔板(USAScientific,目录号18962110)中补充有适当抗生素的1mL LB中来开始培养，并使培养物在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm生长过夜。将5μl过夜培养物稀释到96深孔板中含有17.1mM NH4CH3CO2和适当抗生素的500μl BB培养基中，并在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm孵育24小时。将培养物稀释到在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶中补充有适当的抗生素、1.43mM丝氨酸和诱导剂(如有必要)的2mL BB培养基中至OD600为0.4。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间替换为99％氩气和1％氧气(Airgas,MA USA)。向每个培养小瓶中以10％(体积/体积)注入乙炔以开始反应。在250rpm振荡下在30℃进行乙炔还原20小时，之后通过向每个小瓶中加入0.5mL 4M NaOH进行猝灭。
固氮酶测定(根瘤菌菌株)。通过将单个菌落接种到96深孔板(USA Scientific,目录号18962110)中补充有适当抗生素的0.5mL TY培养基中来开始培养，并使培养物在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm生长过夜。将5μl的过夜培养物稀释到96深孔板中具有30mM琥珀酸盐、10mM蔗糖和10mM NH4Cl以及适当的抗生素的500μl UMS培养基中，并在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm孵育24小时。将培养物稀释到在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶中补充适当的抗生素、1.43mM丝氨酸和诱导剂(如有必要)的2mLUMS培养基加30mM琥珀酸盐和10mM蔗糖中至OD600为0.4。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间替换为99％氩气和1％氧气。向每个培养小瓶中以10％(体积/体积)注入乙炔以开始反应。在250rpm振荡下在30℃进行乙炔还原20小时，之后通过向每个小瓶中加入0.5mL 4M NaOH进行猝灭。
固氮酶测定(茎瘤固氮根瘤菌和施氏假单胞菌)。通过将单个菌落接种到96深孔板中补充有适当抗生素的0.2mL TY培养基中开始培养，并使培养物在Multitron培养箱中在900rpm下分别对于茎瘤固氮根瘤菌和施氏假单胞菌在37℃和30℃下生长过夜。将5μl的过夜培养物稀释到96深孔板中具有30mM乳酸盐和10mM NH4Cl以及适当的抗生素的500μl UMS培养基中，并在Multitron培养箱中在900rpm下分别对于茎瘤固氮根瘤菌和施氏假单胞菌在37℃和30℃下孵育24小时。将培养物稀释到在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶中补充适当的抗生素和诱导剂(如有必要)的2mL UMS培养基加30mM琥珀酸盐中至OD600为0.4。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间替换为99％氩气加1％氧气。向每个培养小瓶中以10％(体积/体积)注入乙炔以开始反应。在250rpm振荡下在30℃进行乙炔还原20小时，之后通过向每个小瓶中加入0.5mL 4M NaOH进行猝灭。
固氮酶测定(棕色固氮菌)。通过将单个菌落接种到96深孔板(USA Scientific,目录号18962110)中补充有适当抗生素的0.5mL Burk培养基中来开始培养，并使培养物在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm生长过夜。将5μl过夜培养物稀释到96深孔板中含有17.1mM NH4CH3CO2和适当抗生素的500μl Burk培养基中，并在Multitron培养箱中在30℃下以900rpm孵育24小时。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间替换为97％氩气和3％氧气(Airgas,MA USA)。向每个培养小瓶中以10％(体积/体积)注入乙炔以开始反应。在250rpm振荡下在30℃进行乙炔还原20小时，之后通过向每个小瓶中加入0.5mL 4M NaOH进行猝灭。
铵存在下的固氮酶活性测定。在含有氮源(如上所述)的基本培养基中孵育过夜后，将培养物稀释至在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶中的2mL无氮基本培养基、1.43mM丝氨酸(对于大肠杆菌和防御假单胞菌Pf-5)和诱导剂(对于诱导型系统)中至OD600为0.4。当测试固氮酶活性的铵耐受性时，将铵(对于大肠杆菌和防御假单胞菌Pf-5为17.1mM NH4CH3CO2并且对于根瘤菌为10mM NH4Cl)加入到无氮基本培养基中。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间对于大肠杆菌替换为100％氩气，对于假单胞菌属和根瘤菌替换为99％氩气加1％氧气。向每个培养小瓶中以10％(体积/体积)注入乙炔以开始反应。在250rpm振荡下在30℃进行乙炔还原20小时，之后通过向每个小瓶中加入0.5mL 4M NaOH进行猝灭。
不同氧气水平下的固氮酶活性测定。在含有氮源(如上所述)的基本培养基中孵育过夜后，将培养物稀释至在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶中的2mL基本培养基、1.43mM丝氨酸(对于大肠杆菌和防御假单胞菌Pf-5)和诱导剂(对于诱导型系统)中至OD600为0.4。使用真空歧管将小瓶顶部空间替换为对于大肠杆菌是100％氮气或对于防御假单胞菌Pf-5和茎瘤固氮根瘤菌为99％氮气加1％氧气。将培养物在30℃下以250rpm振荡孵育分别达对于防御假单胞菌Pf-5为6小时和对于茎瘤固氮根瘤菌为9小时，在此之后，用配备有针型传感器OXF500PT(Pyro Science,Germany)的光氧气计FireStingO2记录顶部空间中的氧浓度。在诱导期后，对于所有物种在顶部空间中均无氧气残留，如通过氧气计证实的。顶部空间中的初始氧气水平通过将纯氧经由注射器注入小瓶的顶部空间中来调节，并通过在30℃下以250rpm振荡15分钟来稳定，之后将乙炔以10％(体积/体积)注入每个培养小瓶中以开始反应，并同时记录顶部空间中的初始氧气浓度。将顶部空间中的氧气水平保持在设定点(<±0.25％O2)附近，与此同时通过每小时注射氧气达3小时并在氧气掺加之前和之后进行氧气监测在30℃下以250rpm进行孵育(图26A至图26B)。在孵育3小时后，通过使用注射器向每个小瓶中注射0.5mL 4M NaOH来猝灭反应。
乙烯定量。如下使用配备有PAL顶部空间自动进样器和火焰离子化检测器的Agilent 7890A GC系统(Agilent Technologies,Inc.,CA USA)通过气相色谱分析乙烯产量。注射预孵育至35℃达30秒的0.5mL顶部空间等分试样，并在GS-CarbonPLOT柱(0.32mm×30m，3微米；Agilent)上在60℃下和1.8mL/min的氦流速下分离4分钟。检测是在加热至300℃的FID中以35mL/min H2和400mL/min空气的气体流量发生的。分别在注射后3.0分钟和3.7分钟检测到了乙炔和乙烯。使用Agilent GC/MSD ChemStation软件对3.7分钟的峰值进行积分，来对乙烯产量进行定量。
用于RNA-seq和核糖体谱分析的样品制备。使产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、防御假单胞菌Pf-5或根瘤菌属种IRBG74的培养物遵循如用于固氮酶活性测定(如上所述)的相同方案生长，但有一些变化。在含氮源的基本培养基中过夜孵育后，将培养物稀释至在具有隔膜塞(Fisher Scientific,目录号FB57873)的125mL Wheaton血清小瓶(DWK LifeSciences，目录号223748)中的25mL基本培养基(如果需要的话，含有诱导剂)和抗生素中至OD600＝0.4。使用真空歧管将小瓶顶部空间对于大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌用100％氮气替换，或者对于防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌属种IRBG74用99％氮气加1％氧气替换。将在30℃、250rpm生长6小时的培养物过滤到0.45μm孔径的硝酸纤维素过滤器(FisherScientific,目录号GVS 1215305)上。使用不锈钢勺合并来自三个小瓶的细胞沉淀，然后在液氮中快速冷冻。将冷冻沉淀物加入到在液氮中预冷却的25mL罐(Retsch,Germany,目录号014620213)中的裂解缓冲液(20mM Tris(pH 8.0)、100mM NH4Cl、10mM MgCl2、0.4％TritonX-100、0.1％NP-40、1mM氯霉素和100U/mL DNA酶I)的650μl冷冻液滴中，并使用TissueLyser II(Qiagen USA)以15Hz下3分钟达5次并在各循环之间进行间歇冷却的设定进行粉碎。通过在4℃以20,000rcf离心10分钟来去除沉淀，并在上清液中回收裂解物。
RNA-seq实验。根据之前描述的方法(稍作改进)进行RNA-se q和核糖体足迹谱分析(Li,G.-W.,Oh,E.&Weissman,J.S.J.N.The anti-Shine-Dalgamo sequence drivestranslational pausing and codon choice in bacteria.484,538(2012)；Li,G.-W.,Burkhardt,D.,Gross,C.&Weissman,J.S.Quantifying absolute proteinsynthesisrates reveals principles underlying allocation of cellularresources.Cell 157,624-635(2014))。用热酚-SDS提取法分离总RNA。使用MICROBExpress试剂盒(Thermo Fisher Scientific,目录号AM1905)测定rRNA级分并从总数中减去。将剩余的mRNA和tRNA用RNA片段化试剂(Thermo Fisher Scientific，目录号AM8740)在95℃下片段化达1分钟45秒。从15％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶(Thermo FisherScientific,目录号EC6885)中分离出RNA片段(10-45bp)。使用T4多核苷酸激酶(lU/μl，New EnglandBiolabs，目录号M0201S)在补充有1μl 20U SUPERase In的20μl反应体积中在37℃将RNA片段的3'末端去磷酸化1小时，在此之后将变性的片段(5皮摩尔)在80℃下孵育2分钟，并在25℃在补充有8μl 50％PEG 8000、2μl 10XT4 RNA连接酶2缓冲液、1μl 200U/μl截短的K277QT4连接酶2(New England Biolabs，目录号M0351)和1μl 20U/μl的SUPERas e In(Invitrogen)的20μl反应体积中连接到1μg寡核苷酸(/5rApp/CT GTAGGCACCATCAAT/3ddc/，Integrated DNA technologies)达3小时。从10％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,目录号EC6875)中分离连接的片段(35-65bp)。使用Superscript III(ThermoFisher Scientific,目录号18080044)和oCJ485引物(/5Phos/AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT/iSpl8/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGATGGTGCCTACAG(SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3))在50℃下对来自纯化的mRNA产物的cDNA文库进行逆转录达30分钟，随后通过加入最终浓度为0.1M的NaOH来水解RNA产物，随后在95℃孵育15分钟。从10％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，目录号EC6875)上分离cDNA文库(125-150bp)。将cDN A产物在60℃下在补充有2μl的10X CircLigase缓冲液、1μl的1mM ATP、1μl的50mM MnCl2和1μl的CircLigase(Epicenter,目录号CL4115K)的20μl反应体积中环化2小时，并在80℃下热灭活10分钟。使用Phusion HF DNA聚合酶(New England Biolabs,目录号M0530)和o231引物(CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQID NO:4))和索引引物(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACT CCAGTCACNNNNNNA CACTCTTTCCCTACAC(SEQ ID NO:5))扩增5μl环化的DNA达7至10个循环。从8％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,目录号EC62152)中回收扩增产物(125-150bp)。将纯化的产物通过BioAnaly zer(Agilent,CAUSA)进行分析，并使用具有快速运行模式的Illumin a HiSeq 2500用测序引物(CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCG ACGATC(SEQ ID NO:6))进行测序。为了产生每个nif簇的RNA-seq读段谱，将原始跟踪谱乘以107，并通过来自每个物种的编码序列的相应总读段归一化(产酸克雷伯氏菌M5al，CP020657.1；大肠杆菌MG 1655，NC_000913.3；防御假单胞菌Pf-5，CP000076；根瘤菌属种IRBG74 HG518322、HG518323、HG518324和携带nif簇的合适质粒)。使用映射到基因上的总测序读段来估计每个基因的mRNA表达水平，表示每百万个片段映射单位每千碱基转录物的片段(FPKM)。
Ribo-seq实验。将0.5mg RNA稀释到包含0.5U RNA酶抑制剂SUPERase In(Invitrogen，目录号AM2694)、5mM CaCl2的195μl裂解缓冲液中，并在25℃下用5μl的750U微球菌核酸酶(Sigma Aldrich,目录号10107921001)处理1小时以获得核糖体保护的单染色体。通过将EGTA加入至最终浓度为6mM来猝灭消化，然后在分离单染色体之前保持在冰上。随后，通过以下方式收集单染色体级分：以35,000rpm通过蔗糖密度梯度(10-55％w/v)超速离心3小时，之后进行热酚-SDS提取以分离核糖体保护的mRNA片段。从15％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶中分离mRNA片段(15-45bp)。将纯化片段的3'末端去磷酸化并连接至经修饰的寡核苷酸。如上所述，通过CircLigase环化由Superscript III产生的cDNA文库。通过对于大肠杆菌和防御假单胞菌Pf-5的相应生物素化寡核苷酸混合物耗竭rRNA产物。使用Phusion HF DNA聚合酶和o231引物和索引引物扩增5μl环化的DNA达7至10个循环。从8％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶中回收扩增产物(125-150bp)。将纯化的产物通过BioAnalyzer进行分析，并使用具有快速运行模式的Illumina HiSeq 2500用测序引物(CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC(SEQ ID NO:7))进行测序。使用Bowtie 1.1.2以-kl-m2-vl的参数将序列与参考序列进行比对。使用中心加权法来映射长度在22个至42个核苷酸范围内的经比对的足迹读段。为了从足迹读段映射核糖体的P位点，修剪来自两个末端的11个核苷酸，并给予剩余的核苷酸相同的得分，用中心区域的长度归一化。使用等重量的每种核苷酸将经比对的读段(10-45个核苷酸)映射至参考。使用Python 3.4脚本来执行映射。为了生成每个nif簇的Ribo-seq读段谱，将原始跟踪谱乘以108，并通过来自每个物种的编码序列的相应总读段归一化。为了计算每个基因的核糖体密度，将读段密度首先以下列方式归一化：(i)排除基因的前5个和最后5个密码子来进行计算，以去除翻译起始和终止的影响，(ii)将全基因组读段密度谱拟合至指数函数，并且使用该函数校正给定基因上每个核苷酸处的密度，(iii)如果基因上的平均读段密度高于1，则应用90％的缩尾处理来减少离群值的影响。通过基因长度和编码序列上的总读段密度对基因上的归一化读段总和进行归一化，以得到核糖体密度。
基于-seq数据的遗传部分强度的计算。启动子的活性被定义为转录起始位点xtss周围的RNAP通量δJ的变化(Gorochowski,T.E.等人，Genetic circuit characterizationand debugging using RNA-seq.13,952(2017))。通过下式计算启动子强度
Figure BDA0003307346880000511
其中m(i)是来自FPKM归一化转录组谱的每个位置i处的转录本数量，γ＝0.0067s-1是mRNA的降解速率，n是xtss之前和之后的窗口长度。窗口长度设置为10。终止子强度Ts被定义为终止子之前和之后转录的减少倍数，所述减少倍数可以从FPKM归一化的转录组谱量化为：
Figure BDA0003307346880000521
其中xo和x1分别是终止子部分的开始和结束位置。翻译效率通过核糖体密度除以FPKM来计算。
nifH表达分析。使用质粒pMR-128至pMR-130测试NifA的互补，所述质粒含有融合至茎瘤固氮根瘤菌ΔnifA突变体中的nifH启动子的sfgfp。诱导型NifA/RpoN表达由质粒pMR-121提供，在所述质粒中加入了由nifH启动子驱动的sfgfp以分析nifH启动子活性，从而产生pMR-131(图29)。将质粒pMR-124中的IPTG诱导型系统用其他诱导型系统取代，所述其他诱导型系统包括水杨酸诱导型、胭脂碱诱导型和章鱼碱诱导型系统，从而分别产生pMR-125、pMR-126和pMR-127。将质粒中的每一个质粒动员到茎瘤固氮根瘤菌ΔnifA突变体中，该突变体按照(本文所述的)用于固氮酶活性的相同方案生长。在含氮源的基本培养基中孵育过夜后，将培养物在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶中的2ml UMS培养基加30mM乳酸盐、抗生素和诱导剂(对于诱导型系统)中稀释至OD600＝0.4。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间替换为99％氩气加1％氧气。将小瓶在30℃以250rpm振荡培养9小时，在此之后将10μl培养物用2mg/mL卡那霉素稀释到150μl PBS中以用于流式细胞术分析。为了测试不同NifA蛋白对nifH启动子的活化，将质粒pMR-51、pMR-53、pMR-88、pMR-89和pMR-90引入大肠杆菌MG1655，并将质粒pMR-91、pMR-92、pMR-93、pMR-94和pMR-95引入防御假单胞菌Pf-5。使用质粒pMR-101来在大肠杆菌中提供由IPTG诱导的NifA表达。使用质粒pMR-96、pMR-97和pMR-98将编码IPTG诱导型NifA的控制元件插入到防御假单胞菌Pf-5的基因组中。将NifA控制元件质粒pMR-96的IPTG诱导型系统用阿拉伯糖诱导型系统和柚皮素诱导型系统替换，从而分别产生pMR-99和pMR-100。分别通过报告质粒pMR-105至pMR-107和pMR102至pMR104或大肠杆菌和防御假单胞菌Pf-5评定nifH表达的诱导性。使用报告质粒将控制元件质粒转化到大肠杆菌或防御假单胞菌Pf-5中。在含氮源的基本培养基中孵育过夜后，将培养物在具有PTFE-硅胶隔膜螺旋盖的10mL玻璃小瓶中的2ml BB培养基、抗生素和诱导剂(对于诱导型系统)中稀释至OD600＝0.4。使用真空歧管将小瓶中的顶部空间对于大肠杆菌替换为100％氩气或对于防御假单胞菌Pf-5替换为99％氩气加1％氧气。将小瓶在30℃下以250rpm振荡培养9小时，在此之后将10μl培养物用2mg/mL卡那霉素稀释到150μl PBS中以用于流式细胞术分析。
序列比对。从NCBI获得类球红细菌2.4.1(RSP_0547)和茎瘤固氮根瘤菌ORS571(AZC_1049)的NifA序列。使用默认设置将NifA蛋白序列与MUSCLE(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)进行比对(图22)。
结果
天然nif簇在大肠杆菌、防御假单胞菌Pf-5和共生根瘤菌中的性能
克隆了一组不同的天然nif簇，以确定它们在不同菌株中的相对性能和相关联的物种屏障(图1A)。使用来自产酸克雷伯氏菌的经充分研究的nif簇的先前定义的边界(Arnold,W.,Rump,A.,Klipp,W.,Priefer,U.B.&Piihler,A.J.I.o.m.b.Nucleotidesequence of a24,206-base-pair DNA fragment carrying the entire nitrogenfixation gene cluster of Klebsiella pneumoniae.203,715-738(1988))和来自多粘类芽孢杆菌WLY7870的小(10kb)簇。类似地，使用施氏假单胞菌A1501(43.7kb)(Yan,Y.等人，Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome ofroot-associated Pseudomonas stutzeri A1501.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences(2008))和棕色固氮菌DI簇(Hamilton,T.L.等人，Transcriptionalprofiling of nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii.J Bacteriol 193,4477-4486,doi:10.1128/IB.05099-ll(2011))的公布边界。施氏假单胞菌A1501 nif簇的区域(Pstl307-Pstl312)被排除，因为这些基因经预测对固氮酶没有影响。棕色固氮菌DJ包含位于基因组的其他区域中的三个推定的电子转运系统(Rnfl和Rnf2复合物和Fix复合物)。RNA-seq数据显示，Rnf2不与nif基因共表达，因此只有Rnfl和Fix复合物通过融合它们的DNA而被包括在内以产生单个46.9kb的构建体。选择来自巴西固氮螺菌Sp7的nif簇(40.1kb)，因为该物种是一种谷类内生菌并且在独立生存条件下固氮。几个研究较少的基因簇也被克隆，以探索物种屏障。作为蓝细菌的代表，按照公布的边界克隆来自蓝丝菌属种ATCC51142的基因簇。它的转录激活物PatB出现在nif簇外部，所述转录激活物与其天然启动子一起克隆并与nif簇融合以形成单一构建体(31.7kb)。从光合紫色细菌(沼泽红假单胞菌CGA009(Oda,Y.等人，Functional genomic analysis of three nitrogenase isozymesin the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris.187,7784-7794(2005))和类球红细菌2.4.1(Haselkom,R.&Kapatral,V.in Genomes and genomics ofnitrogen-fixing organisms,71-82(Springer,2005)))选择若干基因簇，因为这些细菌是与根瘤菌属相同的α变形菌纲的成员。将编码在类球红细菌2.4.1的单独染色体上的rnf簇添加到nif簇中以为固氮酶提供电子。最后，来自甘蔗和稻内共生重氮营养葡糖醋杆菌PAI5的基因簇(28.9kb)以及来自茎瘤固氮根瘤菌ORS571的三个nif基因簇(64kb)37与上游调控元件fixLJK一起克隆，但是发现这些在所有测试的物种中都是无活性的，因此它们没有在图1A至图1F中示出。表2中提供了所有nif簇的精确基因组位置，并且表3中提供了含有nif簇的质粒。
每个簇通过PCR从基因组DNA扩增为多个片段，并使用酵母组件与质粒骨架装配在一起(参见材料和方法部分)。基于重叠群ALJV01上的DNA序列，从头合成多粘类芽孢杆菌WLY78簇(Shanks,R.M.等人，Saccharomyces cerevisiae-based molecular tool kit formanipulation of genes from gram-negative bacteria.72,5027-5036(2006))。将这些簇克隆到不同的质粒系统中以促进转移。对于转移到大肠杆菌和根瘤菌属种IRBG74中，使用基于pBBRl来源的宽宿主范围质粒(对于来自茎瘤固氮根瘤菌ORS571的nif簇，使用第二兼容的RK2来源质粒)。这些质粒含有RK2 oriT以使得能够接合转移大的DNA(参见材料和方法)。对于转移到防御假单胞菌Pf-5，发现该质粒系统不稳定并产生混合群体。为了转移到该菌株中，使用了带有oriT的假单胞菌属特异性质粒pRO1600。在构建后，使用下一代测序对所有质粒进行验证(参见材料和方法部分)。
将该组10个nif簇转移到大肠杆菌MG1655、谷类附生菌防御假单胞菌Pf-5和谷类内生菌根瘤菌属种IRBG74中以产生30个菌株(图1A)。将大肠杆菌选择作为对照，因为已经执行了到该受体的成功转移。天然防御假单胞菌Pf-5不固氮。根瘤菌属种IRBG74包含在不同的基因组位置中的两个nif簇，所述簇保持完整，但在独立生存条件下没有固氮酶活性。基因组簇不具有所需的NifV酶，因为它从植物中获得高柠檬酸盐。除了来自多粘类芽孢杆菌WLY78的簇外，该组中的所有簇都具有nifV。进行了一项测试以确定来自茎瘤固氮根瘤菌ORS571的重组nifV在根瘤菌属种IRBG74中的表达是否会产生活性固氮酶，但没有检测到活性。
使细菌在包含抗生素的适当培养基中生长，然后使用乙炔还原测定评估固氮酶活性(参见方法和材料部分)。如前所述71，使大肠杆菌和假单胞菌在30℃下在BB基本培养基中生长。然而，在这些条件下没有观察到根瘤菌属种IRBG74的生长。测试了不同的培养基和碳源，并且发现含有来自植物的主要碳源147二羧酸(苹果酸盐或琥珀酸盐)和10mM蔗糖的UMS培养基产生了最高的生长率(图6)。过夜生长后，将细胞转移到加塞试管的无铵基本培养基中至最终OD600为0.4。对于大肠杆菌，顶部空间空气完全被氩气替换。对于防御假单胞菌Pf-5和防御假单胞菌种IRBG74，氧气的初始顶部空间浓度保持在1％，因为这些细菌需要氧气进行代谢。将细胞在过量乙炔的存在下于30℃下孵育20小时，并且通过GC-MS定量至乙烯的转化(参见材料和方法部分)。在这些条件下任何菌株都没有显著的生长，因此报道的固氮酶活性对应于相同的细胞密度。
令人惊讶的是，10个簇中有6个在大肠杆菌MG1655中有功能，其中产酸克雷伯氏菌簇产生最高的活性(图1A)。尽管与在大肠杆菌MG1655中相比活性降低了60倍，但是产酸克雷伯氏菌簇在防御假单胞菌Pf-5中也有功能。有趣的是，来自施氏假单胞菌和棕色固氮菌(两者都是专性需氧菌)的簇都能够在防御假单胞菌Pf-5中实现高活性。由此产生的固氮酶活性是产酸克雷伯氏菌中实现的3倍至7倍，产酸克雷伯氏菌只在严格的厌氧条件下固氮。这些簇具有共同的组织特征和类似的电子转运链，诸如Rnf复合物。
来自类球红细菌的单基因簇在根瘤菌属种IRBG74中产生了固氮酶活性(图1A)。值得注意的是，根瘤菌和红细菌都是α变形菌，并且它们的nif簇可能包含可互换的基因。当天然nif簇被从根瘤菌属种IRBG74敲除时，引入单独的类球红细菌簇不产生活性固氮酶。这些数据表明了内源基因簇与导入基因簇之间的复杂互补。为了确定这种方法是否可以推广到其他共生根瘤菌，将红细菌属和红假单胞菌属簇转移到一组从不同豆科植物中分离的12个物种中(图1A)。值得注意的是，这些簇的转移能够在菌株中的7个菌株中产生可检测的固氮酶活性。
