CN113658637B - 土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，旨在解决现有技术中无法种属水平上识别或回答秸秆碳同化的关键微生物类群及其在秸秆腐解中的演替规律的技术问题。本发明基于稳定同位素探针技术，以分离出的13C标记的微生物DNA为基础，选取各OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平统计分析群落组成，再进行玉米秸秆碳同化细菌群落的α‑/β‑多样性、共现性网络分析，以识别鉴定出秸秆碳同化关键微生物类群及其群落演替规律，进而揭示目标土壤中秸秆分解的微生物学机制，据此可进一步研发出有针对性的高效玉米秸秆腐熟剂，以促进秸秆的快速腐熟分解，进而起到改良土壤、节肥增效的目的。
Description
技术领域
本发明涉及微生物鉴定识别技术领域，具体涉及一种土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法。
背景技术
秸秆还田是养分资源高效利用的重要途径，是农田可持续发展的重要保证。我国每年生产的秸秆约9亿吨，养分含量相当于全国化肥养分总量的25%（刘晓永和李书田，2017）。秸秆还田在提高土壤肥力、改善土壤结构、丰富土壤微生物多样性等方面发挥着重要作用。
第二次土壤普查以来，河南省pH值为6.5～7.5的土壤面积下降1.8%，但pH值小于6.5和5.5的土壤则增长2.51%和1.29%，黄褐土是黄淮海粮食主产区的典型土壤类型之一，占地约380万hm2，pH值小于5.5的占地面积达7.08万hm2（刘灿华等，2020），黄褐土土壤黏粒和粉砂较多，保肥性较强，但土壤易板结，缓冲性能较弱（姚丽娟等，2009），秸秆还田是实现其地力提升与养分高效利用的重要举措。
微生物是秸秆腐解和养分转化的参与者，然而当下多数研究方法仅阐明了秸秆还田条件下的土壤微生物多样性分异特征，并将秸秆腐解的“劳动者”和秸秆养分同化的“消费者”混淆为秸秆腐解微生物，并未真区别或阐明秸秆碳同化的微生物类群。近年来，利用磷脂脂肪酸分析、新一代高通量测序等分子生物学技术，科学家描述性地阐明了秸秆还田条件下的土壤微生物群落组成和结构多样性分异特征（Chen et al., 2017; Yuan et al., 2013; Zhao et al., 2016），但是其仍不能从种属水平上识别或回答秸秆碳同化的关键微生物类群及其在秸秆腐解中呈现的演替规律这一核心问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，以解决现有技术中无法种属水平上识别或回答秸秆碳同化的关键微生物类群及其在秸秆腐解中的演替规律的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
设计一种土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，包括如下步骤：
（1）在小麦收获季采集经秸秆还田处理的原状耕层土壤，去除植物残体，过筛混匀后于0～4℃下保存，为待测土壤，备用；
（2）取13C标记玉米秸秆与待测土壤混合后于24～26℃黑暗条件下进行好气培养，培养期间的土壤含水量调节为田间持水量的50～70%；同时设置无秸秆及未标记的12C玉米秸秆为对照；
（3）在好气培养期间每间隔一定时期采集试验及对照的土壤样品，分别提取其DNA后进行超高速等密度梯度离心，分离纯化后进行细菌16S rRNA基因定量PCR，确定秸秆碳源核酸13C-DNA所在密度层，以该DNA为对象，进行16S rRNA基因高通量测序；
（4）对原始序列进行序列拼接及数据去杂；
（5）对优化后序列按照95～98%的相似性水平对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；采用RDP classifier贝叶斯算法选取各OTU代表序列，比对SILVA 数据库进行分类学分析，在各个水平统计每个样品的群落组成，并进行玉米秸秆碳同化细菌群落的α-/β-多样性分析、共现性网络分析。
在所述步骤（5）中，利用所有序列测算α多样性，包括丰富度实际观测值、Shannon多样性指数、物种丰富度Chao1指数、物种丰富度ACE指数、谱系多样性和Good’s物种覆盖度。
在所述步骤（5）中，基于Bray-Curtis距离对微生物群落结构进行主坐标分析，揭示不同腐解时间秸秆碳同化微生物群落结构差异，并采用ADONIS分析检验处理对其影响是否显著。
在所述步骤（5）中，利用相对丰度＞0.01%的OTU，基于Spearman相关矩阵建立共现性网络，计算网络拓扑结构参数包括节点数、边数、连接数、平均度、平均路径长度、网络直径、聚类系数、介数中心性、度中心性，利用R程序中的igraph程序包进行分析，使用交互式可视化平台呈现网络。
进一步计算网络模块内度和模块间度，根据二者将网络节点分别归属为网络核心点kinless hubs、模块核心点module hubs、连接节点connectors和外围节点peripherals，其中，网络核心点和连接节点是秸秆碳同化的关键微生物类群。
在所述步骤（5）中，应用Usearch软件的UPARSE算法对优化后序列按照97%的相似性水平对非重复序列进行OTU聚类。
在所述步骤（4）中，采用Trimmomatic和 FLASH软件对原始序列进行序列拼接及数据去杂：
① 过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的reads，去除含N 碱基的reads；
② 根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10 bp；
③ 拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
④ 根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
在所述步骤（3）中，各密度层DNA分离纯化后利用BioradPCR仪器进行细菌16SrRNA基因的定量PCR，引物为：515F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’和806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’ ；
反应体系为：10μl 2× SuperMix、前后引物10μM各0.4 μl、2.0μl DNA模板、7.2 μl双灭菌水；
扩增程序为：94℃ 40 s，40 ×（95℃ 10 s；60℃ 30 s）以及熔融曲线收集为 95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。
在所述步骤（3）中，对各样本的细菌16S rRNA基因进行扩增和测序；引物为338F5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’；
PCR反应体系包括：4 μl 5×FastPfu Buffer，0.4 μl TransStart FastPfuPolymerase，2 μl dNTPs，0.8 μl前端引物，0.8 μl末端引物，2 μl 10倍稀释的DNA模板；
PCR 产物用QuantiFluor™-ST荧光定量系统进行检测定量，并按照相应比例混合准备构建Miseq文库及测序，基于illumina MiSeq PE300 测序平台进行双末端测序。
在所述步骤（2）中，玉米秸秆与土壤的混合比例为秸秆：折合干土重=1：1800～220g。
与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
利用本发明方法能够有效识别土壤在秸秆碳的分解去向，并识别鉴定出秸秆碳同化关键微生物类群及其群落演替规律，进而揭示目标土壤中秸秆分解的微生物学机制；据此可进一步研发出有针对性的高效玉米秸秆微生物腐熟剂，以促进秸秆的快速腐熟分解，进而起到快速改良土壤、节肥增效的目的。
附图说明
图1为本发明实施例中不同采样时间添加秸秆处理土壤DNA超高速离心后16SrRNA在各浮力密度中的相对丰度SIP密度曲线，图中标示方块中密度层为玉米秸秆碳同化微生物DNA。
图2为本发明实施例中秸秆分解过程中玉米秸秆碳同化细菌群落组成图谱。
图3为本发明实施例中不同采样时间13C标记重组DNA细菌群落结构图谱。
图4为NPKS处理土壤中秸秆碳同化的细菌分子生态网络；图中一个圆圈代表一个节点 OTU；两节点之间的连线代表相互关系，红色（或深色）的线代表正相关关系，绿色（或浅色）的线代表负相关关系。
图5为基于模块拓扑角色的OTU的Zi和Pi值的分布图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂、原料如无特别说明，均为市售常规试剂及原料；所涉及的检测、试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例：障碍黄褐土玉米秸秆碳同化关键微生物的识别
1. 材料与方法
1.1 土壤样品的采集
以黄褐土小麦-玉米轮作体系为研究对象，试验地点位于河南省方城县赵河镇现代农业示范园区（33°08′N，112°58′E），处于亚热带大陆性气候带，年平均日照时数为2092h，年均气温14.4 ℃，年均降雨量803.9 mm左右，无霜期220 d。试验开始于2012年小麦季，试验前供试土壤（0-20cm）有机质22.83 g kg-1，碱解氮、有效磷和速效钾分别为191.0、46.6和99.0 mg kg-1，pH值5.92。小区面积49 m2，3次重复，随机区组排列。选取其中的化肥秸秆配施处理（NPKS），小麦季，化肥用量为每年施用N 117 kg hm-2，P2O5 90 kg hm-2，K2O 75 kghm-2，玉米秸秆（切碎成3-5 cm）全量还田，氮磷钾肥料分别用尿素、过磷酸钙和氯化钾，化肥氮基追比5：5，拔节期开沟条施追肥。玉米季，仅施用化肥N 210 kg hm-2，P2O5 75 kg hm-2，K2O 90 kg hm-2，其中磷肥、钾肥于五叶期一次性沟施，氮肥分别在玉米五叶期沟施和抽雄期穴施（5：5）。
1.2 培养试验
2019年采集小麦收获季NPKS处理的原状耕层土壤，去除植物残体，过2mm筛混匀后于4°C保存，1周内完成培养试验布置。采用室内好气培养试验，将13C标记玉米秸秆与NPKS土壤混合（秸秆：折合干土重=50mg：10g），同时设置无秸秆及未标记的12C玉米秸秆为对照，于25 ℃黑暗条件下进行好气培养试验，其中含水量为田间持水量的60%。培养过程中每7天称重一次，当土壤水分损失超过培养初土重的5%时补充水分。培养过程中注意调换瓶的位置，减少外部条件的影响，同时避免对土壤的扰动。培养期间分别于30、90、180、270、360天采集土壤样品，提取DNA后进行超高速等密度梯度离心，分离纯化后进行细菌16S rRNA基因定量PCR，确定秸秆碳源核酸13C-DNA所在密度层，以该DNA为对象，基于illumina Miseq PE300测序平台完成高通量测序，找出参与秸秆碳素转化的细菌类群，分析其分子生态功能与代谢网络。
1.3 主要测定方法及数据分析方法
（1）土壤DNA提取：采用土壤DNA提取试剂盒（Fast DNA SPIN Kit for soil），DNA定容于60 μl的洗脱液中，最后用1%（wt vol-1）的琼脂糖检验DNA，Nanodrop分光光度计（Nanodrop, PeqLab, Germany）检测其质量和浓度，存放于-80 ℃。
（2）核酸密度梯度离心与分层：采用Beckman超高速离心机（Optima L-100XP），配合垂直转头（VTi90）在190,000×g转速下离心44h；采用注射器微量注射泵（New Era NE-1000）进行梯度分层；使用 Reichert 折光仪（AR200）进行密度测定。
（3）定量PCR：
标准曲线的制作：将琼脂糖胶纯化后的普通PCR产物用载体pGM-T和感受态细胞Escherichia coli TOP10（Tiangen Biotech, Beijing, China）进行克隆，采用柱式质粒小提试剂盒提取过夜培养后的阳性克隆质粒，根据摩尔常数计算目标基因的拷贝数，并将质粒从108-102进行10倍浓度梯度连续稀释，存于-80 ℃待用。
定量PCR体系制作及上机：各密度层DNA分离纯化后利用BioradPCR仪器进行细菌16S rRNA基因的定量PCR，反应体系（20 μl）为：10 μl 2× SuperMix（Vazyme biotechco., ltd）、前后引物（10 μM）各0.4 μl、2.0 μl DNA模板、7.2 μl双灭菌水，引物为515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），扩增程序为：94℃ 40s，40 ×（95℃ 10 s；60℃ 30 s）以及熔融曲线收集为 95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，每个样品三次重复，扩增效率约为92%。确定秸秆碳源核酸13C-DNA所在密度层，以该DNA为对象进行高通量测序。
（4）16S rRNA基因高通量测序：对各样本的细菌16S rRNA基因（V3~V4区）进行扩增和测序，扩增时在引物前端加入barcode序列以区分各个样本。引物为338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），PCR反应体系包括：4μl 5×FastPfu Buffer，0.4 μl TransStart FastPfu Polymerase（Transgen Biotech,Beijing, China），2 μl dNTPs（2.5 mM），0.8 μl前端引物（5μM），0.8 μl末端引物（5μM），2μl 10倍稀释的DNA模板（10 ng）。扩增后PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）切胶回收 PCR产物。PCR 产物用QuantiFluor™-ST（Promega, USA）荧光定量系统进行检测定量，并按照相应比例混合准备构建Miseq文库及测序，基于illumina MiSeq PE300 测序平台进行双末端测序。
（5）生物信息学分析：采用Trimmomatic和 FLASH软件对原始序列进行序列拼接及数据去杂。数据去杂参数和方法为：
1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的reads，去除含N 碱基的reads；
2）根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10 bp；
3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。质控后，所测样品得到645947条高质量序列。
应用Usearch软件的UPARSE算法（http://drive5.com/uparse/）对优化后序列按照97%的相似性水平对非重复序列（不含单序列）进行OTU（Operational Taxonomic Units）聚类（Edgar, 2010），在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列，最终得到1568个OTU。采用RDP classifier贝叶斯算法（http://rdp.cme.msu.edu/）选取各OTU代表序列，比对SILVA 数据库（Release119 https://www.arb-silva.de/）（Caporaso et al., 2011）进行分类学分析，并在各个水平统计每个样品的群落组成。利用所有序列计算α多样性，包括sobs（丰富度实际观测值）、Shannon（Shannon多样性指数）、chao（物种丰富度Chao1指数）、ace（物种丰富度ACE指数）、pd（谱系多样性）和coverage（Good’s物种覆盖度）。
（6）数据分析：利用R语言中的“vegan”包，基于Bray-Curtis距离，对微生物群落结构进行主坐标分析（PCoA）分析，揭示不同腐解时间秸秆碳同化微生物群落结构差异，并采用ADONIS分析（999 permutations）检验处理对其影响是否显著；
利用相对丰度>0.01%的OTU，基于Spearman相关矩阵建立共现性网络，计算网络拓扑结构参数包括节点数（538）、边数（21704）、连接数（0.150）、平均度（80.684）、平均路径长度（2.422）、网络直径（9）、聚类系数（0.628）、介数中心性（0.019）、度中心性（0.258），利用R程序中的igraph程序包进行分析，使用交互式可视化平台Gephi（http://gephi.github.io/）呈现网络。根据Guimera和Amaral（2005）的描述计算网络模块内度（z-score）和模块间度（c-score），根据二者将网络节点分别归属为网络核心点kinless hubs（z-score > 2.5; c-score > 0.62）、模块核心点module hubs（z-score > 2.5；c-score≤ 0.62）、连接节点connectors（z-score ≤ 2.5；c-score > 0.62）和外围节点peripherals（z-score ≤ 2.5；c-score ≤ 0.62），其中，网络核心点和连接节点对网络结构的稳定性及特定环境的微生物网络关系尤为重要，是秸秆碳同化的关键微生物类群（Poudel et al., 2016）。
结果与分析
2.1 定量PCR
利用不同浮力密度梯度下细菌的相对丰度绘制SIP密度曲线（见图1），结果表明，等密度梯度离心已成功将重组（13C-DNA）从总DNA中分离出来（如标示方框中所示），玉米秸秆碳同化细菌DNA主要在浮力密度为1.735-1.75 g ml-1，混合红框中所示的DNA样品作为不同腐解时间玉米秸秆碳同化细菌遗传物质代表，进行进一步高通量测序。
2.2 玉米秸秆碳同化细菌群落的α-/β-多样性分析
Coverage指数表明测序深度足以说明玉米秸秆碳同化细菌群落多样性（见表1），总体上，秸秆腐解30天和360天的α多样性指数（Sobs、Shannon、Ace、Chao和Pd指数）普遍高于腐解中期90天、180天和270天，说明其物种丰富度和谱系多样性更高。
表1 基于OTUs的物种多样性指数
。
分析玉米秸秆不同腐解时期秸秆碳同化细菌群落进行分析发现，在门水平上，放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）为优势菌群，各腐解时期平均相对丰度分别为41.01%、31.13%、9.85%、8.64%、4.24%、2.21%和1.54%（见图2a）。属水平上，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、节细菌属（Arthrobacter）、罗河杆菌属（Rhodanobacter）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、链霉菌属（Streptomyces）、细链孢菌属（Catenulispora）、芽孢杆菌属（Bacillus）等分别是秸秆碳同化细菌主导属（见图2b）。随秸秆腐解，放线菌门在腐解第30和270天相对丰度较高，绿弯菌门和芽单胞菌门在腐解后期相对丰度较高、酸杆菌门和拟杆菌门在腐解前期相对丰度较高（见图2a）。
基于Bray-Curtis距离的PCoA分析表明，在不同秸秆腐解时间的秸秆碳同化细菌群落结构显著不同（Adonis: R 2 = 0.6130, P = 0.001），第一主成分和第二主成分共解释了72.16%的群落组成变异（图3）。
2.3 玉米秸秆碳转化细菌群落的共现性网络分析
网络分析可阐明生物体与生物体之间联系，找出影响整个网络的关键物种，将所有腐解时间的玉米秸秆碳同化细菌群进行共现性网络分析，得13C标记重组DNA的细菌群落共线性的分子生态学网络分析图谱（见图4、图5），从中可以看出其存在明显的模块结构（如图4），根据模块内连接度和模块间连接度将网络节点划分后发现（如图5），玉米秸秆碳同化细菌类群中，放线菌门、变形菌门、酸杆菌门的Granulicella、Angustibacter、Mycobacterium_intracellulare_subsp._chimaera、Candidatus_Koribacter、Dongia、Reyranella和Granulicella发挥了核心作用，是秸秆碳同化的关键细菌类群（见图5、表2）。
表2 玉米秸秆腐解关键细菌类群的分类信息
。
综上，本例以黄褐土为研究对象，以13C高丰度标记玉米秸秆和DNA-SIP技术为核心，配合同位素比率质谱和高通量测序等技术与数据分析，发现，随玉米秸秆腐解，其碳同化的细菌呈明显的群落演替规律，其中Granulicella、Angustibacter、Mycobacterium_ intracellulare_subsp._chimaera、Candidatus_Koribacter、Dongia、Reyranella和Granulicella玉米秸秆碳同化的关键细菌类群。
基于稳定同位素探针技术（Stable Isotope Probing, SIP），以分离出的13C标记的微生物DNA/RNA为基础，在障碍黄褐土上，识别秸秆碳的分解去向，识别鉴定出了秸秆碳同化关键微生物类群及其群落演替规律，进一步揭示了该障碍黄褐土土壤中秸秆分解的微生物学机制。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关方法、步骤及材料进行等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
Claims (10)
1.一种土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在小麦收获季采集经秸秆还田处理的原状耕层土壤，去除植物残体，过筛混匀后于0～4℃下保存，为待测土壤，备用；
（2）取13C标记玉米秸秆与待测土壤混合后于24～26℃黑暗条件下进行好气培养，培养期间的土壤含水量调节为田间持水量的50～70%；同时设置无秸秆及未标记的12C玉米秸秆为对照；
（3）在好气培养期间每间隔一定时期采集试验及对照的土壤样品，分别提取其DNA后进行超高速等密度梯度离心，分离纯化后进行细菌16S rRNA基因定量PCR，确定秸秆碳源核酸13C-DNA所在密度层，以该DNA为对象，进行16S rRNA基因高通量测序；
（4）对原始序列进行序列拼接及数据去杂；
（5）对优化后序列按照95～99%的相似性水平对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；采用RDP classifier贝叶斯算法选取各OTU代表序列，比对SILVA 数据库进行分类学分析，在各个水平统计每个样品的群落组成，并进行玉米秸秆碳同化细菌群落的α-/β-多样性分析、共现性网络分析。
2.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（5）中，利用所有序列计算α多样性，包括丰富度实际观测值、Shannon多样性指数、物种丰富度Chao1指数、物种丰富度ACE指数、谱系多样性和Good’s物种覆盖度。
3.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（5）中，基于Bray-Curtis距离对微生物群落结构进行主坐标分析，揭示不同腐解时间秸秆碳同化微生物群落结构差异，并采用ADONIS分析检验处理对其影响是否显著。
4.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（5）中，利用相对丰度＞0.01%的OTU，基于Spearman相关矩阵建立共现性网络，计算网络拓扑结构参数包括节点数、边数、连接数、平均度、平均路径长度、网络直径、聚类系数、介数中心性、度中心性，利用R程序中的igraph程序包进行分析，使用交互式可视化平台呈现网络。
5.根据权利要求4所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，计算网络模块内度和模块间度，根据二者将网络节点分别归属为网络核心点kinless hubs、模块核心点module hubs、连接节点connectors和外围节点peripherals，其中，网络核心点和连接节点是秸秆碳同化的关键微生物类群。
6.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（5）中，应用Usearch软件的UPARSE算法对优化后序列按照97%的相似性水平对非重复序列进行OTU聚类。
7.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，采用Trimmomatic和 FLASH软件对原始序列进行序列拼接及数据去杂：
① 过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的reads，去除含N 碱基的reads；
② 根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10 bp；
③ 拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
④ 根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
8.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，各密度层DNA分离纯化后利用Biorad PCR仪进行细菌16S rRNA基因的定量PCR，引物为：515F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’和806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’；
反应体系为：10 μl 2× SuperMix、前后引物10 μM各0.4 μl、2.0 μl DNA模板、7.2 μl双灭菌水；
扩增程序为：94℃40 s，40×（95℃ 10 s；60℃ 30 s）以及熔融曲线收集为 95℃ 15s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。
9.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，对各样本的细菌16S rRNA基因进行扩增和测序；引物为338F 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’；
PCR反应体系包括：4 μl 5×FastPfu Buffer，0.4μl TransStart FastPfuPolymerase，2μl dNTPs，0.8 μl前端引物，0.8 μl末端引物，2 μl 10倍稀释的DNA模板；
PCR 产物用QuantiFluor™-ST荧光定量系统进行检测定量，并按照相应比例混合准备构建Miseq文库及测序，基于illumina MiSeq PE300 测序平台进行双末端测序。
10.根据权利要求1所述的土壤中玉米秸秆碳同化关键微生物的识别方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，玉米秸秆与土壤的混合比例为秸秆：折合干土重=1：1800～220g。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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