CN113631180A - 用于确定代谢适应性的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种确定感兴趣的活实体对第一组环境条件和第二组环境条件的代谢适应性的方法，该方法包括(a)用第一底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；(b)用第二底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中，所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM；以及(c)基于将步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种非线性活性与步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种其它活性进行比较，确定所述活实体的代谢适应性。本发明还涉及与其相关的设备和其它方法，以及氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽。

Description

用于确定代谢适应性的装置和方法
本发明涉及确定感兴趣的活实体针对第一组环境条件和第二组环境条件的代谢适应性的方法，该方法包括(a)用第一底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；(b)用第二底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM；以及(c)基于将步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种非线性活性与步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种其它活性进行比较，确定所述活实体的代谢适应性。本发明还涉及与其相关的设备和其它方法；以及氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽。
在生态学、医学和生命科学的其它领域，确定活细胞适应特定环境条件的能力非常重要，因为适应与否的能力可决定细胞命运。适应性测试通常包括将感兴趣的细胞维持在待测试的环境条件下，并且评估存活和/或增殖。然而，在未知特定细胞生长条件的情况下，该过程可能很麻烦，并且其实用性可能受到限制。尽管如此，在例如癌症治疗中，确定细胞是否能够在缺氧条件下转换为例如能量产生是合乎需要的。
近来，酶丙酮酸激酶M2(PKM2)被识别为癌症治疗的特异性靶标，其特别地在癌细胞中产生。PKM2是糖酵解的定步酶并且以两种形式出现：四聚体形式用于需氧降解葡萄糖(氧化磷酸化)并且针对底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)具有低KM值；因此，四聚体形式在PEP的生理浓度下具有很高活性，从而导致葡萄糖进入能量代谢。PKM2的二聚体形式针对PEP具有高KM值，并且在PEP的生理浓度下几乎没有活性，从而在丙酮酸进入合成过程之前，特别是在氧气供应有限的情况下的糖酵解中产生糖酵解中间体。
还报道了恶性细胞中的中心碳代谢受缺氧条件下(与常氧相比)糖酵解酶活性变化的调节，并且这种变化与不良的临床结果相关联(EP2821790A1；WO2017/098051 A2；Gdynia等人，(2018)，EBioMedicine 32：125)。尽管如此，肿瘤细胞的代谢与非肿瘤细胞的代谢在许多方面不同(Gatenby等人，(2004)，Nature Reviews Cancer 4：891；Amoedo等人，(2013)，Biosci.Rep.33：e00080)。
其免疫细胞不能被通常可有效激活人类免疫系统的内源性或外源性刺激(例如DAMP(损伤相关分子模式)、PAMP(病原相关分子模式)((Lee等人，(20189，PNAS 115(19)：E4463；；Venereau等人，(2012)，J.Exp.Med.209(9)：1519)激活的患者和对这些刺激有反应的那些患者(即具有可激活的免疫细胞)之间的区别是医学上的主要挑战。这在如下方面中特别重要：其中患者的结果与可激活的免疫系统交织在一起的疾病(Cheng等人，(20169，Nat Immunol.，17(4)：406；Alves-Filho等人，(2016)，Front.Immunol.；doi：10.3389/fimmu.2016.00145)，例如在病原体诱导的炎症、自身免疫性疾病，脓毒症、癌症的发展、进展或复发、通过增强免疫反应(例如使用检查点抑制剂)进行癌症的治疗、免疫缺陷性疾病、免疫细胞衰竭(例如，预防/预测细胞免疫疗法中的T细胞衰竭)(Cascone等人，(2018)，CellMetabolism 27：977)，组织修复(Venereau等人，(2012)，ibd.)、受伤/局部缺血组织内/向受伤/局部缺血组织(例如血液、骨髓、心脏、冠状动脉、血管、骨骼、脑、神经、髓鞘)的免疫(干)细胞的增殖和/或迁移(Arts等人，(2017)，J.Leukoc.Biol.101：151；Delano等人，(2016)，JCI 26：23；Wasmuth等人，(2005)，Journal of Hepatology 42：195)、和合成免疫学领域(Roybal等人，(2017)，Annu.Rev.Immunol.35：229；Irving等人，(2017)，Front.Immunol.doi：10.3389/fimmu.2017.00267)。同时，人们认为免疫细胞的激活与免疫代谢的显著变化有关。必须适当控制糖酵解的免疫力并且防止自身免疫。此外，有证据表明，发炎的组织被剥夺了氧，形成了需要糖酵解才能生存的环境(Pearce等人，(2013)，Immunity 38(4)：633)。但是迄今为止，没有临床工具允许快速、可行地区分不可激活的免疫细胞和可激活的免疫细胞。
因此，本领域需要提供可靠的装置和方法来测试活细胞适应特定环境条件的能力；特别地，需要预测免疫细胞的激活倾向，优选地需要在不需要复杂的富集和/或激活程序的快速测定中预测免疫细胞的激活倾向。特别地，需要提供至少部分地避免如上所述现有技术缺点的装置和方法。
该问题通过具有独立权利要求的特征的方法和设备来解决。从属权利要求中列出了可以以单独方式或以任意组合实现的优选实施方案。
因此，本发明涉及确定感兴趣的活实体对第一组环境条件和第二组环境条件的代谢适应性的方法，该方法包括
(a)用第一底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的活性；
(b)用第二底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的活性；
其中，所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM，并且其中，步骤(a)和(b)中确定的所述活性中的至少一种是非线性活性；以及
(c)基于将步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种非线性活性与步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种其它活性进行比较，确定所述活实体的代谢适应性。
此外，本发明涉及用于确定包含免疫细胞的测试样品中的所述免疫细胞的激活状态的方法，该方法包括
(a)在常氧条件下孵育所述包含免疫细胞的测试样品的第一子部分，
(b)在缺氧条件下孵育所述包含免疫细胞的测试样品的第二子部分，
(c)确定在所述第一子部分和第二子部分的细胞中至少高亲和力丙酮酸激酶(PKHA)和低亲和力丙酮酸激酶(PKLA)的活性，
(d)比较步骤(c)中确定的所述活性，以及
(e)基于比较步骤(d)的结果，确定所述测试样品中所述免疫细胞的激活状态。
用于确定激活状态的方法优选地是体外方法。此外，除了上面明确提到的那些步骤外，还可以包括其它步骤。例如，其它步骤可以涉及例如提供步骤(a)和(b)的测试样品及其子部分。此外，可以确定在步骤(a)的子部分、步骤(b)的子部分或其它子部分中至少一种细胞因子的分泌。此外，所述步骤中的一个或多于一个可以通过自动化设备执行。优选地，如在EP 2 821 790 A1中所描述的那样执行用于确定激活状态的方法，将该专利的全部公开内容通过引用并入本文。
如下所使用的，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变体形式以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在此上下文中描述的实体中不存在其它特征的情况，也可以指存在一个或多于一个其它特征的情况。例如，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”都可以指如下情况：除B之外，A中不存在其它要素的情况(即，A唯一地并且排他地由B组成的情况)；和除B之外，实体A中还存在一个或多于一个其它要素，例如要素C、要素C和D或甚至其它要素的情况。
此外，如下所用，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与可选的特征结合使用，而不限制其它可能性。因此，由这些术语引入的特征是可选特征，并且并不意在以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代特征来进行。类似地，“在一个实施方案中”或类似表述所引入的特征意在是可选特征，对本发明的其它实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对以这种方式引入的特征与本发明的其它可选或非可选特征组合的可能性也没有任何限制。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“标准条件”是指IUPAC标准环境温度和压力(SATP)条件，即优选25℃的温度和100kPa的绝对压力；此外优选地，标准条件包括pH为7。此外，如果没有另外说明，则术语“约”涉及具有相关领域中公认的技术准确度的指定值，优选涉及±20％，更优选±10％，最优选±5％的指定值。此外，术语“基本上”表示不存在对指示的结果或使用有影响的偏差，即，潜在的偏差不会使指定的结果偏差超过±20％，更优选±10％，最优选±5％。因此，“基本上由……组成”是指包括指定的成分，但排除了其它成分，如下除外：作为杂质存在的物质，由于用于提供成分的工艺所产生的不可避免的物质，和为除实现本发明的技术效果以外的目的而添加的成分。例如，使用短语“基本上由……组成”定义的组合物涵盖了任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组成分组成的组合物将包含小于5重量％，更优选小于3重量％，甚至更优选小于1重量％，最优选小于0.1重量％的一种或多于一种非特定成分。在核酸序列的上下文中，术语“基本上相同”表示至少80％，优选至少90％，更优选至少98％，最优选至少99％的％同一性值。如将理解的，术语基本上相同包括100％的同一性。前述内容比照适用于术语“基本上互补”。
