CN113648341B - 一种牛大力中黄酮类成分的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牛大力中黄酮类成分的提取方法,包括以下步骤:将牛大力进行速冻处理,制备低共熔溶剂‑乙醇双水相提取溶剂,使用超声波辅助处理,浓缩、过滤和洗涤,得到黄酮类成分,配置双水相提取溶剂,通过超声协助两次提取,进一步提高黄酮的纯度和提取率,且具有较高的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取领域,特别涉及一种牛大力中黄酮类成分的提取方法。
背景技术
牛大力,别名猪脚笠、金钟根、山莲藕、倒吊金钟、大力薯。为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤的干燥根,性味甘、平,具有补虚润肺,强筋活络的功效,发现含有黄酮类、酚苷类、三萜类,其中黄酮类成分比较丰富(主要为异黄酮、黄酮、查尔酮),且黄酮类成分具有抗肿瘤、抗炎、抗雌激素等药理活性作用;而目前对牛大力黄酮的提取,大部分为传统的醇提;专利“CN106377582A”一种牡丹花挥发油和总黄酮综合提取方法和专利“CN112451558A”牛大力醇提物在制备降糖或降脂药物、保健品中的应用中,均为醇提放,并且提取耗时过长,使得黄酮类物质纯度低,其抗氧化活性作用欠佳。
发明内容
鉴于此,本发明提出一种牛大力中黄酮类成分的提取方法,解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的:一种牛大力中黄酮类成分的提取方法:包括以下步骤:将牛大力进行速冻处理,制备低共熔溶剂-乙醇双水相提取溶剂,使用超声波辅助处理,浓缩、过滤和洗涤,得到黄酮类成分;所述低共熔溶剂-乙醇双水相提取溶剂为酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,其中酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:3~5的氢键受体与氢键供体组成。
进一步的,所述氢键受体选自氯化胆碱、甜菜碱、1-甲基咪唑中的任意一种或几种组合。
进一步的,所述氢键供体选自苯乙酸、丁二酸、甲苯磺酸中的任意一种或几种组合。
进一步的,种牛大力中黄酮类成分的提取方法,包括以下步骤:
S1、速冻处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,将牛大力段在-10~-20℃下进行速冻处理,粉碎,破壁,得到牛大力粉末;
S2、制备提取溶剂:将体积比为1:3~10的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,所述乙醇溶液的质量浓度为70~90wt%;
S3、超声波提取:将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系中,超声萃取,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
进一步的,所述破壁是用超声波对速冻后的牛大力进行破壁处理,在温度0~6℃、功率600~1000w的条件下破壁处理30~50min。
进一步的,所述牛大力粉末和酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系的质量体积g/mL比为1:45~100。
进一步的,所述超声萃取条件为超声波功率250~320W、温度为40~65℃的条件下超声萃取8~20min。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明采用速冻处理,先将牛大力进行速冻处理,在冻融状态下结合超声破壁,将牛大力细胞壁破坏,减少纤维素等杂质的干扰;配置双水相提取溶剂,通过超声协助两次提取,将黄酮和其他水溶性物质分离,有效去除黄酮中的杂质,进一步提高黄酮的纯度和提取率,并且借助超声协助提取,缩短提取时间至15min左右;同时,本发明的黄酮类成分具有较高的抗氧化活性,对自由基具有较好的清除能力,超氧阴离子O2-清除率达到89.6%,DPPH·清除率达到92.6%,羟自由基清除率达到88.9%。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容,下面提供具体实施例,对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
供试植物材料于2019年5月采自海南省儋州市番加森林保护区,由中国热带农业科学院热带作物品种资源所鉴定为豆科崖豆藤属植物牛大力。
实施例1
一种牛大力中黄酮类成分的提取方法:包括以下步骤:
S1、速冻处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,将牛大力段在-10℃进行速冻处理,粉碎,破壁,得到牛大力粉末;所述破壁是在温度0℃、功率600w的条件下超声破壁处理30min;
S2、制备提取溶剂:将体积比为1:3的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,所述乙醇溶液的质量浓度为70wt%;其中酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:3的氢键受体与氢键供体组成,氢键受体选自氯化胆碱,氢键供体选自苯乙酸;
S3、超声波提取:按照质量体积g/mL比为1:45将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系中,超声萃取,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,超声波功率250W、温度为40℃的条件下超声萃取8min,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
实施例2
一种牛大力中黄酮类成分的提取方法:包括以下步骤:
S1、速冻处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,将牛大力段在-20℃下进行速冻处理,粉碎,破壁,得到牛大力粉末;所述破壁是在温度6℃、功率1000w的条件下超声破壁处理50min;
