CN113661985A - 舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用，属于公共卫生及养殖环境应用技术领域。舍曲林能够能够抑制金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌毒力基因的表达，舍曲林与苯扎氯铵联用能够减少苯扎氯铵的用量，降低金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌对苯扎氯铵的耐药性，有效防止环境金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的污染。经过验证，舍曲林添加量为4～32μg/ml，苯扎氯铵的MIC值降低了约1/2。
Description
技术领域
本发明涉及公共卫生及养殖应用技术领域，尤其涉及舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用。
背景技术
苯扎氯铵(Benzalkonium chloride)，是季铵基类的阳离子表面活性剂，属非氧化性杀菌剂，具有广谱、高效的杀菌能力，能改变细菌胞浆膜通透性，使菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而起杀灭作用，对革兰阳性细菌作用较强。但是经常使用含有苯扎氯铵的抗菌产品，容易导致革兰氏阳性细菌对其产生耐药性。
发明内容
本发明的目的在于提供舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用，舍曲林和苯扎氯铵联用能够减少环境中苯扎氯铵的用量，降低致病菌对苯扎氯铵的耐药性同时减少苯扎氯铵对环境的污染。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用。
本发明还提供了舍曲林和苯扎氯铵在制备降低致病菌毒力基因表达的制剂中的应用。
优选的，所述致病菌包括革兰氏阳性菌。
优选的，所述革兰氏阳性菌包括食源性革兰氏阳性菌。
优选的，所述食源性革兰氏阳性菌包括食源性金黄色葡萄球菌和/或食源性单核细胞增生李斯特菌。
优选的，当所述致病菌为食源性金黄色葡萄球菌时，所述毒力基因包括hal、pyk和RNAIII基因中的一种或几种；当所述致病菌为食源性单核细胞增生李斯特菌时，所述毒力基因优选的包括hag、argA、degU、luxS、prfA、ztcA、flaA、sigB、itrC、sufS和sufU中的一种或几种。
优选的，所述制剂中舍曲林的浓度为4～32μg/mL；所述制剂中苯扎氯铵的浓度为300～500μg/mL。
优选的，所述制剂中舍曲林的浓度为8～16μg/mL；所述制剂中苯扎氯铵的浓度为400μg/mL。
优选的，所述制剂包括消毒剂、药物或饲料添加剂。
优选的，所述消毒剂包括环境消毒剂。
本发明提供了舍舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用。舍曲林能够能够抑制金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌毒力基因的表达，舍曲林与苯扎氯铵联用能够减少苯扎氯铵的用量，，降低金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌对苯扎氯铵的耐药性，有效防止环境金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的污染。经过验证，舍曲林添加量为4～32μg/ml，苯扎氯铵的MIC值降低了约1/2。
附图说明
图1为舍曲林对USA300的杀菌曲线；
图2为舍曲林对Newman的杀菌曲线；
图3为舍曲林对金黄色葡萄球菌的毒力基因表达的影响；
图4为苯扎氯铵和舍曲林联合抑菌效果；
图5不同舍曲林浓度下联用苯扎氯铵(400μg/mL)LM001的生长曲线；
图6不同舍曲林浓度下联用苯扎氯铵(400μg/mL)LM11915的生长曲线；
图7不同舍曲林浓度下联用苯扎氯铵(400μg/mL)对单核细胞增生李斯特菌毒力基因表达的影响。
具体实施方式
本发明提供了舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用。
在本发明中，所述舍曲林来源于常规市售，在本发明具体实施过程中，所述舍曲林购自于舍曲林购自上海麦克林公司。在本发明中，所述苯扎氯铵来源于常规市售，在本发明具体实施过程中，所述苯扎氯铵购自于Sigma-Aldrich公司。
在本发明中，所述致病菌优选的包括革兰氏阳性菌；所述革兰氏阳性菌优选的包括食源性革兰氏阳性菌；所述食源性革兰氏阳性菌优选的包括食源性金黄色葡萄球菌和/或食源性单核细胞增生李斯特菌。
本发明还提供了舍曲林和苯扎氯铵在制备降低致病菌毒力基因表达的制剂中的应用。
当所述致病菌为食源性金黄色葡萄球菌时，所述毒力基因包括hal、pyk和RNAIII基因中的一种或几种。当所述致病菌为食源性单核细胞增生李斯特菌时，所述毒力基因优选的包括hag、argA、degU、luxS、prfA、ztcA、flaA、sigB、itrC、sufS和sufU中的一种或几种。
在本发明中，所述制剂中舍曲林的浓度优选为4～32μg/mL，更优选为8～16μg/mL；所述制剂中苯扎氯铵的浓度优选为300～500μg/mL，更优选为400μg/mL。
在本发明中，所述制剂优选的包括消毒剂、药物或饲料添加剂；所述消毒剂优选的包括环境消毒剂。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、MIC实验方案
采用96孔滴定板中的微量培养基稀释法。将金黄色葡萄球(ATCC25923)菌菌悬液浓度调整到106CFU/ml，用双倍浓度梯度稀释SR，最终得到：128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。在96孔板的每孔中分别加入不同浓度的SR 100μl和菌悬液100μl。空白对照和阳性对照分别为MH菌液(水解酪蛋白培养基)和菌悬液。96孔板37℃培养过夜。MIC是抑制微生物可见生长所需的最低SR浓度。实验重复三次测定结果参见表1。
表1舍曲林对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果
从表1可以看出，舍曲林对金黄色葡萄球菌的MIC值是一致的，其对金黄色葡萄球菌不存在耐药性。
2、生长曲线实验方案
过夜培养金黄色葡萄球菌使其生长到OD600nm＝0.2。在96孔微滴定板的每孔中分别加入不同浓度的舍曲林溶液(SR)100μl和菌悬液100μl，使每孔中SR的最终浓度依次为1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC。分别以MH肉汤和细菌肉汤作为空白对照和阳性对照。置于37℃培养箱中培养，用微孔板分析仪每隔1h读取OD600nm值，监测不同舍曲林浓度对金黄色葡萄球菌生长的影响，测定结果参照图1和图2，其中图1为舍曲林对USA300的杀菌曲线，图2为舍曲林对Newman的杀菌曲线。
从图1和图2可以看出，随着舍曲林用量的增加USA300和Newman两株菌的活性也逐渐减弱，到MIC值时停止生长。
3、通过实时荧光PCR研究舍曲林对金黄色葡萄球菌的毒力基因表达的影响，测定结果参见图3。从图3可以看出，在舍曲林用量为1/2MIC值时能够大幅度抑制金黄色葡萄球菌的hal、pyk和RNAIII基因的表达。
实施例2
将分离自养殖场的5株S.aureus菌株(金1～金5菌株)(参见【谢胜海.舍曲林对金黄色葡萄球菌多重耐药逆转以及毒力抑制作用的研究[D].华南理工大学,2019。注：文献中名称为：J01～J05】，将金黄色葡萄球菌菌悬液浓度调整到106CFU/ml，在96孔板第2列加入100μl舍曲林，3-12列加入50μl MH肉汤，2-12列进行双倍浓度梯度稀释。在另一96孔板第A行加入100μl抗生素溶液，其余各孔加入50μl肉汤，A-G行进行双倍浓度梯度稀释。将两个96孔板中物质混合。除(1，H)外，在96孔板的每孔中分别加入不同浓度菌悬液100μl。第1列为SR单药对照，第12行为抗生素单药对照。96孔板37℃培养过夜。实验重复三次。试验结果参见表2和图4。结果表明在舍曲林添加量为8μg/ml，苯扎氯铵的MIC值降低了大约1/2，联合使用可有效降低苯扎氯铵的用量，降低环境菌株对苯扎氯铵的耐药性，能够有效防止环境微生物的污染。
表2苯扎氯铵与舍曲林进行联合抑菌试验结果
由此可知，舍曲林不仅具有抑菌效果，能够抑制毒力的表达，并且是一种理想的联合抑菌药物，能够减少消毒剂的用量，降低金黄色葡萄球菌对消毒剂的耐药性，减少微生物对环境的污染。
实施例3舍曲林/苯扎氯铵联合对单核细胞增生李斯特菌的棋盘法联合抑菌
1.研究不同浓度舍曲林对多重耐药(含苯扎氯铵)单核细胞增生李斯特菌标准菌株和LM78号(分离自市售生猪肉样品，为河北疾控中心馈赠作为科研用途保藏株，参见【Lili,Olsen,Heidemann R,et al.Characterization ofa plasmid carrying cat,ermBand tetS genes in a foodborne Listeria monocytogenes strain and uptake of theplasmid by cariogenic Streptococcus mutans.】)的MIC和MBC。具体步骤是：调整菌浓度为106CFU/mL，向96孔板第1列加入128ul/mL舍曲林溶液，向2～10列依次二倍稀释。向各孔中添加等量的菌悬液。11列为MH肉汤的空白对照，12列为阳性对照。37℃过夜培养，测定OD600值。
结果如表3显示，舍曲林对2株LM的MIC和MBC为定值。说明舍曲林对多重耐药型单核细胞增生李斯特菌具有削弱其耐药活性的作用，与菌株耐药程度和菌株基因型无关。
表3舍曲林的MIC和MBC
2.时间-杀菌曲线结果分析
通过时间-杀菌曲线测定不同浓度的舍曲林对多重耐药李斯特菌001的杀菌效果。如图5所示，杀菌曲线表明，相比于空白对照组、4μg/mL和32μg/mL舍曲林组，32μg/mL舍曲林组的CFU降低约6个对数值log。所以32μg/mL舍曲林对LM001具有耐药型消除作用。
通过时间-杀菌曲线测定不同浓度的舍曲林对多重耐药李斯特菌11915的杀菌效果。如图6所示，杀菌曲线表明，相比于空白对照组、4μg/mL，8μg/mL舍曲林组和16μg/mL舍曲林组的CFU分别降低约2和6个对数值log。因此，16μg/mL和32μg/mL舍曲林对LM11915具有耐药消除作用。
此外，经过不同浓度的舍曲林与400μg/mL苯扎氯胺共同处理单核细胞增生李斯特菌后，依次对菌悬液进行RNA提取、CDNA制备、实时荧光定量PCR，结果如图7所示，与未经舍曲林处理的空白对照相比，较低浓度的舍曲林与苯扎氯胺联用即可显著降低单核细胞增生李斯特菌毒力基因的表达量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.舍曲林和苯扎氯铵在制备抑制和/或杀灭致病菌的制剂中的应用。
2.舍曲林和苯扎氯铵在制备降低致病菌毒力基因表达的制剂中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述致病菌包括革兰氏阳性菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括食源性革兰氏阳性菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食源性革兰氏阳性菌包括食源性金黄色葡萄球菌和/或食源性单核细胞增生李斯特菌。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当所述致病菌为食源性金黄色葡萄球菌时，所述毒力基因包括hal、pyk和RNAIII基因中的一种或几种；当所述致病菌为食源性单核细胞增生李斯特菌时，所述毒力基因优选的包括hag、argA、degU、luxS、prfA、ztcA、flaA、sigB、itrC、sufS和sufU中的一种或几种。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的应用，其特征在于，所述制剂中舍曲林的浓度为4～32μg/mL；所述制剂中苯扎氯铵的浓度为300～500μg/mL。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制剂中舍曲林的浓度为8～16μg/mL；所述制剂中苯扎氯铵的浓度为400μg/mL。
9.根据权利要求1～6任意一项所述的应用，其特征在于，所述制剂包括消毒剂、药物或饲料添加剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述消毒剂包括环境消毒剂。
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2021
- 2021-09-30 CN CN202111156873.8A patent/CN113661985A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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|---|
| 孟赫诚 等: "舍曲林对金黄色葡萄球菌多重耐药性的逆转作用", 《华南理工大学学报(自然科学版)》 * |
| 徐雅梦 等: "MdrL外排泵在单核细胞增生李斯特菌对苯扎氯铵耐受中的作用", 《微生物学通报》 * |
| 徐雅梦: "MdrL外排泵介导Listeria monocytogenes对苯扎氯铵的耐受机制", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）工程科技辑》 * |
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