CN113637579A - 一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置 - Google Patents
一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113637579A CN113637579A CN202010346121.7A CN202010346121A CN113637579A CN 113637579 A CN113637579 A CN 113637579A CN 202010346121 A CN202010346121 A CN 202010346121A CN 113637579 A CN113637579 A CN 113637579A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pressure
- tissue
- gas
- hydrostatic
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000006835 compression Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000007906 compression Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 2
- -1 Polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/48—Automatic or computerized control
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Computer Hardware Design (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置。所述装置主要由气泵，水油分离器，调压阀，电控器件，离心管，流体管道，气压表和孔板组成，所述装置采用气泵(1)作为动力装置，调压阀(3)在电控器件(4)的控制下调节从水油分离器(2)中导出气体的气压，气体通过对离心管(5)内的液体施压，促使液体进入管道(6)，经由三通阀(7)压缩孔板(11)内气体。所述孔板(11)上有适配的塞子(12)，孔内压强由气压表监测(8)。本装置可以按照预设的压力曲线对细胞和组织进行加压，响应灵敏，且易于拆装，移动性好，能适配多种细胞和组织培养装置，适用于体外细胞和组织静液压加压培养实验。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置。本装置可用于细胞和组织体外静液压加压相关的实验研究。
背景技术
现有技术公开了体内的细胞和组织处在一定的生理微环境条件下，包括特定的温度、湿度、气体浓度以及机械力等，细胞和组织能通过骨架传导或者感受器感知机械环境，通过级联反应调整生命活动。研究实践显示，体外细胞和组织的压力培养装置对于研究力环境对细胞和组织的影响机制和某些疾病的发生发展及治疗有重要的意义。
现有的细胞和组织加压手段主要有液体加压和气体加压；其中，采用液体加压的方式，可以起到缓冲作用，但无法模拟细胞和组织所处的气体环境，对于低氧等特殊气体环境下的细胞和组织，难以进行研究；常见的气体加压通常将细胞和组织培养皿置于某种压力容器中进行加压，压力容器体积往往远大于细胞和组织培养皿，且考虑到密封性的要求，均有复杂的密封设计，导致其组装和搬运的难度增加。体内的细胞和组织处在动态的压力环境中，常规的气体加压装置由于其体积较大，压强切换的滞后性明显，精度不高，且可能引入由气体冲击造成的机械力，同时也给温控带来了挑战。
基于现有技术的缺陷与现状，本申请的发明人拟提供一种操作简易、压力可调的，且尽可能模拟体内环境的细胞和组织培养装置。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，为解决现有技术的缺陷，提供一种操作简易、压力可调的，且尽可能模拟体内环境的细胞和组织培养装置，尤其涉及一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置。
本发明的目的通过以下的技术手段实现：
一种体外细胞和组织加压培养装置，其特征在于：主要由气泵(1)，水油分离器(2)，调压阀(3)，电控器件(4)，离心管(5)，流体管道(6)
，气压表(8)和孔板(11)组成；
所述装置中，采用最大供气压强为1Mpa的气泵(1)作为动力装置，调压阀(3)在电控器件(4)的控制下调节从水油分离器(2)中导出气体的气压，气体通过对离心管(5)内的液体施压，促使液体进入管道(6)，经由三通阀(7)压缩孔板(11)内气体。所述孔板(11)上有适配的塞子(10)，孔内压强由气压表监测(8)。