S2、制备提取溶剂:将体积比为1:10的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,所述乙醇溶液的质量浓度为90wt%;其中酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:5的氢键受体与氢键供体组成,氢键受体选自甜菜碱,氢键供体选自丁二酸;
S3、超声波提取:按照质量体积g/mL比为1:100将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系中,超声萃取,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,超声波功率320W、温度为65℃的条件下超声萃取20min,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
实施例3
一种牛大力中黄酮类成分的提取方法:包括以下步骤:
S1、速冻处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,将牛大力段在-15℃进行速冻处理,粉碎,破壁,得到牛大力粉末;所述破壁是在温度3℃、功率800w的条件下超声破壁处理40min;
S2、制备提取溶剂:将体积比为1:7的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,所述乙醇溶液的质量浓度为80wt%;其中酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:4的氢键受体与氢键供体组成,氢键受体选自1-甲基咪唑,氢键供体选自甲苯磺酸;
S3、超声波提取:按照质量体积g/mL比为1:80将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系中,超声萃取,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,超声波功率280W、温度为55℃的条件下超声萃取15min,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于,所述S2提取溶剂是将体积比为1:2的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,进行超声提取。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于,所述S1中牛大力未进行破壁处理,粉碎后得到牛大力粉末。
实施例6
本实施例与实施例3的区别在于,所述S1中牛大力的破壁处理条件为温度10℃、功率500w的条件下破壁处理40min。
实施例7
本实施例与实施例3的区别在于,所述S3超声萃取条件为超声波功率200W、温度为35℃的条件下超声萃取15min。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于,所述提取溶剂为质量浓度为80wt%乙醇;
具体为牛大力中黄酮类成分的提取方法:包括以下步骤:
S1、速冻处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,将牛大力段进行速冻处理,粉碎,破壁,得到牛大力粉末;所述破壁是在温度3℃、功率800w的条件下超声破壁处理40min;
S2、制备提取溶剂:配制质量浓度为80wt%的乙醇溶液;
S3、超声波提取:按照质量体积g/mL比为1:80将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的乙醇溶液中,超声萃取,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,超声波功率280W、温度为55℃的条件下超声萃取15min,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于,牛大力未进行速冻处理,
具体为牛大力中黄酮类成分的提取方法:包括以下步骤:
S1、预处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,粉碎,破壁,得到牛大力粉末;所述破壁是在温度3℃、功率800w的条件下超声破壁处理40min;
S2、制备提取溶剂:将体积比为1:7的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,所述乙醇溶液的质量浓度为80wt%;其中酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:4的氢键受体与氢键供体组成,氢键受体选自1-甲基咪唑,氢键供体选自甲苯磺酸;
S3、超声波提取:按照质量体积g/mL比为1:80将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系中,超声萃取,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,超声波功率280W、温度为55℃的条件下超声萃取15min,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于,所述酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:8的氢键受体与氢键供体组成;
S1、速冻处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,将牛大力段进行速冻处理,粉碎,破壁,得到牛大力粉末;所述破壁是在温度3℃、功率800w的条件下超声破壁处理40min;
S2、制备提取溶剂:将体积比为1:7的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,所述乙醇溶液的质量浓度为80wt%;其中酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:8的氢键受体与氢键供体组成,氢键受体选自1-甲基咪唑,氢键供体选自甲苯磺酸;