本领域技术人员将术语“免疫细胞”理解为涉及对象的正常免疫系统的所有细胞，包括基因修饰的免疫细胞和具有免疫细胞样特性的非免疫细胞。免疫细胞的替代名称为“白细胞”和“白血细胞”。优选地，该术语涉及至少潜在地涉及与对象的免疫反应有关的所有细胞，并且特别地包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、粒细胞及其混合物。优选地，免疫细胞具有在免疫系统内执行其正常功能的倾向；因此，免疫细胞为非恶性免疫细胞。更优选地，免疫细胞为单核细胞，即优选T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞或其混合物。更优选地，免疫细胞为外周血单核细胞(PBMC)，即，特别是从外周血分离的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞的混合物。更优选地，免疫细胞为T细胞或造血干细胞，更优选为CD34+造血干细胞。还优选地，免疫细胞可以包含在以下本文所指的其它样品类型中和/或与以下本文所指的其它样品类型分离。基因修饰的免疫细胞优选是经基因修饰的，优选离体基因修饰的并且可以用于治疗的免疫细胞。优选的基因修饰的免疫细胞为CAR T细胞和CRISPR修饰的免疫细胞。具有免疫细胞样特性的非免疫细胞是本领域已知的，例如来自Kojima等人，(2017)Nature Chemical Biology，doi：10.1038/nchembio.249。
如本文所用，术语“测试样品”涉及任何包含或怀疑包含免疫细胞的物质的组合物。因此，测试样品可以是体液样品，分离和/或培养的细胞样品，或来自组织或器官的样品或从体外或体内表面获得的洗涤/冲洗液的样品。测试样品可以通过公知的技术获得，并且优选包括来自任何体表、体腔、器官或组织的刮擦、拭子或活检。这样的测试样品可以通过使用刷子、(棉)拭子、刮铲、冲洗/洗涤液、穿刺活检设备、用针或手术器械穿刺腔来获得。然而，本发明的方法也包括血液、脑脊髓液、尿液、唾液、泪液或粪便的测试样品。组织或器官测试样品可以通过例如活检或其它手术程序从任何组织或器官获得。可以从体液或组织或器官中通过分离技术例如过滤、离心或细胞分选来富集免疫细胞。优选地，从已知或怀疑包含免疫细胞的那些细胞、组织或器官中获得细胞、组织或器官的测试样品。应当理解，可以进一步处理测试样品以实施本发明的方法，特别是如权利要求、实施方案和实施例中所指的。优选地，对测试样品进行预处理以获得包含在所述测试样品中的活免疫细胞。优选地，获得子部分，使得在如下获得的所有子部分中存在相似数目免疫细胞的可能性很高：例如，通过提供相似大小的组织切片，优选从随后的切削中获得；或通过提供大致相等数量的小组织切屑，或通过酶消化(例如用胰蛋白酶)消化测试样品以分离细胞并且提供相似的细胞数目。优选地，测试样品是血液测试样品，优选外周血。还优选地，测试样品是来自感染部位的组织或体液样品。还优选地，测试样品是肿瘤样品，更优选癌症样品、例如优选肿瘤活检样品。还优选地，测试样品是淋巴组织样品。然而，还预想该测试样品是培养细胞样品。
优选地，测试样品包含不同类型细胞的混合物，其中测试样品中至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选至少85％的细胞是免疫细胞。优选地，在测试样品预处理之后，预处理的测试样品中和/或从其得到的子部分中至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选至少85％的细胞是免疫细胞。优选地，测试样品包含基本上100％的免疫细胞，优选地为一种免疫细胞例如T细胞或造血干细胞，更优选地为CD34+造血干细胞，特别是在测试样品是经富集和/或培养的免疫细胞样品的情况下。
如本文所用，术语“激活状态”涉及是否能够在对象的免疫反应中执行功能的免疫细胞状态。如本文所用，免疫细胞为“活化”的激活状态涉及其中所述免疫细胞，可选地为在激活或另外的激活之后，在对象的免疫反应中呈现其特征性功能的状态。因此，优选地，处于活化激活状态的免疫细胞是活化的，并且任选地可以通过适当刺激而进一步激活。相反，免疫细胞为“未活化”的激活状态涉及这样的状态，其中即使在施用同源抗原之后，所述免疫细胞也在对象的免疫反应中不呈现其特征性功能。因此，优选地，处于未活化激活状态的免疫细胞是无反应的。还优选地，未活化免疫细胞可以通过使所述免疫细胞与至少一种如下文所述激活剂化合物接触而被激活。
在本说明书的上下文中，术语“激活剂化合物”是本领域技术人员已知的，其涉及提供共刺激信号激活免疫细胞，特别是无能免疫细胞，例如粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)，优选人GM-CSF(hGM-CSF)，其原则上是本领域已知的。优选的激活剂化合物是合成的和/或重组的化合物，优选地为具有激活免疫细胞，优选地为激活选自T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、粒细胞及其混合物中的至少一种免疫细胞的生物学活性的多肽。优选地，与在不存在激活剂化合物下孵育的对照相比，免疫细胞的激活被测量为增殖的增加、趋化性的增加和/或细胞因子的分泌的增加。
优选地，激活剂化合物是高迁移率族Box 1多肽或其衍生物。如本文所用，术语“高迁移率族Box 1多肽”(HMGB1多肽)是指本领域技术人员已知的高迁移率组多肽的成员；或涉及具有抑制四聚体形式PKM2活化的活性的部分序列或其衍生物。优选地，HMGB1多肽是人HMGB1多肽(Genbank ACC No：NP_002119.1 GI：4504425，SEQ ID NO：3)或具有如上所述活性的部分序列或其衍生物。在例如WO 2017/098051、WO 2018/108327及所附实施例中描述了用于测量前述活性的合适测定法。HMGB1多肽可以从细胞或组织中纯化，或者可以化学合成，或者优选地可以重组制造，并且任选地进行生物或化学修饰。HMGB1多肽可以包含可用作纯化或检测标签的其它氨基酸，和/或HMGB1多肽可以被本文另外所指的融合多肽所包含。HMGB1多肽的优选形式和衍生物是(i)包含HMGB1，优选至少包含HMGB1的Box B，更优选包含SEQ ID NO：2多肽的多肽；(ii)包含磷酸化的HMGB1多肽，优选包含人HMGB1的多磷酸化的Box B的多肽；(iii)包含寡磷酸化的HMGB1多肽或其衍生物的多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为不可磷酸化的氨基酸，优选谷氨酰胺(SEQ ID NO：4)，更优选如WO 2017/098051中所述，(iv)包含HMGB1多肽的多肽，其中，至少两个半胱氨酸残基，优选A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45通过烷基桥，优选乙基桥共价连接；(v)包含磷酸化模拟的HMGB1多肽的多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸(SEQ ID NO：5)，更优选如WO 2018/108327中所述；(vi)包含SH-烷基化的HMGB1多肽的多肽；(vii)(i)至(vi)的任何组合和/或混合物。(i)至(vi)的优选组合是(iv)和(v)及(v)和(vi)的组合。因此，优选地，HMGB1多肽的更优选衍生物是(i)包含HMGB1多肽的多肽，其中至少两个半胱氨酸残，优选A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45通过烷基桥，优选乙基桥共价连接；并且其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸；和(ii)包含SH-烷基化的HMGB1多肽的多肽，其中，对应于所述HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸。
优选地，术语“磷酸化的HMGB1多肽”是指在选自Y109、Y144、Y155和Y162的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个位置上被酪氨酸磷酸化的HMGB1多肽。还优选地，包含HMGB1多肽的B-box基序的多肽在选自对应于HMGB1多肽的Y109、Y144、Y155和Y162的位置的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个位置上被磷酸化，更优选被酪氨酸磷酸化。最优选地，多磷酸化的HMGB1多肽是在前述四个酪氨酸残基处被磷酸化且另外在至少一个其它残基，优选丝氨酸和/或苏氨酸残基处，优选在多肽的B-Box内被磷酸化的HMGB1多肽，。
优选地，术语“寡磷酸化的HMGB1多肽”涉及如下HMGB1多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为不可磷酸化的氨基酸，优选谷氨酰胺。优选地，在选自对应于Y109、Y144、Y155和Y162的位置中的至少一个，更优选至少两个，甚至更优选至少三个，最优选所有四个位置上交换为寡磷酸化HMGB1多肽中的不可磷酸化的氨基酸。最优选地，寡磷酸化的HMGB1多肽是其中所有四个前述酪氨酸残基被交换为谷氨酰胺残基的HMGB1多肽。
优选地，术语“磷酸化模拟的HMGB1多肽”涉及如下HMGB1多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸。优选地，在选自对应于Y109、Y144、Y155和Y162的位置中的至少一个，更优选至少两个，甚至更优选至少三个，最优选所有四个位置上交换为磷酸化模拟的HMGB1多肽中的酸性氨基酸。最优选地，磷酸化模拟的HMGB1多肽是其中所有四个前述酪氨酸残基被交换为谷氨酸残基的HMGB1多肽。
本文所用的术语“氧化还原固定的HMGB1衍生物”多肽涉及如下HMGB1衍生物，其中至少一个半胱氨酸残基被修饰使得不再可能形成二硫基。因此，优选地，在氧化还原固定的HMGB1衍生物中，不必修饰所有的半胱氨酸残基便使得不再可能形成二硫基。更优选地，氧化还原固定的HMGB1衍生物是磷酸化模拟的HMGB1衍生物。优选地，氧化还原固定的HMGB1衍生物是如下文所指的SH-烷基化的HMGB1衍生物，或者还优选地，氧化还原固定的HMGB1衍生物是其中至少两个半胱氨酸残基通过烷基桥，优选乙基桥共价连接的HMGB1衍生物。优选地，至少两个半胱氨酸残基是HMGB1的A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45。
术语“SH-烷基化的HMGB1多肽”是本领域技术人员所理解的。优选地，该术语涉及如下HMGB1多肽，其中，至少一个半胱氨酸残基的-SH基团被化学修饰成不可氧化的衍生物；优选地，所述衍生物是碘乙酸或碘乙酰胺衍生物。优选地，所述衍生化在本领域技术人员已知的还原条件下进行的。还优选地，至少两个，更优选至少三个，最优选所有可获得的半胱氨酸残基被衍生化。
还优选地，激活剂化合物是提供HMGB1多肽或其衍生物的试剂，术语“提供HMGB1多肽或其衍生物的试剂”优选地涉及具有将如本文所指的HMGB1多肽或其衍生物释放至生物系统的能力的任何试剂或组合物。优选地，提供HMGB1多肽或其衍生物的试剂以诱导血浆浓度为1nM至1000nM，更优选10nM至250nM，最优选为25nM至150nM的剂量使用。
还优选地，激活剂化合物是PKM2活性的抑制剂，更优选地，使PKM2的四聚体形式不稳定的化合物，甚至更优选地，是P-M2tide(酪氨酸磷酸化肽GGAVDDDYAQFANGG(SEQ ID NO：1))或其衍生物，所述P-M2tide的衍生物具有抑制PKM2活性或提供在对象体内代谢时具有所述活性的化合物。优选地，PKM2活性抑制剂以小于0.1mM，更优选小于0.05mM，最优选小于0.01mM的浓度使用；或者，优选地，以诱导血浆浓度为小于0.1mM，更优选小于0.05mM，最优选小于0.01mM的剂量使用。还优选地，PKM2活性的调节剂以0.0005mM至0.1mM，更优选0.001mM至0.05mM，最优选0.005mM至0.01mM的浓度使用；或者，优选地以诱导血浆浓度为0.0005mM至0.1mM，更优选为0.001mM至0.05mM，最优选为0.005mM至0.01mM的剂量使用。
优选地，本文所用的多肽或其衍生物是指具有作为激活剂化合物和/或作为PKM2抑制剂的活性的多肽本身或其衍生物；因此，该术语优选地还包括包含与(多)肽至少70％同一性并且具有如上所述一种或多于一种活性的氨基酸序列的多肽。优选地，该术语还涉及与包括HMGB1多肽或其衍生物的免疫细胞特异性结合的试剂。优选地，所述与免疫细胞特异性结合的试剂是抗体、适配体、凝集素等。还优选地，提供HMGB1多肽或其衍生物的术语试剂涉及诱导分泌HMGB1多肽的HMGB1分泌细胞。可以诱导分泌HMGB1的细胞及其制备方法是本领域已知的；可以诱导分泌HMGB1的优选细胞是巨噬细胞和NK细胞。还优选地，提供HMGB1多肽或其衍生物的术语试剂涉及编码HMGB1多肽或其衍生物的可表达多核苷酸。如本领域技术人员将理解的，所述多核苷酸优选地包含在载体或宿主细胞中。
术语“孵育”是本领域技术人员所理解的，并且优选地涉及将细胞维持在允许所述细胞存活和/或增殖的条件下。维持免疫细胞的优选条件是本领域技术人员已知的，并且在本文实施例中描述。优选地，选择孵育条件，使得第一子部分和第二子部分之间孵育条件的唯一差异是指定的条件，优选氧气供应或其替代物。优选地，孵育持续6h至24h，更优选7h至15h，甚至更优选10h至14h，最优选12h±1h。优选地，将第一子部分和第二子部分孵育相同的时间段，即第一子部分和第二子部分之间的孵育时间差优选为至多1h，更优选为至多0.5h，甚至更优选为至多0.25h。优选地，将测试样品在标准细胞培养条件下预处理至少12h，更优选至少18h，最优选至少24h。
根据本发明，将测试样品的至少第一子部分在常氧条件下，即优选地在包括对应于正常组织中的氧含量(约1％至10％)至空气中的氧含量(21％氧气)的浓度范围的氧气的气氛下，优选在标准条件下孵育。因此，优选地，常氧条件下的氧浓度为至少1％，更优选为至少5％，更优选为至少10％；最优选地，氧浓度为21％。还优选地，常氧条件下的氧浓度为1％至30％，优选为1％至21％，更优选为5％至21％，最优选为10％至21％。
根据本发明，将测试样品的至少第二部分在缺氧条件下，即在包括诱导正常细胞缺氧反应的氧浓度的气氛下孵育。优选地，缺氧条件下的氧浓度为至多0.5％，更优选为至多0.3％，甚至更优选为至多0.1％，最优选为0％。优选地，缺氧条件下的氧浓度为0％至0.5％，更优选为0％至0.3％，最优选为0％至0.1％。还优选地，可在通过缺氧的药理学替代物确定激活状态的方法中诱导缺氧样条件；在本发明的上下文中，缺氧的药理学替代物是抑制氧化磷酸化的药理化合物；缺氧的药理学替代物例如解偶联剂是本领域中已知的。优选地，缺氧的药理学替代物是丙酮酸激酶，优选丙酮酸激酶M2，更优选高亲和力丙酮酸激酶M2的抑制剂。优选地，丙酮酸激酶抑制剂是包含酪氨酸磷酸化肽GGAVDDDYAQFANGG(SEQ IDNO：1)，优选由酪氨酸磷酸化肽GGAVDDDYAQFANGG(SEQ ID NO：1)组成的肽。
优选地，选择常氧和缺氧条件，使得所述两种氧气浓度之间的显著差异影响至少两个测试样品。因此，常氧和缺氧条件之间的氧浓度差优选为至少1％，更优选为至少2％，甚至更优选为至少10％，最优选为至少20％。
确定酶活性、特别是高亲和力丙酮酸激酶及低亲和力丙酮酸激酶的酶活性的方法是本领域已知的。优选地，该方法中，确定其它酶的活性，其它酶特别是己糖激酶、苹果酸脱羧酶、乳酸脱氢酶(LDH)和细胞色素c氧化复合物IV中的至少一种。优选地，确定至少高亲和力丙酮酸激酶、低亲和力丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的活性。酶活性可以如教科书中所述和本领域技术人员已知例如EP 2 821 790 A1中所述的那样来测量。表1总结了用于确定相关酶活性的优选测定法和反应条件。
表1：示例性酶测定
Figure BPA0000307001190000111
优选地，确定的活性被确定为相对活性，即与已知不受氧可利用性影响的酶例如看家酶的活性相比的活性。更优选地，确定的活性是比活性，即每质量蛋白质的活性(例如以U/mg表示)。本领域技术人员将理解，上述用于高亲和力PK的测定法不能区分丙酮酸激酶M1(PKM1基因的产物)活性和高亲和力酸激酶M2(PKM2基因的产物)活性；因此，在该测定中，将分别确定存在于测试样品子部分中的所有丙酮酸激酶的总活性。
如本文所用，术语“丙酮酸激酶M”或“PKM”涉及PKM基因，优选人PKM基因的产物之一。从PKM基因转录出几个剪接变异体，其产生同工酶。同种型a，也称为丙酮酸激酶M1(PKM1，Genbank Acc.No：NP_002645.3)是对底物磷酸烯醇丙酮酸具有高亲和力的四聚体酶。第二同种型的丙酮酸激酶M称之为“丙酮酸激酶M2”或“PKM2”。因此，优选地，本文中所指的PKM为PKM2。优选地，PKM2是哺乳动物PKM2，更优选是人PKM2。优选地，PKM2包含GenbankAcc NO：AAQ15274.1的氨基酸序列，或更优选地由Genbank Acc NO：AAQ15274.1的氨基酸序列组成，优选地由包括Genbank Acc NO：KJ891817.1的核酸序列或由Genbank Acc NO：KJ891817.1的核酸序列组成的多核苷酸编码。PKM2可以对其底物磷酸烯醇丙酮酸具有高亲和力的优选非磷酸化的四聚体形式存在；和以对其底物磷酸烯醇丙酮酸具有低亲和力的优选磷酸化的二聚体形式存在。由于常规活性测定不区分PKM1和高亲和力形式的PKM2，因此术语“高亲和力丙酮酸激酶”，也称为“丙酮酸激酶高亲和力”或“PKHA”包括上述两种同工酶。相比之下，术语“低亲和力丙酮酸激酶”，也称为“丙酮酸激酶低亲和力”或“PKLA”，涉及二聚体形式的PKM2。
根据本发明确定的“比较”活性的步骤是本领域技术人员理解的。如本领域技术人员理解的，分别比较相同类型的酶的活性。因此，优选地，将常氧条件下的LDH活性与缺氧条件下的LDH活性进行比较，将常氧条件下的PKHA活性与缺氧条件下的PKHA活性进行比较，等等。根据本发明的方法，缺氧条件下PKHA或PKLA的活性相较于常氧条件下的活性的强烈变化表明免疫细胞是活化的，即具有活化的激活状态。优选地，所述变化可以是增加或减少；还优选地，所述变化是至少1.5倍，更优选为至少2倍，最优选为至少3倍的变化。相比之下，缺氧条件下PKHA或PKLA的活性相较于常氧条件下的活性的适度变化或无变化或者PKHA和PKLA两者的并行变化表明免疫细胞为非活性的。
优选地，比较步骤(d)包括计算缺氧子部分中的酶活性与常氧子部分中的酶活性的比率。更优选地，前述方法步骤(d)还包括计算一种或多于一种厌氧酶的活性总和与一种或多于一种需氧酶的活性总和的比率。
因此，优选地，步骤(d)包括根据等式(I)计算代谢评分
Figure BPA0000307001190000121
其中
MS：代谢评分；
APKLA/缺氧：缺氧下细胞中的低亲和力丙酮酸激酶的活性；
APKLA/常氧：常氧下细胞中的低亲和力丙酮酸激酶的活性；
ALDH/缺氧：缺氧下细胞中的乳酸脱氢酶的活性；
ALDH/常氧：常氧下细胞中的乳酸脱氢酶的活性；
APKHA/缺氧：缺氧下细胞中的高亲和力丙酮酸激酶的活性；以及
APKHA/常氧：常氧下细胞中的高亲和力丙酮酸激酶的活性。
如将理解的，也可以在两步骤计算方法中提供相同计算，其中，在第一步骤中，优选地，计算归一化的缺氧/常氧酶活性(AX/归一化)，其中X＝感兴趣的酶)：ALDH/归一化＝ALDH/缺氧/ALDH/常氧，APKLA/归一化＝APKLA/缺氧/APKLA/常氧，和APKHA/归一化＝APKHA/缺氧/APKHA/常氧。在第二步骤中，优选地，可以根据例如以下等式(II)来计算代谢评分MS：
Figure BPA0000307001190000131
如从上面将理解的，在用于计算代谢评分MS的公式中，MS值对应于被除数中的求和数除以除数中的求和数，表示免疫细胞的激活状态为未活化的：在等式(II)的上述实施例中，在各自酶的活性在缺氧和常氧下基本上相同的情况下，归一化活性是1；即，如果例如ALDH/缺氧＝ALDH/常氧，则ALDH/缺氧/ALDH/常氧＝1。因此，在这种情况下，MS值＝1+1/1，即MS＝2。因此，在根据等式(I)和(II)之一来计算代谢评分MS的情况下，MS基本上为2表示测试样品包含在缺氧条件下不会主动脱离氧化磷酸化的免疫细胞。因此，在这种情况下，这样的MS表示免疫细胞的激活状态为非活化的。相比之下，在根据等式(I)和(II)之一来计算代谢评分MS的情况下，MS显著偏离2表示测试样品包含在缺氧下主动地从氧化磷酸化转变为糖酵解的免疫细胞。因此，在这种情况下，这样的MS表示免疫细胞的激活状态是活化的。优选地，在根据等式(I)和(II)之一来计算代谢评分MS的情况下，MS与值2的偏差为±0.1，更优选为±0.25，最优选为±0.5表示激活状态为活性。
有利地，在本发明的工作中发现，通过确定免疫细胞从氧化磷酸化转变为糖酵解的倾向，可以确定所述免疫细胞待活化或变得活化的倾向。令人惊讶地发现，在缺氧条件下转变为糖酵解的免疫细胞是活化的，且任选地或，进一步可活化的，而不能进行所述转变的免疫细胞是未活化的，大部分是无反应的。因此，本发明用于确定免疫细胞的激活状态的方法允许预测免疫细胞变得活化的能力并且提高对抗原的免疫反应。
以上所作的定义比照适用于以下内容。下文中作进一步说明的另外定义和解释也比照适用于本说明书中所述的所有实施方案。
本发明还涉及确定感兴趣的活实体针对第一组环境条件和第二组环境条件的代谢适应性的方法，该方法包括
(a)用第一底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；
(b)用第二底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选为约等于或低于所述酶针对所述底物的KM；以及
(c)基于将步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种非线性活性与步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种其它活性进行比较，确定所述活实体的代谢适应性。
