CN113684322A

CN113684322A - 一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法

Info

Publication number: CN113684322A
Application number: CN202111054793.1A
Authority: CN
Inventors: 陈孝欢; 程吕; 孙瑞强
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-09-09
Also published as: CN113684322B

Abstract

提供了一种生产抗体蛋白的方法：该方法包括以下步骤：a)接种细胞并在36‑37℃培养，控制初始pH在7.00±0.20范围的第一pH；b)在细胞生长到指数期中后期后，开始降低培养温度至30‑32℃，在降温日同时添加HCl使pH下降，至范围在6.7‑6.90的第二pH，所述第一pH大于第二pH，维持该pH直到收获细胞，并在pH稳定后，加入CO₂气体达到第一CO₂分压为50‑80mmHg；c)在细胞生长达到平台期后，维持pH并提高CO₂气体至第二分压为80‑110mmHg，所述第二分压高于第一分压；和d)收获细胞并收集抗体蛋白产物CO₂。还提供了控制抗体蛋白生产中的糖基化水平的方法。

Description

一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法

(1)技术领域

本发明属于生物制药领域，特别是哺乳动物细胞批次补料培养技术领域，涉及抗体类蛋白N-糖基化修饰的调节方法。

(2)背景技术

糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，起始于内质网，结束于高尔基体。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质，帮助蛋白质折叠功能作用。

在生物制药领域，抗体类药物被广泛应用于疾病治疗，高聚甘露糖型是抗体 N-糖基化修饰中一种常见的非成熟化糖型，CHO细胞表达抗体的高聚甘露糖型主要是Man 5(五聚甘露糖型)，高比例的Man 5使抗体在人体中的清除效率增加，从而影响抗体类药物的药物代谢动力学和药效动力学参数，因此Man 5水平常是抗体类药物的一个重要质量参数，降低Man 5水平往往是新药或生物类似药开发过程中追求的目标。

影响抗体高聚甘露糖型水平的因素主要有两方面，一是细胞株本身的翻译后修饰能力，二是细胞培养工艺条件。目前，在细胞培养工艺方面可有效提高高聚甘露糖型水平的方法有：一、添加α-甘露糖苷酶I/II抑制剂，如几夫碱，1-脱氧甘露伊酶素，甘露抑素A；二、添加塔格糖或棉子糖降低糖基化修饰过程中的 UDP-GlcNac底物水平；三、添加高尔基体pH中和剂莫能霉素。相反，现有的有效降低高聚甘露糖型水平的方法有限，经文献报道的方法有每日添加锂或单次添加一定量的MnCl₂；然而，另有文献证明添加锰离子可提高Man 5水平，而在实际应用过程中，金属离子添加物对甘露糖基化修饰水平的影响无明显规律，同时，由于在生产过程中引入非常规添加物，最终的抗体药物产品中是否有该物质的残留，残留浓度检测，其残留浓度是否安全都是本领域技术人员未知的，有待探究与验证，这对于抗体类药物生产和质量监控造成了风险。

在已披露的文献中，有学者提出培养工艺中的pH条件能影响Man 5的水平，但无明确的pH控制策略。有些学者专注在对高Man5产生的原因的研究，即高pH 条件下，细胞代谢副产物NH4⁺水平提高，导致高尔基体pH提高，抑制糖基化成熟的修饰过程，从而使Man5水平增高，但没有说明能通过降低pH降低NH4⁺从而使 Man5水平降低；而事实上，细胞代谢副产物NH4⁺浓度受众多因素影响，目前在细胞培养工艺界没有有效降低NH4⁺水平的控制方法。也有学者整体研究了pH对Man5 修饰水平的全局影响，有文献报道高pH组(7.10)相对于低pH组(6.80)，Man5 水平更低；另外也有文献报道，在6.8-7.8pH范围内，pH对Man5的影响因细胞系的不同而不同。总的来说，依据已有文献的报道，可以明确细胞培养过程中的 pH条件对产物蛋白的Man5修饰水平有影响，但具体到如何影响，采用何种方式以及将pH控制到什么水平可以对Man5进行有效调控并不明确。

(3)发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种有效在生产过程中降低抗体类药物中 Man5的手段。