所述装置的气源为培养箱内的气体，通过气体入口(13)通入气泵(1)中。本装置中设有气体置换，在加压前，调节三通阀(7)，连通培养箱气体入口(14)和加压孔板(11)所在的气路，打开截止阀(9)，使得管路中的气体和培养箱中相同，保证实验过程中，细胞和组织所处环境和培养箱中气体成分一致。该模式使得所述装置无需外加复杂的气体预混装置，且与低氧等特殊类型的培养箱适配。
本发明中，所述的电控器件为PLC，单片机等电信号控制设备；按预设的压力曲线控制调压阀实现压力调控，通过调压阀反馈系统能实现粗略的压力监测，精确的孔内压力可由气压表(8)实时读取，气压表的量程可根据实际需求选取0-0.1Mpa或者0-1Mpa。
本发明中，所述调压阀为包括比例阀、电磁调压阀等在内的可调节气体压力的器件；涉及恒压培养时，还可用手动调压阀进行控制，并省去电控器件。
本发明中，所述离心管内装有DMEM、MEM等基础细胞和组织培养基，提前置于培养箱内预平衡。
本发明中，所述装置的塞子可选用无毒且透光的PDMS材料，通过调整所述塞子的尺寸可以使其适配不同规格的孔板(6/12/24/48/96孔)和培养瓶等细胞和组织培养装置，通常将塞子直径设为孔口直径的1.2-1.6倍，塞子上用打孔器开有两孔，通过与之过盈配合的鲁尔接头(10)与软管相连，保证装置的气密性。
本发明中，所述三通阀(7)可连接多路并列管道实现多孔加压，以获得多个相同条件的重复实验组，可用于进行染色等生物学实验；在孔板剩余的孔上配置所述塞子，可以实现在同一孔板上同时设实验组和对照组，简化实验操作，最大程度减少了两者之间的变量，使实验结果更具说服力。
本发明中，所述的各个器件间的连接软管可为橡胶软管、塑料软管、PE、PVC、PP、硅胶管等软管，软管和器件间可用快插、快拧接头连接。
本发明提供了一种轻便、操作简易、高通量、自动化调压以及能实时监控的体外细胞和组织静液压加压培养装置。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明通过液压驱动孔内气体压缩来实现细胞和组织的加压培养，既可实现特殊气体环境下细胞和组织的加压培养，也可缓冲压强切换带来的冲击。
2.本发明可通过调整电控装置的程序来实现不同压力曲线下细胞和组织自动化加压，且可通过压力表实时检测孔内的实际压力。由于其加压体系小，压力调节的响应速度将大大提高。
3.本发明可利用并列管道实现高通量的细胞和组织加载实验，且与各种细胞和组织培养装置相适配。
4.本发明的装置体积小，易于拆装，可直接置于培养箱内，无需外设气瓶和气体预混装置。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明塞子部分的结构简图；
图3为本发明的气压可调的细胞和组织加压培养装置的一实施例实物图。
图中1：气泵；2：水油分离器；3：调压阀；4：电控器件；5：离心管；6：流体管道；7：三通阀；8：气压表；9：截止阀；10：鲁尔接头；11：孔板；12：塞子；13、14：培养箱气体入口；15：塞孔。
具体实施方式
为了更直观地显示本发明的技术方案和优势，将下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
如图1所示，所述静液压可调的细胞和组织加压培养装置，包括：装置的动力源气泵(1)；用于过滤手机其他的水油分类器(2)；调压阀(3)由电控器件(4)控制，本实施例中调压阀选用比例阀，电控器件选用单片机；离心管(5)；三通阀(7)；用于细胞和组织培养的孔板(11)配有塞子(12)；用于显示实时压力的气压表(8)；截止阀(9)；用于连接各器件的流体管道(6)。
使用时，将各个器件间用软管连接并测试装置的气密性，将种有细胞和组织的培养装置与适配的塞子相连，本实施例中选用24孔板，根据实际需要设置并列管道；作为对照组的孔不连入加压系统中但也相应塞上塞子；根据预设的压力曲线设定单片机程序，通过电路系统控制比例阀，在离心管(5)中加入对应的培养基后放入培养箱中进行预平衡，将孔板和气体入口(13)(14)放入培养箱中，为保证实验组的细胞和组织所处环境的气体组分和对照组相同，在加压前需进行气体置换操作，打开截止阀(9)后转动三通阀(7)，使气体入口(14)和孔板所在管路连通，置换管路内的气体为培养箱中的气体，关闭截止阀(9)后转动三通阀(7)，使离心管所在管路和孔板所在管路相通，打开控制系统和气泵开关，离心管内的液体受到气压从出口管道流出时压缩后续管路和孔板内的气体，使得细胞和组织受到预期的压强，离心管出口液柱随着调压阀出口气体压强的改变而律动，加压孔内的气压可以通过气压表(8)实时观察读取，比例阀出口气体的压强能通过反馈系统在PC端显示。加压指定时间后关闭开关，取下孔板进行后续的生物学分析。
使用结果显示，本体外细胞和组织静液压加压培养装置轻便、操作简易、高通量、能自动化调压以及实时监控，尤其是通过液压驱动孔内气体压缩来实现细胞和组织的加压培养，既可实现特殊气体环境下细胞和组织的加压培养，也可缓冲压强切换带来的冲击，通过调整电控装置的程序实现不同压力曲线下细胞和组织自动化加压，且可通过压力表实时检测孔内的实际压力，由于其加压体系小，压力调节的响应速度明显提高。