本发明的确定代谢适应性的方法是体外方法。该方法可以包括除上面明确提到的那些步骤之外的步骤。例如，其它步骤可以涉及例如提供用于步骤a)和b)的样品，和/或例如通过去除细胞或通过富集一组或一类细胞例如免疫细胞来预处理所述样品。此外，优选在至少一种，更优选至少两种，还更优选至少三种其它底物浓度下确定酶活性，其中所述方法中使用的底物浓度优选彼此不相同。优选地，所述其它底物浓度中的至少一种，更优选至少两种处于与第二底物浓度相同的范围内。因此，优选地，该方法包括至少另外的步骤(b1)：用第三底物浓度确定在所述第一环境条件下维持的所述细胞中包含的所述至少一种酶的活性，并且确定在所述第二环境条件下维持的所述细胞中包含的所述至少一种酶的活性；其中，优选地，所述第三底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM。更优选地，第二底物浓度约等于所述酶针对所述底物的KM，并且第三底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多0.5倍，优选至多0.1倍，更优选至多0.05倍。此外，可以确定多于一种酶的活性；例如如上所述，可以确定至少PKLA、PKHA和LDH的活性。
此外，所述步骤中的一个或多于一个可以由自动化设备执行。如本领域技术人员将理解的，确定步骤(a)和(b)可以由自动化设备例如在高通量环境中执行。此外，确定步骤(c)优选地由自动化设备，特别是计算机程序，优选地如下文所述来执行。因此，优选地，步骤(c)由计算机实施，优选地通过利用具有已知代谢适应性的细胞的步骤(a)和(b)的数据训练自动机器学习算法来实施。优选地，对于确定步骤(c)，计算机实施的算法，优选人工智能算法利用已知适应第一环境条件和第二环境条件的样品数据来训练。优选地，所述训练之后，计算机实施的算法可以提供确定步骤，优选地在不需要另外的用户交互的情况下提供确定步骤。
如本文所用，术语“环境条件”涉及对细胞施加影响的任何可测量参数。优选地，环境条件是氧的可用性、温度、周围介质的pH、CO2浓度、辐射、低分子量化合物的存在、不存在或浓度、周围介质的渗透压等。优选的感兴趣的低分子量化合物是营养物和药物化合物，特别是化学治疗剂。因此，“一组环境条件”是在给定时间对细胞施加影响的一组参数。优选地，第一组环境条件和第二组环境条件的不同之处在于一至五个，优选一至四个，更优选一至三个，甚至更优选一或两个，最优选仅一个环境条件，优选不同之处仅在于氧的可用性方面。然而，还预想第一组环境条件和第二组环境条件的不同之处优选在于氧的可用性和化学治疗化合物的存在/不存在方面；或在于氧的可用性和激活剂化合物的存在/不存在方面。优选地，如上所述，至少一种酶为丙酮酸激酶，优选丙酮酸激酶M2。
术语“对环境条件的代谢适应性”被本领域技术人员理解为涉及响应于至少一种环境条件的变化的细胞的代谢组成和/或活性的可测量变化，并且包括所述细胞中包含的至少一种酶的活性的可测量变化。优选地，所述适应性是至少一种酶的活性、基因表达、RNA剪接、miRNA表达、表观遗传调控等的变化。更优选地，所述适应性是至少一种酶的活性的变化。优选地，环境条件是氧的可用性；因此，优选地，代谢适应性是从常氧下的氧化磷酸化到缺氧下的糖酵解的转变。因此，确定代谢适应性的方法优选地用于如上文所述的确定免疫细胞的激活状态的方法中；还优选地，确定代谢适应性的方法用于确定患有癌症，特别是白血病的对象的预后，优选地如Gdynia等人，(2018)，EBioMedicine 32：125中所述；或用于确定患有不适当的细胞增殖的对象是否适合用药物化合物，特别是化学治疗剂进行的治疗，优选地如Gdynia等人，(2018)，EBioMedicine 32：125中所述；或用于确定患有不适当的细胞增殖的对象是否适合用PKM2活性调节剂进行的治疗，优选地如WO 2017/09805中所述。
术语“活实体”包括任何类型的活细胞、组织、器官或生物体，优选已知或怀疑具有适应环境条件变化的能力。优选地，活实体是古细菌细胞、细菌细胞或真核细胞。更优选地，活实体是多细胞生物体，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人。因此，本文所用的术语“样品”涉及活实体的样品。在活实体是单细胞的或非人多细胞的，优选非哺乳动物多细胞的生物体的情况下，样品优选地包括多个所述活体、活体或其子部分，或包含或已包含所述活体的生长培养基。因此，优选地，样品包含活实体的细胞内酶和/或活实体的细胞外酶。样品还可以包含活体的混合物。还优选地，在活实体是多细胞生物，优选哺乳动物，更优选人的情况下，样品是所述活实体的细胞或体液的样品。优选地，样品包括细胞，更优选地是血液或组织样品。还优选地，样品是无细胞样品，更优选血浆或血清样品。优选地，样品是样品类型，并且如上文所述在测试样品的上下文中提供，该解释比照适用于样品。优选地，样品是如上文所指的测试样品。优选地，样品包含不适当增殖的细胞，即增殖到导致与正常、健康状态的活实体明显偏离程度的细胞。因此，优选地，样品包括癌细胞。还优选地，样品包含如上文所指的免疫细胞。优选地，样品中的细胞以它们包含在样品中的形式使用；更优选地，在进行确定代谢适应性的方法之前，富集感兴趣的细胞，优选富集至如上文对于免疫细胞所指定的浓度。
术语“确定酶的活性”涉及确定由酶催化的反应随时间的进展。确定反应随时间的进展的优选方式包括确定至少一种产物随时间的增加和/或至少一种底物随时间的减少。如将理解的，该术语优选地涉及确定时间间隔内的平均活性。因此，优选地，确定酶的活性包括确定在第一时间点ta和第二时间点tb的产物和/或底物的量，并且将酶的活性表示为在时间间隔Δt＝tb-ta内产物或底物的浓度的变化。优选地，所述时间间隔Δt具有0.1s至10min，优选1s至5min的持续时间。然而，也预想对活性连续测量。
根据确定代谢适应性的方法，在开始确定反应后的两个不相同的时间点确定至少两种活性。因此，优选地，在开始确定反应后的时间点t1(或t3)确定第一活性，并且在开始确定反应后的时间点t2(或t4)确定第二活性。术语“开始确定反应”被本领域技术人员理解为涉及使确定反应发生所需的所有成分组合时的时间点(t0)。优选地，通过添加待确定其活性的酶来开始确定反应。优选地，开始确定反应的时间点与t1和/或t3之间的时间间隔与t1与t2和/或t3与t4之间的时间间隔基本上相同，优选相同。优选地，步骤(a)和(b)的确定是并行进行的；因此，优选t1＝t3并且t2＝t4。优选地，在酶、底物浓度和环境条件的每种组合的不相同时间点确定至少三种活性，更优选地确定至少四种活性，甚至更优选地确定至少五种活性，最优选地确定至少六种活性。如将理解的，可以针对酶、底物浓度和环境条件的每种组合独立选择待确定的活性数目；例如，优选地，在步骤(a)中可以分别确定仅两种活性，并且在步骤(b)中，可以确定至少三种活性，更优选至少四种活性，甚至更优选至少五种活性，最优选至少六种活性。优选地，确定活性的时间点之间的间隔基本上相同，更优选相同。优选地，给定时间点的活性是通过确定在给定时间点(tn)产生的产物量和/或消耗的底物量并且减去前述时间点(tn-1)产生的产物量和/或消耗的底物量来确定的。用于确定活性的优选的测量持续时间和时间间隔可以由本领域技术人员根据本文做出的说明来调整。例如，在根据上表1确定PKLA和PKHA的情况下，可以在至少10min，优选至少20min，更优选至少30min，最优选超过约30min内测量活性，并且优选的测量间隔可以为5min。
优选地，至少一种酶活性是非线性活性。如本文所用，术语“酶的非线性活性”是指使得反应随时间的进展是非线性的在反应开始后的底物浓度和/或时间点的酶活性。如将理解的，所述非线性活性优选是表观活性，其优选地低于在标准测定条件下确定的活性；如还将理解的，术语底物的“第一浓度”和“第二浓度”是指相应测定中底物的起始浓度，同时测定中在确定酶活性的时间点的底物浓度可以较低，这取决于前述酶活性。优选地，如果在第二时间间隔Δt2内在测定中产生的产物量和/或消耗的底物量为第一时间间隔Δt1内在测定中产生的产物量的至多80％，优选至多70％，更优选至多60％，最优选至多50％，其中Δt1＝Δt2并且其中Δt1在Δt2之前，则随时间变化的反应进程，优选产物增加和/或底物减少是非线性的。因此，优选地，如果确定的活性是前一种活性，优选紧接前一种活性的至多80％，优选至多70％，更优选至多60％，最优选至多50％，则酶活性是非线性的。因此，优选地，步骤(a)和(b)的至少一种活性，优选至少两种，更优选至少三种，最优选所有四种活性是非线性活性。优选地，在步骤(a)中，用第一种起始底物浓度随时间确定在所述第一组环境条件下维持的所述感兴趣的细胞中包含的所述至少一种酶的多种活性和/或在所述第二组环境条件下维持的所述细胞中包含的所述至少一种酶的多种活性，和/或在步骤(b)中，用第二种起始底物浓度随时间确定在所述第一组环境条件下维持的所述感兴趣的细胞中包含的所述至少一种酶的多种活性和/或在所述第二组环境条件下维持的所述细胞中包含的所述至少一种酶的多种活性；其中所述活性中的至少一种是非线性活性。因此，方法还可另外包括在导致线性活性的条件下确定所述酶的活性。还优选地，可以调整步骤(a)和/或步骤(b)的一个或两个确定步骤，使得所测量的第一活性是线性的，然而稍后测量的活性是非线性的。
在确定步骤(c)中，将步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种非线性活性与步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种其它活性进行比较。优选地，步骤(b)中确定的至少一种活性是非线性的。因此，优选地，确定所述感兴趣的细胞的代谢适应性基于(i)比较步骤(a)中针对第一环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第一环境条件确定的酶活性；(ii)比较步骤(a)中针对第一环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第二环境条件确定的酶活性；(iii)比较步骤(a)中针对第二环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第一环境条件确定的酶活性；(iv)比较步骤(a)中针对第二环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第二环境条件确定的酶活性；(v)比较步骤(b)中针对第一环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第二环境条件确定的酶活性，或(vi)(i)至(v)的任何组合。如将理解的，优选地，比较在开始确定反应后的相同时间点确定的酶活性，并且更优选地，比较在相同时间间隔内确定的酶活性。
术语“KM”是本领域技术人员已知的酶针对底物的米氏常数，其通常表示在最大速度的一半时催化酶反应的底物浓度。
优选地，第一底物浓度是本领域常规用于确定感兴趣的酶活性的底物浓度。因此，优选地，第一底物浓度是所述酶针对所述底物的KM的至少两倍，优选至少五倍，更优选至少十倍。然而，还预想到第一底物浓度与第二底物浓度在相似范围内，但其与第二底物浓度不同；因此，优选地，第一底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM并且与所述第二底物浓度不相同。在感兴趣的酶具有两种或多于两种底物或一种底物和一种辅底物如NAD(P)的情况下，则上述浓度涉及所述底物中的一种，优选非辅底物的浓度，同时另一种底物的浓度如现有技术中的常规浓度使用。优选地，在至少一种酶是丙酮酸激酶的情况下，底物是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，并且第一浓度是10mM，第二浓度是0.1mM。
有利地并且令人惊奇地，在本发明的工作中发现，通过包括来自非线性酶反应的酶活性数据，可以显著改善活实体对变化的环境条件的适应性分析。
本发明还公开并且提出了一种计算机程序，其包括计算机执行指令，该指令用于当在计算机或计算机网络上执行该程序时，执行本文公开的一个或多于一个实施方案中的根据本发明的方法。具体地，计算机程序可以存储在计算机可读数据载体上。因此，具体地，可以通过使用计算机或计算机网络，优选地通过使用计算机程序来执行上述方法步骤a)至d)中的一个、多于一个或甚至全部。
本发明还公开并且提出了一种具有程序代码装置的计算机程序产品，以便当在计算机或计算机网络上执行该程序时，执行本文公开的一个或多于一个实施方案中的根据本发明的方法。具体地，程序代码装置可以存储在计算机可读数据载体上。
此外，本发明公开并且提出了一种其上存储有数据结构的数据载体，该数据载体在加载到计算机或计算机网络中，例如加载到计算机或计算机网络的工作存储器或主存储器中之后，可以执行根据本文公开的一个或多于一个实施方案的方法。
本发明还提出并且公开了一种计算机程序产品，其具有存储在机器可读载体上的程序代码装置，以便当在计算机或计算机网络上执行程序时，执行根据本文公开的一个或多于一个实施方案的方法。如本文所用，计算机程序产品是指作为可交易产品的程序。产品通常可以以任意格式例如纸质格式存在或在计算机可读数据载体上存在。具体地，计算机程序产品可以分布在数据网络上。
此外，本发明提出并且公开了一种调制数据信号，其包含可由计算机系统或计算机网络读取的指令，用于执行根据本文公开的一个或多于一个实施方案的方法。
优选地，参照本发明的计算机实施的方面，可以通过使用计算机或计算机网络来执行根据本文公开的一个或多于一个实施方案的方法的一个或多于一个方法步骤或甚至所有方法步骤。因此，通常，可以通过使用计算机或计算机网络来执行包括提供和/或处理数据的任何方法步骤。通常，这些方法步骤可以包括任何方法步骤，通常除了需要手动工作的方法步骤外，例如提供样品和/或执行实际测量的某些方面。
具体地，本发明还公开了：
-一种包括至少一个处理器的计算机或计算机网络，其中处理器适于执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种计算机可加载数据结构，其适于在计算机上执行该数据结构时执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种计算机程序，其中计算机程序适于在计算机上执行程序时执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种计算机程序，其包括程序装置，该程序装置用于在计算机上或在计算机网络上执行计算机程序时执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种计算机程序，包括根据前述实施方案的程序装置，其中程序装置存储在计算机可读的存储介质上，
-一种存储介质，其中数据结构存储在该存储介质上，并且其中该数据结构适于在被加载到计算机或计算机网络的主存储器和/或工作存储器中之后执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，以及
-一种具有程序代码装置的计算机程序产品，其中该程序代码装置可以存储或存储在存储介质上，用于在计算机上或在计算机网络上执行时，该程序代码装置执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法。
本发明还涉及一种设备，其包括微处理器并且有形地嵌入算法，在所述微处理器上执行时，该算法至少执行确定代谢适应性的方法的步骤(c)。
如本文所使用的“设备”应包括至少前述装置。此外，设备优选地还包括用于根据所述方法的步骤(a)和/或(b)确定酶活性的装置。因此，优选地，该设备还包括或可操作地连接至适于执行所述方法的步骤(a)和(b)的检测单元。优选地，设备的装置可操作地彼此连接。如何以操作方式连接这些装置将取决于在设备中包括的装置的类型。优选地，单个设备包含多个装置。因此，设备可以包括用于确定活性的分析单元以及包括微处理器和用于处理结果数据以进行评价的嵌入式算法的评估单元。优选的设备是那些无需专业临床医生的特殊知识就可以应用的设备，例如仅需要装载样品的电子设备。可替选地，用于确定至少一种生物标志物的方法可以在包括优选可操作性地彼此连接的多个设备的系统中实施。具体地，装置必须以允许执行如上详述的本发明方法的方式连接。因此，如本文所用，优选地，可操作地连接是指功能性地连接。优选的系统包括用于确定酶活性的装置。如本文所用的，用于确定酶活性的装置包括用于分离分析物的装置，例如色谱设备；以及用于确定分析物的装置，例如质谱设备；还包括用于在线确定活性的装置，例如光学装置，特别是光度、发光或荧光单元。合适的设备是本领域已知的。优选地，设备或系统还包括用于将步骤(c)的结果和/或确定结果输出给用户的输出单元。
本发明还涉及激活免疫细胞的方法，包括根据本发明的方法确定所述免疫细胞的激活状态以及使激活状态为未活化的免疫细胞与激活剂化合物接触。
优选地，激活或进一步激活免疫细胞的方法是体外方法。更优选地，与确定免疫细胞的激活状态有关的步骤为体外步骤，而使激活状态为未活化的免疫细胞与激活剂化合物接触可以在体外和/或体内进行。因此，该方法可以包括另外的步骤，例如提供用于分析或施用其它药物化合物例如抗生素的测试样品。
此外，本发明涉及氧化还原固定的HMGB1衍生物，涉及用于医学上的所述氧化还原固定的HMGB1衍生物；和涉及用于免疫细胞的激活的所述氧化还原固定的HMGB1衍生物。
术语“氧化还原固定的HMGB1衍生物”为如上所述。如上所述，氧化还原固定的HMGB1衍生物优选为如上所述的磷酸化模拟的HMGB1，即优选地是氧化还原固定的磷酸化模拟的HMGB1衍生物。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及用于确定至少一种酶的活性的方法，包括使所述至少一种酶与固定细胞样品的提取物接触，并且确定所述酶的活性。在另一优选的实施方案中，本发明还涉及通过固定细胞样品的提取物确定至少一种酶的活性的调节的方法，包括
(i)提供所述至少一种酶的至少第一和第二等份试样；
(ii)使所述第二等份试样与所述固定细胞样品的提取物接触；
(iii)确定步骤(i)的所述第一等份试样的活性和步骤(ii)的所述第二等份试样的活性；
(iv)比较步骤(iii)中的所述第一等份试样和所述第二等份试样的活性，并且进而
(v)通过固定细胞样品的提取物确定至少一种酶的活性的调节。
优选地，前述方法是体外方法，并且可以包括其它步骤，优选地如本文别处所指定的。此外，一个或多于一个步骤可以由自动化设备辅助进行或可以是完全自动化的，优选如本文别处所指定的。
术语“细胞样品”优选涉及包括细胞，优选免疫细胞和/或癌细胞，优选肿瘤细胞的任何样品。优选地，细胞样品是例如肿瘤的组织样品，还优选地，细胞样品是如上所指的测试样品。
术语“癌症”优选地是本领域技术人员所理解的，并且涉及动物(包括人)的疾病，其特征在于体细胞(“癌细胞”)群不受控制的生长。这种不受控制的生长可伴随着对周围组织的侵入和破坏，并且可能使癌细胞扩散到体内的其它位置。优选地，术语癌症还包括肿瘤复发，即复发。因此，优选地，癌症是实体癌，即形成至少一种可检测的肿瘤、其转移或复发的癌症。优选地，癌症选自如下列表：艾滋病相关的淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑干神经胶质瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、脊索瘤、结肠癌、大肠癌、颅咽管瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、眼内黑色素瘤、卡波济肉瘤、喉癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤病、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞氏综合症、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。优选地，癌症是慢性淋巴性白血病或结肠癌。
优选地，术语“固定”样品涉及经过化学处理以防止或减慢其成分与新鲜样品状态之间的偏差的样品。优选地，固定是可逆的；因此，优选地，样品是醛固定的样品，更优选通过与甲醛和/或戊二醛接触，更优选与甲醛接触而固定。因此，优选地，固定细胞样品是用福尔马林，即优选甲醛水溶液，优选包括10重量/重量％至40重量/重量％，更优选约37重量/重量％甲醛处理的样品。优选地，细胞样品还是包埋的细胞样品，即优选地包埋到优选蜡状固体中的细胞样品，例如以提高可切割性。优选地，细胞样品是石蜡包埋的，更优选是固定的和石蜡包埋的细胞的样品。
术语“固定细胞样品的提取物”优选地涉及从固定细胞样品获得的提取物，至少包括包含在所述样品中的多肽。从固定细胞样品中提取多肽的方法是本领域已知的，并且包括使用信息在内的相关试剂盒是商购可得的。优选地，由固定细胞样品制备提取物包括优选在60℃至90℃，更优选约80℃的温度下加热样品10min至120min，优选约60min。如本领域技术人员将理解的，所需的时间和温度取决于几个因素，例如固定度、样品大小等；本领域技术人员能够根据需要建立适当的条件。优选地，特别是在样品是包埋式固定细胞样品的情况下，在脱蜡步骤之前进行加热步骤；合适的脱蜡条件是本领域中已知的，包括例如用清洁剂如十二烷基硫酸钠和/或有机溶剂例如乙醇处理。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种为患有疾病的患者提供风险分类的方法，该方法包括根据本发明确定酶的活性和/或根据本发明通过固定组织样品的提取物确定酶的活性的调节，其中所述固定细胞样品为所述对象的样品。
术语“提供风险分类”优选地涉及为患有疾病的对象分配风险，即对有利或不利结果的可能性的估计；优选地，所述风险是进展、治疗失败、复发和/或致命结果的风险。因此，提供风险分类优选包括确定针对环境条件的代谢适应性和/或细胞的激活状态，两者均如上文所述。因此，优选地，提供风险分类的方法包括以下步骤：通过根据本发明的固定组织样品的提取物确定酶活性的调节的方法，并且确定步骤(iii)还包括
(I)用第一底物浓度确定所述第一等份试样的至少两种活性和所述第二等份试样的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；以及
(II)用第二底物浓度确定第一等份试样的至少两种活性和所述第二等份试样的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶的针对所述底物的KM。
优选地，疾病是癌症，并且固定细胞样品是固定血细胞，优选固定免疫细胞的样品。还优选地，疾病是癌症，并且固定组织样品是癌症样品，优选肿瘤样品。
优选地，为了提供风险分类，所确定的一种或多于一种酶活性不一定反映固定前细胞样品中一种或多种酶的活性或其相关调节。然而，令人惊奇地发现，在本发明的工作中，可以通过它们对添加到这些提取物中的酶的作用来区分来自不同生理状态的固定细胞样品(例如具有不同预后的肿瘤)的提取物。本文在实施例8中提供细节。
鉴于上述，优选以下实施方案：
实施方案1.一种用于确定包含免疫细胞的测试样品中的所述免疫细胞的激活状态的方法，该方法包括
(a)在常氧条件下孵育所述包含免疫细胞的测试样品的第一子部分，
(b)在缺氧条件下孵育所述包含免疫细胞的测试样品的第二子部分，
(c)确定在所述第一子部分和第二子部分的细胞中至少高亲和力丙酮酸激酶(PKHA)和低亲和力丙酮酸激酶(PKLA)的活性，
(d)比较步骤(c)中确定的所述活性，以及
(e)基于比较步骤(d)的结果，确定所述测试样品中所述免疫细胞的激活状态。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中，在常氧条件下PKHA或PKLA的活性相较于缺氧条件下的活性的强烈变化指示免疫细胞是活化的。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的方法，其中，与在缺氧条件下PKHA或PKLA的活性相较于常氧条件下的活性的适度变化或无变化或者PKHA和PKLA两者的并行变化指示免疫细胞是未活化的。
实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞为外周血单核细胞(PBMC)，优选T细胞或造血干细胞，更优选CD34+造血干细胞。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中，所述测试样品是血液样品，优选外周血、肿瘤样品、淋巴组织样品或培养细胞样品。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中，测试样品中的细胞的至少25％，优选至少50％是免疫细胞。
实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中，在常氧条件下孵育包括在包含至少1％氧气的气氛下孵育至少12h±1h。
实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中，在缺氧条件下孵育包括在包含至多0.1％氧气的气氛下孵育。
实施方案9.根据实施方案8所述的方法，其中，所述丙酮酸激酶抑制剂是包含酪氨酸磷酸化肽GGAVDDDYAQFANGG(SEQ ID NO：1)，优选由酪氨酸磷酸化肽GGAVDDDYAQFANGG(SEQ ID NO：1)组成的肽。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中，步骤(c)还包括确定所述第一和第二子部分的所述细胞中的乳酸脱氢酶(LDH)的活性。
实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括确定在步骤(a)、步骤(b)的子部分中或其它子部分中至少一种细胞因子的分泌。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中，步骤(d)包括根据等式(I)计算代谢评分
Figure BPA0000307001190000261
其中
MS：代谢评分；
APKLA/缺氧：缺氧下细胞中的低亲和力丙酮酸激酶的活性；
APKLA/常氧：常氧下细胞中的低亲和力丙酮酸激酶的活性；
ALDH/缺氧：缺氧下细胞中的乳酸脱氢酶的活性；
ALDH/常氧：常氧下细胞中的乳酸脱氢酶的活性；
APKHA/缺氧：缺氧下细胞中的高亲和力丙酮酸激酶的活性；以及
APKHA/常氧：常氧下细胞中的高亲和力丙酮酸激酶的活性。
实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括根据实施方案14至25中任一项所述方法的步骤。
实施方案14.一种确定感兴趣的活实体针对第一组环境条件和第二组环境条件的代谢适应性的方法，该方法包括
(a)用第一底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；
(b)用第二底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中，所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM；以及
(c)基于将步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种非线性活性与步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种其它活性进行比较，确定所述活实体的代谢适应性。
实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中，所述第一底物浓度(i)为所述酶针对所述底物的KM的至少两倍，优选至少五倍，更优选至少十倍；或(ii)其中所述第一底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶的KM并且与所述第二底物浓度不相同。
实施方案16.根据实施方案14或15所述的方法，其中，步骤(c)包括
(i)比较步骤(a)中对于第一环境条件确定的酶活性与步骤(b)中对于第一环境条件确定的酶活性；
(ii)比较步骤(a)中针对第一环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第二环境条件确定的酶活性；
(iii)比较步骤(a)中针对第二环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第一环境条件确定的酶活性；
(iv)比较步骤(a)中针对第二环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第二环境条件确定的酶活性；
(v)比较步骤(b)中针对第一环境条件确定的酶活性与步骤(b)中针对第二环境条件确定的酶活性，或
(vi)(i)至(v)的任何组合。
实施方案17.根据实施方案14至16中任一项所述的方法，其中，所述方法包括至少一个其它步骤：(b1)用第三底物浓度确定在所述第一环境条件下维持的所述细胞中包含的所述至少一种酶的活性并且确定在所述第二环境条件下维持的所述细胞中包含的所述至少一种酶的活性；并且其中所述第三底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM。
实施方案18.根据实施方案14至17中任一项所述的方法，其中，所述第二底物浓度约等于所述酶针对所述底物的KM并且其中所述第三底物浓度是所述酶针对所述底物的KM的至多0.5倍，优选至多0.1倍，更优选至多0.05倍。
实施方案19.根据实施方案14至18中任一项所述的方法，其中，至少步骤(c)由计算机实施，优选地通过利用具有已知代谢适应性的细胞的步骤(a)和(b)的数据训练自动机器学习算法来实施。
实施方案20.根据实施方案14至19中任一项所述的方法，其中，所述第一环境条件为常氧并且其中所述第二环境条件为缺氧并且其中所述代谢适应性为能量代谢从常氧下的氧化磷酸化到缺氧下的糖酵解的转变。
实施方案21.根据实施方案14至20中任一项所述的方法，其中，所述至少一种酶为丙酮酸激酶，优选丙酮酸激酶M2。
实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中，所述底物为丙酮酸并且其中所述第一底物浓度为10mM，并且其中所述第二底物浓度为0.1mM。
实施方案23.根据实施方案14至22中任一项所述的方法，其中，步骤(a)和(b)包括确定至少高亲和力丙酮酸激酶(PKHA)和低亲和力丙酮酸激酶(PKLA)的活性。
实施方案24.根据实施方案23所述的方法，其中，在缺氧条件下PKHA或PKLA的活性相较于常氧条件下的活性的强烈变化指示从常氧下的氧化磷酸化成功地转变为缺氧下的糖酵解；和/或其中，在缺氧条件下PKHA或PKLA的活性相较于常氧条件下的活性的适度变化或无变化或者PKHA和PKLA两者的并行变化指示从常氧下的氧化磷酸化未成功转变为缺氧下的糖酵解。
实施方案25.根据实施方案14至24中任一项所述的方法，其中，步骤(a)和(b)中确定的所述活性至少之一为非线性活性。
实施方案26.一种包括微处理器并且有形地嵌入算法的设备，当在所述微处理器上执行时，该算法至少执行根据实施方案14至25中任一项所述方法的步骤(c)的算法。
实施方案27.根据实施方案26所述的设备，其中，所述设备还包括或可操作地连接至适于执行根据实施方案14至25中任一项所述方法的步骤(a)和(b)的检测单元。
实施方案28.一种激活免疫细胞的方法，包括使激活状态为未活化的免疫细胞与激活剂化合物接触，其中，所述激活剂化合物选自HMGB1多肽或其衍生物和PKM2抑制剂。
实施方案29.根据实施方案28所述的方法，其中，所述激活剂化合物选自如下列表：
(i)包含HMGB1多肽，优选至少包含HMGB1的Box B，更优选包含SEQ ID NO：2的多肽；
(ii)包含磷酸化的HMGB1多肽，优选包含人HMGB1的多磷酸化的Box B的多肽；
(iii)包含寡磷酸化的HMGB1多肽或其衍生物的多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一种被交换为不可磷酸化的氨基酸，优选谷氨酰胺；
(iv)包含HMGB1多肽的多肽，其中，至少两个半胱氨酸残基，优选A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45通过烷基桥，优选乙基桥共价连接；
(v)包含磷酸化模拟的HMGB1多肽的多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸；
(vi)包含SH-烷基化的HMGB1多肽的多肽；以及
(vii)(i)至(vi)的任何组合和/或混合物。
实施方案30.根据实施方案28或29所述的方法，其中，所述激活剂化合物是(i)包含HMGB1多肽的多肽，其中，至少两个半胱氨酸残基，优选A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45通过烷基桥，优选乙基桥共价连接；并且其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸；和(ii)包含SH-烷基化的HMGB1多肽的多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸。
实施方案31.根据实施方案28至30中任一项所述的方法，其中，在所述接触之前，根据实施方案1至13中任一项所述方法确定所述免疫细胞的激活状态，并且其中，将确定为激活状态为未活化的免疫细胞与所述激活剂化合物接触。
实施方案32.一种氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽。
实施方案33.根据实施方案32的氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽，其为磷酸化模拟的HMGB1衍生物。
实施方案34.根据实施方案32或33的氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽，其中(ii)至少两个半胱氨酸残基，优选A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45通过烷基桥，优选乙基桥共价连接；并且其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸；或(ii)所述多肽为SH-烷基化的HMGB1多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸。
实施方案35.根据实施方案32至34中任一项所述的氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽，其用于医学。
实施方案36.根据实施方案32至34中任一项所述的氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽，其用于免疫细胞的激活。
实施方案37.一种用于确定至少一种酶的活性的方法，包括使所述至少一种酶与固定细胞样品的提取物接触，并且确定所述酶的活性。
实施方案38.一种通过固定细胞样品的提取物确定至少一种酶的活性的调节的方法，该方法包括
(i)提供所述至少一种酶的至少第一和第二等份试样；
(ii)使所述第二等份试样与所述固定细胞样品的提取物接触；
(iii)确定步骤(i)的所述第一等份试样的活性和步骤(ii)的所述第二等份试样的活性；
(iv)比较步骤(iii)中的所述第一等份试样和所述第二等份试样的活性，并且进而
(v)通过固定细胞样品的提取物确定至少一种酶的活性的调节。
实施方案39.根据实施方案37或38所述的方法，其中，所述固定细胞样品是固定的测试样品。
实施方案40.根据实施方案37至39中任一项所述的方法，其中，所述固定细胞样品为醛固定的细胞样品，优选甲醛和/或戊二醛固定的样品，优选甲醛固定的样品。
实施方案41.根据实施方案37至40中任一项所述的方法，其中，所述固定细胞样品是福尔马林固定的细胞样品。
实施方案42.根据实施方案37至41中任一项所述的方法，其中，所述固定细胞样品是福尔马林固定且包埋的细胞样品，优选是福尔马林固定且石蜡包埋的细胞样品。
实施方案43.根据实施方案37至42中任一项所述的方法，其中，所述固定细胞样品是固定组织样品。
实施方案44.根据实施方案37至43中任一项所述的方法，其中，所述至少一种酶包括在固定之前预期或已知存在于所述细胞样品中的酶。
实施方案45.根据实施方案37至44中任一项所述的方法，其中，所述至少一种酶包含，优选是主要代谢途径的酶，优选为糖酵解、柠檬酸循环、脂肪酸合成、核苷酸生物合成或氨基酸生物合成的代谢途径的酶。
实施方案46.根据实施方案37至45中任一项所述的方法，其中，所述至少一种酶包含，优选是高亲和力丙酮酸激酶(PKHA)、低亲和力丙酮酸激酶(PKLA)和乳酸脱氢酶(LDH)中的至少一种。
实施方案47.一种为患有疾病的患者提供风险分类的方法，包括根据实施方案37或39至46中任一项确定酶的活性和/或根据实施方案38至46中任一项通过固定组织样品的提取物确定酶的活性的调节，其中，所述固定细胞样品为所述对象的样品。
实施方案48.根据实施方案47所述的方法，其中，所述提供风险分类包括确定所述固定细胞样品中包含的细胞针对环境条件的代谢适应性和/或细胞的激活状态。
实施方案49.根据实施方案47或48所述的方法，本文所述疾病是癌症，并且其中，所述固定细胞样品是固定血细胞，优选固定免疫细胞的样品。
实施方案50.根据实施方案47至49中任一项所述的方法，其中，所述疾病是癌症，并且其中，所述固定组织样品是癌症样品，优选肿瘤样品。
实施方案51.根据实施方案47至50中任一项所述的方法，其中，所述方法包括根据实施方案38至46中任一项通过固定组织样品的提取物来确定酶活性的调节的方法的步骤，并且其中，所述确定步骤(iii)还包括
(I)用第一底物浓度确定所述第一等份试样的至少两种活性和所述第二等份试样的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；以及
(II)用第二底物浓度确定第一等份试样的至少两种活性和所述第二等份试样的至少两种活性，其中在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM。
关于本说明书中引用的所有参考文献，其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容通过引用并入本文。
附图说明
图1：在指定条件下PBMC的增殖；P-M2tide：通过与P-M2tide孵育诱导糖酵解；A)对照(无激活剂化合物)；B)添加hGM-CSF；C)至G)添加HMGB1或其变体。
图2：在缺氧条件下，在不存在和存在P-M2tide下及在存HMGB1或其变体下PBMC的趋化性；值是在具有合适二硫键的人4E-HMGB1(S-S 4E-hHMGB1)存在下相对于所示化合物的改善％。
图3：在富含CD34+的人造血脐带血细胞中的通过HMGB1细胞因子4E-hHMGB1、4Q-hHMGB1和烷基化4E-hHMGB1诱导趋化性。
图4：实施例7中患者样品处理的示意图；类似地处理实体瘤(CRC)样品，但在3mlRPMI培养基中孵育碎片化的CRC组织而不是细胞悬浮液。NX＝常氧(有氧)条件；AX＝缺氧(厌氧)条件。
图5：使用EnFin-TestTM试剂盒进行酶动力学分析的移液方案和设置。
图6：数据评价；将显示时间序列数据(A)的矩阵融合(R的融合函数)到单个向量，其中在168个要素中表示了所有时间点、阳性与阴性对照(噪声)以及两个条件(有氧/无氧)。这些向量用于训练机器学习算法(B)：SVM(左上)，亮灰色点表示决策边缘的支持向量，中间灰色和深灰色点表示两类(“0”或“1”)，决策树(C5.0和随机森林，底部)显示用于多数表决的n-树和(前馈)神经网络(右上)，此处具有输入和输出层以及两个隐藏层，点表示神经元；作为纯化酶添加的酶称为“Avatar酶”。
图7：实施例7中与如下指定的固定细胞提取物接触的指定酶的活性：A)PKLA/来自患者1或2的提取物，B)PKLA/来自患者3或4的提取物，C)PKLA/来自患者5或6的提取物；D)LDH/来自患者3或4的提取物，以及D)PKHA/来自患者1或2的提取物。
下列实施例将仅说明本发明。它们决不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：
本文使用的细胞模型区分免疫激活环境和免疫抑制环境。免疫激活环境包括生长因子/血清的补充，并且允许血液衍生的免疫细胞的生长和存活。免疫抑制环境包括生长因子/血清的剥夺(饥饿)并且减少血液衍生的免疫细胞的生长和存活。患者血液/组织中免疫细胞的生长和存活对于适当发挥功能/激活免疫系统具有决定性作用，并且被视为免疫系统功能的指标(Pearce等人，(2013)，Immunity 38(4)：633；Odegaard等人，(2013)，Immunity 38：644)。在两种情况下，药理学导致厌氧糖酵解的转变，并且将免疫细胞的增殖和存活与未修饰的免疫细胞进行比较。作为原理证明，我们可以证明未修饰的免疫细胞(通过本文所述的血液试验无法检测到厌氧糖酵解)仅在免疫抑制环境中显示出增殖和存活降低。因此，通过将要求保护的测试方法应用于血液衍生的免疫细胞，可以检测到无活化/无反应免疫细胞。重要的是，可将在免疫抑制条件下变为无反应的无反应免疫细胞(例如来自免疫抑制的患者)与尽管暴露于相同免疫抑制条件但仍可活化的免疫细胞(例如来自免疫抑制的患者)区分开。这可以特异性鉴定出无反应的免疫细胞，并且如果需要(例如在免疫瘫痪患者中)，应该用适当试剂刺激。
实验设置(图1A)
(a)对照10％FCS：免疫激活环境，免疫细胞显示出在中心碳代谢(CCM)内转变为厌氧糖酵解，因此患者免疫系统为活化的。验血结果：2.67(显著改变，参考间隔2.0±0.3)。
(b)对照10％FCS+P-M2tide：免疫激活环境，细胞显示出在CCM内转变为厌氧糖酵解，因此患者免疫系统为活化的。验血结果：0.30(显著改变，参考间隔2.0±0.3)。
(c)对照饥饿：免疫抑制环境，免疫细胞显示出CCM内未转变为厌氧糖酵解，因此患者免疫系统为无活化/无反应的。验血结果：2.14(未改变，参考间隔2.0±0.3)。
(d)对照饥饿+P-M2tide：免疫抑制环境，免疫细胞显示出CCM内转变为厌氧糖酵解，因此患者免疫系统为活化的。验血结果：1.37(显著改变，参考间隔2.0±0.3)。
从OXPHOS到糖酵解的转变发生在免疫细胞激活后(Palsson-McDermott等人，(2015)，Cell Metabolism 21：65；Pearce等人，(2013)，Immunity 38(4)：633)。为了测量最大程度的转变，必须完全消除OXPHOS，这是通过在缺乏氧(缺氧)下培养免疫细胞来实现的，其中由于缺乏作为底物的氧而使OXPHOS不活化。
实施例2
为了评估无反应免疫细胞可刺激的程度和试剂，我们使用重组人GM-CSF(20ng/ml，图1B)或刺激人HMGB1细胞因子的免疫系统重组/合成变体(200nM，图1C-G)。
在对照细胞中，在免疫抑制条件(饥饿)下，具有增加的测试评分(即显示出通过本发明的验血所测量的CCM内从OXPHOS到糖酵解的转变)的单核人血液供体细胞没有死亡。用人粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行的治疗可部分挽救未转换为厌氧糖酵解(不变的测试评分)的免疫抑制的细胞，然而显示出向厌氧糖酵解转变的免疫抑制的细胞能够从细胞死亡中完全挽救出并且显示出增加的增殖(和存活率)(与未刺激的对照样品相比)。野生型人重组HMGB1(高迁移率组box 1蛋白)，一种有效的免疫刺激细胞因子，和DAMP未能增加免疫细胞的增殖和存活率。重组人4E-HMGB1(HMGB1的变体，其中四个酪氨酸残基交换为谷氨酸残基，本文中如上所述；WO 2018/108327)增加了显示出向厌氧糖酵解转变的非抑制免疫细胞的增殖，并且还增加了显示出向厌氧糖酵解转变的免疫抑制免疫细胞(饥饿)的存活率和增殖。然而，与hGM-CSF刺激的细胞相比，它对显示出这种转变的受抑制的免疫细胞的增殖和存活具有适度作用。相反，重组人4Q-HMGB1(具有四个酪氨酸残基交换为谷氨酰胺残基的HMGB1的变体，本文中如上所述；WO2017/098051)显示出与4E-hHMGB1相比对未转变为厌氧糖酵解的免疫抑制的细胞的弱刺激，，并且已转变为厌氧糖酵解的免疫抑制细胞的刺激没有显著增加(与对照细胞相比)。
为了有效地增强对免疫抑制细胞的刺激(达到至少如在暴露于免疫抑制条件的可激活免疫细胞中的水平)，我们以如下两种方式改变最有希望的免疫刺激重组HMGB1变体4E-hHMGB1的化学结构：(i)将SH(巯基)残基(现通过4E-hHMGB1中的烷基化不可逆地还原残基Cys-23、Cys-45和Cys-106)改变为稳定的烷基化残基(不可氧化(还原烷基化)形式；烷基4E-hHMGB1)和(ii)将永久性二硫键引入蛋白质结构(A-Box结构域，残基Cys-23和Cys-45现于4E-hHMGB1中形成稳定二硫键；S-S 4E-hHMGB1)。烷基4E-hHMGB1刺激导致免疫抑制的免疫细胞的存活率和增殖增加(与对照，hGM-CSF和wt-hHMGB1相比)，然而，其作用比(未烷基化的)4E-hHMGB1小。用合成重组S-S 4E-hHMGB1变体的刺激显示出对活化的(转变为厌氧糖酵解)和未活化的(显示未转变为厌氧糖酵解)免疫抑制的免疫细胞两者均为最佳的存活和增殖效果。与4E-hHMGB1对应物相比，它在未抑制的免疫细胞中激活增殖的程度小，然而，本发明的挑战是(a)识别出当暴露于免疫-抑制条件中为无活化/无反应(未转变为厌氧糖酵解)的免疫细胞和(b)显示它们可以通过本发明提出的新化合物有效地激活，从而消除免疫抑制作用。
实施例3