为了解决以上技术问题，在本发明的一个方面提供了一种生产抗体蛋白的方法：该方法包括以下步骤：

a)接种细胞并在36-37℃，优选36.5℃培养，控制第一pH在7.00±0.20范围的第一pH；

b)在细胞生长到指数期中后期，优选达到20×10⁶/ml的培养密度后，开始降低培养温度至30-32℃，优选31℃，在降温日同时添加HCl使pH下降，至范围在 6.7-6.90的第二pH，所述第一pH大于第二pH，维持该pH直到收获细胞，并在pH 稳定后，加入CO₂气体达到第一CO₂分压为50-80mmHg；

c)在细胞生长达到平台期后，维持pH并提高CO₂气体至第二分压为 80-110mmHg，所述第二分压高于第一分压；和

d)收获细胞并收集抗体蛋白产物CO₂。

在该方面的一个优选方式中，步骤b)在降温日后到细胞生长平台期的天数为降温日后3-7天，优选5天。

在该方面的另一个优选方式中，其中在平台期后提高CO₂气体分压，继续培养2-4天，然后收获细胞CO₂。

在该方面的另一个优选方式中，其中所述培养在Actipro培养基中进行的。

在该方面的还有一个优选方式中，还包括在接种前使用Actipro培养基培养。

在该方面的还有另一个方面中，还包括在培养过程中补充CB7a/b培养基，每次优选补充为3％培养液重量，优选在培养的第3、5、7、10天进行补充。

在本发明的另一个方面，提供了一种控制抗体蛋白生产中的糖基化水平的方法，包括以下步骤：

d)收获细胞并收集抗体蛋白产物CO₂。

在该方面的还有一个优选方式中，还包括在接种前使用Actirpo培养基培养。

在本发明的一个具体实施方式中，所述糖基化水平的改变选自高聚甘露糖型的减少，岩藻糖水平减少，去岩藻糖基化，半乳糖基水平减少。

在本发明的一个优选实施方式中，所述高聚甘露糖型是五聚甘露糖。

优选的，在本发明的实施方式中，使用1N HCl控制pH。

优选的，本发明的实施方式中在第14天收集细胞并提取抗体蛋白。

本发明的抗体蛋白生产方法和调节糖基化水平的方法的优点是：有效降低目标蛋白高聚甘露糖基化水平的工艺，其能够有效降低抗体类蛋白的Man 5水平；适用于不同工艺背景条件的抗体蛋白发酵工艺，具有工艺稳健性，包括生长代谢稳定，无不可控的乳酸代谢问题产生，蛋白产量不受明显影响；且在该工艺中不带有其它杂质，避免造成额外的杂质增加，影响蛋白性质以及增加额外的评估工作。

各种实施方式的其它特征和优势将在下面的说明书中进行部分阐述，并且部分地根据说明书其将是显而易见的，或者可以通过各种实施方式的实践得到了解。各种实施方式的目标和其它优势将通过特别是在说明书和所附权利要求书中所指出的要素及组合得以实现和达到。

除非另外指出，本发明采用的试剂、细胞、以及仪器装置都是普通的市售和公众可得的。

(4)附图说明

图1-图4显示Actipro中的活细胞密度、乳酸代谢、在线pH和pCO₂随时间变化曲线工艺对比图。

图5-图6显示了不同工艺的蛋白产量和Man5比例CO₂。

(5)具体实施方式

现在将详细地参考本发明的一些实施方式，其中的实例在附图中被阐述。尽管本发明结合图解的实施方式进行描述，但是应当理解，它们并非意图使本发明限于那些实施方式。相反，本发明意图覆盖可以被所附权利要求书限定的本发明包括在内所有替换、修改和等价物。

本发明的核心技术方案是在培养过程中联合使用1N HCl溶液和CO₂气体，对培养液的pH和pCO₂两个关键工艺参数进行调控。其中HCl负责降温后发酵液pH 的降低。pH控制的具体设置如下：接种日至降温日的第一pH目标值为7.00，死区范围为±0.20，该段时间内的pH由CO₂气体进行控制；降温日后，改用HCl控制pH使其下降至第二pH至目标值为6.80，死区范围为±0.10，维持至收获日。在pH改用HCl控制后，CO₂气体则负责在第5-9天将pCO₂水平提高到50-80mmHg，在第10天至收获日进一步提高pCO₂水平至80-110mmHg其中第一pCO₂＜第二 pCO₂。

以一批批次补料培养的工艺控制方法为例，表1对比了本发明的联合控制策略与常规控制策略的技术方案差异：

CO₂气体可快速跨越生物膜从而酸化细胞内部环境，当使用CO₂控制低pH时，大量加入的CO₂能使细胞质快速酸化，同时细胞质中的细胞器则处于比正常pH控制条件下更低的pH环境，这一作用有利也有弊，有利的一面是，高尔基体在低pH 环境下能更有效的进行翻译后修饰，从而使目标蛋白的Man5的比例大大降低；弊端则是，线粒体作为细胞进行有氧代谢的关键场所，受低pH环境的影响后，活性大大降低，最终表现为代谢产物乳酸持续累积，这一弊端直接导致使用CO₂气体控制低pH来降低Man5的方法无法被广泛使用。