Claims (7)
1.一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置，其特征在于，主要由气泵(1)，水油分离器(2)，调压阀(3)，电控器件(4)，离心管(5)，流体管道(6)，气压表(8)和孔板(11)组成；
所述装置中，采用气泵(1)作为动力装置，调压阀(3)在电控器件(4)的控制下调节从水油分离器(2)中导出气体的气压，气体通过对离心管(5)内的液体施压，促使液体进入管道(6)，经由三通阀(7)压缩孔板(11)内气体，所述孔板(11)上有适配的塞子(10)，孔内压强由气压表监测(8)。
2.根据权利要求1所述的静液压可调的细胞和组织加压培养装置，其特征在于，所述装置的气源为培养箱内的气体，在加压前，调节三通阀，通过气体置换使管路中的气体和培养箱中的相同。
3.根据权利要求1所述的静液压可调的细胞和组织加压培养装置，其特征在于，所述的电控器件为PLC，单片机电信号控制设备，通过预设的压力曲线控制调压阀实现压力的调控；通过调压阀反馈实现压力的粗略监测；精确的孔内压强由气压表(8)实时读取。
4.根据权利要求1所述的静液压可调的细胞和组织加压培养装置，其特征在于，所述调压阀为调节气体压力的器件，选自比例阀或电磁调压阀。
5.根据权利要求1所述的静液压可调的细胞和组织加压培养装置，其特征在于，所述装置的塞子选用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)，通过调整所述塞子的尺寸适配多种细胞和组织培养装置。
6.根据权利要求1所述的静液压可调的细胞和组织加压培养装置，其特征在于，在所述的三通阀(7)后，连接多路并列管道实现多孔加压。
7.根据权利要求1所述的静液压可调的细胞和组织加压培养装置，其特征在于，所述的各器件间的连接软管选自橡胶软管、塑料软管、PE、PVC、PP或硅胶管。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010346121.7A CN113637579A (zh) | 2020-04-27 | 2020-04-27 | 一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010346121.7A CN113637579A (zh) | 2020-04-27 | 2020-04-27 | 一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113637579A true CN113637579A (zh) | 2021-11-12 |
Family
ID=78415154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010346121.7A Pending CN113637579A (zh) | 2020-04-27 | 2020-04-27 | 一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113637579A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001236002A1 (en) * | 2000-03-02 | 2001-11-22 | Purpose Co., Ltd. | Method and apparatus for culturing cell or tissue |
| JP2003289851A (ja) * | 2003-05-12 | 2003-10-14 | Takagi Ind Co Ltd | 細胞又は組織の培養装置 |
| CN102229888A (zh) * | 2011-06-08 | 2011-11-02 | 南京大学医学院附属鼓楼医院 | 反馈式气控压应力细胞培养装置 |
| WO2012017663A1 (ja) * | 2010-08-04 | 2012-02-09 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 単核球分離管、単核球分離システム、単核球の分離方法、単核球、及び、体内投与用薬剤 |
| CN202182011U (zh) * | 2011-05-16 | 2012-04-04 | 青岛华瑞汽车零部件有限公司 | 一种高压气源发生设备 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3865354B2 (ja) * | 2000-03-02 | 2007-01-10 | 高木産業株式会社 | 細胞又は組織の培養方法 |
-