基于全长16S rRNA基因序列进行系统发生分析(产酸克雷伯氏菌BWI76_05380；棕色固氮菌Avin_55000；类球红细菌DQL45_00005；蓝丝菌属ATCC51142、cce_RNA045；巴西固氮螺菌AMK58_25190；沼泽红假单胞菌RNA_55；防御假单胞菌PST_0759；类芽孢杆菌属种WLY78、JQ003557)。使用MUSCLE生成多重序列比对(Edgar,R.C.J.N.a.r.MUSCLE:multiplesequence alignment with high accuracy and high throughput.32,1792-1797(2004))。使用Geneious软件(R9.0.5)，以及Jukes-Cantor距离模型和UPGMA作为树构建方法，以及来自1000个平行测定的自展值构建系统发生树。这个系统发生树如图30A所示。比例尺表示每个位点有2％的替代。基于进化接近度的簇被圈出。使用来自图1A的相同数据，图30B总结了携带10个nif簇中的每个nif簇的三个宿主菌株中的相对固氮酶活性。结果表明，系统发生接近度对在缺乏nif簇的新宿主中实现最高固氮酶活性具有预测能力。
此后，进行研究以进一步表征转录和翻译的变化影响在物种间转移天然簇时观察到的活性差异的程度。启动子活性、核糖体结合位点和密码子使用的差异会以有害的方式改变nif基因的表达水平。为了定量这种影响，执行RNA-seq和核糖体谱分析实验以评估产酸克雷伯氏菌nif簇在产酸克雷伯氏菌以及大肠杆菌MG1655、防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌属种IRBG74中的表达。RNA-seq实验提供了基因的mRNA水平(计算为FPKM)，并且可用于测量启动子和终止子的性能。核糖体谱分析可用于定量蛋白质合成速率、核糖体结合位点(RBS)强度和基因内部的核糖体暂停。核糖体密度(RD)被证明是与蛋白质表达率相关的。翻译效率是通过用转录本的数量(来自Ribo-seq的FPKM)归一化RD来计算。核糖体谱分析已被应用来确定多亚基复合物中表达的蛋白质的相对水平。
当在产酸克雷伯氏菌与大肠杆菌之间比较时，有义和反义方向上的RNA-seq谱非常接近(图1B至图1C)，并且保留了mRNA之间的比率(R2＝0.89)(图1D)。这与观察到该簇在两个宿主中产生相似活性是一致的。相比之下，防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌属种IRBG74的RNA-seq谱差异更显著(图1B至图1C)，并且在mRNA转录本之间没有相关性(图1D)。
使用核糖体谱分析测量蛋白质表达率之间的比率(图1E和图9)。值得注意的是，在产酸克雷伯氏菌中测得的比率几乎与棕色固氮菌的免疫印迹测定完全相关，并且H:D:K化学计量反映了已知的2:1:1比率。有趣的是，与mRNA水平不同，当簇在物种间转移时，表达率的比率是高度相关的：大肠杆菌(R2＝0.94)、防御假单胞菌Pf-5(R2＝0.61)和根瘤菌属种IRBG74(R2＝0.71)(图1E至图1F)。与其他菌株相比，根瘤菌属种IRBG中NifH的产量明显较低。为了增加该宿主中簇的诱导，将NifA过表达，但这被证明未成功产生高水平的活性固氮酶(图10A至图10B)。
下面总结了天然nif簇转移到新物种的结果。最成功的受体是大肠杆菌。然而，这不是一个可行的农业菌株，并且在17.1mM铵的存在下活性被消除(图7A至图7E，和图8A至图8B)。在防御假单胞菌Pf-5中获得了中等程度的高活性，但这产生了组成型开启的响应(产酸克雷伯氏菌簇)或被铵强烈抑制(棕色固氮菌簇)。还发现防御假单胞菌Pf-5中的施氏假单胞菌簇在铵的存在下是无活性的，这与先前公布的结果不一致(Setten,L.等人，Engineering Pseudomonas protegens Pf-5for nitrogen fixation and itsapplication to improve plant growth under nitrogen-deficient conditions.PLoSOne 8,e63666(2013))。通过将簇转移到根瘤菌中只能获得低水平的活性。为了解决这些问题，应用不同的方法工程改造簇以产生更高活性，表现出更少的铵抑制，并且是可诱导的。
重构的克雷伯氏菌属簇至根瘤菌属种IRBG74的转移
重构基因簇的过程涉及仅使用明确表征的遗传部分从下到上完全重构遗传系统。一种详尽的方法是对基因进行重编码(以消除内部调控)，重组为操纵子，用合成核糖体结合位点(RBS)控制表达，和使用T7 RNAP启动子和终止子。携带在遗传上独特的位置的单独“控制元件”将合成的感应元件和回路与T7 RNAP的表达联系起来。对于各种应用，这种方法已被证明有助于在物种之间转移多基因系统，通过部分替换和酶挖掘简化优化，并使得能够用诱导合成感应元件的刺激来替换自然控制簇的环境信号(Smanski,M.J.等人，Synthetic biology to access and expand nature's chemical diversity.NatureReviews Microbiology 14,135(2016)；Song,M.等人，Control of type III proteinsecretion using a minimal genetic system.8,14737(2017)；Guo,C.-J.等人，Discovery of reactive microbiota-derived metabolites that inhibit hostproteases.168,517-526.e518(2017)；Ren,H.,Hu,P.,Zhao,H.J.B.&bioengineering.Aplug-and-play pathway refactoring workflow for natural product research inEscherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.114,1847-1854(2017))。在以前的研究中，克雷伯氏菌属nif簇被重构，随后将所述簇用作平台以通过改变遗传组织和控制表达的部分来优化活性。顶部变体(v2.1)在产酸克雷伯氏菌nif敲除中完全恢复了活性，并且在大肠杆菌中有功能。为了转移到大肠杆菌中，使用了基于质粒上携带的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型T7RNAP的控制元件(图2A)。优化期间的有趣观察结果是，天然簇的遗传组织，包括操纵子的存在，与活性无关。
使用T7 RNAP的优点是它基本上在所有原核生物中都有功能，因此重构的簇可以原样转移，并通过在新宿主中表达T7 RNAP来诱导转录。然而，需要根据在该物种中发挥作用的调控和调控部分来为每个宿主构建新的控制元件。基于质粒(pKT249)上携带的IPTG诱导型T7 RNAP设计用于大肠杆菌的控制元件(图2A)。为了将重构的簇转移到根瘤菌属种IRBG74中，首先构建了控制元件，所述控制元件在该物种中起作用并产生等同范围的T7RNAP表达。
虽然之前已经描述了根瘤菌属的一些诱导型系统和成组的遗传部分，但是需要建立一个新的部分集合并对其进行表征，以便拥有创建具有足够动态范围的控制元件所需的部分。首先，对发现分别跨越382倍和23倍的表达范围的一组20个组成型启动子(Anderson,J.等人，BglBricks:A flexible standard for biological part assembly.4,1(2010))和7个T7依赖性启动子(emme,K.,Zhao,D.&Voigt,C.A.Refactoring the nitrogenfixation gene cluster from Klebsiella ox ytoca.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 109,7085-7090(2012))进行表征(图11A至图11C)。其次，使用RBS文库计算器筛选285个核糖体结合位点(RBS)的文库，表示表达范围为5,600倍(图12A至图12B)。最后，对一组29个终止子进行了表征，发现其中17个具有>10的终止子强度(图13A至图13B)。然后使用这些部分文库，构建了6个用于根瘤菌属种IRBG74的诱导型系统，所述诱导型系统响应于IPTG、群体信号3OC6HSL、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸(图14)。在优化之后，这些系统产生7至到400倍的诱导。
然后通过使用优化的IPTG诱导型系统构建控制元件，以驱动T7RNAP的变体(R6232S、N末端lon标签，GTG起始密码子)的表达(图2A)。测试控制T7 RNAP表达的RBS变体，并选择中等强度以在限制毒性的同时使诱导最大化(图16)。通过替换recA，将控制元件携带在基因组上(参见材料和方法)。将最终控制元件的响应函数与针对大肠杆菌中pKT249获得的响应函数进行比较，显示它们在中等诱导水平下扫略过相同的表达范围(图2B)。为了在两个物种中达到相同的诱导水平，选择0.1mM IPTG用于大肠杆菌，并且选择0.5mM IPTG用于根瘤菌属种IRBG74(图2B中带圆圈的点)。
然后将重构的v2.1簇转移到根瘤菌属种IRBG74，但没有观察到活性(图2C至图2D)。当将v2.1簇转移到防御假单胞菌Pf-5时也没有观察到活性(图17)。为了确定组成重构的簇的遗传部分是否如设计的那样起作用，执行了RNA-seq和核糖体谱分析实验(图18)。根据这些数据，可以计算启动子/终止子的强度以及基因的转录水平和翻译速率(参见材料和方法)。启动子在根瘤菌属种IRBG74中的性能系统地低于大肠杆菌，尤其是控制nifH的第一启动子(图2E)。终止子在两个物种中相同地起作用，尽管很弱，并且从簇中心的三个终止子没有检测到终止(图2E)。不同生物之间的基因翻译有显著差异(图2F)。当将来自重构的簇的nif基因的表达率与其在产酸克雷伯氏菌中的天然环境中的水平进行比较时，几乎没有相关性(图2F)。重要的是，与大肠杆菌中的相同簇相比，在根瘤菌属种IRBG74中从重构的簇表达的NifH减少了9倍。因此，当在生物体之间转移时，重构的簇产生了广泛不同的组分基因表达水平，甚至当使用不同的控制元件在它们之间匹配转录时也如此。
基于这些结果，设计了新的重构的簇(v3.2)(图2G)。为nifH选择了非常强的启动子。通过以下方式破坏转录：加入启动子以分开nifENX和nifJ，并选择更强的终止子。应注意，当天然簇转移到新的宿主时，nif基因之间的表达率得到更好的保留(图1D)，但重构的簇不是这样(图2F)，假设这可能是由于操纵子结构的破坏和基因之间相关的翻译偶联。产酸克雷伯氏菌操纵子被完整克隆，包括天然RBS，并替换了重构的簇的这些区域(图2G)。应注意，这也保留了nifT和nifX，它们没有被包括在第形式中，因为它们是不重要的(Simon,H.M.,Homer,M.J.&Roberts,G.P.J.I.o.b.Perturbation of nifT expression inKlebsiella pneumoniae has limited effect on nitrogen fixation.178,2975-2977(1996))或抑制性的(Gosink,M.M.,Franklin,N.M.&Roberts,G.P.I.J.o.b.The productof the Klebsiella pneumoniae nifX gene is a negative regulator of thenitrogen fixation(nif)regulon.172,1441-1447(1990))。
与v2.1相比，v3.2簇在大肠杆菌中的活性较低，但在根瘤菌属种IRBG74(图2H)和防御假单胞菌Pf-5(图17)中的活性较高。该实验在根瘤菌属种IRBG74中的双nif敲除菌株中执行，因此表明重构的簇在产生固氮酶活性方面是独立的。应用RNA-seq和核糖体谱分析来评估v3.2在所有三个物种中的性能(图21、图19和图20A至图20F)。启动子在不同的宿主中相似地表现，但终止子的功能存在显著差异。尽管如此，基因的翻译速率(RD)非常一致，并且NifH表达几乎相同(图2J)。NifH的较高表达和保留的蛋白质之间的比率是重构的簇在根瘤菌属种IRBG74中起作用的可能原因。下一尝试是通过增加所用诱导剂的浓度来提高根瘤菌属种IRBG74中nif基因的表达水平，但是发现了明显的最佳值，超过该最佳值则表达增加会导致活性迅速下降(图2M)。这表明仅使用来自产酸克雷伯氏菌的基因在独立生存条件下在根瘤菌属种IRBG74中获得活性有潜在上限。
用合成控制代替茎瘤固氮根瘤菌nif调控
茎瘤固氮根瘤菌nif基因跨不同基因组位置中的三个簇分布。调控信号集中在NifA激活物上，该激活物与RpoNσ因子一起开启基因组nif簇的转录。众多且未完全特征的环境信号集成在该节点的上游，包括NtrBC(Kaminski,P.A.&Elmerich,C.J.M.m.Thecontrol of Azorhizobium caulinodans nifA expression by oxygen,ammonia and bythe HF-I-like protein,NrfA.28,603-613(1998))、NtrXY(Pawlowski,K.,Klosse,U.,DeBruijn,F.J.M.&MGG,G.G.Characterization of a novel Azorhizobium caulinodansORS571 two-component regulatory system,NtrY/NtrX,involved in nitrogenfixation and metabolism.231,124-138(1991))、FixLJK(Kaminski,P.&Elmerich,C.J.M.m.Involvement of fixLJ in the regulation of nitrogen fixation inAzorhizobium caulinodans.5,665-673(1991)；Kaminski,P.,Mandon,K.,Arigoni,F.,Desnoues,N.&Elmerich,C.J.M.m.Regulation of nitrogen fixation inAzorhizobiumcaulinodans:identification of a fixK-like gene,a positiveregulator ofnifA.5,1983-1991(1991))、NrfA(Kaminski,P.A.&Elmerich,C.J.M.m.Thecontrol of Azorhizobium caulinodans nifA expression by oxygen,ammonia and bythe HF-I-like protein,NrfA.28,603-613(1998))和PII蛋白(例如，GlnB和GlnK(Michel-Reydellet,N.&Kaminski,P.A.J.J.o.b.Azorhizobium caulinodans Plland GlnKproteins control nitrogen fixation and ammonia assimilation.181,2655-2658(1999)))。将簇(总共64kb，包含76个基因)克隆到上述质粒系统中，并转移到根瘤菌属种IRBG74和防御假单胞菌Pf-5中，但在任一菌株中都没有发现活性。茎瘤固氮根瘤菌NifA和RpoN的过表达并没有导致活性，并且经进一步研究发现，这些调节剂在这些菌株中无活性。簇的大小以及遗传和基因功能信息的缺乏会使完全重构所述系统复杂化。出于这些原因，决定修改控制nif的调控，使其处于合成感应元件的控制之下。
本文的一个目标是消除固氮酶活性的铵抑制，这种抑制集中在NifA的调控上。使用sacB无标记缺失方法(参见材料和方法)将天然nifA基因从基因组中敲除，目的是将NifA置于诱导控制之下(图3A)。在ΔnifA菌株中只有来自nifH启动子的基础活性(图3B)。当NifA过表达时，启动子开启并且其活性通过操纵子中RpoN的共表达而进一步增强(应注意对于这些实验，基因组rpoN基因保持完整)。将针对根瘤菌属设计的IPTG诱导型系统(上一部分)携带在pBBRl-ori质粒上以在茎瘤固氮根瘤菌中进行测试。使用GFP，发现这诱导了几个数量级的表达(图21)。然后，将茎瘤固氮根瘤菌nifA和rpoN基因置于IPTG和携带在同一质粒上的与茎瘤固氮根瘤菌nifH启动子(包含ATG上游281nt)融合的荧光报告分子控制之下(参见材料和方法)。在用于固氮的条件下分析来自nifH启动子的响应函数，显示出至45倍的宽动态范围(图3C)。
将控制元件设计成共表达NifA和RpoN，并测试其诱导固氮酶的能力(图3D)。当完全诱导时，与野生型菌株相比，活性完全恢复。然后评估铵对固氮酶活性的抑制。10mM氯化铵的存在导致野生型菌株没有可检测的活性(图3E)。即使当NifA和RpoN都处于诱导控制之下，也存在强抑制，仅为野生型的固氮酶活性的5％。这表明铵对NifA活性的转录后控制保持完整。
在相关的α变形菌中，在NifA中鉴定出了消除铵抑制的突变(Paschen,A.,Drepper,T.,Masepohl,B.&Klipp,W.Rhodobacter capsulatus nifA mutants mediatingnif gene expression in the presence of ammonium.FEMS microbiology letters200,207-213(2001)；Rey,F.E.,Heiniger,E.K.&Harwood,C.S.Redirection ofmetabolism for biological hydrogen production.Applied and environmentalmicrobiology73,1665-1671(2007))。这些突变发生在N端GAF结构域中。使用多重序列比对，鉴定出两个等同残基在茎瘤固氮根瘤菌中突变(L94Q和D95Q)(图22)。制备这些突变，然后单独或组合进行测试(图3D)。当NifA的双重突变体与RpoN共表达时，铵的存在仅导致活性的轻微降低。
氧不可逆地抑制固氮酶并抑制nif簇。对诱导型nif簇进行氧敏感性测试，注意到茎瘤固氮根瘤菌是一种专性需氧菌并且在微需氧条件下固氮。然后将固氮酶对氧气的耐受性根据顶部空间中氧气浓度的变化进行评定，通过在监测氧气的水平同时注入氧气保持恒定(方法和图26A)。天然和诱导型基因簇对氧的反应几乎相同(图3F)。最佳活性出现在0.5％至1％之间，具有宽的耐受性(在3％氧气下活性为30％)。
防御假单胞菌Pf-5中可控nif活性的介绍
天然产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌和棕色固氮菌nif簇都在防御假单胞菌Pf-5中起作用(图1A)。然而，当天然施氏假单胞菌和棕色固氮菌簇转移时，固氮酶被强烈抑制。相比之下，转移天然产酸克雷伯氏菌簇会产生不受控制的(组成型开启的)固氮酶活性(图4E)。对于防御假单胞菌Pf-5中的这三个簇，试图通过从簇中移除nifA主调控元件并从控制元件中表达它们来获得调节控制(图4A)。
与根瘤菌属一样，我们发现，首先，在构建具有足够动态范围的控制元件之前，必须构建用于防御假单胞菌Pf-5的部分文库。表征了分别跨越778倍和24倍表达范围的一系列20个组成型启动子和7个T7启动子(图11A至图11C)。筛选了192个RBS的文库，表示表达范围为4,079倍(图12A至图12B)。选择彼此之间不共享序列同源性并且在根瘤菌属种IRBG74中的终止子强度>10的一组七个终止子，并与三种常用终止子(例如，T7终止子、rrnBTl和L3S2P21)一起表征。这七个终止子显示出终止子强度>50(图13A至图13B)。
将针对根瘤菌属设计的诱导型系统按原样转移到假单胞菌属特异性pRO1600质粒(参见材料和方法)。发现3OC6HSL诱导型系统、aTc诱导型系统、枯茗酸诱导型系统和DAPG诱导型系统都是有功能的(图15A)。此外，构建了基于Pfde启动子的柚皮素诱导型系统，并发现该系统有功能。通过在PBAD启动子中替换-10盒来增强阿拉伯糖诱导型系统的强度，并且通过阿拉伯糖转运体AraE的组成型表达改善了阿拉伯糖的输入(图15B)。最后，通过用Ptac启动子替换PAllacOl启动子并对LacI进行三氨基酸取代，针对防御假单胞菌Pf-5对IPTG诱导型系统进行优化(Meyer,A.J.,Segall-Shapiro,T.H.,Glassey,E.,Zhang,J.&Voigt,C.A.J.N.c.b.Escherichia coli“Marionette”strains with 12highly optimizedsmall-molecule sensors.1(2018))。这一努力产生了七个新的诱导型系统，该七个新的诱导型系统在防御假单胞菌Pf-5中产生41-554倍的诱导(图15C)。
为了简化簇之间的比较，试图建立了可诱导所有三个的单一通用控制元件。每一个都有不同的NifA序列，因此交叉诱导基因簇的能力得到了测试。为了做到这一点，将来自每个nif簇的nifH启动子克隆并与gfp融合以构建基于质粒的报告分子(参见材料和方法)。在大肠杆菌和防御假单胞菌Pf-5中评估了各种NifA同源物活化nifH启动子的能力(图23A至图23B)。结果表明，与表达与所转移簇同源的NifA变体相比，表达来自与宿主相似物种的NifA变体更重要。这可能是由于需要NifA来招募宿主转录机制，而启动子中的NifA结合位点跨物种间非常保守。基于这些数据，使用上述置于优化的IPTG诱导型系统控制下的施氏假单胞菌NifA构建控制元件。NifA的RBS是合成地设计的以涵盖nif基因的广泛表达(图24A)。使用mini-Tn7系统将控制元件插入到基因组中glmS的终止密码子下游25bp处。图4C和图24B示出了该控制元件使用荧光报告分子从每个簇诱导nifH启动子的能力。
然后评定基因簇中的每个基因簇在防御假单胞菌Pf-5中的固氮酶活性(图4D)。包含转移的簇的三个防御假单胞菌Pf-5菌株经修饰以插入控制元件并从每个簇中缺失天然的nifLA基因(图4B)。这三种菌株都是诱导型的，其中显示产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌和棕色固氮菌的固氮活性分别为1,200倍、2,300倍和130倍的动态范围。当被诱导时，这些系统都产生与未修饰的天然簇的转移所实现的相比类似的或甚至更高的固氮酶活性(图4D)。作为参考，由产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌和棕色固氮菌产生的固氮酶活性如图4D中的虚线所示(从上到下)(参见方法和材料)。所有这三个诱导型簇产生的活性水平都接近从野生型施氏假单胞菌和棕色固氮菌测量的活性水平。
天然施氏假单胞菌和棕色固氮菌簇被铵强烈抑制：17.1mM的存在分别消除了活性或将活性降低了7倍(图4E和图8A至图8B)。诱导型簇显示活性几乎没有降低，并且诱导型棕色固氮菌簇显示几乎没有氨抑制。虽然防御假单胞菌Pf-5中的天然产酸克雷伯氏菌簇产生组成型响应，但仍有某种抑制，这种抑制被诱导型形式降低了。
测试诱导型nif簇的氧敏感性。需注意，野生型棕色固氮菌由于簇内部和外部的遗传因素而能够在环境条件下固氮。首先，确定了防御假单胞菌Pf-5中的控制元件可以在氧存在下诱导来自三个nifH启动子的转录(图26A至图26B)。随后将固氮酶对氧气的耐受性根据顶部空间中氧气浓度的变化进行评定，如针对茎瘤固氮根瘤菌所描述(前一部分)。天然簇和诱导型簇表现出相同的氧响应(图4F)。来自产酸克雷伯氏菌的nif簇最敏感，在厌氧条件下产生最高的活性，但在O2存在下所述活性被快速消除。相比之下，来自施氏假单胞菌和棕色固氮菌的nif簇显示出最佳条件下分别为1％和0.5％的更宽耐受性。然而，与茎瘤固氮根瘤菌相比，这两个簇在更低的氧浓度下失去活性。
为了探索电子转运链的影响，制备了棕色固氮菌簇的几个突变体(图27)。棕色固氮菌簇包含两个潜在的至固氮酶的电子转运系统，并且冗余系统可有助于维持不同氧水平下固氮酶的氧化还原状态。重新测量了不同突变背景下固氮酶活性对氧浓度的依赖性。通过添加rnf2操纵子或缺失rnf2操纵子没有看到影响，但是缺失rnf1消除了活性。这表明，在这些条件下，rnf1操纵子是防御假单胞菌Pf-5中电子的唯一来源，并且Fix复合物不能补充Rnf复合物，这与棕色固氮菌的情况不同。
用农业相关感应元件控制固氮
控制元件的精心设计和表征具有简化可使用不同合成感应元件来诱导固氮酶表达的过程的益处。通过了解从非活性固氮酶变成活性固氮酶所需的动态范围，可以定量选择能够产生兼容响应的感应元件。这使得不同的环境信号—或者使用遗传逻辑电路的信号的组合—用来控制表达。为了证明这一点，选择了对与根际相关的各种化学信号做出响应的11种合成感应元件，并且证明了这些感应元件可用于在例如大肠杆菌的经工程改造的菌株(携带重构的v2.1 nif)、根瘤菌属种IRBG74(携带重构的v3.2 nif)、防御假单胞菌Pf-5(携带诱导型棕色固氮菌nif)和茎瘤固氮根瘤菌(诱导型nifA/rpoN)中产生诱导型固氮酶(图5A至图5D)。
根际中的化学信号的作用在图5A中示出。枯茗酸存在于植物种子中，并且用作杀真菌剂。天然根渗出物可包括糖、氨基酸、有机酸、酚类化合物、植物激素和类黄酮。这些代表了控制根面附近固氮酶产生的潜在信号。谷类已被证明可以释放阿拉伯糖、香草酸和水杨酸。此外，水杨酸调节植物先天免疫反应，并且已经研究了其外源添加到谷物的影响。柚皮素是许多类黄酮的常见前体，并且当应用于稻和小麦时改善了内生根定殖。染料木黄酮是异黄酮合酶所催化的来自柚皮素的产物，是从玉米根释放的。稻释放的群体感应模拟物可以调节3OC6HSL受体蛋白LuxR，这已经用大肠杆菌生物感应元件菌株进行了可视化。
根茎中的天然细菌或以生物防治剂形式添加的细菌、以喷雾接种剂或种子包衣形式引入的细菌，都会产生化学特征。用产生DAPG的根定殖假单胞菌属菌株接种谷类引起了对抗真菌病原体的保护。许多细菌产生群体分子，诸如N-酰基高丝氨酸内酯，作为通讯手段，并且植物可以响应于这些信号。细菌苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)产生3OC14HSL，所述3OC14HSL增强苜蓿结瘤，并已被证明诱导谷类中的系统抗性。DHBA可以由根定殖细菌产生以增加铁溶解度，并作为农杆菌属和根瘤菌属的化学引诱剂发挥作用。
这些化学物质的感应元件是基于针对每个物种的控制元件构建的。对于大肠杆菌MG1655，先前已经构建了包含携带在基因组中的12个优化的感应元件的菌株，所述感应元件响应于各种小分子(Meyer,A.J.,Segall-Shapiro,T.H.,Glassey,E.,Zhang,J.&Voigt,C.A.J.N.b.Escherichia coli“Marionette”strains with 12highly optimized small-molecule sensors.1(2018).)。这些感应元件的响应函数以标准单位来表征，使得在没有进一步调谐的情况下鉴定可以与固氮酶表达关联的菌株变得简单。Marionette包含用于香草酸、DHBA、枯茗酸、3OC6HSL和3OC14HSL的感应元件。对于每个感应元件，输出启动子与T7RNAP通过转录融合，并且响应启动子(PT7)的响应是作为诱导剂浓度的函数进行测量(图5B和图28B)。然后，引入v2.1重构的nif簇，并在存在和不存在诱导剂的情况下测量固氮酶活性(图5C和图28C)。将针对响应于阿拉伯糖和柚皮素的防御假单胞菌Pf-5构建的诱导型系统用于驱动NifA的表达，以控制棕色固氮菌nif簇(图4A)。首先使用报告分子证实这些感应元件对nifH启动子的诱导(图5B)。当这被nzf基因簇替换时，它导致固氮酶活性的诱导型响应(图5C)。根瘤菌属种IRBG74中的最佳固氮酶活性较低；然而，在此证明了它可以置于诱导型控制之下。将针对根瘤菌属种IRBG74开发的DAPG诱导型系统与T7 RNAP的控制关联，并且这产生了来自PT7的强烈响应(图5B)。然而，当用于驱动v3.2重构的途径的表达时，仅观察到9倍的诱导，与在该菌株中观察到的低固氮酶活性一致(图5C)。最后，用针对根瘤菌属设计的水杨酸感应元件来控制NifA(L94Q/D95Q)/RpoN在茎瘤固氮根瘤菌中的表达(图3A和图5B)。这产生了1000倍的固氮酶活性动态范围(图5C)。
植物可以经工程改造以释放正交化学信号，所述正交化学信号随后可以被对应的经工程改造细菌感测到。这将具有的益处是只有在经工程改造的作物存在下才能诱导固氮酶。此外，如果该分子可被经工程改造的细菌代谢，则它可以作为一种机制，围绕这种机制可以设计一种合成共生关系，其中植物提供碳并且细菌以经工程改造的关系固氮。为此，豆科植物和拟南芥已经工程改造以产生冠瘿碱，包括胭脂碱和章鱼碱。基于LysR型转录激活因子OccR(章鱼碱)和NocR(胭脂碱)及其相应的Pocc和Pnoc启动子，构建了针对茎瘤固氮根瘤菌这两种冠瘿碱的感应元件(图5D和图21)。将这些感应元件与NifA(L94Q/D95Q)/RpoN的表达相关联，并且使用荧光报告分子测量来自PnifH的响应。两个响应函数都有大动态范围(图5B)并产生高诱导型固氮酶活性(图5C)。与野生型相比，胭脂碱感应元件产生了412倍的动态范围，并且章鱼碱感应元件导致了高40％的固氮酶活性。
讨论
为了设计一种能将固定的氮递送到谷类作物的细菌，这项工作提供了多种物种、天然nif簇和工程改造策略的并行比较，所述工程改造策略可用于在可作为内生菌或附生菌与谷类联合的菌株中获得诱导型固氮酶活性。为此，构建了约100个菌株，涉及将10个大小从10kb到64kb的天然nif簇转移到16种不同的根瘤菌属、固氮根瘤菌属、假单胞菌属的种和大肠杆菌。采取了不同的方法根据生物信息学和蛋白质工程来使这些nif簇变得可诱导，以从头开始完成基因重建(重构)。除了最高活性之外，重要的是固氮对氮肥(氨)的加入和微需氧环境是稳健的。例如，内生菌，诸如其中nifA被从基因组中敲除并且nifA突变体和rpoN在质粒上互补的固氮根瘤菌属变体，可用于获得高固氮酶活性。对于附生菌来说，防御假单胞菌Pf-5是一种基于将棕色固氮菌nif簇转移并将施氏假单胞菌的nifA置于诱导型控制下的多用途菌株。在这两种情况下，所获得的固氮酶活性分别与野生型茎瘤固氮根瘤菌和施氏假单胞菌几乎相同。两者都没有显示出的氨的显著抑制，并且获得了在1％氧气中的最佳活性。基于这些菌株，证明了固氮酶可以被置于响应于谷类根渗出物(阿拉伯糖、水杨酸)、植物激素(柚皮素)和可由经遗传修饰的植物(例如，可表达或渗出胭脂碱或章鱼碱)释放的推定信号传导分子的诱导型控制之下。
因为根瘤菌属种IRBG74可以固定豆科植物根瘤中的氮，并且还可以与稻联合，所以投入了大量的精力来工程改造这种菌株以使其在与谷类联合时固氮。第一种尝试只是补充nifV，因为nifV在根瘤菌属种IRBG74中是不存在的，并产生植物所提供的代谢物，但这一尝试没有成功。然后，发现所有转移的初始nif簇(其中一些在防御假单胞菌Pf-5和大肠杆菌中具有高活性)在根瘤菌属种IRBG74中没有功能，这导致尝试来自α变形菌的簇，所述簇中的一个簇产生了非常低水平的活性，这依赖于根瘤菌属种IRBG74天然的nif基因。之前公布的基于克雷伯氏菌属nif的重构的基因簇在根瘤菌属种IRBG74中进行了尝试了，但这些簇显示为没有活性。只有在构建了新的重构的簇(v3.2)后，才获得了不依赖于天然nif基因的独立生存条件下的活性。这使得表达水平增加，并且发现了一个最佳值，超过该最佳值，活性就会丧失。这是首次在于独立生存条件下在其他情况下无法执行该功能的根瘤菌属中对nif活性进行工程改造。
本公开包括不同程度的nif途径重新工程改造以促进异源转移。最热望的是所有nif基因和调控的完全重构，其中所有调控基因部分被替换，基因被重新编码，操纵子被重组，并且转录由正交T7 RNAP执行。最初，对性能的评估依赖于整体固氮酶活性，而不是对基础部分的理解。因此，第一重构路径表现不佳。在随后的研究中，更好的部分文库和DNA装配和自动化平台使得能够进行许多变体的合成。此外，随着RNA-seq成本的下降，RNA-seq被用来评估内部部分诸如启动子和终止子的性能。这表明首次的设计实际上是大的单操纵子，对单独基因的转录水平几乎没有差异控制。使用这些技术允许可以对重构的nif途径的功能进行剪裁，并发现许多潜在的遗传结构不需要达到高活性。
应用使得能够测量翻译部分(例如，核糖体结合位点)的新技术核糖体谱分析，并推断表达水平。此外，固氮酶活性和基础部分的功能被评定为簇在物种之间移动。有趣的是，天然克雷伯氏菌nif簇可以被转移并且它的表现类似，但是重构的簇在不同的宿主中产生了差异很大的表达水平，有时会导致活性完全丧失。这可以通过维持重构的簇中的天然操纵子结构来恢复，这意味着这不是由于合成的感应元件、T7 RNAP或启动子/终止子。这是操纵子的假设功能之一。实现这一点需要维持天然簇的密码子使用和翻译偶联。然而，这并不意味着也不可能对该功能进行合成地编码。已经有了计算进展，所述计算进展使得能够当编码在操纵子上时，计算上游基因内部的RBS。如果与密码子优化算法相结合，这将允许设计获得所需程度的翻译偶联和表达水平的从头遗传部分。
本公开证明了茎瘤固氮根瘤菌和防御假单胞菌Pf-5中nif簇的去调控，使得能够将它们置于谷类根渗出物的控制之下。这解除了在存在外源氮肥的情况下对该途径的抑制，这对于将该细菌用作综合农业解决方案的一部分来说至关重要。此外，这些生物保留了在微需氧环境中固氮的能力，从而避免了对强制严格厌氧的根瘤的需要。nif途径的完全去调节使细菌在土壤中没有竞争力并迅速消失，从而限制了其对生长周期的特定阶段的影响。因此，证明固氮酶可以置于化学根渗出物的控制之下。
实施方案
1.一种能够在有氧独立生存条件下固氮的根瘤菌，所述根瘤菌包括具有外源nif簇的共生根瘤菌，其中所述外源nif簇赋予所述共生根瘤菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述根瘤菌不是茎瘤固氮根瘤菌。
2.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自独立生存的固氮生物。
3.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自共生的固氮生物。
4.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自光合α变形菌。
5.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自γ变形菌。
6.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自蓝细菌。
7.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自厚壁菌。
8.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自类球红细菌。
9.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇来自沼泽红假单胞菌。
10.根据段落1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇是诱导型重构的nif簇。
11.根据段落10所述的根瘤菌，其中所述诱导型重构的nif簇是诱导型重构的克雷伯氏菌属nif簇。
12.根据前述段落中任一项所述的根瘤菌，其中所述根瘤菌是IRBG74。
13.根据前述段落中任一项所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇包含6个nif基因。
14.根据段落13所述的根瘤菌，其中所述6个nif基因是nifHDK(T)Y、nifEN(X)、nifJ、nifBQ、nifF、和nifUSVWZM。
15.根据段落13或14所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇中的每个nif基因前面是T7启动子。
16.根据段落15所述的根瘤菌，其中所述T7启动子是野生型启动子。
17.根据前述段落中任一项所述的根瘤菌，所述根瘤菌还包含内源nif簇。
18.根据前述段落中任一项所述的根瘤菌，其中所述nif簇具有nifV基因。
19.根据段落18所述的根瘤菌，其中所述nifV基因是内源的。
20.根据前述段落中任一项所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇还包含终止子。
21.根据段落15-20中任一项所述的根瘤菌，其中所述T7启动子具有终止子，并且其中所述终止子在所述T7启动子的下游。
22.根据段落12所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇是重构的根瘤菌IRBG74 nif簇。
23.一种能够在有氧独立生存条件下固氮的植物生长促进细菌，所述植物生长促进细菌包括具有外源nif簇的细菌，所述外源nif簇具有至少一个诱导型启动子，其中所述外源nif簇赋予所述细菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述细菌不是茎瘤固氮根瘤菌。
24.根据段落23所述的植物生长促进细菌，其中所述细菌是共生细菌。
25.根据段落23所述的植物生长促进细菌，其中所述细菌是内生菌。
26.根据段落25所述的植物生长促进细菌，其中所述内生菌是根瘤菌IRBG74。
27.根据段落23所述的植物生长促进细菌，其中所述细菌是附生菌。
28.根据段落27所述的植物生长促进细菌，其中所述附生菌是防御假单胞菌PF-5。
29.根据段落23-28中任一项所述的植物生长促进细菌，其中所述植物生长促进细菌与经遗传修饰的谷类植物联合。
30.根据段落29所述的植物生长促进细菌，其中所述经遗传修饰的谷类植物包含编码化学信号的外源基因。
31.根据段落29所述的植物生长促进细菌，其中所述固氮受所述化学信号控制。
32.根据段落30或31所述的植物生长促进细菌，其中所述化学信号是冠瘿碱、间苯三酚或rhizopene。
33.根据段落23-32中任一项所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇包含6个nif基因。
34.根据段落33所述的根瘤菌，其中所述6个nif基因是nifHDK(T)Y、nifEN(X)、nifJ、nifBQ、nifF和nifUSVWZM。
35.根据段落23-34中任一项所述的根瘤菌，其中所述诱导型启动子是T7启动子。
36根据段落23-34中任一项所述的根瘤菌，其中所述诱导型启动子是PAllacO1启动子。
37.根据段落23-36中任一项所述的根瘤菌，其中所述诱导型启动子由选自包括IPTG、水杨酸钠、章鱼碱、胭脂碱、群体信号3OC6HSL、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸的组中的试剂活化。
38根据段落23-37中任一项所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇还包含终止子。
39.根据段落23-37中任一项所述的根瘤菌，其中所述诱导型启动子具有终止子，并且其中所述终止子在所述诱导型启动子的下游。
40.一种能够在谷类作物中诱导非铵依赖性固氮的茎瘤固氮根瘤菌，所述茎瘤固氮根瘤菌包含：
(i)经修饰的nif簇，其中内源nifA基因被缺失或改变；和
(ii)至少一个包含nifA和RNA聚合酶σ因子(RpoN)的操纵子，其中所述操纵子包含含有诱导型启动子的调控元件。
41.根据权利要求40所述的茎瘤固氮根瘤菌，其中所述诱导型启动子是PAllacO1启动子。
42.根据段落40或41所述的茎瘤固氮根瘤菌，其中所述诱导型启动子由选自IPTG、水杨酸钠、章鱼碱、胭脂碱、群体信号3OC6HSL、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸的试剂活化。
43.根据段落40-42中任一项所述的茎瘤固氮根瘤菌，其中所述内源nifA基因用以下取代中的至少一种取代改变：
(i)L94Q；
(ii)D95Q；和
(iii)L94Q和D95Q两者。
44.一种工程改造能够在有氧独立生存条件下固氮的根瘤菌的方法，所述方法包括将外源nif簇转移至共生根瘤菌，其中所述外源nif簇赋予共生根瘤菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述根瘤菌不是茎瘤固氮根瘤菌。
45.根据段落44所述的方法，其中所述外源nif簇包含6个nif基因。
46.根据段落45所述的方法，其中所述6个nif基因是nifHDK(T)Y、nifEN(X)、nifJ、nifBQ、nifF和nifUSVWZM。
47.根据段落45或46所述的方法，其中所述nif基因中的每个nif基因前面是野生型T7启动子。
48.根据段落44-47中任一项所述的方法，其中所述外源nif簇在质粒中转移至所述根瘤菌。
49.根据段落44-48中任一项所述的方法，其中所述外源nif簇还包含终止子。
50.根据段落47-49中任一项所述的方法，其中所述野生型T7启动子具有终止子，并且其中所述终止子在所述野生型T7启动子的下游。
51.根据段落44-50中任一项所述的方法，其中所述内源NifL基因被缺失。
52.一种产生氮以供谷类植物消耗的的方法，所述方法包括提供能够在谷类植物附近在有氧独立生存条件下固氮的植物生长促进细菌，其中所述植物生长促进细菌是具有外源nif簇的共生细菌，其中所述外源nif簇赋予所述共生细菌固氮能力，从而使得能够在有氧独立生存条件下固氮。
53.根据段落52所述的方法，其中所述植物生长促进细菌是根瘤菌。
54.根据段落52所述的方法，其中所述植物生长细菌是根据段落1-22和23-39中任一项所述的细菌。
55.根据段落52-54中任一项所述的方法，其中所述谷类植物是经遗传修饰的谷类植物。
56.根据段落55所述的方法，其中所述经遗传修饰的谷类植物包括编码化学信号的外源基因。
57.根据段落56所述的方法，其中所述固氮处于所述化学信号的控制下。
58.根据段落56或57所述的方法，其中所述化学信号是冠瘿碱、间苯三酚或rhizopene。
59.根据段落52-55中任一项所述的方法，其中所述固氮处于化学信号的控制下。
60.根据段落57或59所述的方法，其中所述化学信号是根渗出物、生物防治剂或植物激素。
61.根据段落60所述的方法，其中所述根渗出物选自由以下组成的组：糖、激素、类黄酮和抗菌剂。
62.根据段落57或59所述的方法，其中所述化学信号是香草酸盐。
63.根据段落57或59所述的方法，其中所述化学信号是IPTG、aTc、枯茗酸、DAPG、和水杨酸、3,4-二羟基苯甲酸，3OC6HSL或3OC14HSL。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。在本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除另外非明确声明，否则所公开的每个特征仅仅是一系列等同或相似特征的示例。
根据以上描述，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域的技术人员可以容易地确定本发明的本质特征，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求书的范围内。
等效案
虽然本文已经描述和说明了几个发明实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文所述的功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每个被认为在本文所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置都意欲为示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教导所用于的一个或多个特定应用。本领域的技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文所述的特定创造性实施方式的许多等同方案。因此，应该理解的是，前述实施方案仅通过举例的方式呈现，并且在所附权利要求书及其等效案的范围内，创造性实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的方式实践。本公开的创造性实施方案针对本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本公开的创造性范围内。
如本文所定义和使用的所有定义应该理解为支配字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义的术语的普通含义。
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请都各自关于引用所针对的主题以引用方式并入本文中，所述主题在某些情况下可以包含整个文件。
除非明确指出相反的意思，否则在说明书和权利要求书中使用的如本文所用的不定冠词“一”和“一种(个)”应该理解为意谓“至少一种(个)”。
说明书和权利要求书中使用的如本文所用的短语“和/或”应该理解为意谓如此结合的元件中的“一个或两个”，即在一些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的元件。用“和/或”列出的多个元件应该以相同的方式解释，即“一个或多个”这样结合的元件。除了由“和/或”条款特别标识的要素之外，可以任选地存在其他元素，而无论与那些特别标识的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，在一个实施方案中，对“A和/或B”的引用可以仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。
如在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应该理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包括至少一个，但也包括多于一个的数个要素或要素列表，以及任选地，附加的未列出的项目。只有明确指出与此相反的术语，诸如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”，或者，当在权利要求中使用时，“由……组成”将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般来说，当前面有排他性的术语，例如“……中的任一者”、“……中的一者”、“……中的仅一者”或“……中的恰好一者”时，如本文所用的术语“或”仅应被解释为表示排他性的替代物(即“一个或另一个，而不是两个”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由……组成”应具有专利法领域中使用的普通含义。
如在说明书和权利要求书中所使用的，在提到一个或多个要素的列表时，术语“至少一个”应该被理解为意谓从要素列表中的任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但是不一定包括要素列表中具体列出的每个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许任选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素列表中特别标识的要素之外的要素，而无论与那些具体标识的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一者”(或者等同地，“A或B中的至少一者”，或者等同地“A和/或B中的至少一者”)在一个实施例方案中可以指至少一者，任选地包括多于一个A，不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中指至少一个，任选地包括多于一个B，不存在A(和任选地包括除A之外的要素)；在又一实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个A，和至少一个，任选地包括多于一个B(和任选地包括其他要素)；等等。
还应当理解的是，除非明确指出相反的情况，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的次序不必限于叙述该方法的步骤或动作的次序。
附表
表2.用于nif簇克隆的引物。
Figure BDA0003307346880000801
Figure BDA0003307346880000811
Figure BDA0003307346880000821
Figure BDA0003307346880000831
Figure BDA0003307346880000841
Figure BDA0003307346880000851
Figure BDA0003307346880000861
表3.本研究中使用的菌株
Figure BDA0003307346880000862
Figure BDA0003307346880000871
Figure BDA0003307346880000881
表4.本研究中使用的质粒
Figure BDA0003307346880000882
Figure BDA0003307346880000891
Figure BDA0003307346880000901
Figure BDA0003307346880000911
Figure BDA0003307346880000921
Figure BDA0003307346880000931
Figure BDA0003307346880000941
表5.本研究中使用的遗传部分序列
Figure BDA0003307346880000942
Figure BDA0003307346880000951
Figure BDA0003307346880000961
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Figure BDA0003307346880000981
Figure BDA0003307346880000991
Figure BDA0003307346880001001
Figure BDA0003307346880001011
Figure BDA0003307346880001021
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Figure BDA0003307346880001091
Figure BDA0003307346880001101
Figure BDA0003307346880001111
Figure BDA0003307346880001121
Figure BDA0003307346880001131
Figure BDA0003307346880001141
Figure BDA0003307346880001151
Figure BDA0003307346880001161
Figure BDA0003307346880001171
Figure BDA0003307346880001181
Figure BDA0003307346880001191
Figure BDA0003307346880001201
Figure BDA0003307346880001211
表6.本研究中使用的RBS序列
Figure BDA0003307346880001212
Figure BDA0003307346880001221
Figure BDA0003307346880001231
Figure BDA0003307346880001241
Figure BDA0003307346880001251
Figure BDA0003307346880001261
Figure BDA0003307346880001271
a起始密码子是加下划线的。
b通过RBS计算器2合理地设计了用于控制元件的RBS
表7.本研究中使用的化学物质
Figure BDA0003307346880001272
Figure BDA0003307346880001281
Figure BDA0003307346880001291
序列表
<110> 麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)
<120> 与谷类联合的根瘤菌中的固氮的控制
<130> M0656.70492WO00
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/820,765
<151> 2019-03-19
<150> US 16/746,215
<151> 2020-01-17
<160> 293
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 可以由/5rApp/修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 可以由/3ddc/修饰
<400> 1
ctgtaggcac catcaat 17
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 可以由/5Phos/修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> 可以由/iSp18/修饰
<400> 2
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 可以由/iSp18/修饰
<400> 3
caagcagaag acggcatacg agatattgat ggtgcctaca g 41
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 5
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(68)
<223> n是a、c、g、或t
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg atcggaagag cacacgtctg aactccagtc 60
acnnnnnnac actctttccc tacac 85
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
cgacaggttc agagttctac agtccgacga tc 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
cgacaggttc agagttctac agtccgacga tc 32
<210> 8
<211> 68
<212> DNA
<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)
<400> 8
cgtagggcgc attaatgcag ctggcacgac aggtgaattc tagactgctg gatacgctgc 60
ttaaggtc 68
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)
<400> 9
tacgctgttt gagctggcaa acct 24
<210> 10
<211> 74
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 10
gcccggagag caagcccgta gggcgcatta atgcagctgg cacgacaggt gttaggttgg 60
cctgaattcg gtgt 74
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 11
ggctcacttc gatttcgtcc gcggtgcgtg ccctgctagt gatgcgta 48
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 12
cgcctgattt cgcctgatga acagg 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 13
tgacgctgtt gaccaccgcc 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 14
atggaagtgg tcggcaccgg cta 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 15
cgcaacggtt ggggtaggtt gg 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 16
gacgtccatc gcttcggctt cga 23
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 17
ctgcgaaatc gacgctgtcg agcatcatcg cggttca 37
<210> 18
<211> 101
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 18
atccattctc aggctgtctc gtctcgtctc tacgtacgcg gatcccaggc aacgtcttcg 60
tactgcggta ccgggttgcg ggggcagcca gtggaaaaag g 101
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 19
ctacggcacg ccctggttcg a 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 20
gctcggaaag tgctggagaa ac 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 21
aaatcagaca ttcatggcca cagg 24
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 22
tctaccatgg cgtgactctc gg 22
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 23
actcgtcttc tgtccgttta aactcccgga actctaccac cgc 43
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 24
cttggataga cgaggcacag c 21
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 25
gccggctcct gcaacctgaa ggggccgagg atgatg 36
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 26
gaattgagga taaatgtcag ggatttcatg 30
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 27
ccaagcattt tgagatcgcg gatg 24
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 28
cggaggtgcc ggtatgagcg a 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 29
gaagtttgca gcgaaagagg cg 22
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 30
gggatgatgc agaatacatc ccg 23
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 31
ggtgacctgg atgatgcaga ggagag 26
<210> 32
<211> 118
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 32
ggcccgcgtt aggttggcct gaattcggtg tgtatccccc ggagatacgt aaaaaaaaaa 60
accccgccct gtcaggggcg gggttttttt ttgataagtc aagctatcag aaccgatc 118
<210> 33
<211> 48
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 33
taattcccat aacatctgca tgcataataa ggtggggaaa gtctcagc 48
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 34
aatgtatttc tgatcgatgc gacg 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 35
gttatctggc tgatgtttgt ggtg 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 36
gtcaaactgt cttgtttaaa gccg 24
<210> 37
<211> 104
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 37
ttaaggtcat gcagcaggag aactaaaggc ccgcgttagg ttggtaataa aaaagccccc 60
ggaatgatct tccgggggcc ctgcgcaaat acaacatcga gatc 104
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 38
gacgactgaa taaggatcgc ggaatg 26
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 39
tatgtcacag gcccgacaaa gcg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 40
gattgtcggg tatcgcacac gag 23
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 41
cgaaggagtt cgccccagtc tattc 25
<210> 42
<211> 68
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 42
aatacgatcg catgtcctag gtaatacgac tcactatagg gagaggtaat cagtggtgga 60
tttgatgt 68
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 43
ccaagcaaag gaccaccctc 20
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 44
agcttcgata tcatccgctg at 22
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 45
ttgttcatgt cggacctaac cga 23
<210> 46
<211> 67
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 46
caatacgatc gcatgtccta ggtaatacga ctcactatag ggagatgcat ttcacgcttc 60
gcgattc 67
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 47
ccgccttcac cagagacacc 20
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 48
atcgagaagt tctacgatgc cgt 23
<210> 49
<211> 68
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 49
gcaaaaaaaa accccgcccc tgacagggcg gggttttttt tttcaattgg acctggatgg 60
gcagcaag 68
<210> 50
<211> 106
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 50
ctcgcatcca ttctcaggct gtctcgtctc gtctctctag agtcggagct cttggggcct 60
ctaaacgggt cttgaggggt tttttgttgt cttcgacgcg aagctc 106
<210> 51
<211> 53
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 51
ataggcaata cgatcgcatg tccgtttaaa ctgataagga cggcactggc tgg 53
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 52
cgatgccgtc cagcacctc 19
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 53
ctgccacggt tcccaaggtt c 21
<210> 54
<211> 62
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 54
taaaaaagcg gctaaccacg ccgctttttt tacgtctgca gtgttgtcga agcttgatgc 60
gc 62
<210> 55
<211> 60
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 55
cgctgcttaa ggtcatgcag caggagaact aaaggcccgc tctgcgaaag gaatagcgtc 60
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 56
ctatcgccgc cacctgacc 19
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 57
cgtcagaacg gctctgacgc atcagggaga 30
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 58
agtaatattg cggatcggcc agcagcgagg aa 32
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 59
ggtggtcatt ggcaacggtt cgaag 25
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 60
tccccaagag cccaaccgtt ccgggagcga a 31
<210> 61
<211> 99
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 61
ttaaggtcat gcagcaggag aactaaaggc ccgcgttagg ttggtaataa aaaagccccc 60
ggaatgatct tccgggggcc gatcgaggaa atcgacgtg 99
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 62
atattccgga tacggctggt gaggtgga 28
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 63
cgccacgtcg tcaatgccta taac 24
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 64
tgaccaccgt gcagaagatc c 21
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)
<400> 65
gtgacgctcg cgtatcaggt ttg 23
<210> 66
<211> 69
<212> DNA
<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)
<400> 66
atcaggcgca tatttgaatg tatttactgc agcggccgct tctagagtga ccaaaagctt 60
ccgcaaccc 69
<210> 67
<211> 48
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 67
actacgcatc actagcaggg cacgcaccgc ggacgaaatc gaagtgag 48
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 68
ttgtcgactc ccggggtctg ac 22
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 69
ggctttaacg gcatgttccg ggt 23
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 70
gtagtcgtcg ttgtggccga actc 24
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 71
aaagcatcat ctcgggtcgg gc 22
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 72
cgtcgagcga caacgcctcg a 21
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 73
ctatgagctg gactgaaccg cgatg 25
<210> 74
<211> 74
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)
<400> 74
gaaaataccg catcaggcgc atatttgaat gtatttactg cagcggccgc tggcgaatct 60
ccttcctcgg ttcg 74
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 75
gccttcgaac atgttgtccc ag 22
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 76
tcgagttcga gcagtttctc cagc 24
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 77
agcgaacaat acctgtggcc 20
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 78
tggcgcttgc ccttgttcca a 21
<210> 79
<211> 54
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 79
gcgcggtggt agagttccgg gagtttaaac ggacagaaga cgagtcgtgc gggc 54
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 80
ttgctcaggg tcgggttggc 20
<210> 81
<211> 39
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 81
catcatcctc ggccccttca ggttgcagga gccggcttg 39
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 82
gcaagccact ccactgacga a 21
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 83
acaggttccg cagttcacaa gc 22
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 84
gctgattgtg atcgacaata ttcgg 25
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 85
gaaagcctac acgaagcaaa gg 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 86
cttgagaatc tgccgggcgc ct 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 87
atccacaaat caacaccctg cg 22
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 88
aaagcgttcc agtcacggtc ac 22
<210> 89
<211> 48
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 89
gagactttcc ccaccttatt atgcatgcag atgttatggg aattaacg 48
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 90
accttgacaa tcattacaca gcg 23
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 91
caaatataat gatcgacatt ttcaccac 28
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 92
cgttaacttt gtcgcaaaac ttcg 24
<210> 93
<211> 102
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 蓝丝菌属
<400> 93
accaaggcga atctccttcc tcggttcgcg atcacgctac tccgccaata aaaaagcccc 60
cggaatgatc ttccgggggc cagattcagg taactgctca ag 102
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 94
tgcgtcttct tcgggcatcg tca 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 95
agaaaattga ttgcggacga gcg 23
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 96
ttcaataagt taagcagatc ggcctcg 27
<210> 97
<211> 33
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 97
cggtgttacg aataaatatt tctacgaata gac 33
<210> 98
<211> 68
<212> DNA
<213> 巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)
<400> 98
gctccaaaag gagcctttaa ttgtatcggt ttatcagctt gctttgttcc gcgggtctcg 60
atacaacg 68
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 99
ggtcttgcgg atcatcactt tc 22
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 100
gacggtcagg tggtccgaac 20
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 101
ggtgagaatg atcatgatcg gcc 23
<210> 102
<211> 67
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 102
ctccaaaagg agcctttaat tgtatcggtt tatcagcttg ctttgacgac aagtggagaa 60
gggatag 67
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 103
tcccatggtc atgtcctttg cg 22
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 104
gtgcgctttt ccacgaggag c 21
<210> 105
<211> 66
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 105
aattgaaaaa aaaaaccccg ccctgtcagg ggcggggttt ttttttgcag cgcccattcc 60
gtcttc 66
<210> 106
<211> 66
<212> DNA
<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400> 106
gctccaaaag gagcctttaa ttgtatcggt ttatcagctt gctttggaga aagcctgcgc 60
ggctag 66
<210> 107
<211> 65
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 107
gcccccggaa ggtgatcttc cgggggcttt ctcatgcgtt gacagccttg agatagatca 60
agtgc 65
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 108
ctgatccagg ccttcatcgg 20
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 109
gacatgtctg gtctccttgg aac 23
<210> 110
<211> 42
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 110
ttctggaatt tggtaccgag tcagtaacgt gccacagcct cg 42
<210> 111
<211> 117
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 111
atcaggcgca tatttgaatg tatttactgc agcggccgct acgtacttgt ggggtcagtt 60
ccggctgggg gttcagcagc cacctgcagt taattaaggc gctcctttcc tgattcg 117
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 112
gctgctgtgt ggagagatcg 20
<210> 113
<211> 22
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 113
gtcggtgaga ttgatcatgg cc 22
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 114
tgcatgtccg ttcctcgctg 20
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 115
acatgtcttg aattccttcg aacc 24
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 116
tgcattgcgt tcgctccc 18
<210> 117
<211> 19
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
<400> 117
tgtcagggca ggcagggcc 19
<210> 118
<211> 41
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 118
tcaccagccg tatccggaat atgtcaggat catgacatcc c 41
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 119
acgatttcca tgcccaggtc 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 120
cctccagcac ctcttcgatg 20
<210> 121
<211> 67
<212> DNA
<213> 重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<400> 121
gctccaaaag gagcctttaa ttgtatcggt ttatcagctt gctttgggca atacctgaga 60
cgtttca 67
<210> 122
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 122
agagtgttga cttgtgagcg gataacaatg atacttagat tcaattgtga gcggataaca 60
atttcacaca 70
<210> 123
<211> 2652
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 123
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctacttgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gacaaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtacgat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 124
<211> 51
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(A. caulinodans)
<400> 124
cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga g 51
<210> 125
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 125
atggcgatga gcccaaagat ggagttccgc cagagccagt ctctggtgat gacgccgcag 60
ctgatgcagg ccatcaagct gctgcagctc tccaatctcg aactggtcgc ctatgtggag 120
gccgagctcg aacgcaatcc gctgctggag cgggcgagcg agccggaaag ccccgagcac 180
gatccgccga acccgcagga agaggcaccc accccgcctg acagtggcgc gccggtgtcc 240
ggcgactgga tggaaagcga catgggctcg agccgcgagg ccatcgagac ccggctggac 300
accgacctcg gcaatgtctt tcccgatgat gcgccggccg agcgcatcgg cgcgggcagc 360
ggcagcggct cgtccatcga atggggctcg ggcggcgacc ggggcgagga ctacaatccg 420
gaagccttcc tcgctgccga gacgacgctg gccgaccatc tggaagccca gctctccgtg 480
gcggagcccg atccggcgcg ccgcctcatc ggcctcaacc tcatcggcct catcgacgag 540
acgggttatt tctccggcga cctcgatgcg gtggccgagc aactgggcgc cacccacgat 600
caggtggccg acgtgctgcg cgtcatccag agcttcgagc cgtccggcgt cggcgcacgg 660
tcgctcagcg aatgcctggc cctgcaattg cgcgacaagg atcgctgcga tcccgccatg 720
caggcgctgc tcgacaatct ggaactcctc gcccgccacg accgcaacgc gctgaagcgc 780
atctgcgggg tggacgcgga agacctcgcg gacatgatcg gcgagatccg ccgcctcgat 840
ccgaagcccg gcctcgccta tggcggcggc gtcgtccacc cgctggtgcc ggacgtgttc 900
gtgcgcgagg gctccgacgg cagctggatc gtggaactga attccgagac gctgccgcgc 960
gtgctggtga accagaccta tcacgcgacg gtggccaagg cggcgcgctc ggccgaggaa 1020
aagaccttcc tcgccgactg cctccagagc gcctcctggc ttacccgctc gctcgaccag 1080
cgggctcgca ccatcctcaa ggtggcgagc gagatcgtgc gccagcagga cgccttcctc 1140
gtgcacggcg tgcggcacct gcgccccctg aacctgcgca cggtggcgga tgccatcggc 1200
atgcacgaat ccaccgtctc gcgggtgacc tcgaacaagt acatctccac cccgcgcggg 1260
gtgctggaga tgaagttctt cttctcctcc tccatcgctt cctcgggtgg tggcgaggcc 1320
catgcggcgg aggcggtgcg ccaccgcatc aagagcctca tcgaggccga gagtgcggac 1380
gacgtgctgt ccgacgacac gctggtgcag aagctgaagg acgacggcat cgatatcgcc 1440
cgccgaacgg tcgcgaaata tcgcgagagc atgaacatcc cgtcctcggt ccagcgccgc 1500
cgcgaaaagc aggccctgcg cagcgacgcc gccgccgccg gctga 1545
<210> 126
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 126
gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60
tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120
gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180
tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240
gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300
cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 360
gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 420
actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 480
ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag 540
caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc 600
tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 660
agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact 720
gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc 780
gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 840
tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 900
gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 960
gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 1020
gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 1080
tga 1083
<210> 127
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 127
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgttagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatag 717
<210> 128
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 128
atgcgtaaag gcgaagagct gttcactggt gtcgtcccta ttctggtgga actggatggt 60
gatgtcaacg gtcataagtt ttccgtgcgt ggcgagggtg aaggtgacgc aactaatggt 120
aaactgacgc tgaagttcat ctgtactact ggtaaactgc cggtaccttg gccgactctg 180
gtaacgacgc tgacttatgg tgttcagtgc tttgctcgtt atccggacca tatgaagcag 240
catgacttct tcaagtccgc catgccggaa ggctatgtgc aggaacgcac gatttccttt 300
aaggatgacg gcacgtacaa aacgcgtgcg gaagtgaaat ttgaaggcga taccctggta 360
aaccgcattg agctgaaagg cattgacttt aaagaagacg gcaatatcct gggccataag 420
ctggaataca attttaacag ccacaatgtt tacatcaccg ccgataaaca aaaaaatggc 480
attaaagcga attttaaaat tcgccacaac gtggaggatg gcagcgtgca gctggctgat 540
cactaccagc aaaacactcc aatcggtgat ggtcctgttc tgctgccaga caatcactat 600
ctgagcacgc aaagcgttct gtctaaagat ccgaacgaga aacgcgatca tatggttctg 660
ctggagttcg taaccgcagc gggcatcacg catggtatgg atgaactgta caaatga 717
<210> 129
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 129
atggcttcct ccgaagacgt tatcaaagag ttcatgcgtt tcaaagttcg tatggaaggt 60
tccgttaacg gtcacgagtt cgaaatcgaa ggtgaaggtg aaggtcgtcc gtacgaaggt 120
acccagaccg ctaaactgaa agttaccaaa ggtggtccgc tgccgttcgc ttgggacatc 180
ctgtccccgc agttccagta cggttccaaa gcttacgtta aacacccggc tgacatcccg 240
gactacctga aactgtcctt cccggaaggt ttcaaatggg aacgtgttat gaacttcgaa 300
gacggtggtg ttgttaccgt tacccaggac tcctccctgc aagacggtga gttcatctac 360
aaagttaaac tgcgtggtac caacttcccg tccgacggtc cggttatgca gaaaaaaacc 420
atgggttggg aagcttccac cgaacgtatg tacccggaag acggtgctct gaaaggtgaa 480
atcaaaatgc gtctgaaact gaaagacggt ggtcactacg acgctgaagt taaaaccacc 540
tacatggcta aaaaaccggt tcagctgccg ggtgcttaca aaaccgacat caaactggac 600
atcacctccc acaacgaaga ctacaccatc gttgaacagt acgaacgtgc tgaaggtcgt 660
cactccaccg gtgcttaa 678
<210> 130
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 130
atggtttcga agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cttgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agacgatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 131
taatacgact cactataggg aga 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 132
taatacgact cactacaggc aga 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 133
taatacgact cactagagag aga 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 134
taatacgact cactaatggg aga 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 135
taatacgact cactaaaggg aga 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 136
taatacgact cactataggt aga 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(A. caulinodans)
<400> 137
taatacgact cactattggg aga 23
<210> 138
<211> 1221
<212> DNA
<213> 产酸克雷伯氏菌(K. oxytoca)
<400> 138
gtgttccgtg ggaggcctgc catgctcgcc aagacacccg caaaccccgc gccgcttcag 60
cggacggcgt tcctgaacga caccacgctg cgcgacggcg agcaggcgcc gggtgtcgcc 120
ttcacccgca aggagaagat cgagatcgcc gccgcccttg ccgccgccgg tgtcccggag 180
atcgaggcgg gaacgcccgc catgggcgac gaagaggtgg aaaccatccg ctccatcgtc 240
tcgctgaacc tcccgacgcg cgtcatggcc tggtgccgca tgagcgagga cgacctgatg 300
gccgccgtcg cggcgggcgt gaagatcgtc aatgtctcca ttcccacctc cgaccggcaa 360
ctggccggca agctcggcaa ggatcgcgcc tgggcgctcg gccgtgtggc ggaggtggtg 420
acactggcgc gtcggctcgg ctttgaggtg gcggtagggg gcgaggattc ctcgcgggcc 480
gatcccgatt ttctctgccg tctcgcggag acggcgaagg cggcgggcgc ctttcgcctg 540
cggctggccg acacgcttgg cgtgcttgac cccttcggca cctatgcatt ggtgcgccgg 600
gtggccgcca ccaccgacat cgagcttgag ttccacgccc atgacgatct cggccttgcc 660
accgccaata cgctggcggc ggtgatgggc ggagcgcgtc acgccagcgt caccgtcgcc 720
gggctcggcg agcgcgcggg caatgccgcg ctggaggaag tggccatcgc cctgcgccag 780
acggcgcggg cggagaccgg catcgctccg gccgcgctga agccgctggc cgaactagtg 840
tgcggcgccg ccgcccgtcc ggtgccgcgc ggcaaggcca tcgtcggcgc ggatgtgttc 900
acccacgagt cgggcatcca tgtctccggc ctgctcaagg accgggccac ctatgaagct 960
ctgaatccgg aactgttcgg gcgtggccac acggtggtgc tcggaaagca ttccggtctt 1020
gcggcggtgg agaaggcgct ggccgacgag ggcatcaccg tggatgcggt gcgcgggcgc 1080
gccattctcg accgggtgcg ggcttttgct gtccgcacca aggagaatgt ttcccgcgag 1140
acgctgctgc gcttctatca ggacagcttc accgagtccg cgctgcgtct gcggcgggcc 1200
gccgtggaag gcgcaatctg a 1221
<210> 139
<211> 323
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(P. stutzeri)
<400> 139
tgttgcctca agcacagcct gtgccagctc gcggatgaca gaagagttag cgcgaattca 60
acgcgttatg aagagagtcg ccgcgcagcg cgccaagaga ttgcgtggaa taagacacag 120
ggggcgacaa gctgttgaac aggcgacaaa gcgccaccat ggccccggca ggcgcaattg 180
ttctgtttcc cacatttggt cgccttattg tgccgttttg ttttacgtcc tgcgcggcga 240
caaataacta acttcataaa aatcataaga atacataaac aggcacggct ggtatgttcc 300
ctgcacttct ctgctggcaa aca 323
<210> 140
<211> 233
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(A. vinelandii)
<400> 140
tgtcatgttc gcaacagttg ccgaaagtgt ggaaaaccgg cgcttggccc ggccgatctt 60
tttgtcgcca ttgcaacagt caggcctgtc ggttgttaac tatcgaaccg ccgaaggatg 120
ttgctagtaa ttaaattatt ctaattaaaa caagtgctta gattatttta gaaacgctgg 180
cacaaaggct gctattgccc tgttgcgcag gcttgttcgt gcctatagcc cac 233
<210> 141
<211> 256
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 141
tgtcagtttt gtcacagggg gccggaccag gatggtggac gctcgatggg gatgtcgggc 60
cattgttcgg ttgtagcaat tacaacagtc ggagtagggg gattgtaggg ggattgttgt 120
gtatcagacc gccctgcagc tcccgtcgat ggataattaa tcatttaaaa tcaatggttt 180
atttatgtgt tgcgggtgct ggcacagacg ctgcattacc tttggtgcgc ggagttgttc 240
gggcttacgg ccgaac 256
<210> 142
<211> 294
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(A. caulinodans)
<400> 142
ttgacaaagc ctccgagaag agcgccccct aacccctcct cagccctgat cggcagtatc 60
atcttgtcga atcctaacgt ctgataggca acgctatacg acaaacgctg gttacaattg 120
tcggttccgc gacaagaatt tgctttgtct ggcgggtggt ctattttgag ctaagtagct 180
gagaaatcag gaaaacaaaa ctctattcgg tctacccgac gagttggcac gggtcttgta 240
accatccttg cgcaggcggc gaaagccacc ggcgatattc atgttgcggg caac 294
<210> 143
<211> 215
<212> DNA
<213> 产酸克雷伯氏菌(K. oxytoca)
<400> 143
tgtcgcgttt gaaacacggg gcttttggaa ccgttcgatt ctgcaatgca ctgattttac 60
ttgattaatt cgaccacacg accactggca cacccgttgc aaaacccctt ggtgcaggcg 120
acgggttgcc ggtctggttc gcggatctcc tcgatccccg gctaccgacc cgcctccgaa 180
aagtccggtc ccgatccagt tcggcggggc cacac 215
<210> 144
<211> 1575
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌(P. stutzeri)
<400> 144
atgatccata aatccgattc ggacaccacc gtcagacgtt tcgatctctc ccagcagttt 60
accgccatgc agcggataag cgtggtcctg agtcgcgcca ccgaagcgag caaaaccctg 120
caggaggttc tgagcgtgct acataacgat gcctttatgc agcacgggat gatttgcctg 180
tacgacagcc agcaggagat cctgagcatc gaagcgctgc agcaaacgga agatcagacg 240
ctgcccggca gtacgcaaat tcgctaccgg ccgggggaag gattagtcgg taccgtgctg 300
gcgcagggcc agtcgctggt gctgccgcgc gtcgccgacg accagcgttt tctcgatcgt 360
ctgagcctgt acgactatga cctgccgttt atcgccgttc cgctgatggg cccccactcc 420
cggcccatcg gcgtactggc ggcgcagccg atggcgcgtc aggaagagcg gctgcccgcc 480
tgcacgcgct ttctcgaaac cgtcgccaat ctgatcgccc agacgattcg cctgatgatc 540
ctgccaacct ccgccgcgca ggcgccgcag cagagcccca gaatagagcg cccgcgcgcc 600
tgtacccctt cgcgcggttt cggcctggaa aatatggtcg gtaaaagccc ggcgatgcgg 660
cagattatgg atattattcg tcaggtttcc cgctgggata ccacggtgct ggtacgcggc 720
gagagcggca ccgggaaaga gctcatcgcc aacgccatcc accataattc tccgcgcgcc 780
gccgcggcgt tcgtcaaatt taactgcgcg gcgctgccgg acaacctgct ggagagcgag 840
ctgtttggtc atgagaaagg cgcgtttacc ggcgcggtgc gccagcggaa aggccgcttt 900
gagctggcgg acggcggcac cttattcctc gatgagatcg gcgaaagcag cgcctcgttt 960
caggctaagc tactgcgtat tctgcaagag ggggagatgg agcgcgtcgg cggcgacgaa 1020
accctgcggg tcaacgtgcg cattatcgcg gcgaccaacc gccatctgga agaggaggtg 1080
cggctgggtc atttccgcga ggatctatac taccgcctga acgtaatgcc tatcgcgctg 1140
ccgccgctgc gcgagcgcca ggaggatatc gccgagctgg cgcactttct ggtgcgaaaa 1200
atcgcccaca gccaggggcg aacgctgcgc atcagcgatg gggcgattcg cctgctgatg 1260
gagtacagct ggccgggaaa cgtgcgcgaa ctggaaaact gtctcgaacg ttcggcggtg 1320
ctgtcggaaa gcggcctgat agaccgggac gtgattctgt tcaaccatcg cgataacccg 1380
ccgaaagcgc tcgccagcag cggcccggcg gaggacggct ggctcgataa cagcctcgac 1440
gagcgccagc ggctgatcgc cgccctggaa aaagcgggct gggtgcaggc caaagcggcg 1500
cggctgctcg gcatgacccc gcgccaggtg gcgtatcgca ttcagattat ggatatcacc 1560
atgccgcgac tgtga 1575
<210> 145
<211> 1566
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(A. vinelandii)
<400> 145
atgaacgcca cattcgccga acgccccagc gcgccaaccc gcaacgaact gctggatgcc 60
caactgcagg cgctggcgca gatcgcccgc atccttaacc gcggccggcc catcgaggaa 120
ctgctggccg agatcctcgc cgtgctgcac gaagacctcg gcctgctgca cgggctggtc 180
tccatctgca acccgaagga cggcagcctg caggtgggcg ccgtgcacag cgactccgaa 240
accgtggtac gggcctgcga aagcacccgc taccgcatcg gcgaaggcgt gttcggcaac 300
atcctcaagc atggcaacag cgtggtgctc gggcgtatcg acgccgaacc gcgctttctc 360
gaccgactgg cgctgtacga catggacctg cccttcatcg ccgtgccgat caaggccgtc 420
gacggcacca ccatcggcgt gctggctgcc cagcccgacc gccgcgccga cgagctgatg 480
cccgaacgca cccgtttgat ggaaatcgtc gcccgcctac tggcgcagac cgtgcgcctg 540
gtggtgaacc tcgaggacgg ccaggaagtg gtcgacgagc gcgacgagct acgccgcgaa 600
gtccgcgcca agtacggctt cgagaacatg gtggtgggcc acaccgcctc catgcgccgg 660
gttttcgacc aggttcgacg ggtcgccaag tggaacagca ccgtgctgat cctcggcgaa 720
tccggcaccg gcaaggagct gatcgccagc gccatccact acaactcacc gcgcgctcac 780
cagccgctgg tacgcctgaa ctgcgccgcg ctaccggaaa ccctgctcga atcggaactg 840
ttcggtcacg agaaaggcgc cttcaccggc gccgtgaagc agcgcaaggg acgtttcgaa 900
caggccgacg gcggcaccct gttcctcgac gagatcggcg agatctcgcc gatgttccag 960
gccaagctgc tgcgcgtgct gcaggaaggc gagctggagc gcgtcggcgg cagccagacg 1020
gtgaaggtca acgtgcgcat cgtcgccgcc accaaccgcg acctggagca cgaggtggag 1080
caaggcaagt tccgcgaaga cctctactac cgcctcaacg tcatggccat ccgcgtcccg 1140
ccgctgcgcg agcgcagcgc cgacatcccg gaactggccg aattcctcct cgacaagatc 1200
gcccgccagc agggtcgcaa actcaagctg accgacagcg ccctgcgtct gctgatgagc 1260
caccgctggc cgggcaacgt gcgcgaactg gaaaactgcc tggaacgctc ggccatcatg 1320
agcgaggatg gcaccatcag ccgcgacgtg gtctccctca ccggcctcga ccacgacgcc 1380
acgccgctgg cgccggtccc cgaagtcgac ctcgccgacg acagcctcga cgaccgcgag 1440
cgcgtcatcg ccgcgctgga acaggccggc tgggtccagg ccaaggccgc ccgcctgctc 1500
ggcatgacgc cccggcagat cgcctaccga gtgcagacgc tgaacattca tatgcgcaag 1560
atctga 1566
<210> 146
<211> 1569
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 146
atgaatgcaa ccatccctca gcgctcggcc aaacagaacc cggtcgaact ctatgacctg 60
caattgcagg ccctggcgag catcgcccgc acgctcagcc gcgaacaaca gatcgacgaa 120
ctgctcgaac aggtcctggc cgtactgcac aatgacctcg gcctgctgca tggcctggtg 180
accatttccg acccggaaca cggcgccctg cagatcggcg ccatccacac cgactcggaa 240
gcggtggccc aggcctgcga aggcgtgcgc tacagaagcg gcgaaggcgt gatcggcaac 300
gtgctcaagc acggcaacag cgtggtgctc gggcgcatct ccgccgaccc gcgctttctc 360
gaccgcctgg cgctgtacga cctggaaatg ccgttcatcg ccgtgccgat caagaacccc 420
gagggcaaca ccatcggcgt gctggcggcc cagccggact gccgcgccga cgagcacatg 480
cccgcgcgca cgcgccttct ggagatcgtc gccaacctgc tggcgcagac cgtgcgcctg 540
gtggtgaaca tcgaggacgg ccgcgaggcg gccgacgagc gcgacgaact gcgtcgcgag 600
gtgcgcggca agtacggctt cgagaacatg gtggtgggcc acacccccac catgcgccgg 660
gtgttcgatc agatccgccg ggtcgccaag tggaacagca ccgtactggt cctcggcgag 720
tccggtaccg gcaaggaact gatcgccagc gccatccact acaactcgcc gcgcgcgcac 780
cgccccttcg tgcgcctgaa ctgcgccgcg ctgccggaaa ccctgctcga gtccgaactc 840
ttcggccacg agaagggcgc cttcaccggc gcggtgaagc agcgcaaggg gcgtttcgag 900
caggccgacg gcggcaccct gttcctcgac gagatcggcg agatctcgcc gatgttccag 960
gccaagctgc tgcgcgtgct gcaggaaggc gagttcgagc gggtcggcgg caaccagacg 1020
gtgcgggtca acgtgcgcat cgtcgccgcc accaaccgcg acctggaaag cgaggtggaa 1080
aagggcaagt tccgcgagga cctctactac cgcctgaacg tcatggccat ccgcattccg 1140
ccgctgcgcg agcgtaccgc cgacattccc gaactggcgg aattcctgct cggcaagatc 1200
ggccgccagc agggccgccc gctgaccgtc accgacagcg ccatccgcct gctgatgagc 1260
caccgctggc cgggcaacgt gcgcgaactg gagaactgcc tggagcgctc ggcgatcatg 1320
agcgaggacg gcaccatcac ccgcgacgtg gtctcgctga ccggggtcga caacgagagc 1380
ccgccgctcg ccgcgccgct gcccgaggtc aacctggccg acgagaccct ggacgaccgc 1440
gaacgggtga tcgccgccct cgaacaggcc ggctgggtgc aggccaaggc cgcgcggctg 1500
ctgggcatga cgccgcggca gatcgcctac cgcatccaga ccctcaacat ccacatgcgc 1560
aagatctga 1569
<210> 147
<211> 1695
<212> DNA
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(A. caulinodans)
<400> 147
atgctgcaca atgggctcaa tgagggtatg actgaacgat ccgctcaaac catccacaaa 60
ccggatttct ggggcagcgg tatctatcgg atatcgaaag ttttgattgg tccagacagt 120
ctcgagacga agcttgccaa tgtcattaac gccctctcag taattctccc aatgcggcgc 180
ggcgcaatcg tcgttctaaa tgttaaagga gagcccgaga tggttgcaat gctgggccta 240
gagcaagcat ctcaaggcgc ccgctccatt ccggcggagg ctgcgataga tagaatcgtc 300
gccaaaggcg cgccgctggt cgtaccggac atttgcaagt cggacctgtt ccaggcggag 360
ctccaaacca actcgaacgc cacaggccca gccacgttcg ttggcgtccc gatgaaggtc 420
gaaaaagaaa cgcttggaac actatggatc gaccgcgcca aagatggcag cactaggatc 480
caatttgagg aagaggtgcg cttcctctcc atggtcgcca acctttcggc ccgggccatt 540
tggctggatc gccaccagag ccgcgatggt cagccaatcg tgggcgagga aggaactcgc 600
aagactagtt caggcgacaa ggaactgccc gaatctgccc gacaaaggcc cacaaaaatc 660
gattggattg tcggggaaag ccctgccctc aagcaggtgg ttgaaagcgt caaagtcgtt 720
gcaacaacca attctgcggt gcttctcagg ggcgaaagcg gcacgggcaa ggagttcttt 780
gcaaaggcca tccacgagct ttcataccgg aaaaagaagc ccttcgtgaa gttgaactgc 840
gccgcgctgt ctgcaggcgt tttggaatcg gaattgtttg gacatgaaaa gggcgccttc 900
acgggggcca tctctcagcg cgcaggccgc ttcgaactcg cagacggcgg aacgctgctg 960
ctcgatgaga tcggcgacat ttcgccgggc ttccaagcga aactgttgcg cgtcttgcag 1020
gaaggtgagc ttgagcgagt cggcggcaca aaaacactca aagtggacgt tcgactcata 1080
tgcgccacga acaaagacct agaagcggca gtcgcggatg gggagttcag ggccgacctt 1140
tattaccgga tcaatgtggt gcccctattt ctgccgcctc tccgggagcg aaatggggat 1200
attccacgcc ttgcgagagt tttcctcggc cgattcaaca gggaaaacaa tcgcgatctc 1260
gcgttcgcgc cggctgcgct cgagctcttg tcaaaatgca actttcccgg caacgtccga 1320
gagcttgaaa actgcgtccg caggaccgcc actctcgcgc gttcggagac gatcgttcca 1380
tcagatttct cctgcctgaa gaaccagtgc ttttcttcaa tgctctggaa aaccggtgac 1440
cgtccacttg gggatacgct caatgggttg gccatgcgta agagtttgtc ggtcgaatcg 1500
ccgatcagcc tcggttactc caatggaccg gccggcttaa cggtggcacc acatctaacg 1560
gaccgcgagc tgctaatcag tgcgatggag aaggccggtt gggttcaggc aaaggcagct 1620
cggatcctcg gcctcacacc gcgacaggtc ggctatgctt tacgtaggca tcgtatacag 1680
gtgaagaaaa tctaa 1695
<210> 148
<211> 1848
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 148
atgccaatga ccgacgcctt ccaggtccgc gtacctcggg tttcgtcgag caccgccgga 60
gacatcgccg cgtcatccat caccacgcgg ggcgcgctgc cgcgcccggg agggatgcct 120
gtgtccatgt cgcgggggac ctcgcccgag gtggcactca tcggggtcta tgagatatcg 180
aagatcctga cggcgccccg gcgcctcgaa gtcacgctcg ccaatgtggt gaacgtgctc 240
tcctccatgc tgcagatgcg gcatggcatg atctgcatcc tcgacagcga gggcgatccc 300
gacatggtgg ccaccaccgg ctggacgcct gagatggcgg gccagatccg cgcgcatgtg 360
ccccagaagg ccatcgacca gatcgtcgcc acgcagatgc cgctggtggt gcaggacgtg 420
acggccgatc cgctcttcgc cggtcacgag gatctgttcg gcccgcctga ggaggccacc 480
gtctccttca tcggcgtgcc gatcaaggcc gaccaccatg tgatgggcac cctctccatc 540
gaccgcatct gggacggcac cgcccgtttc cgcttcgacg aggacgtgcg cttcctcacc 600
atggtggcca atctcgtcgg ccagaccgtg cgcctgcaca agctggtggc gagcgaccgc 660
gaccggctga tcgcccagac gcaccgcctc gaaaaggcgc tgcgggaaga aaaatccggg 720
gccgagccgg aggtggccga ggccgccaac ggatccgcca tgggcatcgt gggcgatagc 780
ccgctggtga aacgcctgat cgcgaccgcg caagtggtcg cccgctcaaa ctccaccgtg 840
ctgctgcgcg gggagagcgg caccggcaag gagttgttcg cccgtgccat ccacgaactg 900
tcgccccgca agggcaagcc cttcgtgaag gtgaactgcg ccgccctccc ggaatcggtg 960
ctggaatcgg aactgttcgg ccatgagaag ggcgccttca ccggtgcgct gaacatgcgc 1020
cagggccgct tcgagctggc gcacggcggc acgctcttcc ttgacgagat cggcgagatc 1080
acccccgctt tccaggccaa gctgctgcgc gtgctgcagg aaggcgagtt cgagcgggtc 1140
ggcggcaatc gcacgctgaa ggtggatgtg cggctcgtgt gcgccaccaa caagaatctg 1200
gaagaggcgg tctccaaggg cgagttccgg gccgatctct actaccgcat ccatgtggtg 1260
ccgctgatcc tgccgccgct gcgcgaacgg ccgggcgaca ttcccaagct cgcgaagaac 1320
ttcctcgacc gcttcaacaa ggaaaacaag ctccacatga tgctctcggc gccggccatc 1380
gacgtgctgc ggcgctgcta tttcccgggc aacgtgcgcg agctggagaa ctgtatccgg 1440
cggacggcaa cgctcgccca cgatgccgtc atcacccccc atgacttcgc ctgcgacagc 1500
ggccagtgcc tctcggccat gctctggaag ggctcggccc cgaagcctgt gatgccgcac 1560
gtgccgccgg cgcccacgcc gctgactccg ctctcccctg ctccgctcgc gaccgcagcg 1620
cccgctgcgg cgagcccggc gccggcggcc gacagcctgc cggtcacttg ccccggcacc 1680
gaggcctgtc ccgcggtgcc cccccgccag agcgaaaagg agcagttgct ccaggccatg 1740
gagcgctccg gctgggtgca ggcgaaggcc gcgcgcctcc tcaacctcac gccgcgccag 1800
gtgggttatg cgctgcgcaa atatgacatc gacatcaagc gcttctga 1848
<210> 149
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 149
taggtgttga cggctagctc agtcctaggt acagtgctag ctctaga 47
<210> 150
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 150
taggtgttta cagctagctc agtcctaggt attatgctag ctctaga 47
<210> 151
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 151
taggtgttga cagctagctc agtcctaggt actgtgctag ctctaga 47
<210> 152
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 152
taggtgctga tagctagctc agtcctaggg attatgctag ctctaga 47
<210> 153
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 153
taggtgttga cagctagctc agtcctaggt attgtgctag ctctaga 47
<210> 154
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 154
taggtgttta cggctagctc agtcctaggt actatgctag ctctaga 47
<210> 155
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 155
taggtgttta cggctagctc agtcctaggt atagtgctag ctctaga 47
<210> 156
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 156
taggtgttta cggctagctc agccctaggt attatgctag ctctaga 47
<210> 157
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 157
taggtgctga cagctagctc agtcctaggt ataatgctag ctctaga 47
<210> 158
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 158
taggtgttta cagctagctc agtcctaggg actgtgctag ctctaga 47
<210> 159
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 159
taggtgttta cggctagctc agtcctaggt acaatgctag ctctaga 47
<210> 160
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 160
taggtgttga cggctagctc agtcctaggt atagtgctag ctctaga 47
<210> 161
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 161
taggtgctga tagctagctc agtcctaggg attatgctag ctctaga 47
<210> 162
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 162
taggtgctga tggctagctc agtcctaggg attatgctag ctctaga 47
<210> 163
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 163
taggtgttta tggctagctc agtcctaggt acaatgctag ctctaga 47
<210> 164
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 164
taggtgttta tagctagctc agcccttggt acaatgctag ctctaga 47
<210> 165
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 165
taggtgttga cagctagctc agtcctaggg actatgctag ctctaga 47
<210> 166
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 166
taggtgttga cagctagctc agtcctaggg attgtgctag ctctaga 47
<210> 167
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 167
taggtgttga cggctagctc agtcctaggt attgtgctag ctctaga 47
<210> 168
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 168
taggtgttga cagctagctc agtcctaggt ataatgctag ctctaga 47
<210> 169
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 169
taggtgttga cattattcca tcgaactagt taactagtac gaaagtt 47
<210> 170
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 170
tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgt 48
<210> 171
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 171
tactcgaacc cctagcccgc tcttatcggg cggctagggg ttttttgt 48
<210> 172
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 172
tacatatcgg gggggtaggg gttttttgt 29
<210> 173
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 173
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc 80
<210> 174
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 174
ctcggtacca aattccagaa aagaggcctc ccgaaagggg ggcctttttt cgttttggtc 60
c 61
<210> 175
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 175
ctcggtacca aattccagaa aagacacccg aaagggtgtt ttttcgtttt ggtcctcctt 60
ggccctccat ccttagatag cagataaaaa aaatccttag ctttcgctaa ggatgatttc 120
ttcataggca atacgatcgc atgtcc 146
<210> 176
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 176
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120
gcgtttata 129
<210> 177
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 177
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120
gcgtttata 129
<210> 178
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 178
ggtcttgtcc actaccttgc agtaatgcgg tggacaggat cggcggtttt cttttctctt 60
ctcaatgact gaatagaaaa gacgaacatt aacgcatgag aaagcccccg gaagatcacc 120
ttccgggggc ttttttattg cgctacaaat gaaagtacat agaaatta 168
<210> 179
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 179
cagataaaaa aaatccttag ctttcgctaa ggatgatttc ttccttggcc ctccatcctt 60
agatagctcg gtaccaaatt ccagaaaaga cacccgaaag ggtgtttttt cgttttggtc 120
ctcataggca atacgatcgc atgtcc 146
<210> 180
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 180
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg 120
gttttttg 128
<210> 181
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 181
ctcggtacca aattccagaa aagagacgct ttcgagcgtc ttttttcgtt ttggtcctcc 60
ttggccctcc atccttagat agagttaacc aaaaaggggg gattttatct cccctttaat 120
ttttccttca taggcaatac gatcgcatgt cc 152
<210> 182
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 182
cgcagatagc aaaaaagcgc ctttagggcg cttttttaca ttggtggtcc ttggccctcc 60
atccttagat agaggcgact gacgaaacct cgctccggcg gggttttttg ttatctgcat 120
cataggcaat acgatcgcat gtcc 144
<210> 183
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 183
tcggtcagtt tcacctgatt tacgtaaaaa cccgcttcgg cgggtttttg cttttggagg 60
ggcagaaaga tgaatgactg tc 82
<210> 184
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 184
gcccccggaa gatcaccttc cgggggcttt tttattggcg gccggctgat tgatcaggcg 60
gccggctgat tggcgcgtta cctggtagcg cgccattttg ttt 103
<210> 185
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 185
gtaatcgtta atccgcaaat aacgtaaaaa cccgcttcgg cgggtttttt tatgggggga 60
gtttagggaa agagcatttg tca 83
<210> 186
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 186
aaaaaaaaac cccgcccctg acagggcggg gttttttttt t 41
<210> 187
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 187
tccggcaatt aaaaaagcgg ctaaccacgc cgcttttttt acgtctgcat gactgaatag 60
aaaagacgaa cattaacgca tgagaaagcc cccggaagat caccttccgg gggctttttt 120
attgcgctcc ttggccctcc atccttagat ag 152
<210> 188
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 188
ggaagaccat actggaaaca cagaaaaaag cccgcacctg acagtgcggg cttttttttt 60
cgaccaaagg tgactgaata gaaaagacga acattcgcag atagcaaaaa agcgccttta 120
gggcgctttt ttacattggt ggtcataggc aatacgatcg catgtcc 167
<210> 189
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 189
tccggcaatt aaaaaagcgg ctaaccacgc cgcttttttt acgtctgcat ccttggccct 60
ccatccttag atagctcggt accaaattcc agaaaagagg cctcccgaaa ggggggcctt 120
ttttcgtttt ggtcctcata ggcaatacga tcgcatgtcc 160
<210> 190
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 190
ttcagccaaa aaacttaaga ccgccggtct tgtccactac cttgcagtaa tgcggtggac 60
aggatcggcg gttttctttt ctcttctcaa tacatgaaag tacatagaaa ttactcggta 120
ccaaattcca gaaaagaggc ctcccgaaag gggggccttt tttcgttttg gtcctcatag 180
gcaatacgat cgcatgtcc 199
<210> 191
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 191
ttcagccaaa aaacttaaga ccgccggtct tgtccactac cttgcagtaa tgcggtggac 60
aggatcggcg gttttctttt ctcttctcaa tccttggccc tccatcctta gatagtccgg 120
caattaaaaa agcggctaac cacgccgctt tttttacgtc tgcatcatag gcaatacgat 180
cgcatgtcc 189
<210> 192
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 192
ctcggtacca aattccagaa aagaggcctc ccgaaagggg ggcctttttt cgttttggtc 60
ctgactgaat agaaaagacg aacattaacg catgagaaag cccccggaag atcaccttcc 120
gggggctttt ttattgcgct ccttggccct ccatccttag atag 164
<210> 193
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 193
ctcggtacca aattccagaa aagaggcctc ccgaaagggg ggcctttttt cgttttggtc 60
ctccttggcc ctccatcctt agatgtccgg caattaaaaa agcggctaac cacgccgctt 120
tttttacgtc tgcatcatag gcaatacgat cgcatgtcc 159
<210> 194
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 194
ctcggtacca aagacgaaca ataagacgct gaaaagcgtc ttttttcgtt ttggtcctac 60
aaatgaaagt acatagaaat tattcagcca aaaaacttaa gaccgccggt cttgtccact 120
accttgcagt aatgcggtgg acaggatcgg cggttttctt ttctcttctc aatccttggc 180
cctccatcct tagatag 197
<210> 195
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 195
gggaactgcc agacatcaaa taaaacaaaa ggctcagtcg gaagactggg ccttttgttt 60
tatctgttgt ttgtcggtga acactctccc gactagtagc ggccgctgca gaaagaggag 120
a 121
<210> 196
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 196
aacgcatgag aaagcccccg gaagatcacc ttccgggggc ttttttattg cgctcatagg 60
caatacgatc gcatgtcctc cggcaattaa aaaagcggct aaccacgccg ctttttttac 120
gtctgcatcc ttggccctcc atccttagat ag 152
<210> 197
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 197
gggaactgcc agacatcaaa taaaacaaaa ggctcagtcg gaagactggg ccttttgttt 60
tatctgttgt ttgtcggtga acactctccc g 91
<210> 198
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 198
aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt tttttggaga 60
ttttcaacat gaaaaaatta ttatttgatg atcagatagc ggcggggaac tgccagacat 120
caaataaaac aaaaggctca gtcggaagac tgggcctttt gttttatctg ttgtttgtcg 180
gtgaacactc tcccg 195
<210> 199
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 199
aacgcatgag aaagcccccg gaagatcacc ttccgggggc ttttttattg cgctccttgg 60
ccctccatcc ttagatagct cggtaccaaa ttccagaaaa gaggcctccc gaaagggggg 120
ccttttttcg ttttggtcct cataggcaat acgatcgcat gtcc 164
<210> 200
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 200
aacgcatgag aaagcccccg gaagatcacc ttccgggggc ttttttattg cgctccttgg 60
ccctccatcc ttagatagtt cagccaaaaa acttaagacc gccggtcttg tccactacct 120
tgcagtaatg cggtggacag gatcggcggt tttcttttct cttctcaatc ataggcaata 180
cgatcgcatg tcc 193
<210> 201
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 201
cctaggacct gtaggatcgt acaggtttac gcaagaaaat ggtttgttac tttcgaataa 60
atctaga 67
<210> 202
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 202
cggtggaatc cctatcagtg atagagattg acatccctat cagtgataga tataatgagc 60
actctaga 68
<210> 203
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 203
aacaaacaga caatctggtc tgtttgtatt atggaaaatt tttctgtata atagattcaa 60
caaacagaca atctggtctg tttgtattat 90
<210> 204
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 204
aaaaagagtt tgacatgata cgaaacgtac cgtatcgtta aggttactag agtctaga 58
<210> 205
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 205
ggggcctcgc ttgggttatt gctggtgccc ggccgggcgc aatattcatg ttgatgattt 60
attatatatc gagtggtgta tttatttata ttgtttgctc cgttaccgtt attaac 116
<210> 206
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 206
atgaaaaaca taaatgccga cgacacatac agaataatta ataaaattaa agcttgtaga 60
agcaataatg atattaatca atgcttatct gatatgacta aaatggtaca ttgtgaatat 120
tatttactcg cgatcattta tcctcattct atggttaaat ctgatatttc aatcctagat 180
aattacccta aaaaatggag gcaatattat gatgacgcta atttaataaa atatgatcct 240
atagtagatt attctaactc caatcattca ccaattaatt ggaatatatt tgaaaacaat 300
gctgtaaata aaaaatctcc aaatgtaatt aaagaagcga aaacatcagg tcttatcact 360
gggtttagtt tccctattca tacggctaac aatggcttcg gaatgcttag ttttgcacat 420
tcagaaaaag acaactatat agatagttta tttttacatg cgtgtatgaa cataccatta 480
attgttcctt ctctagttga taattatcga aaaataaata tagcaaataa taaatcaaac 540
aacgatttaa ccaaaagaga aaaagaatgt ttagcgtggg catgcgaagg aaaaagctct 600
tgggatattt caaaaatatt aggttgcagt gagcgtactg tcactttcca tttaaccaat 660
gcgcaaatga aactcaatac aacaaaccgc tgccaaagta tttctaaagc aattttaaca 720
ggagcaattg attgcccata ctttaaaaat taa 753
<210> 207
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 207
atgtccagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc ctaa 624
<210> 208
<211> 612
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 208
atgagcccga aacgtcgtac ccaggcagaa cgtgcaatgg aaacccaggg taaactgatt 60
gcagcagcac tgggtgttct gcgtgaaaaa ggttatgcag gttttcgtat tgcagatgtt 120
ccgggtgcag ccggtgttag ccgtggtgca cagagccatc attttccgac caaactggaa 180
ctgctgctgg caacctttga atggctgtat gagcagatta ccgaacgtag ccgtgcacgt 240
ctggcaaaac tgaaaccgga agatgatgtt attcagcaga tgctggatga tgcagcagaa 300
ttttttctgg atgatgattt tagcatcagc ctggatctga ttgttgcagc agatcgtgat 360
ccggcactgc gtgaaggtat tcagcgtacc gttgaacgta atcgttttgt tgttgaagat 420
atgtggctgg gtgtgctggt gagccgtggt ctgagccgtg atgatgccga agatattctg 480
tggctgattt ttaacagcgt tcgtggtctg gcagttcgta gcctgtggca gaaagataaa 540
gaacgttttg aacgtgtgcg taatagcacc ctggaaattg cacgtgaacg ttatgcaaaa 600
ttcaaacgtt ga 612
<210> 209
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 209
atggcacgta ccccgagccg tagcagcatt ggtagcctgc gtagtccgca tacccataaa 60
gcaattctga ccagcaccat tgaaatcctg aaagaatgtg gttatagcgg tctgagcatt 120
gaaagcgttg cacgtcgtgc cggtgcaagc aaaccgacca tttatcgttg gtggaccaat 180
aaagcagcac tgattgccga agtgtatgaa aatgaaagcg aacaggtgcg taaatttccg 240
gatctgggta gctttaaagc cgatctggat tttctgctgc gtaatctgtg gaaagtttgg 300
cgtgaaacca tttgtggtga agcatttcgt tgtgttattg cagaagcaca gctggaccct 360
gcaaccctga cccagctgaa agatcagttt atggaacgtc gtcgtgagat gccgaaaaaa 420
ctggttgaaa atgccattag caatggtgaa ctgccgaaag ataccaatcg tgaactgctg 480
ctggatatga tttttggttt ttgttggtat cgcctgctga ccgaacagct gaccgttgaa 540
caggatattg aagaatttac cttcctgctg attaatggtg tttgtccggg tacacagcgt 600
taa 603
<210> 210
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 210
atggaactgc gtgacctgga tttaaacctg ctggtggtgt tcaaccagtt gctggtcgac 60
agacgcgtct ctgtcactgc ggagaacctg ggcctgaccc agcctgccgt gagcaatgcg 120
ctgaaacgcc tgcgcacctc gctacaggac ccactcttcg tgcgcacaca tcagggaatg 180
gaacccacac cctatgccgc gcatctggcc gagcacgtca cttcggccat gcacgcactg 240
cgcaacgccc tacagcacca tgaaagcttc gatccgctga ccagcgagcg taccttcacc 300
ctggccatga ccgacattgg cgagatctac ttcatgccgc ggctgatgga tgcgctggct 360
caccaggccc ccaattgcgt gatcagtacg gtgcgcgaca gttcgatgag cctgatgcag 420
gccttgcaga acggaaccgt ggacttggcc gtgggcctgc ttcccaatct gcaaactggc 480
ttctttcagc gccggctgct ccagaatcac tacgtgtgcc tatgtcgcaa ggaccatcca 540
gtcacccgcg aacccctgac tctggagcgc ttctgttcct acggccacgt gcgtgtcatc 600
gccgctggca ccggccacgg cgaggtggac acgtacatga cacgggtcgg catccggcgc 660
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ctgctcgcca ctgtgccgat atgtttagcc gactgctgcg tagagccctt cggcctaagc 780
gccttgccgc acccagtcgt cttgcctgaa atagccatca acatgttctg gcatgcgaag 840
taccacaagg acctagccaa tatttggttg cggcaactga tgtttgacct gtttacggat 900
tgataa 906
<210> 211
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 211
tcaatgtatt gatgccgtcc atatcatgaa tcaaaacaat ccatttgatc aatatcaagc 60
tcactcttaa gcttcactca tccgctgcat 90
<210> 212
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 212
atgcgtttca acaagctcga cctcaatctt ctggtcgccc tggatgcact gctcacggag 60
atgagcatca gccgcgccgc cgaaaagatc catctgagcc agtcggccat gagcaatgcc 120
ctggcgcggc tgcgcgagta tttcgatgat gaattgctga tccaggtggg ccggcgcatg 180
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gatggctcca tcgcggcgct gccggccttc gtgccggccg agtccacgcg cgagtttcgc 300
atctcggttt cggactttac gctctccgtc ctcatccccc gggtgctggc gcgcgcgcac 360
gccgagggca agcacatccg ctttgccctg atgccgcagg tgcaagaccc gacccgctcg 420
ctggatcggg ccgaggtgga cctgctggtc ttgccgcagg aattctgcac gcccgatcat 480
cctgccgaag aggtcttccg cgaacggcat gtctgcgtgg tctggcgcga cagtgcgctg 540
gcgcaaggcg agctgacgct ggaacgctac atggcctcag gccatgtggt gatggtgccg 600
cctggggcca atgcgtcgtc ggtggaggcg tggatggcca ggaagctggg ctttgcgcgc 660
cgggtggaag tgaccagctt cagcttcgct tctgcgctgg cgctggtaca ggggacggac 720
cgcatcgcca cggtgcatgc ccggctggcg cagctgctgg ctccgcaatg gccggtggtg 780
atcaaggaga gtccgctgtc gctgggcgag atgcggcaga tgatgcagtg gcatcgctac 840
cgcagcaatg atcctggcat ccagtggctg cgtcgggtgt ttctggagag tgcgcaggag 900
atggatgcgg cgctgccagg catctgctga 930
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 213
cagacattgc cgtcactgcg tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc 60
gcttattaaa agcattctgt aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa 120
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actctctata ttttctccat acccgttttt ttgggctagc gaattc 286
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<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 214
atgcaatatg gacaattggt ttcttctctg aatggcggga gtatgaaaag tatggctgaa 60
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acgccgattg aggccaacgg ttatctcgat ttttttatcg accgaccgct gggaatgaaa 180
ggttatattc tcaatctcac cattcgcggt cagggggtgg tgaaaaatca gggacgagaa 240
tttgtttgcc gaccgggtga tattttgctg ttcccgccag gagagattca tcactacggt 300
cgtcatccgg aggctcgcga atggtatcac cagtgggttt actttcgtcc gcgcgcctac 360
tggcatgaat ggcttaactg gccgtcaata tttgccaata cggggttctt tcgcccggat 420
gaagcgcacc agccgcattt cagcgacctg tttgggcaaa tcattaacgc cgggcaaggg 480
gaagggcgct attcggagct gctggcgata aatctgcttg agcaattgtt actgcggcgc 540
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 215
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tggatcctgt gctctgaaat tcagccgctg aaatgccgcg atttcggtat tacctgttcg 1200
accaccacga actgggtgtc gaatatgatt atcggcgcga ccttcctgac actgcttgat 1260
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attactttct ggctcattcc ggaaaccaaa aatgtcacgc tggaacatat cgaacgcaaa 1380
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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ctcgagtgtt gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcgctcacaa 60
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 217
aacaaataca catgggcgca tgcctattac tgcccttgcg atatggaagg caagctttta 60
gtaacaatag aaaactgggt cctactctcg aagaatgcac tgcggcggtc acgtcaacac 120
gtgctgcacc gttgagaatg aatgctgggc agattgccag cggcgtcatt ttcggctgtc 180
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 218
atgacgtcag cagcgaatct ggtgaggatc acgcagcccg cgatcagccg gctgatcagg 60
gatctcgaag aggaaattgg gatcagcctc ttcgaaagaa cgggcaaccg gttacgtcct 120
acgcgggagg ccggtattct gttcaaggaa gtgtcgcgac atttcaacgg gattcagcac 180
atcgacaaag tcgcggctga actgaagaag tctcatatgg ggtccctaag ggtcgcctgt 240
tatacagcgc cagctctgag ttttatgtcc ggcgtcattc agacgttcat cgccgatcgg 300
cccgacgtgt cggtctacct cgacacagtt ccttcccaga cggtcctcga attggtctcg 360
ctccagcact acgatctcgg aatatcgata ttggctggcg actatcctgg tctcaccacc 420
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 219
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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ctggctgccg acatcggcag gcaggcagcg gggacgctcc gcattgctgc aatgcctgct 300
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gccgacatcg gttatgccga tggcccacag gagcgccaag gttttctaat cgaaacccgg 480
tcgcttcccg ctgttgtcgc tgtcccgatg ggacatcgac ttgctggcct tgaccgtgtc 540
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tcgcatactg cgctaagtct cgtccgcgaa ggcgccggga tcgcaattat cgatccagcc 720
gcggcgatcg agttcacgga caggatcgta ctgcgaccgt tctcgatctt cattgacgcc 780
ggattcctcg aagtccggtc agcaattggc gctccctcaa ccatcgtcga tcgtttcaca 840
accgaattct ggaggtttca tgatgacttg atgaagcaga acggcctaat ggagtaa 897
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 221
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agc 63
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 222
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gctcctcgcg ctttcagtct ttgttttggc gcatgtcgtt atcgcaaaac cgctgcacac 120
ttttgcgcga catgctctga tccccctcat ctgggggggc ctatctgagg gaatttccga 180
tccggctcgc ctgaaccatt ctgctttcca cgaacttgaa aacgct 226
<210> 223
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 223
ttttgttcga ttatcgaaca aattattgaa atatcgaaca aaacctctaa actactgtgg 60
cactgaatca aaaaattata aaccctgatc aga 93
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
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<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
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atttcacaca tctagagcta atcatcgcgt actcaggagg caagtaatg 49
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<211> 54
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<223> 根瘤菌属种IRBG74
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taacaatttc acacatctag agctaatcat ctcgtactaa gcacgcaagt aatg 54
<210> 252
<211> 54
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 252
taacaatttc acacatctag agctaatcat cgcgtactaa ctacgcaagt aatg 54
<210> 253
<211> 54
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 253
taacaatttc acacatctag agctaatctt cgcgtactaa gaacgcaagt aatg 54
<210> 254
<211> 54
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 254
taacaatttc acacatctag agctaatctt cgcgtactaa aaacgcaagt aatg 54
<210> 255
<211> 54
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 255
taacaatttc acacatctag agctaatctt cgcgtactaa caacgcaagt aatg 54
<210> 256
<211> 54
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 256
taacaatttc acacatctag agctaatctt ctcgtactca tgacgcaagt aatg 54
<210> 257
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 257
atttcacaca tctagaatta aagagaagaa attaaccatg 40
<210> 258
<211> 29
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 根瘤菌属种IRBG74
<400> 258
ctagtgcgaa ctagctcata ccgcagatg 29
<210> 259
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 259
ctagcgcagg tccaacgttt ttctaagcaa ggaggtcata tg 42
<210> 260
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 260
ctagcgaagg tccaacgttt ttctaagcaa ggaggtcata tg 42
<210> 261
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 261
ctagcgaagg tccaacgttt ttctaagcca ggaggtcata tg 42
<210> 262
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 262
ctagcgcagg tccaacgttt ttctaagcca ggaggtcata tg 42
<210> 263
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 263
ctagcgaagc tccaacgttt ttctaagcaa ggaggtcata tg 42
<210> 264
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 264
gaattctaca ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 265
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 265
gaattctaaa ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 266
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 266
gaattctaag ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 267
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 267
gaattcttaa ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 268
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 268
gaattctaca ctaacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 269
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 269
gaattctacg ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 270
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 270
gaattctcaa ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 271
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 271
gaattctaag ctaacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 272
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 272
gaattctcag ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 273
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 273
gaattctcaa ctaacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 274
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 274
gaattctacg ctaacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 275
<211> 35
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 275
gaattctcaa ctaacggaca ggagatatac atatg 35
<210> 276
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 276
gaattctcag ctaacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 277
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 277
gaattctaaa ctaacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 278
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 278
gaattctcag ctcacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 279
<211> 34
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 279
gaattctcaa ctaacggaca ggagggtcgg gatg 34
<210> 280
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 280
gaattctaca ctcacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 281
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 281
gaattctaag ctcacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 282
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 282
gaattctcaa ctcacggaca ggagggtcgg atg 33
<210> 283
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 283
gaattctaca ctaacggaca gcagggtcgg atg 33
<210> 284
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 284
ctagcgcagg tccaaccttt ttctaagcaa gtaggtcata tg 42
<210> 285
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 285
gaattctcag ctaacggaca gcagggtcgg atg 33
<210> 286
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 286
ctagcgcagg tccaaccttt ttctaagcaa ctaggtcata tg 42
<210> 287
<211> 42
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 287
ctagcgaagg tccaaccttt ttctaagcca gtaggtcata tg 42
<210> 288
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 288
gaattctacg ctcacggaca gcagggtcgg atg 33
<210> 289
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 289
gaattctccg ctcacggaca ggagggtccg atg 33
<210> 290
<211> 33
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 290
cttctcggcc agctgacagg ggaagctcgc atg 33
<210> 291
<211> 34
<212> DNA
<213> 防御假单胞菌(P. protegens)
<400> 291
cttctcggcc agctgacagg aggaagctcg catg 34
<210> 292
<211> 582
<212> PRT
<213> 类球红细菌(R. sphaeroides)
<400> 292
Met Asp Thr Ser Ala Ala Arg Ser Gly Ala Val Ala Glu Arg Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Leu Thr Leu Asp Ala Leu Cys Glu Ile Ala Lys Leu Leu Thr
20 25 30
Gly Ala Ser Asp Pro Ile Ala Cys Met Pro Ala Val Phe Gly Val Leu
35 40 45
Gly Ala Phe Met Gly Leu Arg His Gly Ala Leu Ala Ile Leu Gln Glu
50 55 60
Gly Ala Gln Ala Glu Thr Gln Arg Asn Ala Arg His Val Asn Pro Tyr
65 70 75 80
Val Ile Ala Ala Thr Ala Ser Gly Val Pro Pro Ala Gly Ala Glu Ala
85 90 95
Arg Ala Ile Pro Ala Gln Val Ala Arg His Val Phe Arg Asn Gly Val
100 105 110
Ser Leu Val Ser Cys Asp Ile Leu Glu Glu Phe Gly Ala Glu Ala Leu
115 120 125
Pro Pro Gly Leu Gly Asp Ser Arg Gln Ala Leu Val Ala Val Pro Ile
130 135 140
Arg Asp Gln Ala Asn Ser Pro Phe Val Leu Gly Val Leu Cys Ala Tyr
145 150 155 160
Arg Ser Leu Lys Asp Asn Gly Ala Arg Tyr Leu Asp Thr Asp Leu Arg
165 170 175
Val Leu Asn Met Val Ala Ala Val Leu Glu Gln Ser Ile Arg Phe Arg
180 185 190
Arg Leu Val Ala Arg Asp Arg Asp Arg Ile Val Gln Glu Ala Arg Glu
195 200 205
Ala Ile Arg Val Ala Ala Glu Ala Thr Ala Gly Pro Pro Val Glu Ala
210 215 220
Pro Ala Glu Leu Ala Leu Glu Gly Val Ile Gly Ser Ser Pro Ala Ile
225 230 235 240
Gln Arg Val Ile Gly Gln Ile Arg Lys Val Ala Gly Thr His Thr Pro
245 250 255
Val Leu Leu Arg Gly Glu Ser Gly Thr Gly Lys Glu Val Phe Ala Arg
260 265 270
Ala Leu His Ala Leu Ser Glu Arg Arg Asp Lys Ala Phe Ile Lys Val
275 280 285
Asn Cys Ala Ala Leu Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser Glu Leu Phe Gly
290 295 300
His Glu Lys Gly Ser Phe Thr Gly Ala Val Gln Gln Lys Lys Gly Arg
305 310 315 320
Pro Glu Met Ala Glu Gly Gly Thr Leu Phe Leu Asp Glu Ile Gly Glu
325 330 335
Ile Ser Leu Glu Phe Gln Ala Lys Leu Leu Arg Ile Leu Gln Glu Gly
340 345 350
Glu Phe Glu Arg Val Gly Gly Thr Arg Thr Leu Arg Val Asp Val Arg
355 360 365
Leu Val Thr Ala Thr Asn Lys Asp Leu Glu Arg Ala Val Ala Asn Gly
370 375 380
Thr Phe Arg Ala Asp Leu Tyr Phe Arg Ile Cys Val Val Pro Ile Val
385 390 395 400
Leu Pro Pro Leu Arg Asp Arg Lys Glu Asp Ile Gly Leu Leu Ala Gln
405 410 415
Gly Leu Leu Glu Arg Phe Asn Lys Arg Asn Gly Met Lys Lys Lys Leu
420 425 430
His Pro Ser Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln Cys Asn Phe Pro Gly Asn
435 440 445
Val Arg Glu Leu Glu Asn Cys Ile Ala Arg Val Ala Ala Leu Ser Pro
450 455 460
Glu Thr Val Ile His Ala Asp Asp Leu Ala Cys His His Asp His Cys
465 470 475 480
Leu Ser Ala Asp Leu Trp Arg Leu Gln Thr Gly Ser Ala Ser Pro Val
485 490 495
Gly Gly Leu Ala Gln Gly Pro Leu Glu Leu Pro Val Leu Gly Ser Arg
500 505 510
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Thr Val
515 520 525
Pro Ser Ala Pro Leu Asp Gly Glu Ala Ala Glu Arg Glu Ala Leu Ile
530 535 540
Glu Ala Met Glu Arg Ala Gly Trp Val Gln Ala Lys Ala Ala Arg Leu
545 550 555 560
Arg Gly Met Thr Pro Arg Gln Ile Gly Tyr Ala Leu Lys Lys Tyr Asn
565 570 575
Ile Arg Val Glu Lys Phe
580
<210> 293
<211> 615
<212> PRT
<213> 茎瘤固氮根瘤菌(A. caulinodans)
<400> 293
Met Pro Met Thr Asp Ala Phe Gln Val Arg Val Pro Arg Val Ser Ser
1 5 10 15
Ser Thr Ala Gly Asp Ile Ala Ala Ser Ser Ile Thr Thr Arg Gly Ala
20 25 30
Leu Pro Arg Pro Gly Gly Met Pro Val Ser Met Ser Arg Gly Thr Ser
35 40 45
Pro Glu Val Ala Leu Ile Gly Val Tyr Glu Ile Ser Lys Ile Leu Thr
50 55 60
Ala Pro Arg Arg Leu Glu Val Thr Leu Ala Asn Val Val Asn Val Leu
65 70 75 80
Ser Ser Met Leu Gln Met Arg His Gly Met Ile Cys Ile Leu Asp Ser
85 90 95
Glu Gly Asp Pro Asp Met Val Ala Thr Thr Gly Trp Thr Pro Glu Met
100 105 110
Ala Gly Gln Ile Arg Ala His Val Pro Gln Lys Ala Ile Asp Gln Ile
115 120 125
Val Ala Thr Gln Met Pro Leu Val Val Gln Asp Val Thr Ala Asp Pro
130 135 140
Leu Phe Ala Gly His Glu Asp Leu Phe Gly Pro Pro Glu Glu Ala Thr
145 150 155 160
Val Ser Phe Ile Gly Val Pro Ile Lys Ala Asp His His Val Met Gly
165 170 175
Thr Leu Ser Ile Asp Arg Ile Trp Asp Gly Thr Ala Arg Phe Arg Phe
180 185 190
Asp Glu Asp Val Arg Phe Leu Thr Met Val Ala Asn Leu Val Gly Gln
195 200 205
Thr Val Arg Leu His Lys Leu Val Ala Ser Asp Arg Asp Arg Leu Ile
210 215 220
Ala Gln Thr His Arg Leu Glu Lys Ala Leu Arg Glu Glu Lys Ser Gly
225 230 235 240
Ala Glu Pro Glu Val Ala Glu Ala Ala Asn Gly Ser Ala Met Gly Ile
245 250 255
Val Gly Asp Ser Pro Leu Val Lys Arg Leu Ile Ala Thr Ala Gln Val
260 265 270
Val Ala Arg Ser Asn Ser Thr Val Leu Leu Arg Gly Glu Ser Gly Thr
275 280 285
Gly Lys Glu Leu Phe Ala Arg Ala Ile His Glu Leu Ser Pro Arg Lys
290 295 300
Gly Lys Pro Phe Val Lys Val Asn Cys Ala Ala Leu Pro Glu Ser Val
305 310 315 320
Leu Glu Ser Glu Leu Phe Gly His Glu Lys Gly Ala Phe Thr Gly Ala
325 330 335
Leu Asn Met Arg Gln Gly Arg Phe Glu Leu Ala His Gly Gly Thr Leu
340 345 350
Phe Leu Asp Glu Ile Asp Glu Ile Thr Pro Ala Phe Gln Ala Lys Leu
355 360 365
Leu Arg Val Leu Gln Glu Gly Glu Phe Glu Arg Val Gly Gly Asn Arg
370 375 380
Thr Leu Lys Val Asp Val Arg Leu Val Cys Ala Thr Asn Lys Asn Leu
385 390 395 400
Glu Glu Ala Val Ser Lys Gly Glu Phe Arg Ala Asp Leu Tyr Tyr Arg
405 410 415
Ile His Val Val Pro Leu Ile Leu Pro Pro Leu Arg Glu Arg Pro Gly
420 425 430
Asp Ile Pro Lys Leu Ala Lys Asn Phe Leu Asp Arg Phe Asn Lys Glu
435 440 445
Asn Lys Leu His Met Met Leu Ser Ala Pro Ala Ile Asp Val Leu Arg
450 455 460
Arg Cys Tyr Phe Pro Gly Asn Val Arg Glu Leu Glu Asn Cys Ile Arg
465 470 475 480
Arg Thr Ala Thr Leu Ala His Asp Ala Val Ile Thr Pro His Asp Phe
485 490 495
Ala Cys Asp Ser Gly Gln Cys Leu Ser Ala Met Leu Trp Lys Gly Ser
500 505 510
Ala Pro Lys Pro Val Met Pro His Val Pro Pro Ala Pro Thr Pro Leu
515 520 525
Thr Pro Leu Ser Pro Ala Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Ala Ala Ala
530 535 540
Ser Pro Ala Pro Ala Ala Asp Ser Leu Pro Val Thr Cys Pro Gly Thr
545 550 555 560
Glu Ala Cys Pro Ala Val Pro Pro Arg Gln Ser Glu Lys Glu Gln Leu
565 570 575
Leu Gln Ala Met Glu Arg Ser Gly Trp Val Gln Ala Lys Ala Ala Arg
580 585 590
Leu Leu Asn Leu Thr Pro Arg Gln Val Gly Tyr Ala Leu Arg Lys Tyr
595 600 605
Asp Ile Asp Ile Lys Arg Phe
610 615

Claims (59)

1.一种能够在有氧独立生存条件下固氮的根瘤菌，所述根瘤菌包括具有外源nif簇的共生根瘤菌，其中所述外源nif簇赋予所述共生根瘤菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述根瘤菌不是茎瘤固氮根瘤菌。
2.根据权利要求1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇选自由以下组成的组：独立生存的固氮生物、共生的固氮生物、光合α变形菌、γ变形菌、蓝细菌、厚壁菌、类球红细菌和沼泽红假单胞菌。
3.根据权利要求1所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇是诱导型重构的nif簇。
4.根据权利要求3所述的根瘤菌，其中所述诱导型重构的nif簇是诱导型重构的克雷伯氏菌属nif簇。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的根瘤菌，其中所述根瘤菌是IRBG74。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇包含6个nif基因。
7.根据权利要求6所述的根瘤菌，其中所述6个nif基因是nifHDK(T)Y、nifEN(X)、nifJ、nifBQ、nifF、和nifUSVWZM。
8.根据权利要求6或7所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇的每个nif基因前面是T7启动子。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的根瘤菌，其还包含内源nif簇。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇还包含终止子。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的根瘤菌，其中所述T7启动子具有终止子，并且其中所述终止子在所述T7启动子的下游。
12.根据权利要求11所述的根瘤菌，其中所述外源nif簇是重构的根瘤菌IRBG74 nif簇。
13.一种能够在有氧独立生存条件下固氮的植物生长促进细菌，所述植物生长促进细菌包括具有外源nif簇的细菌，所述外源nif簇具有至少一个诱导型启动子，其中所述外源nif簇赋予所述细菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述细菌不是茎瘤固氮根瘤菌。
14.根据权利要求13所述的植物生长促进细菌，其中所述细菌是共生细菌。
15.根据权利要求13所述的植物生长促进细菌，其中所述细菌是内生菌。
16.根据权利要求15所述的植物生长促进细菌，其中所述内生菌是根瘤菌IRBG74。
17.根据权利要求13所述的植物生长促进细菌，其中所述细菌是附生菌。
18.根据权利要求17所述的植物生长促进细菌，其中所述附生菌是防御假单胞菌PF-5。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的植物生长促进细菌，其中所述植物生长促进细菌与经遗传修饰的谷类植物联合。
20.根据权利要求19所述的植物生长促进细菌，其中所述经遗传修饰的谷类植物包含编码化学信号的外源基因。
21.根据权利要求19所述的植物生长促进细菌，其中所述固氮受所述化学信号控制。
22.根据权利要求20或21所述的植物生长促进细菌，其中所述化学信号是冠瘿碱、间苯三酚或rhizopene。
23.根据权利要求13-22中任一项所述的根瘤菌，其中所述诱导型启动子是T7启动子，并且任选地其中所述诱导型启动子是PAllacO1启动子。
24.根据权利要求13-23中任一项所述的根瘤菌，其中所述诱导型启动子由选自包括IPTG、水杨酸钠、章鱼碱、胭脂碱、群体信号3OC6HSL、aTc、枯茗酸、DAPG和水杨酸的组中的剂活化。
25.根据权利要求13-24中任一项所述的根瘤菌，其中所述诱导型启动子具有终止子，并且其中所述终止子在所述诱导型启动子的下游。
26.一种能够在谷类作物中诱导非铵依赖性固氮的茎瘤固氮根瘤菌，所述茎瘤固氮根瘤菌包含：
(i)经修饰的nif簇，其中内源nifA基因被缺失或改变；和
(ii)至少一个包含nifA和RNA聚合酶σ因子(RpoN)的操纵子，其中所述操纵子包含含有诱导型启动子的调控元件。
27.根据权利要求26所述的茎瘤固氮根瘤菌，其中所述内源nifA基因被以下取代中的至少一种取代改变：
(i)L94Q；
(ii)D95Q；和
(iii)L94Q和D95Q两者。
28.一种工程改造能够在有氧独立生存条件下固氮的根瘤菌的方法，所述方法包括将外源nif簇转移至共生根瘤菌，其中所述外源nif簇赋予共生根瘤菌在有氧独立生存条件下的固氮能力，并且其中所述根瘤菌不是茎瘤固氮根瘤菌。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述外源nif簇在质粒中转移至所述根瘤菌。
30.根据权利要求28或29中任一项所述的方法，其中所述内源NifL基因被缺失。
31.一种产生氮以供谷类植物消耗的的方法，所述方法包括提供能够在所述谷类植物附近在有氧独立生存条件下固氮的植物生长促进细菌，其中所述植物生长促进细菌是具有外源nif簇的共生细菌，其中所述外源nif簇赋予所述共生细菌固氮能力，从而使得能够在有氧独立生存条件下固氮。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述植物生长细菌是根据权利要求1-19和23-39中任一项所述的细菌。
33.根据权利要求31或32中任一项所述的方法，其中所述谷类植物是经遗传修饰的谷类植物。
34.一种用于制备固氮细菌的方法，所述方法包括：
a)鉴定宿主细菌；
b)基于所述宿主细菌与所述供体细菌之间的进化距离选择具有nif簇的供体细菌；
c)将所述供体细菌的所述nif簇插入所述宿主细菌，从而制备固氮细菌。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌与所述供体细菌之间的所述进化距离是16S核糖体RNA基因序列中每个位点小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的取代。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌和所述供体细菌属于相同的属、科、目或纲。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述供体细菌选自克雷伯氏菌属、假单胞菌属、固氮菌属、葡糖醋杆菌属、固氮螺菌属、固氮根瘤菌属、红假单胞菌属、红细菌属、蓝丝菌属或类芽孢杆菌属。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌选自由以下组成的组：大肠杆菌、防御假单胞菌Pf-5和根瘤菌IRBG74。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述供体细菌选自由以下组成的组：产酸克雷伯氏菌、施氏假单胞菌、棕色固氮菌、重氮营养葡糖醋杆菌、巴西固氮螺菌、茎瘤固氮根瘤菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、蓝丝菌属和类芽孢杆菌。
40.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌是大肠杆菌并且所述供体细菌是产酸克雷伯氏菌。
41.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌是防御假单胞菌Pf-5，并且所述供体细菌是施氏假单胞菌。
42.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌是根瘤菌IRBG74，并且所述供体细菌是类球红细菌。
43.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌是非共生细菌，例如固氮菌属、拜叶林克氏菌属或梭菌属细菌。
44.根据权利要求34所述的方法，其中所述宿主细菌是共生细菌，例如根瘤菌属、弗兰克氏菌属或固氮螺菌属细菌。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述宿主细菌与豆科植物、放线菌植物或谷类作物共生。
46.根据权利要求34所述的方法，其中所述插入的nif簇处于诱导型控制下。
47.一种选择与宿主细菌相容的供体细菌的nif簇的方法，所述方法包括：
对所述供体细菌和所述宿主细菌进行系统发生分析；
基于所述系统发生分析确定所述供体细菌与所述宿主细菌之间的进化距离小于参考值；以及
为所述宿主细菌选择所述供体细菌的所述nif簇。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述系统发生分析通过使用距离矩阵、最大简约、最大似然或贝叶斯推理来执行。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述系统发生分析通过分析核糖体RNA(例如，16s rRNA)取代率来执行。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述参考值是16S核糖体RNA基因序列中每个位点10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的取代。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述参考值是5亿年、4亿年、3亿年、2亿年、1亿年、5000万年或1000万年。
52.根据权利要求47所述的方法，其还包括将所述nif簇插入至所述宿主细菌并评估所述固氮活性。
53.根据权利要求47所述的方法，其中所述nif簇处于诱导型控制下。
54.一种包含nif簇的细菌，其中所述nif簇处于外源控制遗传元件的控制下。
55.根据权利要求54所述的细菌，其中所述nif簇是内源或外源nif簇。
56.根据权利要求54所述的细菌，其中所述外源控制遗传元件响应于诱导剂而引发启动子活性。
57.根据权利要求56所述的细菌，其中所述启动子活性通过下式来测量
Figure FDA0003307346870000071
其中m(i)是来自FPKM归一化转录组谱的每个位置i处的转录本数量，γ＝0.0067s-1是mRNA的降解速率，并且n是xtss之前和之后的窗口长度。
58.根据权利要求56所述的细菌，其中所述诱导剂通过化学递送或生物防治递送而递送至所述细菌。
59.根据权利要求56所述的细菌，其中所述诱导剂是种子中的化学信号(例如，枯茗酸)、天然根渗出物(例如，阿拉伯糖、水杨酸、香草酸或柚皮素)、来自细菌的化学信号(例如，3OC6HSL、3OC14HSL、DHBA或DAPG)。
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