S3、超声波提取:按照质量体积g/mL比为1:80将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系中,超声萃取,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,超声波功率280W、温度为55℃的条件下超声萃取15min,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
一、纯度测试
本发明制得的黄酮呈姜黄色,将实施例1~7和对比例1~3经HPLC测试牛大力黄酮纯度,每组做三次平行试验;
提取率=提取物中总黄酮质量/原牛大力总黄酮质量×100%
纯度(%) | 提取率(%) | |
实施例1 | 97.2 | 87.5 |
实施例2 | 98.7 | 88.9 |
实施例3 | 98.8 | 89.2 |
实施例4 | 96.1 | 86.3 |
实施例5 | 95.6 | 85.4 |
实施例6 | 94.9 | 86.3 |
实施例7 | 95.2 | 84.6 |
对比例1 | 88.6 | 80.1 |
对比例2 | 84.9 | 79.5 |
对比例3 | 87.1 | 78.3 |
由上表可知,本发明的提取方法提高牛大力中黄酮类成分的提取率和纯度,其中实施例1~7和对比例1比较,本发明选择使用酸性低共熔溶剂-乙醇双水相作为提取溶剂,通过超声协助两次提取,将黄酮和其他水溶性物质分离,有效去除黄酮中的杂质,进一步提高黄酮的纯度和提取率;与对比例2比较,速冻处理后的牛大力组织内部破裂,再经破壁处理后,黄酮成分提取更加彻底;与对比例3比较,调整酸性低共熔溶剂的氢键受体与氢键供体之间的摩尔比,提高双水相体系的稳定性,各个步骤的共同作用之下,将牛大力的黄酮类成分较高程度的提取出来;实施例1~3和实施例4比较,将酸性低共熔溶剂和乙醇按比例混合达到更好的双水相体系,实施例1~3和实施例5、6比较,特定的超声条件破壁处理后的牛大力细胞壁破坏,减少纤维素等杂质的干扰;实施例1~3和实施例7比较,特定的超声辅助两次提取在特定的温度和功率下,将牛大力中的难以提取的黄酮类物质充分提取。
二、抗氧化测定
(1)抗超氧阴离子O2-能力的测定:采用邻苯三酚自氧化法测定;
(2)DPPH·清除率测定:称取各实施例和对比例的提取物样品10mg,用污水乙醇溶解,配成10mL溶液待用,加入1mL DPPH·溶液,用无水乙醇定容至10mL,以VmL样品和(10-V)mL污水乙醇为参比,在518nm处测定其吸光度值为A2,1mL DPPH·溶液和9mL污水乙醇,混合均匀,以污水乙醇溶液为参比,在518nm处测定吸光度值为A1,按照以下计算DPPH·清除率:
DPPH·清除率=(A1-A2)/A1×100%
(3)羟自由基(·OH)清除率测定:称取各实施例和对比例的提取物样品10mg,用污水乙醇溶解,配成10mL溶液待用,依次加入0.4mL邻二氮菲(5mmol·L-1)、2mLTris-HCI缓冲溶液、0.4mLFeSO4溶液,用无水乙醇定容至10mL,然后于37℃恒温水浴反应,在538nm处测量吸光度值A2;不加双样式而加入样品时的吸光度值为A0,加入双氧水而不加入样品时的吸光度值为A1,按照以下计算公式计算样品对羟自由基的清除率:
羟自由基(·OH)清除率=(A2-A1)/(A0-A1)×100%
O<sup>2-</sup>清除率(%) | DPPH·清除率(%) | 羟自由基清除率(%) | |
实施例1 | 81.6 | 90.3 | 84.3 |
实施例2 | 88.5 | 91.2 | 85.6 |
实施例3 | 89.6 | 92.6 | 88.9 |
实施例4 | 83.5 | 90.1 | 82.1 |
实施例5 | 82.4 | 89.6 | 81.3 |
实施例6 | 81.6 | 85.4 | 80.0 |
实施例7 | 79.4 | 86.2 | 81.3 |
对比例1 | 70.1 | 78.5 | 75.6 |
对比例2 | 73.3 | 75.6 | 77.1 |
对比例3 | 72.9 | 76.1 | 72.6 |
由上述可知,本发明的牛大力黄酮成分具有较好的抗氧化活性,对超氧阴离子O2-、DPPH·清除率测定、羟自由基具有较好的清除能力,则可说明本发明配制的提取溶剂双水相能将具有较强抗氧化成分的黄酮物质充分提取,获得更高的活性作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种牛大力中黄酮类成分的提取方法,其特征在于:包括以下步骤:将牛大力进行速冻处理,制备低共熔溶剂-乙醇双水相提取溶剂,使用超声波辅助处理,浓缩、过滤和洗涤,得到黄酮类成分;
S1、速冻处理:将牛大力洗净,沥干水分后切段,将牛大力段进行速冻处理,粉碎,破壁,所述破壁是用超声波对速冻后的牛大力进行破壁处理,在温度0~6℃、功率600~1000w的条件下破壁处理30~50min,得到牛大力粉末;
S2、制备提取溶剂:将体积比为1:3~10的酸性低共熔溶剂和乙醇溶液混合,形成酸性低共熔溶剂-乙醇双水相,所述乙醇溶液的质量浓度为70~90wt%,其中酸性低共熔溶剂由摩尔比为1:3~5的氢键受体与氢键供体组成,所述氢键受体选自氯化胆碱、甜菜碱、1-甲基咪唑中的任意一种或几种组合,所述氢键供体选自苯乙酸、丁二酸、甲苯磺酸中的任意一种或几种组合;
S3、超声波提取:将S1得到的牛大力粉末加入到S2制得的酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系中,所述牛大力粉末和酸性低共熔溶剂-乙醇双水相体系的质量体积g/mL比为1:45~100,超声萃取,所述超声萃取条件为超声波功率250~320W、温度为40~65℃的条件下超声萃取8~20min,萃取结束后过滤,静置,取上层,得到含有黄酮类成分的低共熔溶剂相;
S4、二次提取:将上述含有黄酮类成分的低共熔溶剂相进行二次提取,控制超声条件,过滤,静置,取上层,减压浓缩,纯化得到牛大力黄酮类成分。
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