HCl分子作为离子型溶液具有不可直接跨膜的特性，当使用HCl控制极低pH 时，细胞内环境不会被快速酸化，线粒体活性得到最大程度的保护，从而避免细胞产生代谢异常的问题；同时，由于外部环境被酸化，细胞对自身环境进行缓慢调节后,目的蛋白的Man5水平也能得到一定程度的降低。本发明的联合控制策略首次出乎意料地联合使用CO₂和HCl对细胞培养环境进行精准控制，从理论出发，通过对CO₂的使用浓度和HCl控制下的pH水平进行优化，意外地获得了卓越的糖基化控制和有效的减少乳酸累积的理想效果。

本发明中可根据常规方法计算和调节HCl，以实现对pH水平的监控。

1.HCl的控制方法：

例如，当使用HCl控制低pH时，在降温日，先将pH控制关闭，更改pH设定点为低于降温日前第一pH的第二pH值，例如6.80±0.10，pH上限的关联控制工具切换为安装了1N HCl通道的进料泵。

在细胞密度达到指数期中后期，即细胞密度达到例如至少20×10⁶/ml后，降低培养温度至30-32℃，优选31℃。降低温度的当日被称作降温日，可以是例如培养开始后第4天，第5天或以后的天数。该HCl的控制可使用发酵生产工艺中所市售的任何进料系统和pH监控装置来控制和实现。

2.CO₂的控制方法：

本发明人根据市售的不同CO₂控制系统提供了不同的控制方法，如下：

2.1在具有pCO₂控制能力的控制器中，使用Metteler pCO₂电极，将CO₂ MFC 与pCO₂控制模块关联，pCO₂的设定点设为目标值，例如70mmHg；每日取样测pCO₂，若离线pCO₂与目标pCO₂值之间的差异大于5mmHg，对在线pCO₂值进行过程校准。

2.2在无pCO₂控制模块，但具有气体关联控制能力的控制器中，使用与O₂关联底通CO₂的方式控制pCO₂，CO₂流速依据公式一：(pCO₂目标值)/760＝(CO₂流速)/(O₂流速)进行连续控制，每日取样测pCO₂，依据离线pCO₂与目标pCO₂值之间的差异大小，对流速系数进行微调。例如当我们在Ambr 250反应器中需要控制70mmHg pCO₂的目标值时，则需要设置控制程序，根据公式1：

CO₂流速＝0.092*(O₂流速)；

若离线pCO₂值为69.5mmHg，则无需调整系数，若离线pCO₂值为80mmHg,则可将0.092降低为0.088，4小时后再取样测离线pCO₂值，直至离线pCO₂与在线 pCO₂值差值不超过5mmHg，即可停止对系数的调整。

2.3在无法进行关联设置的控制器中，采用手动控制的方法，具体操作如下

第一步：依据以上公式1直接计算CO₂流速，例如在一个3L反应器中，第5 天需要控制70mmHg pCO₂，此时O₂ flow为0.3L/min，那么设定CO₂流速为0.028 L/min。

第二步：每日取样测pCO₂，依据离线pCO₂与目标pCO₂值之间的差异大小，对CO₂流速进行微调,调节标准如2.2所述。

综上所述，本发明人提供了可实施本发明方法的各种生物控制器，其应具备 pH、pCO₂或气体流速控制能力的生物控制器中实施，见表2。市售的实验使用的控制器类型、相应的控制能力和对应控制能力下的控制方法：

表2市售的生物控制器及其控制能力

本发明中的抗体蛋白可以是IgG1,IgG2,IgG3,IgG4以及具有IgG Fc端结构的融合蛋白，优选IgG1和具有IgG1 Fc端结构的融合蛋白。

本发明中的培养方式包括但不限于批次补料流加培养。

本发明中使用的基础培养基包括但不限于CD CHO、Actipro、Dynamis,优选为Actipro。

本发明利用了在指数期的中后期降温培养并降低pH，保持培养液细胞外部的酸化环境，使得细胞对自身环境进行缓慢调节，最大程度保护线粒体活性而使得细胞内环境不会快速酸化，在细胞培养的阶段能够实现最大程度的蛋白生产和稳定的 Man 5水平降低；并在细胞生长达到平台期(即细胞数量进入稳定阶段后)后，提高 CO₂气体分压继续培养细胞2-4天，此时细胞内部环境酸化，高尔基体在低pH环境下能更有效的进行翻译后修饰，从而使目标蛋白的Man5的比例大大降低。

现在已经概括地描述了本发明，通过参考下述实施例的下述内容，可以更容易地理解本发明，这些实施例通过例证的方式提供并且并非意图限定本发明，除非明确指出。

实施例

1.设备和试剂：

1.1设备信息

1.2试剂信息

材料	缩写	厂商	货号
				CD CHO<sup>TM</sup> AGT<sup>TM</sup>	CD CHO	Gibco	12490003
Dynamis<sup>TM</sup> AGT<sup>TM</sup>培养基	Dynamis	Gibco	A26175
				Cell Boost<sup>TM</sup> 7a	CB7a	HyClone<sup>TM</sup>	SH31026.04
Cell Boost<sup>TM</sup> 7b	CB7b	HyClone<sup>TM</sup>	SH31027.02CN
				ActiPro<sup>TM</sup>	Actipro	HyClone<sup>TM</sup>	SH31037.01
L-谷氨酰胺	Gln	JTBaker	2078-06
				无水葡萄糖	Glucose	JT Baker	1919-09
HT添加剂	HT	Gibco	11067030
				杀稻瘟菌素S HCl	BS	Gibco	A11139
博来霉素筛选抗生素	Zeocin	Invitrogen	R25001
				碳酸氢钠	NaHCO3	Merck	1.37013.2500
盐酸,6.0N溶液	HCl	JTBaker	0327-02
				碳酸氢钠	NaHCO3	Merck	1.37013.2500
碳酸钠	Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>	Merck	1.06398.5000
				Poloxamer 188	NA	Merck	1.37065.1000
消泡剂	Antifoam	HyClone<sup>TM</sup>	SH30897.01

2.实验方法：

2.1细胞的培养和抗体蛋白的收获：

1)联合控制培养：在Actipro培养基中使用批次补料流加培养方式培养 CHO-K1细胞，该细胞表达抗体Fc端融合蛋白。细胞以0.4×10⁶细胞/mL的接种密度在第0日接种于3L反应器后，在36.5℃下培养，将其pH维持在7.00±0.20。在培养第5天，将培养液的温度降到31.0℃，CO₂在系统中通过加入1N HCl调节 pH逐步下降，在第5天至收获日将pH维持在6.80±0.10范围内。在降温日后，即培养的第5-9天，打开CO₂通路，使用送气装置使得CO₂气体的分压水平达到 50-80mmHg，然后在第10日开始进一步提高CO₂分压至80-110mmHg，直到收获细胞。

2)单一CO₂培养：

在Actipro培养基中使用批次补料流加培养方式CHO-K1细胞，该细胞表达抗体Fc端融合蛋白。细胞以0.4×10⁶细胞/mL的接种密度在第0日接种于3L反应器后，在36.5℃下培养，将其pH维持在7.00±0.20。在第5天，将培养液的温度降到31.0℃,同时继续使用CO₂通路将pH控制在6.80±0.10范围内。

3)单一HCl培养：

在Actipro培养基中使用批次补料流加培养方式CHO-K1细胞，该细胞表达抗体Fc端融合蛋白。细胞以0.4×10⁶细胞/mL的接种密度在第0日接种于3L反应器后，在36.5℃下培养，将其pH维持在7.00±0.20。在第5天，将培养液的温度降到31.0℃,同时关闭CO₂通路，在系统中通过加入1N HCl调节pH逐步下降，在第5-12天将pH维持在6.80±0.10范围内。在培养第12天至收获日的pH维持在6.65±0.05范围内。

4)常规培养：

在Actipro培养基中使用批次补料流加培养方式CHO-K1细胞，该细胞表达抗体Fc端融合蛋白。细胞以0.4×10⁶cells/mL的接种密度在第0日接种于3L反应器后，在36.5℃下培养，将其pH维持在7.00±0.20。在第5天，将培养液的温度降到31.0℃。

2.2检测方法：

1)活细胞密度的检测：

在培养期间，使用Beckman Vi-Cell细胞计数仪XR每天定时监控活细胞密度。

2)乳酸浓度的检测：

在培养期间，用CedexBio HT自动化多功能生物化学分析仪根据厂商说明检测发酵液样本中的乳酸浓度。

3)pCO₂的检测：

在培养期间，用

348(Siemens)的血液气体分析仪根据厂商说明检测发酵罐中的二氧化碳分压。

4)蛋白表达量：

在培养终点，用CedexBio HT自动化多功能生物化学分析仪根据厂商说明检测发酵液样本中的蛋白质浓度。

5)糖基化分析：

使用HILIC方法(亲水作用液相色谱，ACQUITY UPLC BEH酰胺1.7μm 2.1×150 mm)对培养终点的蛋白质样品进行糖型比例分析。

3.结果和讨论：

3.1图1-图4显示了基础培养基Actipro中的活细胞密度、乳酸代谢、pH(图 3)和pCO₂随时间变化曲线工艺对比图。蛋白产量和Man5的水平的工艺对比见表3

表3 Actipro中蛋白产量和Man5％水平的工艺对比

与常规工艺相比，单一CO₂控制下的低pH工艺从第8天开始至收获结束，乳酸持续累积，无减缓迹象，蛋白产量基本相当，Man5水平大幅降低；单一HCl控制下的低pH工艺与单一CO₂控制下的低pH工艺相比，乳酸代谢得到极大改善，基本与常规工艺表现一致，Man5水平随pH控制水平的降低而降低，但是降低幅度与常规工艺相比没有实质性改善；联控工艺条件下，如图2所示，乳酸代谢基本上自始至终都保持在极低的水平，这对于产物的品控水平有极大意义，且Man5水平在单一HCl工艺基础上有进一步降低，且降幅能与单一CO₂控制下的低pH工艺相当。

联合控制策略能够对于抗体蛋白产品带来良好的稳定性，可在发酵过程中作为一种全新而不会带入杂质的有效控制副产品产生和提高产品稳定性的策略。

对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，对本文描述的各种实施方式可以进行各种更改和改变，而不背离本文教导的精神或范围。因而，拟使各种实施方式将各种实施方式的其它更改和改变覆盖在本教导的范围之内。

Claims

1.一种生产抗体蛋白的方法：该方法包括以下步骤：

a)接种细胞并在36-37℃，优选36.5℃培养，控制初始pH在7.00±0.20范围的第一pH；

b)在细胞生长到指数期中后期后，开始降低培养温度至30-32℃，优选31℃，在降温日同时添加HCl使pH下降，至范围在6.7-6.90的第二pH，所述第一pH大于第二pH，维持该pH直到收获细胞，并在pH稳定后，加入CO₂气体达到第一CO₂分压为50-80mmHg；

c)在细胞生长达到平台期后，维持pH并提高CO₂气体至第二分压为80-110mmHg，所述第二分压高于第一分压；和

d)收获细胞并收集抗体蛋白产物CO₂。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)在降温日后到细胞生长平台期的天数为降温日后3-7天，优选5天。

3.如权利要求1所述的方法，其中在平台期后提高CO₂气体分压，继续2-4天，然后收获细胞CO₂。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述培养在Actipro培养基中进行。

5.如权利要求1所述的方法，其中还包括在接种前使用Actipro培养基培养。

6.如权利要求1所述的方法，其中还包括在培养过程中补充CB7a/b培养基。

7.一种控制抗体蛋白生产中的糖基化水平的方法，包括以下步骤：

b)在细胞生长到指数期后，降低培养温度至30-32℃，优选31℃，在降温日同时添加HCl使pH下降，至范围在6.7-6.90的第二pH，所述第一pH大于第二pH，在pH稳定后，加入第一分压为50-80mmHg的CO₂气体；

c)在细胞生长达到平台期后，维持pH并提高CO₂气体分压至80-110mmHg的第二分压，所述第二分压高于第一分压；和

d)收获细胞并收集抗体蛋白产物。

8.如权利要求7所述的方法，其中步骤b)在降温日后到细胞生长平台期的天数为降温日后3-7天，优选5天。

9.如权利要求7所述的方法，其中在平台期后提高CO₂气体分压，继续2-4天，然后收获细胞。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述培养在Actipro培养基中进行。

11.如权利要求7所述的方法，其中还包括在接种前使用Actipro培养基培养。

12.如权利要求7所述的方法，其中所述糖基化水平的改变选自高聚甘露糖型的减少，岩藻糖水平减少，去岩藻糖基化，半乳糖基水平减少，优选所述高聚甘露糖型是五聚甘露糖。

13.如权利要求1或7所述的方法，其中添加的HCl的浓度为1N。

14.如权利要求1或7所述的方法，其中在第14天收获细胞并提取抗体蛋白。

15.如权利要求1或7所述的方法，所述抗体蛋白选自是IgG1,IgG2,IgG3,IgG4以及具有IgG Fc端结构的融合蛋白，优选IgG1和具有IgG1 Fc端结构的融合蛋白。

16.如权利要求7所述的方法，其中还包括在培养过程中补充CB7a/b培养基。