2020
- 2020-04-27 CN CN202010346121.7A patent/CN113637579A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001236002A1 (en) * | 2000-03-02 | 2001-11-22 | Purpose Co., Ltd. | Method and apparatus for culturing cell or tissue |
| JP2003289851A (ja) * | 2003-05-12 | 2003-10-14 | Takagi Ind Co Ltd | 細胞又は組織の培養装置 |
| WO2012017663A1 (ja) * | 2010-08-04 | 2012-02-09 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 単核球分離管、単核球分離システム、単核球の分離方法、単核球、及び、体内投与用薬剤 |
| CN202182011U (zh) * | 2011-05-16 | 2012-04-04 | 青岛华瑞汽车零部件有限公司 | 一种高压气源发生设备 |
| CN102229888A (zh) * | 2011-06-08 | 2011-11-02 | 南京大学医学院附属鼓楼医院 | 反馈式气控压应力细胞培养装置 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 赵志河等: "《口腔力学生物学》", 31 December 2017, 上海交通大学出版社, pages: 118 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103756898B (zh) | 一种可施加动态载荷的细胞三维受力培养装置 | |
| WO2019120135A1 (zh) | 细胞培养模块及细胞培养系统 | |
| CN112481077B (zh) | 一种微流控灌流培养装置及其灌流方法 | |
| US20110229927A1 (en) | Sample port of a cell culture system | |
| CN108728360B (zh) | 一种细胞共培养的装置及其方法 | |
| EP2190973A2 (en) | Mesoscale bioreactor platform for perfusion | |
| CN103146574B (zh) | 一种高通量微流控生物力学长期刺激系统及其应用 | |
| CN102229888B (zh) | 反馈式气控压应力细胞培养装置 | |
| CN101942389A (zh) | 用于体外细胞共培养的力学加载流动腔装置 | |
| CN206289259U (zh) | 一种可控氧控温气压加压细胞培养装置 | |
| WO2019191685A1 (en) | Workstation for automated control of an in vitro system | |
| CN103333800B (zh) | 一种体外细胞动静态正-负压加载实验系统及方法 | |
| CN113637579A (zh) | 一种静液压可调的细胞和组织加压培养装置 | |
| CN104673669A (zh) | 一种基于微载体的微流控细胞培养系统及其操控方法 | |
| CN107511188B (zh) | 一种基于芯片实验室微流体技术气控微阀装置及其控制方法 | |
| CN108467837A (zh) | 一种可视多通道流体剪切力细胞培养装置及其方法 | |
| CN103146573B (zh) | 一种动脉血管模拟微流控装置及其应用 | |
| CN205420413U (zh) | 一种多功能型实验室光生物反应器系统 | |
| CN201686700U (zh) | 组织细胞培养装置 | |
| CN209226998U (zh) | 一种可视多通道流体剪切力细胞培养装置 | |
| US20130230907A1 (en) | High-throughput sensorized bioreactor for applying hydrodynamic pressure and shear stress stimuli on cell cultures | |
| CN102719355B (zh) | 细胞真空吸附固定装置 | |
| CN103290145A (zh) | 一种灌注式生物反应器实验方法及其使用装置 | |
| CN105259934B (zh) | 无线遥控微量注射装置 | |
| CN2647864Y (zh) | 一种体外血管培养反应装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |