CN113702524A - 一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法 - Google Patents
一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法，所述方法包括使用选择50％甲醇溶液对水产品中样品进行超声辅助提取，以磷酸缓冲液在pH＝5.5的弱酸性流动相下，10min左右实现砷化合物的完全分离，获得As(Ⅲ)(亚砷酸盐)、As(Ⅴ)(砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA(二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖‑OH和砷糖‑PO4的不同形态的砷。本发明的开展将在形态水平上获得砷在藻类植物和水生环境中的归趋信息，为明确藻类植物砷的污染原因及其控制技术提供科学依据，亦对采取生物修复开展砷环境污染治理具有重要的意义，具有很好的代表性和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及有害物不同形态的化合物分离技术领域，具体涉及一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法。
技术背景
砷由于其剧毒、致畸、致癌和致突变效应而严重威胁人类健康，被国际癌症研究中心(IARC)划分为一类致癌物。砷由污染的水体、食物和空气经食物链进入人体后，随血液流动分布于全身各组织器官。砷的长期摄入容易引发黑脚病、心血管疾病等，还与一系列癌症包括皮肤癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、肾癌等有关。食物摄入是除职业性接触之外人类砷暴露的最主要来源，由于食物砷超标而造成的砷中毒事件屡有发生。
砷是一种变价元素，以多种化合物的形式存在于自然界中，常见的化合物包括亚砷酸(AsIII)、砷酸(AsV)、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)和砷糖等。有些化合物还有不同的砷价态，如MMA、DMA分别存在三价和五价形态：一甲基次砷酸盐(MMAIII)、一甲基砷酸盐(MMAV)、二甲基次砷酸盐 (DMAIII)、二甲基砷酸盐(DMAV)。砷化合物的毒性与其化合物形态密切相关，研究表明不同砷化合物的毒性依次为：砷化氢>DMAIII、 MMAIII>AsIII>AsV>>DMAV、MMAV>>砷糖、AsC、AsB。而以前人们在研究砷污染物环境问题时，常以砷元素总量作为评价标准，很少把其化合物形态区别对待。但当这些砷化物进入生态环境后，其生物富集、代谢和转化等过程以及致毒效应、致癌效应等往往都会呈现形态选择性。因此，只有在形态水平上研究砷污染物的环境问题才能弄清它们在环境中的迁移转化规律和生态效应，才能准确的评价其对人类健康和生态环境系统的风险。
不同生长区域的植物中的砷形态存在着明显的差异。在陆生植物中，常见形态以无机砷(AsIII+AsV)为主，另含有少量DMA和MMA。在水生植物中，砷的形态和含量普遍比陆生植物丰富，大量研究表明，藻类植物是砷的富集植物。藻类植物含有丰富的砷形态包括：AsIII、 AsV、MMA、DMA、砷糖等，其中砷糖含量占48.9-80.3％，这些植物的砷总量、有机砷的含量都远高于其他植物。
不同形态的砷可能被动物或微生物选择性地降解或转化，从而在环境、生物体内中产生砷形态的选择性残留。研究发现，砷形态在动物体内的富集和代谢存在着较高的选择性，而针对砷形态在植物体内的动态变迁机制及选择性富集行为研究尚未见报道，相关研究多为植物形态含量的报道。
藻类植物是一种重要的经济植物，在水产行业中占有重要地位，按生长环境可主要分为海生藻类及淡水生藻类。其中海带是我国重要的经济型食用海生藻类，根据FAO数据统计，中国海带的年产量近10年占全球海带产量的83％-87％，为产量最高的国家，仅在2011年中国海带总出口量近2万吨，总出口额达6000万美元。轮藻是我国一种分布广泛的大型沉水藻类植物，也是一种具有一定经济价值和开发潜力的大型淡水生藻类，在环保、农业、医药业等方面均有应用。由于其对水体中的各种刺激都有较高的敏感性，且具备对环境适应性强、在室内栽植简单易行、生长周期短等特点，常被应用于教学和科研，在植物系统学中是不可缺少的典型材料。有研究表明，藻类植物在生长期间会通过固着器或假根从底泥或水体中富集重金属等污染物，海带等海藻、轮藻等淡水藻含有丰富的砷形态，但藻类植物对底泥和水体中砷形态的动态变迁及富集行为尚未见报道，而这种富集作用可以对环境中的砷起到净化作用。而底泥或水体微生物可能选择性降解砷形态导致砷形态比例发生变化，同时藻类植物也可能优先富集其中一种形态，从而造成砷在藻类植物体内以不同形式存在，因此有必要深入开展这方面的研究。
水体砷污染对人体健康造成了严重威胁，水生植物种类多、生长迅速、分布广泛，在砷积累方面有很大潜力，运用大型水生植物修复砷污染水体引起了越来越多的关注。理解植物对砷的吸收、运输和随后的转化是植物修复过程中的关键环节，有助于了解砷在水环境中的循环和归趋，因此一些关于水生植物对砷富集的研究陆续展开。水生植物对砷的积累依赖于植物的生活型，有研究表明沉水和浮水植物体内的砷含量显著高于挺水植物。沉水植物与其周围的环境达到平衡，表面积较大，积累的效果也最好。但也有一些研究认为水生植物对砷的吸收主要是通过植物表面的物理化学吸附作用力。
发明内容
鉴于现有技术的缺陷，本发明旨在于提供一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法。本发明以砷富集植物藻类(海带、轮藻等)为实验对象，建立植物体中AsIII、AsV、 MMAIII、DMAIII、MMAV、DMAV、AsB、AsC等8种环境中常见砷形态的HPLC-ICP-MS联用分离分析方法，依此开展不同形态砷在藻类植物体内的动态选择性富集行为、在水培环境中的迁移转化规律研究，以及用砷作为示踪标记物研究砷形态环境归趋的可行性，同时探讨藻类植物对砷的净化能力及富集变化规律。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法，所述方法包括使用选择50％甲醇溶液对水产品中样品进行超声辅助提取，以磷酸缓冲液在pH＝5.5的弱酸性流动相下，10min 左右实现砷化合物的完全分离，获得As(Ⅲ)(亚砷酸盐)、As(Ⅴ) (砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA(二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖-OH和砷糖-PO4的不同形态的砷。
需要说明的是，所述方法还包括加入10mL 1:1甲醇水，涡旋2min，超声处理30min，完毕后，以4000r/min进行离心15min，再加入10mL 1:1甲醇水，涡旋2min，超声处理30min后获得上清液1，同样以 4000r/min进行离心15min后得到上清液2和上清液3，将上清液1、上清液2和上清液3去甲醇后定容，最后通过HPLC-ICP-MS方法获得 As(Ⅲ)(亚砷酸盐)、As(Ⅴ)(砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA (二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖-OH和砷糖-PO4的不同形态的砷。
本发明还提供一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法用于种植业农产品安全监控中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、不同形态砷的分离检测方法的建立。
根据植物产品的特性拟采用微波萃取技术提取8种形态砷，经离心或有机试剂净化后，在HPLC-ICP-MS上实现不同形态的分离、定性鉴定和定量检测。同时完成方法学评价，包括方法的准确度、精密度和灵敏度等。
2、不同形态砷在藻类植物体内的选择性富集行为研究。
以目前广泛种植食用和应用的藻类植物(海带、轮藻等)作为实验对象，人工种植于水培环境中。根据我国重金属污染较严重地区中砷的环境浓度确定水培环境中砷的浓度，在植株整个生长期(幼龄期、成熟期等)内按一定时间间隔采样，分别测定藻类植物不同部位(海带包括固着器、柄、叶片等，轮藻包括假根、中轴、侧枝、小枝等) 中8种形态砷的浓度，分离鉴定砷可能的降解产物。研究整个生长期内不同形态砷在藻类植物不同部位的选择性富集和分布行为差异，以及富集量随时间变化的规律。
3、不同形态砷在水培水体和底泥中的浓度变化情况研究。
在采集植物样品的同时采集水培水体和底泥，测定样品中8种砷形态的浓度，研究植物生长期间砷形态在水体和底泥中变化规律，考察藻类植物富集砷对水培水体和底泥所起的净化作用，以此采取针对性措施为开展环境中砷的污染治理提供建议。
4、砷形态在水培系统内的迁移转化规律及选择性行为机理研究。
结合砷形态在水体、底泥和藻类植物中的浓度随时间的变化规律，研究砷形态在水培小型生态系统内的迁移转化规律，以及其在藻类植物体内产生形态选择性富集行为的机理和影响因素，如：植株从底泥或水体中富集砷前，其形态比例可能已经由于水体或底泥中微生物的选择性降解而产生变化，或者只是植物在富集不同形态时产生选择性行为，或者兼而有之。探讨以砷作为示踪标记物研究砷在环境中迁移、分布、富集和代谢转化等行为的可行性。
5、藻类植物中砷形态污染状况。
在实验期间同时采集部分市售藻类植物产品，尤其是砷污染较重地区的样品，测定其中砷形态的主要种类、含量，与本实验结果相对比，明确藻类植物产品中不同形态砷的污染状况和来源，为开展此类产品的安全性评估提供依据，筛选出适合开展生物修复的藻类品种应用于水环境中重金属修复。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为本发明的不同提取剂对砷形态提取量示意图；
图3为本发明的超声及微波提取对砷形态提取量示意图；
图4为本发明的甲醇水不同体积比对总砷提取率的影响示意图；
图5为本发明的提取次数对总砷提取率的影响示意图。
具体实施例
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
如图1所示，本发明为一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法，所述方法包括使用选择50％甲醇溶液对水产品中样品进行超声辅助提取，以磷酸缓冲液在pH＝5.5的弱酸性流动相下，10min左右实现砷化合物的完全分离，获得As(Ⅲ) (亚砷酸盐)、As(Ⅴ)(砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA(二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖-OH和砷糖-PO4的不同形态的砷。
需要说明的是，所述方法还包括加入10mL 1:1甲醇水，涡旋2min，超声处理30min，完毕后，以4000r/min进行离心15min，再加入10mL 1:1甲醇水，涡旋2min，超声处理30min后获得上清液1，同样以 4000r/min进行离心15min后得到上清液2和上清液3，将上清液1、上清液2和上清液3去甲醇后定容，最后通过HPLC-ICP-MS方法获得 As(Ⅲ)(亚砷酸盐)、As(Ⅴ)(砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA (二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖-OH和砷糖-PO4的不同形态的砷。
本发明还提供一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法用于种植业农产品安全监控中的应用。
实施例
采用HPLC-ICP-MS联用法及Orbitrap Fusion三合一高分辨率质谱仪优化和建立了As(Ⅲ)(亚砷酸盐)、As(Ⅴ)(砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA(二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖-OH和砷糖-PO4等8种形态砷在水体、植物体内提取、净化、定性分离、定量检测方法，对方法的准确性、精密性、灵敏度、回收率等指标进行了验证。在HPLC-ICP-MS联用法中，添加50μg/L的亚砷酸盐、砷酸盐、甲基胂酸、二甲基胂酸、砷胆碱、砷甜菜碱，回收率为84％～95％，相对标准偏差分别为2.64％～7.18％，亚砷酸盐、砷酸盐、甲基胂酸、二甲基胂酸、砷胆碱、砷甜菜碱的仪器检出限分别为 0.3、0.5、0.7、0.6、0.5、0.3μg/L。结果表明该方法具有分离时间短、灵敏度高、回收率高等优点，适用于砷的形态分析。在此基础上，为确证藻类植物中高浓度未知物质，采用Orbitrap Fusion三合一高分辨率质谱仪对砷糖-OH和砷糖-PO4进行了分析、鉴定。
提取剂的选择
藻类植物大多砷含量丰富，要保证将其中各形态砷进行提取，在样品前处理中保证待测砷形态的稳定和提取完全是检测结果准确的关键因素，因此需要探求一种高效的提取方法。根据查阅文献表明，目前对植物样品而言，常用提取剂包括甲醇水、乙醇水、盐酸、磷酸、磷酸盐、硝酸等，经前期试验证实，乙醇水提取容易将样品中可溶性有机物提取出来，溶解的有机物相对较多，使提取液颜色变深而且粘稠，导致样品提纯不完全，因而不利于各形态砷的提取，影响随后的色谱分离；磷酸与砷酸盐结构相似，因此提取检测时会在图谱中As(V) 出峰位置造成很明显的干扰峰，影响样品的检测；硝酸具有一定的氧化能力，在提取过程中可能会发生少量的As形态转化。而无论对于藻类植物鲜样还是干样，甲醇水都具有较理想的提取率，且提取过程简便易行，提取液易于处理。磷酸氢二铵、甲醇水、水、盐酸等提取剂对砷各形态超声提取量见图2。
提取方式的选择
超声提取是砷形态分析中的经典方法，近年来微波协助提取也被广泛的发展和应用。其中，微波协助提取实验过程：称取待测样品约 5g(干样称取1g)于微波装置专用的聚四氟乙烯管中，加入10ml提取剂，放入微波系统，将温度调到80℃(从室温到80℃爬升时间为 10min)，于80℃保持5min后冷却到室温(冷却过程为10min)，将上清液转移到离心管中，离心20min(转速5000r/min)，将离心后的上清液转移至小烧杯中，向微波后的残渣中加入5mL提取剂，重复上述微波、离心过程，将上清液综合于小烧杯，重复此提取过程两次。超声提取试验过程包括：称取待测样品约5g(干样称取1g)于50mL 离心管中，向样品中加入10mL提取剂混匀后，超声波超声20min，离心20min，将离心后上清液转移至小烧杯中，向离心后的残渣中加入5mL提取剂混匀后，超声波超声20min，离心20min重复两次。超声和微波两种提取方法的提取效果见图3，由图可知，超声和微波提取的效率相当，但微波提取对仪器要求较高(要求可稳定精确控温至 80℃)，且一些微波消解仪对提取液具有选择性(如乙醇可能被限制使用于微波提取)，而超声仪应用广泛，操作简单。考虑到仪器的普遍性以及可操作性，超声提取更具优势。
提取剂体积比的选择
为了消除有机溶剂对提取效率的影响，对甲醇和水的体积比进行了优化选择，设置的体积比为1:2、1:1、2:1、3:1，考察甲醇水对砷形态进行提取后的提取率，取其均值得到图4。由图可知，在一定范围内，样品提取效率随着甲醇水浓度的增大而提高(1:1甲醇水提取效率明显高于1:2甲醇水)，但增大到一定程度又随着甲醇水体积比的增大而降低(3:1甲醇水提取效率低于2:1甲醇水)。究其原因可能是一定量的甲醇能提高砷的提取效率，但甲醇具有弱变形性质，如果过多反而可能降低提取效率，还有一个原因可能是甲醇含量多，提取出样品中有机物质，从而干扰了测定的精确性。由此，我们选择 1:1作为提取剂的体积比。
提取次数的选择
实验表明，同一样品的提取次数对总砷提取率的影响很大。如图 5所示，样品首次提取后，提取到的砷只有50％，随着提取次数的增加，提取效率呈上升趋势，但经3次以上的提取后，提取效率没有明显的增加，其中原因可能是各砷化物之间存在很强的相互作用，尤其是在砷酸与植物基质之间存在很强的相互作用，因此选择将样品提取 3次。
因此基于上述的技术方案可以确定：称取1.0g样品于50mL离心管中，加入10mL体积比为1:1甲醇/水(50％甲醇)溶液，涡旋混匀2min，于超声波中室温超声提取30min，以4000r/min的速度离心15min，收集上清液，重复2次，提取液在60℃水浴锅中蒸发去除甲醇，定容后以0.45μm滤膜过滤待测。
仪器条件的优化选择
由于不同形态As化合物的化学结构不同，解离常数与流动相的 pH存在着较大相关性。在水溶液中，砷胆碱(C5H14AsO+)和砷甜菜碱(C5H12AsO+)主要是以阳离子形式存在，而砷酸盐(AsO43-)、亚砷酸盐(AsO33-)、甲基胂酸(CH4AsO3-)、二甲基胂酸(C2H6AsO2-) 则均为阴离子形式。因此，在阴离子交换色谱柱上，砷胆碱和砷甜菜碱不会和色谱柱上的交换基团产生作用而直接洗脱出峰，而其余四种砷化合物则随pH值的变化出峰时间相应延长或缩短。本研究分别选取了pH 5.5(弱酸性)、pH 7.0(中性)、pH 10.5(碱性)三种不同的流动相pH值，发现流动相的pH为5.5时，6种峰能够完全实现分离。流动相中加入2％的乙醇是为了提高仪器的增敏性，增敏效应产生的原因可能是电离的碳离子与部分未电离的目标离子发生了电荷转移，提高了电离效率。
电感耦合等离子体质谱条件的优化
用含有10ng/mL的Ce、Co、Li、Tl、Y调谐溶液对ICP-MS仪器测定时的工作条件进行优化，采用时间分辨采集模式，使仪器的灵敏度、氧化物、双电荷、分辨率等指标符合ICP-MS仪器最佳测定条件，避免样品溶液中35Cl和所使用的载气氩气形成75ClAr+多原子离子干扰砷的检测。在砷形态分离时合理控制流动相的流速、有机相比例、 pH值均可以较好地控制砷形态分离的时间及检测信号强度。经优化后的总砷及砷形态分析的仪器参数为RF功率：1550W，反射功率： 1.80W，雾化室温度：2.0℃，采样深度：8.0mm，等离子体气流速 15L/min，载气：高纯氩气(纯度≥99.999％)，载气流速：0.80L/min，稀释气流速：0.30L/min，射频电压：2.1V，蠕动泵流速：0.3rps， He气流量：3.8mL/min，检测质量数：m/z＝75(As)，信号采集模式：时间分辨模式，As积分时间：0.3s。最终确立的仪器工作参数见下表。
HPLC-ICP-MS仪器工作参数
综上，经优化选择确定的仪器条件为：流动相A相:10mM乙酸钠+3mM硝酸钠+2mM磷酸二氢钠+0.2mM乙二胺四乙酸二钠，流动相B相：乙醇，等度洗脱，A:B(98:2，V:V)，pH为5.5，流速： 1.0mL/min，柱温：25℃，进样量：10μL。
实际样品的分析
采集12种水产样品经上述前处理后，用HPLC法测定水产品中的总砷含量，同时采用本研究的HPLC-ICP-MS方法分析水产品中的砷形态，并比较总砷含量与各形态砷含量的加和值。由结果可知，尽管水产品中总砷含量较高，砷酸盐和亚砷酸盐等高毒性的无机砷的含量较低，水产品中主要的砷形态以砷甜菜碱、二甲基胂酸和一种未知的砷化合物为主，该未知砷化合物为砷糖。参考我国农业行业标准 NY/T 1709-2011《绿色食品藻类及其制品》中规定，藻类及其制品中砷以无机砷含量作为判定标准，无机砷限量值为1.5mg/kg，据此测定海带和紫菜中无机砷可判定海带和紫菜中砷的超标情况。
实施例
在水培环境中使用近似环境污染浓度的砷，人工种植目前广泛种植食用的藻类植物。定期采集植物样本，测定其中不同形态砷的含量，研究整个藻类植物生长期内不同形态砷在植株不同组织部位的形态选择性富集变迁行为，以及富集量随时间变化的规律，并分离鉴定其可能的降解产物。
植物材料的获取
金鱼藻(沉水植物)、黑藻(沉水植物)、大藻(浮水植物)，均采自河中清洁水域、农家清洁水域或水族馆购买。植物釆集后，除去其他杂质，用大量自来水和蒸馏水洗净，培养于1/10的Hoagland 营养液中。3种植物在温室(或光照培养箱)适应培养3周后，分选取生长旺盛、大小一致的植株进行水培实验。
植物材料的培养
采用室内水培法，选用容积为2.5L的塑料小桶做容器，培养液含有1/10的霍格兰(Hogland)营养液和不同浓度的3种形态As，设计每种As形态4个浓度梯度，As(III)：对照(0mg.L-1)、低(0.1 mg.L-1)、中(0.3mg.L-1)、高(0.5mg.L-1)；As(V)：对照(0mg.L-1)、低(1.0mg.L-1)、中(3.0mg.L-1)、高(5.0mg.L-1)；DMA：对照(0mg.L-1)、低(1.0mg.L-1)、中(3.0mg.L-1)、高(5.0mg.L-1)。三种形态砷分别以AS2O3、Na2HAsO4·7H2O、C2H6AsNaO2·3H2O形式添加，添加的As均为分析纯，As离子浓度以纯As计。以上每个处理设置3个重复，每桶分别培养约50.0g植物，所有培养在温室自然光照和光照培养箱下完成，气温变化为18-25℃，相对湿度70-85％。
针对As(III)培养液中As形态可能发生了变化，对0.3mg./L As(III)处理下的培养液砷形态进行动态监测，植物培养方法参照水培法，以无植物处理作为对照，每个处理设置3个重复，3种植物加入前取少量培养液，植物加入后按时间间隔(先8h、后加密为2h)取样。
在营养液的选择方面，目前市场上营养液的配方很多，有些配方经过几十年的实用检验证明是可靠并且非常有效的，其中Hogland营养液配方是使用最早的并且到现在仍被使用的一种经典配方，被各国无土栽培实验和无土栽培种植爱好者广泛使用，适用用各种植物的无土栽培，且成分中不含有对砷形态有干扰的物质，因此选用Hogland 营养液作为植物培养的营养液。
植物样本的获取
3种植物均在培养10d后收获，收获时采集少量培养液分析其砷形态。植物用蒸馏水和去离子水各冲洗数遍后，参照Zhang等的方法用500ml冰冷的淋洗液浸泡20min以去除质外体中的砷，淋洗液由1mmol/L K2HPO4、5mmol/L 2-(N-吗啡琳)乙磺酸(MES)和0.5mmol/LCa(NO3)2组成。植物整株浸泡于淋洗液中，收集淋洗液，并将植株用滤纸吸干表面水分后称量其鲜重，并测定淋洗液的砷含量。收获后将每个植株样品的根和莲叶分开，用液氮速冻后储存于-80℃超低温冰箱中。
样品制备
植物干样：剪刀剪碎后用粉碎机磨成粉末后待测。
植物鲜样：不同的植物部位用真空冷冻干燥机在-40℃下冻干，经磨碎充分混匀后待测。
前处理方法
植物样：称取1.0g样品于50mL离心管中，加入10mL体积比为1:1甲醇/水(50％甲醇)溶液，涡旋混匀2min，于超声波中室温超声提取30min，以4000r/min的速度离心15min，收集上清液，重复2次，提取液在60℃水浴锅中蒸发去除甲醇，定容后以0.45μ m微孔滤膜过滤后待测。
水样：采集后经0.45μm微孔滤膜过滤后待测。
仪器与试剂
1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括1260Hip Bio ALS自动进样器，1260Bio Quat Pump四元泵，1260TCC柱温箱； 7700series ICP-MS(美国Agilent公司)带ASX-500Series ICP-MS Autosampler(美国Agilent公司)；PRP-X100型(250mm×4.1mm， 10μm)阴离子交换柱(Hamilton，美国)；Milli-Q Advantage A10 超纯水系统(美国Millipore公司)；KH-300DE超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；BT25S型电子天平(赛多利斯科学仪器公司，德国)。
GBW(E)080283砷单元素标准溶液、GBW08671砷胆碱溶液标准物质、GBW08670砷甜菜碱溶液标准物质、GBW08667砷酸根溶液标准物质购自中国计量科学研究院，一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA) 标准物质购自美国Sigma公司，亚砷酸钠标准物质购自美国ChemService公司，调谐液(Part#5185-5959)购自美国Agilent 公司，硝酸、高氯酸、甲醇(色谱纯)购自德国Merck公司，氢氧化钠、磷酸二氢钠(99.999％metal basis)、乙酸铵(纯度99.99％metal basis)、硝酸钠(99.99％metal basis)、乙二胺四乙酸二钠(99.999％metal basis)购自阿拉丁试剂公司，实验用水为一级水。
结果与分析
藻类植物吸附总砷情况
从总体上看，3种植物对砷的吸附量很少，在3种形态砷处理下，所有植物对砷的吸附量随着砷浓度的增加而增大，高浓度As(III)培养下，沉水植物金鱼藻、黑藻对砷的吸附量显著高于浮水植物大藻；各浓度As(V)培养下，3种植物对砷的吸附量无显著差异；在中、高浓度DMA培养下，大藻对砷的吸附量显著高于金鱼藻和黑藻。
不同形态砷处理下砷的吸附量
藻类植物的总砷吸收量
3种植物总砷吸收量随着培养液中砷浓度的增加而显著增加，植物对As(V)的吸收显著高于DMA，高浓度As(V)处理下，3种植物体内的总As含量最高。As(III)或As(V)各浓度处理下，3种植物体内总含量趋势表现为大藻＞黑藻＞金鱼藻，高浓度As(V)处理下，大藻体内总As含量显著高于黑藻和金鱼藻，说明大藻对As(III)和As(V) 吸收效果最好，而金鱼藻最差。黑藻对DMA的吸收效果较好，高浓度 DMA处理下，黑藻体内的砷含量高于另外2种植物。
不同形态砷处理下砷的吸收量
砷形态对藻类植物生物量的影响
As(V)和DMA对3种植物的生长几乎无显著影，而As(III)对植物生长的影响较大。与空白对照相比，各浓度As培养均未显著抑制黑藻的生长，反而一定浓度的As(V)和DMA能够刺激黑藻的生长；大藻对种砷形态也不敏感，3种形态的As各浓度处理下均未显著抑制或促进它生长；金鱼藻对As(III)耐性较弱，高浓度As(III)显著抑制其生长。
表6不同形态砷处理下植物的生物量
3种供试植物以少量吸附和大量吸收的方式从培养液中积累As，植物对DMA的积累能力明显低于As(V)；同一生活型的大藻对无机As 的吸收效果最好，而金鱼藻最差，黑藻对DMA的吸收效果最好。培养液砷形态分析结果显示，培养10d后，As(III)各处理浓度下，3种植物培养液中As(III)形态发生了迅速氧化，氧化速率为黑藻>大藻> 金鱼藻>无植物，而As(V)和DMA各浓度处理培养液中As形态未发生变化。
植物体内砷形态分析结果表明，As(III)培养下，植物根部主要是As(III)(占39-86％)，茎叶部也主要是As(III)(占39.4-88.3％)； As(V)培养下植物根部主要是As(V)(占37％-94％)，茎叶内主要是 As(III)(占31.1-85.6％)；DMA培养下植物根部(占23.46-100％)和茎叶(占72.6-100％)内主要是DMA。低、中浓度As(V)处理下，大藻根部和黑藻茎叶的AS(III)含量显著增加，因此水生植物体内存在As 的还原，是砷解毒的关键机制。
3.0mg/L和5.0mg/L的As(III)和As(V)显著抑制黑藻、金鱼藻和大藻生物量，其中As(III)的抑制最明显；3种植物对As(III)的吸收最大，其次是As(V)和DMA。As(III)、As(V)和DMA处理下，黑藻对As的最大吸收量均显著高于金鱼藻和大藻；3种植物在浓度 1.0mgL-1不同形态AS培养条件下对AS的动态吸收表明，黑藻、大藻对As(III)和DMA、金鱼藻对As(V)的吸收在第6d后达到较高水平，金鱼藻对As(III)吸收在第2d后就能达到较高水平，大藻对As(v) 的吸收在第4d能达到较高水平。
综上所述，本发明提供了以下内容：
(1)采用HPLC-ICP-MS联用法建立砷富集植物藻类(海带、轮藻等)中AsIII(亚砷酸盐)、AsV(砷酸盐)、MMAIII(甲基次砷酸)、DMAIII(二甲基次砷酸)、MMAV(甲基砷酸)、DMAV(二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)等8种环境中常见砷形态的高通量检测方法，完成方法学评价；
(2)在水培环境中使用近似环境污染浓度的砷，人工种植目前广泛种植食用的藻类植物。定期采集植物样本，测定其中不同形态砷的含量，研究整个藻类植物生长期内不同形态砷在植株不同组织部位的形态选择性富集变迁行为，以及富集量随时间变化的规律，并分离鉴定其可能的降解产物；
(3)研究实验期间不同形态砷在水培水体中的浓度变化情况，结合其在植物体内的富集变迁行为研究砷形态在水培小型生态系统 (水体和藻类植物)内的迁移转化规律、产生形态选择性富集行为的机理，同时使用砷作为示踪标记物研究重金属环境归趋的可行性；
(4)从市场上采集藻类植物样品，测定其中砷形态含量，与本实验结果对比，研究藻类植物产品中砷形态的污染种类、程度和来源；
(5)在以上研究基础上，明确藻类植物对水培环境污染物的富集净化作用，筛选出适合开展生物修复的藻类品种应用于水环境中重金属修复。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变，而所有的这些改变，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法，其特征在于，所述方法包括使用选择50％甲醇溶液对水产品中样品进行超声辅助提取，以磷酸缓冲液在pH＝5.5的弱酸性流动相下，10min左右实现砷化合物的完全分离，获得As(Ⅲ)(亚砷酸盐)、As(Ⅴ)(砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA(二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖-OH和砷糖-PO4的不同形态的砷。
2.根据权利要求1所述的针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法，其特征在于，所述方法还包括加入10mL 1:1甲醇水，涡旋2min，超声处理30min，完毕后，以4000r/min进行离心15min，再加入10mL 1:1甲醇水，涡旋2min，超声处理30min后获得上清液1，同样以4000r/min进行离心15min后得到上清液2和上清液3，将上清液1、上清液2和上清液3去甲醇后定容，最后通过HPLC-ICP-MS方法获得As(Ⅲ)(亚砷酸盐)、As(Ⅴ)(砷酸盐)、MMA(甲基砷酸)、DMA(二甲基砷酸)、AsB(砷甜菜碱)、AsC(砷胆碱)、砷糖-OH和砷糖-PO4的不同形态的砷。
3.一种利用如权利要求1所述的针对8种不同形态砷在植物体、水体和底泥的机体中的分离分析方法用于种植业农产品安全监控中的应用。
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