CN113694059A - Nl101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用 - Google Patents

Nl101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了NL101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用。本发明通过脾脏致敏诱导的急性肾移植抗体介导的排斥反应模型，研究NL101对急性排斥反应的抑制作用，实验表明腹腔注射NL101，能显著减少异型肾脏移植小鼠外周血、脾脏细胞的B细胞和浆细胞群落比例，减轻急性排斥反应。同样地，NL101对慢性排斥反应具有抑制作用，能够显著降低异型肾脏移植小鼠的死亡率。

Description

NL101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及NL101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用。
背景技术
抗体介导的排斥反应(ABMR)是导致移植物失功的重要原因。ABMR的发生主要来源于供受体间人类白细胞抗原(human leukocyte antigens，HLA)的错配，抗原呈递细胞(antigen presenting cells，APCs)将移植器官中暴露的HLA 抗原加工为抗原肽并递呈给成熟B细胞，在辅助T细胞的协同下于生发中心 (germinal center，GC)发展成活化的B细胞，最后分化为可分泌针对供体特异性抗体(donor HLA specific antibodies，DSA)的浆细胞；在ABMR复发的情况下，浆细胞的增殖则遵循另一更为便捷的途径，即记忆性B细胞直接在辅助T 细胞的协同下活化、增殖，短时间大量生成可分泌DSA的浆细胞。被分泌的DSA与移植物内皮细胞结合后，一方面可独立募集表达FcγR的免疫细胞，一方面触发补体激活，在内皮细胞血管腔侧形成膜攻击复合物(membrane attack complex， MAC)，进一步加强内皮应激以及炎症细胞募集信号。
HLA差异源于基因，位点复杂，无法在现阶段技术条件下完全清除或封闭，因此，在ABMR损伤中，如何减少和阻断产生DSA的浆细胞分化和增殖是ABMR 治疗的关键点。
现阶段ABMR治疗的主要目标包括：
1)减少或消除新发DSA产生，2)消除循环中的现存DSA，3)阻断循环 DSA在移植物上的效应，与目标相对应的临床处置手段仅有CD20单抗清除B 细胞，血浆置换和丙种球蛋白清除(封闭)抗体，激素冲击减少炎症三类或组合方案，虽然这些治疗可改善短期预后，却也被证实无法改善长期预后(Am J Transplant 2009；9:1099-107.Am J Transplant2011；11:2405-13.N Engl J Med 2018；379:1150-60)。缺少器官和位点的靶向性是这些治疗的共性。
NL101(即EDO-S101)，结构如下所示，
Figure BDA0002990662970000021
NL101化学式为C19H28Cl2N4O2，分子量为415.36，为白色至淡黄色结晶性粉末；无臭。在二甲基亚砜中略溶，在甲醇或N,N-二甲基甲酰胺中微溶，在水中不溶或几乎不溶，在醋酸中易溶。
NL-101是一类能作用于肿瘤细胞内的HDAC分子和DNA分子，产生确切抗肿瘤作用的药物。HDAC和DNA已被临床证实为有效的抗恶性肿瘤作用靶点，前者是现代分子靶向类靶点，后者是传统的细胞毒类靶点。NL-101进入肿瘤细胞后，抑制HDAC的活性：一方面使结合紧密的染色质(DNA)变得疏松，使其更容易被NL-101分子中的氮芥基团进攻，造成大量DNA损伤，诱导细胞凋亡和周期抑制，另一方面通过直接或间接的方式抑制DNA的损伤修复，阻止细胞存活和耐药性的产生。目前没有使用NL-101用于治疗急性、慢性排斥反应中报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供NL101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
NL101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用。
进一步地，所述治疗急性、慢性排斥反应药物中至少含有NL101。
NL101在制备治疗急性、慢性ABMR药物中的应用。
NL101在制备治疗脾脏致敏诱导的急性肾移植抗体介导的排斥反应药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明通过脾脏致敏诱导的急性肾移植抗体介导的排斥反应模型，研究 NL101对急性排斥反应的抑制作用，实验表明腹腔注射NL101，能显著减少异型肾脏移植小鼠外周血、脾脏细胞的B细胞和浆细胞群落比例，减轻急性排斥反应。同样地，NL101对慢性排斥反应具有抑制作用，能够显著降低异型肾脏移植小鼠的死亡率。
附图说明
图1为本发明的抗原致敏组、同型肾脏移植组、异型肾脏移植导致急性 ABMR组、ABMR+他克莫司处理和ABMR+NL101处理组小鼠外周血和脾脏细胞中B细胞和浆细胞流式细胞术检测结果示意图及统计图。
图2为本发明的抗原致敏组、同型肾脏移植组、异型肾脏移植导致急性 ABMR组、ABMR+他克莫司处理组和ABMR+NL101处理组小鼠血清IgG和IgM 丰度检测结果统计图。
图3为本发明的抗原致敏组、同型肾脏移植组、异型肾脏移植导致急性 ABMR组、ABMR+他克莫司处理和ABMR+NL101处理组移植肾中C4d荧光免疫图。
图4为本发明的抗原致敏组、同型肾脏移植组、异型肾脏移植导致急性 ABMR组、ABMR+他克莫司处理和ABMR+NL101处理组移植肾中淋巴细胞比例流式检测及统计图。
图5为本发明的抗原致敏组、同型肾脏移植组、异型肾脏移植导致急性ABMR组、ABMR+他克莫司处理和ABMR+NL101处理组血清和移植肾中IL-6、 IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF和IL-12p70水平统计图。
图6为慢性ABMR各组死亡率结果图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行描述和说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。基于本申请提供的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域普通技术人员显式地和隐式地理解的是，本申请所描述的实施例在不冲突的情况下，可以与其它实施例相结合。
除非另作定义，本申请所涉及的技术术语或者科学术语应当为本申请所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本申请所涉及的“一”、“一个”、“一种”、“该”等类似词语并不表示数量限制，可表示单数或复数。本申请所涉及的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含；本申请所涉及的“连接”、“相连”、“耦接”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电气的连接，不管是直接的还是间接的。本申请所涉及的“多个”是指大于或者等于两个。“和/或”描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“A和/或B”可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。本申请所涉及的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序。
以下实施例中所使用的试剂、药物、仪器等均能够通过商业途径购得。
实施例1
1.动物分组及手术
10周龄雄性C57BL/6和Balb/c小鼠在模型制备前均在温度23±2℃，湿度 55±10％的无菌环境中自由生长，体重均在25g左右。手术期间使用质量分数1％戊巴比妥生理盐水溶液腹腔注射麻醉小鼠(80mg/kg小鼠)，手术处理分为抗原致敏和移植物排异两个阶段，具体分组和实施步骤如下：
(1)抗原致敏组(allergy inducing group，简称为Blank组)：取Balb/c雄性小鼠脾脏，钝性分离制备细胞浓度为107个/ml脾脏单细胞生理盐水悬液，备用。对C57BL/6雄性小鼠进行尾静脉注射新鲜制备的上述脾脏单细胞悬液(0.1ml/ 只小鼠)，致敏后不进行移植手术(n＝4，即有4只C57BL/6雄性小鼠不进行移植手术)，其肾脏则作为空白对照。
其他抗原致敏的C57BL/6雄性小鼠作为受体，详见以下几组。以下分组中所述的供体C57BL/6小鼠是没有被Balb/c小鼠抗原致敏的。
(2)同型肾脏移植组(isogeneic kidney transplantation group，简称为Iso组)：取被Balb/c小鼠抗原致敏的C57BL/6小鼠4只作为受体，取供体C57BL/6小鼠肾脏，移植至受体C57BL/6小鼠，并保留受体小鼠原肾脏；
(3)异型肾脏移植导致急性ABMR组(allogeneic kidney transplantationinduced acute AMBR group，简称为ABMR组)：取被Balb/c小鼠抗原致敏的 C57BL/6小鼠4只作为受体，以Balb/c小鼠作为肾脏供体，移植至受体C57BL/6 小鼠，并保留受体小鼠原肾；因受体C57BL/6小鼠2周前被Balb/c小鼠抗原致敏已产生抗体，因此在二次接触Balb/c小鼠来源移植物时，会产生急性抗体介导的排斥反应；
(4)ABMR+他克莫司处理组(ABMR+Tacrolimus group，简称为ABMR +Tac组)：取被Balb/c小鼠抗原致敏的C57BL/6小鼠4只作为受体，以Balb/c 小鼠作为肾脏供体，移植至受体C57BL/6小鼠，并保留受体小鼠原肾脏，术后，对受体小鼠每日进行腹腔注射Tac溶液(即他克莫司溶液或者FK506溶液)处理；所述Tac溶液的制备及注射用量详见下文：药物处理。
(5)ABMR+NL101处理组(ABMR+NL101 group，简称为ABMR+NL101 组)：取被Balb/c小鼠抗原致敏的C57BL/6小鼠4只作为受体，以Balb/c小鼠作为肾脏供体，移植至受体C57BL/6小鼠，并保留受体小鼠原肾，移植前24小时给予受体C57BL/6小鼠NL101溶液处理；所述NL101溶液的制备及注射用量详见下文：药物处理。
2.药物处理
所述Tac溶液的制备及注射用量如下：
将他克莫司(FK506)粉末溶于体积分数5％DMSO玉米油溶剂，制得浓度为15mg/ml的母液Y，于-80℃保存，在使用前，用生理盐水稀释为浓度为 0.125mg/ml他克莫司溶液，在移植肾复灌30分钟前，对受体小鼠进行腹腔注射 FK506溶液(1mg FK506/kg小鼠)，并维持该剂量每天给药，至术后5天，处死小鼠取样。
所述NL101溶液的制备及注射用量如下：
将NL101溶于DMSO制备10mg/ml母液X，避光4℃保存，于使用前用生理盐水配制成浓度为2mg/ml的NL101溶液，在移植前24h给予受体C57BL/6 小鼠腹腔注射(30mg NL101溶液/kg小鼠)。
抗原致敏组和同型肾脏移植组则给予同体积生理盐水腹腔注射，不给予其他药物处理。
移植术后5天，用质量分数1％戊巴比妥生理盐水溶液(80mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，使用摘眼球取血法取小鼠全血于抗凝管中；对所有小鼠进行质量分数5％戊巴比妥生理盐水溶液腹腔注射(300mg戊巴比妥/kg小鼠)，麻醉安乐死，并取脾脏、肾脏组织做后续检测。
3.新生浆细胞检测
取0.2ml小鼠全血与2ml红细胞裂解液混合，常温避光孵育15min，离心 400g，5min提取外周血细胞(PBMC)；脾脏经研磨头压过40μm滤网，行钝性分离成脾脏单细胞悬液；使用BSA/PBS溶液(1％BSA)对PBMC和脾脏单细胞进行重悬，制备成每毫升108个细胞的悬液，取50μl细胞悬液加入等体积新配制的流式抗体溶液(以50μl体积为例：CD45 BV786,CD3FITC,B220 PE-Cy7, CD19 APC-Cy7,CD138 BV421,CD27 PE各1μl+44μl流式细胞染色液，所有试剂均购于BD Pharmingen公司)，避光，冰上孵育15min，加入2ml流式细胞染色液，离心450g 5min，弃上清，用200μl的PBS(0.01M，pH 7.4)重悬，使用 CytoFLEX LX流式细胞分析仪进行流式检测，主要检测B细胞(CD45+CD3- B220+CD19+)和其中浆细胞(CD138+CD27-)细胞群落占淋巴细胞总群落的比，用于评估NL101对ABMR中B细胞和浆细胞激活水平的影响。
4.血清DSA丰度检测
对小鼠全血进行离心3000g，30min，离心后获取血清，进行IgG和IgM丰度流式细胞术检测，从而测量新生供体特异性抗体(donor specific antibody)水平，用于评估NL101对ABMR反应中浆细胞分泌DSA功能的影响。
5.C4d免疫组化检测
将移植肾组织用质量分数4％多聚甲醛固定2小时，质量分数20％和30％梯度蔗糖PBS溶液(0.01M，pH 7.4)脱水沉底，进行冰冻切片(切片厚度20μm)，对切片组织进行C4d免疫组化检测，并荧光拍照，用于评估NL101对ABMR反应中补体和内皮激活水平的影响。
6.移植物浸润炎症细胞检测
将小鼠移植肾组织单细胞悬液，使用BSA/PBS溶液(1％BSA)进行重悬，制备成每毫升108个细胞的悬液，取50μl细胞悬液加入等体积新配制的流式抗体溶液(以50μl体积为例：CD45 BV786抗体1μl+49μl流式细胞染色液，所有试剂均购于BD Pharmingen公司)，避光，冰上孵育15min，加入2ml流式细胞染色液，离心450g 5min，弃上清，用200μl的PBS(0.01M，pH 7.4)重悬，使用CytoFLEX LX流式细胞分析仪进行流式检测，测定移植肾组织中浸润的淋巴细胞(CD45+)数量，用于评估NL101对ABMR反应中移植物内皮激活后，遭受淋巴细胞攻击水平的影响。
7.炎症因子水平测定
将小鼠血清(对小鼠全血进行离心3000g 30min，离心后获得血清)和移植肾组织匀浆离心14,000g 30min，取上清，利用CBA炎症因子测定试剂盒(BD, 552364)，对样本中IL-6,IL-10,MCP-1,IFN-γ,TNF,IL-12p70水平进行测量，用于评估NL101对ABMR反应中局部和全身性炎症水平的影响。
实施例2
1.动物分组及手术
10周龄雄性C57BL/6和Balb/c小鼠在模型制备前均在温度23±2℃，湿度 55±10％的无菌环境中自由生长，体重均在25g左右。手术期间使用质量分数1％戊巴比妥生理盐水溶液腹腔注射麻醉小鼠(80mg/kg小鼠)，手术处理分为抗原致敏和移植物排异两个阶段，具体分组和实施步骤如下：
以下各组中，肾脏移植之前，供体小鼠与受体小鼠均为正常小鼠，没有进行抗原致敏。
(1)同型肾脏移植组(isogeneic kidney transplantation group，简称为Iso组)：取C57BL/6小鼠5只作为受体，取供体C57BL/6小鼠肾脏进行移植至受体C57BL/6小鼠，并摘除受体小鼠原肾；
(2)异型肾脏移植导致的慢性ABMR组(allogeneic kidney transplantationinduced chronic AMBR group，简称为chronic ABMR组)：取C57BL/6 小鼠5只作为受体，以Balb/c小鼠作为肾脏供体，移植至受体C57BL/6 小鼠，并摘除受体小鼠原肾；因受体小鼠为首次接受Balb/c小鼠抗原刺激，因此抗体产生时间较长，并呈现逐级放大效应，可产生类似于慢性抗体介导的排斥反应；
(3)chronic ABMR+他克莫司处理组(chronic ABMR+Tacrolimus group，简称为chronic ABMR+Tac)：取C57BL/6小鼠5只作为受体，以Balb/c 小鼠作为肾脏供体，移植至受体C57BL/6小鼠，并摘除受体小鼠原肾；术后，对受体小鼠每日进行腹腔注射Tac溶液(即他克莫司溶液或者 FK506溶液)处理；所述Tac溶液的制备及注射用量与实施例1中一致；
(4)chronic ABMR+NL101处理组(chronic ABMR+NL101 group，称为chronic ABMR+NL101组)：取C57BL/6小鼠5只作为受体，以Balb/c 小鼠作为肾脏供体，移植至受体C57BL/6小鼠，并摘除受体小鼠原肾；移植前24小时给予受体C57BL/6小鼠NL101溶液处理，所述NL101溶液的制备及注射用量与实施例1中一致。
2.小鼠死亡率记录
移植小鼠术后7日进行单独饲养，防止小鼠打斗造成对实验结果的影响，并每日收集死亡小鼠，并进行解剖检查，排除出血、尿道梗阻等外科手术原因后，纳入死亡数量。
检测结果
1、新生激活B细胞和浆细胞数量及比例检测结果
图1是抗原致敏组、同型肾脏移植组、异型肾脏移植导致急性ABMR组、 ABMR+他克莫司处理组和ABMR+NL101处理组，外周血和脾脏细胞中B细胞和浆细胞流式细胞术检测结果示意图及统计图。对抗原致敏组(Blank)、同型肾脏移植组(Iso)、异型肾脏移植导致急性ABMR组(ABMR)、ABMR+他克莫司处理组(ABMR+Tac)和ABMR+NL101处理组(ABMR+NL101)小鼠的外周循环血细胞(如图1A所示)和脾脏细胞(如图1B所示)进行流式细胞术分析，结果如图1所示；其中细胞群落标注均为在上阶母群内所占百分比；图1C 为B细胞(B cell)和浆细胞(Plasma cell)占外周循环血细胞(PBMC)和脾脏细胞(Spleen)的淋巴细胞中百分比统计图，****P<0.0001,***P<0.001,and*P <0.05 vs Blank group；####P<0.0001,###P<0.001,##P<0.01,and#P<0.05 vs Iso group,ΔΔΔΔP<0.0001,ΔΔΔP<0.001,ΔΔP<0.01,andΔP<0.05 vsABMR group；□□□□P<0.0001 and□□□P<0.001 vs ABMR+Tac group。
由图1可知，NL101能够显著降低ABMR反应脾脏中B细胞和浆细胞群落。具体地，在脾脏中，同型肾脏移植组小鼠B细胞(CD45+CD3-群中B220+CD19+ 群，P<0.01)和浆细胞(B220+CD19+群中CD138+CD27-群，P<0.05)较非移植小鼠(即空白对照组)有显著增高。
异型肾脏移植导致小鼠ABMR后，B细胞(P<0.0001)和浆细胞(P<0. 0001)群落比例较同型移植小鼠显著提高。
每日他克莫司给药可显著降低异型肾脏移植排斥后B细胞(P<0.001)和浆细胞(P<0.001)群落比例；NL101单次注射则可显著降低ABMR所导致的B 细胞(P<0.0001)和浆细胞(P<0.0001)群落比例，并且较他克莫司给药组仍有显著下降(P<0.0001)(图1A，C)。
在外周血中，同型肾脏移植小鼠B细胞和浆细胞较非移植小鼠相比无显著差异。异型肾脏移植导致小鼠ABMR后，B细胞(P<0.0001)和浆细胞(P<0. 0001)群落比例较同型肾脏移植小鼠显著提高；每日他克莫司给药可显著降低异型肾脏移植排斥后B细胞(P<0.01)和浆细胞(P<0.01)群落比例；NL101单次注射处理则可显著降低ABMR所导致的B细胞(P<0.0001)和浆细胞(P< 0.0001)群落比例增高，并且较他克莫司给药组仍有显著下降(P<0.001)(图1 B，C)。
2、血清DSA水平检测结果
图2为对抗原致敏组(Blank)、同型肾脏移植组(简称为Iso)、异型肾脏移植导致急性ABMR组(ABMR)、ABMR+他克莫司处理组(ABMR+Tac)和 ABMR+NL101处理组(ABMR+NL101)小鼠的血清样本中IgG和IgM丰度流式细胞检测统计图，数据以IgG或IgM阳性细胞占所有细胞百分比代表(％of Parent，纵坐标)，其中，***P<0.001,**P<0.01,and*P<0.05 vs Blankgroup；###P<0.001,##P<0.01,and#P<0.05 vs Iso group；ΔΔΔP<0.001,ΔΔP<0.01,andΔP <0.05 vs ABMR group,□□P<0.01 and□P<0.05 vs ABMR+Tac group。
由图2可知，NL101显著降低ABMR反应中血清DSA水平。具体地，在致敏2周后，异型肾脏移植术后IgG(P<0.001)和IgM(P<0.001)则比同型肾脏移植小鼠水平显著增高；每日他克莫司给药可降低异种肾脏移植排斥所产生的 IgG和IgM；但经NL101单次处理的异型肾脏移植术后，IgG和IgM水平均显著降低，提示DSA丰度被NL101显著降低。
3、移植组织内皮C4d检测结果
对抗原致敏组(Blank)、同型肾脏移植组(简称为Iso)、异型肾脏移植导致急性ABMR组(ABMR)、ABMR+他克莫司处理组(ABMR+Tac)和 ABMR+NL101处理组(ABMR+NL101)小鼠肾脏组织冰冻切片中C4d(绿色) 免疫杂交显色图，细胞核(蓝)使用DAPI染色；图中白色圆圈标注出肾小球部位(Bar＝100μm，图中的横线表示其长度为100μm，为标尺)。
在致敏2周后，同型肾脏移植小鼠移植肾术后3天，肾组织中管周毛细血管内皮C4d(绿色)信号较弱，与缺血再灌损伤所导致的内皮损伤信号相关，属于非DSA性的补体激活，也符合流式细胞术结果中B细胞和浆细胞有所增加的结果；在异型肾脏移植小鼠移植肾术后3天肾组织中周毛细血管部、肾小球毛细血管内皮C4d信号显著增强；每日他克莫司给药较ABMR组可普遍降低C4d信号强度，但信号分布未见改变；NL101处理，可使C4d信号显著减少，说明补体激活被NL101显著降低。
4、移植物中炎症细胞数量检测结果
图4A为对抗原致敏组(Blank)小鼠的原位肾脏、同型肾脏移植组(简称为Iso)、异型肾脏移植导致急性ABMR组(ABMR)、ABMR+他克莫司处理(ABMR +Tac)和ABMR+NL101处理组(ABMR+NL101)小鼠的移植肾脏进行CD45+ 阳性细胞占所有细胞百分比的流式细胞术分析；图4B为CD45+阳性细胞占肾脏 (Blank组)或移植肾(其他组)总细胞百分比统计图，其中，***P<0.0001,and **P<0.01 vs Blank group,###P<0.001 and#P<0.05 vs Iso group,ΔΔΔP<0.001, andΔΔP<0.01 vs ABMR group。
流式细胞数据显示，在同型移植肾中CD45+细胞约占总细胞数的 7.98±0.95％，与缺血再灌损伤相关；在异型移植肾中CD45+细胞占总细胞数的百分比急剧增加至64.38±4.81％，体现出ABMR反应下炎症细胞的大量募集；每日他克莫司给药组，移植肾中CD45+细胞占总细胞数的百分比下调至28.47±6.88％ (P<0.001 vs ABMR组)，异型肾脏移植+NL101处理组，移植肾中CD45+细胞占总细胞数的百分比为18.22±2.13％，可显著降低移植肾中CD45+细胞占总细胞数的百分比(P<0.001)，说明NL101可减少移植物中炎症细胞募集；综上， NL101能够减少ABMR反应中浸润移植物炎症细胞数量。
5、移植物局部炎症因子水平和循环炎症因子水平检测结果
对抗原致敏组(Blank)、同型肾脏移植组(简称为Iso)、异型肾脏移植导致急性ABMR组(ABMR)、ABMR+他克莫司处理组(ABMR+Tac)和 ABMR+NL101处理组(ABMR+NL101)小鼠的血清中IL-6、IL-10、MCP-1、 IFN-γ、TNF和IL-12p70水平进行检测并统计，结果如图5(A)所示；对抗原致敏组(Blank)小鼠的原位肾脏和其他组移植肾组织上清中IL-6、IL-10、MCP-1、 IFN-γ、TNF和IL-12p70水平进行检测并统计，结果如图5(B)所示，其中， ****P<0.0001，***P<0.001,and*P<0.05 vs Iso group,####P<0.0001，###P< 0.001，##P<0.01 and#P<0.05 vs ABMR group,ΔΔΔP<0.001,ΔΔP<0.01 andΔP< 0.05 vs ABMR+Tac group。
图5(A)中，小鼠血清检测结果显示，同型肾脏移植小鼠血清中IL-12p70 水平较空白对照组有所增高，但两个值之间无显著差异，因此可将这些差异视为与缺血再灌损伤相关的损伤改变；在异型肾脏移植小鼠血清中IL-6、IL-10、 MCP-1、IFN-γ、TNF和IL-12p70水平较同型肾脏移植肾中均显著增高，他克莫司和NL101处理可显著下调各个炎症因子，其中NL101相较于他克莫司可对 IFN-γ进行进一步下调(P<0.05)。
图5(B)中，小鼠肾脏组织的检测结果显示，同型移植肾中MCP-1和TNF 水平均较空白组有所增高，但未达显著差异，因此可将这些差异视为与缺血再灌损伤相关的损伤改变；在异型移植肾中IFN-γ、IL-6、MCP-1水平较同型移植肾中显著增高，IL-10和IL-12水平较同型移植肾中显著降低；他克莫司和NL101 处理能够显著下调IFN-γ、IL-6、MCP-1水平，NL101可上调IL-10水平。综上， NL101能够减少ABMR反应中移植物局部炎症因子水平和循环炎症因子水平。
6、慢性ABMR各组死亡率结果
在慢性ABMR模型中，因小鼠原肾已被摘除，机体代谢均依仗移植肾功能，因此若产生肾脏排斥，小鼠则会由于尿毒症死亡。图6中结果显示，在Iso组中，所有小鼠均可顺利存活4周以上，而在Chronic ABMR组中，小鼠均产生了排斥反应，在1周内死亡率达到80％，在2周内已全部死亡；他克莫司处理后小鼠的排斥反应被较好抑制，在1周后小鼠开始发生死亡，并在11和23天后分别死亡 1只，在4周后有40％小鼠存活；在NL101处理组中，11天后有一只小鼠死亡，在4周后有60％小鼠存活。这说明，NL101给药能够显著降低Chronic ABMR所带来的不利影响。
本领域的技术人员应该明白，以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (4)

1.NL101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的NL101在制备治疗急性、慢性排斥反应药物中的应用，其特征在于，所述治疗急性、慢性排斥反应药物中至少含有NL101。
3.NL101在制备治疗急性、慢性ABMR药物中的应用。
4.NL101在制备治疗脾脏致敏诱导的急性肾移植抗体介导的排斥反应药物中的应用。
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