在使用合成和/或重组HMGB1变体的另外的实验中，我们还检查分化的免疫细胞(单核血液供体细胞，图2)的趋化性。与hGM-CSF、wt hHMGB1细胞因子和烷基化的4E-hHMGB1相比，S-S 4E-hHMGB1增加无活化/无反应的血清饥饿(免疫抑制)免疫细胞的趋化性，即它们显示出未转变为厌氧糖酵解(如本发明的测试分数定义)。此外，合成的S-S 4E-hHMGB1对暴露于免疫抑制条件但活化的(显示出向厌氧糖酵解的转变)血液供体单核细胞具有优越的趋化作用(与野生型hHMGB1细胞因子相比)。尽管SS 4E-hHMGB1未能诱导比可能通过三种重组/合成HMGB1细胞因子4E-hHMGB1、4Q-hHMGB1和烷基化4E-hHMGB1所得趋化性更多的趋化性，但它在诱导富含CD34+的人造血脐带血细胞的趋化性方面胜过所有所示化合物(HSC，图3)。趋化性刺激(造血)干细胞是免疫系统刺激的重要特征，可响应病原体引起的炎症，自身免疫性疾病，脓毒症，预防癌症的发展、进展或复发，免疫缺陷症，防止免疫细胞衰竭，组织修复(免疫干细胞在受伤/局部缺血组织(例如血液、骨髓、心脏、冠状动脉、血管、骨骼、脑、神经、髓鞘)内的增殖和/或迁移)(Palsson-McDermott等人，(2015)，Cell Metabolism21：65)。
总而言之，我们表明，还关于人单核免疫细胞和人富含CD34+的脐带血造血干细胞的趋化性方面，与其它所示化合物相比，同类最佳的SS 4E-hHMGB1处理可有效刺激在免疫抑制条件下培养的无反应血液供体免疫细胞(模型总结(c))。我们还提供关于人免疫细胞的原理验证的离体数据，表明(i)通过特异地阻断PK四聚体(使用充分表征的磷酸酪氨酸肽，称为P-M2tide；GGAVDDDpYAQFANGG)药理抑制PK la来调节PKM2活性，使免疫细胞能够从OXPHOS转变为厌氧糖酵解和(ii)这种转变的发生使免疫细胞在免疫抑制条件下能够增殖/存活/迁移。
这项验血的一个重要特征是，它显示个体独特的免疫细胞激活状态。这是通过在两种条件下(常氧和缺氧)评估个体样品中酶活性的变化来实现的，因此不使用绝对值(这将需要其它个体的参考值来进行免疫状态的个体间比较)，但使用相对值(比率)。
实施例4：实验细节
实验1：健康的血液供体单核淋巴细胞在常氧(21％)和缺氧(0％)下培养。在匀浆中测量PK低亲和力(PK la)、PK高亲和力(PK ha)和乳酸脱氢酶(LDH)的酶活性。在缺氧的细胞培养条件下，大分子(氨基酸、脂肪酸、RNA/DNA)和能量(ATP)的合成必须通过来自中心碳代谢(CCM)的葡萄糖中间体提供能量。从常氧到缺氧的酶活性的显著变化表明，由免疫细胞的增殖(细胞培养物补充有生长因子)和存活(细胞培养物不补充有生长因子，即血清饥饿条件)增加所显示的向厌氧糖酵解的转变增加。一个重要发现是，当显示未转变为无氧糖酵解的免疫细胞受到饥饿抑制(未补充生长因子)时，这些细胞因此死亡和/或未增殖(与未抑制的对照和显示转变为厌氧糖酵解的抑制的对照相比)。巯基的不可裂解交联如下完成：用3x 800μl 4E-hHMGB1(410μg/ml在PBS中，pH 7.4)，使用mid-dialyse系统，添加8μl 0.5MDTT(1h，22℃)，随后用500ml冰冷PBS+5mM EDTA(pH 7，1h，4℃)透析和用500ml冰冷PBS+5mMEDTA(pH 7，过夜，4℃)透析。然后添加8μl BMOE(双(马来酰亚胺)乙烷，Thermo Fisher)(1h，22℃)，随后添加8μl 0.5DTT。将溶液用500ml冰冷PBS+5mM EDTA(pH 7，4℃)透析1h并且用500ml冰冷PBS+5mM EDTA(pH 7，4℃)透析过夜。巯基烷基化如下完成：用3x 800μl 4E-hHMGB1(410μg/ml在PBS中，pH 7.4)，使用mid-dialyse系统，添加8μl 0.5M DTT(1h，22℃)，随后用500ml冰冷PBS+5mM EDTA(pH 8，1h，4℃)透析和用500ml冰冷PBS+5mM EDTA(pH 8，过夜，4℃)透析。然后添加8μl 0.5M碘乙酰胺(30min，22℃，没有光)，随后添加8μl 0.5M DTT。将溶液用500ml冰冷PBS+5mM EDTA(pH 7.4，4℃)透析1h并且用500ml冰冷PBS+5mM EDTA(pH7.4，4℃)透析过夜。P-M2tide寡肽(Gly-Gly-Ala-Val-Asp-Asp-Asp-pTyr-Ala-Gln-Phe-Ala-Asn-Gly-Gly)购自Enzo Life Sciences。(n＝8)。
实验2：不同的人HMGB1形式(如前所述在HEK细胞中表达，以及在其半胱氨酸残基上化学修饰的合成烷基4E-hHMGB1和合成S-S 4E-hHMGB1的情况下)或人重组GM-CSF针对存在或不存在P-M2tide(来自Enzo Life Sciences)寡肽(Gly-Gly-Ala-Val-Asp-Asp-Asp-pTyr-Ala-Gln-Phe-Ala-Asn-Gly-Gly，SEQ ID NO：1)的健康的血液供体单核淋巴细胞(通过推荐的使用Ficoll-PaqueTM的Ficoll梯度标准程序分离)的趋化能力。不同的HMGB1变体表现出对PK la酶的变构中心的不同的结合特性。根据制造商的说明，使用具有5μm孔(每孔10000个细胞，3h，n＝2)的Corning Plate HTS Transwell(CLS3374-2EA)系统进行测定。
实验3：人HMGB1变体针对新鲜人富含CD34+的脐带血造血干细胞(HSC)的趋化性。HSC根据(Wein等人，(2010)，Stem Cell Res 4：129)分离并且立即用于趋化性测定。简而言之，单核细胞(MNC)利用Ficoll-hypaque技术(Biochrom，Berlin，Germany)通过密度梯度离心来分离。将CD34+细胞使用磁性微珠在亲和柱上用AutoMACS系统(均为Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，Germany)通过单克隆抗-CD34抗体的阳性选择来纯化。通过流式细胞仪对分离的细胞进行重新分析，揭示纯度＞95％的CD34+细胞。根据制造商的说明，使用具有5μm孔(每孔10000个细胞，3h和8h，n＝3)的Corning Plate HTS Transwell(CLS3374-2EA)系统进行测定。
实施例5：
代码实例用于正确分类白血病患者(n＝22；分类问题＝开始治疗后两年内对化疗加利妥昔单抗治疗的响应者和未响应者)和结直肠癌患者(n＝101；分类问题＝治愈性手术(切除原发肿瘤和转移灶(如果有))后的手术后两年内的DFS)；100％准确度，p＜0.05：
Figure BPA0000307001190000391
Figure BPA0000307001190000401
Figure BPA0000307001190000411
Figure BPA0000307001190000421
Figure BPA0000307001190000431
Figure BPA0000307001190000441
Figure BPA0000307001190000451
Figure BPA0000307001190000461
Figure BPA0000307001190000471
实施例6
使用随机森林、决策树(C5.0)和具有径向和线性内核的SVM(支持向量机)的针对实施例5的白血病分类问题(治疗开始后两年内对化疗加利妥昔单抗治疗的反应者对非反应者的分类)的训练集结果的实施例。接收器操作曲线值达到100％或接近100％：
>fit.rf
随机森林
49个样品
168个预测器
2个分类：′否′，′是′
重采样：交叉验证(10重，重复10次)
样本大小的总结：44，44，44，44，44，44，...
跨调谐参数重新采样结果：
Figure BPA0000307001190000472
ROC用于选择使用最大值的最佳模型。
用于该模型的最终值是mtry＝2.
>fit.c50
C5.0
49个样品
168个预测器
2个分类：′否′，′是′
重采样：交叉验证(10重，重复10次)
样本大小的总结：44，44，44，44，44，45，...
跨调谐参数重新采样结果：
Figure BPA0000307001190000481
ROC用于选择使用最大值的最佳模型。
用于模型的最终值是试验＝1，模型＝tree和winnow＝FALSE。
>fit.svmlinear
具有线性内核的支持向量机
49个样品
168个预测器
2个分类：′否′，′是′
重采样：交叉验证(10重，重复10次)
样本大小的总结：44，44，44，44，45，43，...
重采样结果：
ROC Sens Spec
1 0.96 1
调谐参数″C″保持恒定在值1
>fit.svmradial
具有径向基函数内核的支持向量机
49个样品
168个预测器
2个分类：′否′，′是′
预处理：集中的(168)，缩放的(168)
重采样：交叉验证(10重，重复10次)
样本大小的总结：44，43，45，44，44，44，...
跨调谐参数重新采样结果：
Figure BPA0000307001190000491
调谐参数′sigma′保持为0.00438827的恒定值
ROC用于选择使用最大值的最佳模型。
用于该模型的最终值为sigma＝0.00438827以及C＝0.5.
用于分析的时间序列数据集的实施例(4个患者样品，表2)。原始数据显示NADH在37℃340nm处减少，在本实施例中监测时间是每5分钟一次，持续30分钟。
表2：示例性原始测量数据
Figure BPA0000307001190000501
Figure BPA0000307001190000511
Figure BPA0000307001190000521
实施例7：通过监测酶动力学对慢性淋巴细胞性白血病和结肠癌患者进行风险分类
7.1方法
概述：在厌氧组织/血液培养物中，使用
Figure BPA0000307001190000522
-测试试剂盒分析来自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的PBMC(外周血单核细胞)和结直肠癌(CRC)患者的原发性肿瘤的癌组织中负责厌氧适应性的关键代谢酶的活性。将包含线性和非线性酶活性的动力学数据矢量化，其中所有单个时间序列数据堆积为单个矢量。用流行的机器学习算法(包括SVM、RF、C5.0和神经网络)对由酶促测试试剂盒生成的酶动力学数据集进行训练，并且使用单独数据集进行评估。
具体描述：对于CLL，研究样品包括2013年至2014年在海德堡大学医院就诊并且诊断为CLL并接受CIT治疗的22例患者。通过Ficoll梯度分离外周血单核细胞(PBMC)。该研究得到海德堡大学伦理委员会的批准(S-356/2013和S-254/2016)。
对于CRC，研究样品包括2009年至2012年在海德堡大学医院就诊并且诊断为CRC的101例患者，并且由DACHS研究(德国癌症研究中心)在IMPACT联合会的框架内进行描述(“Improving long-term prognosis and quality of life of patients withcolorectal cancer”)。通过海德堡大学医院临床研究部门(KFO 227)获得的原发性肿瘤的冷冻组织样品进行分析，德国海德堡国家肿瘤疾病中心(NCT)的组织生物库承认了一致的品质。该研究得到德堡大学伦理委员会的批准(KFO 310/2001)。
遗传畸变和CEA血清水平
从医学报告中获得荧光原位杂交(FISH)引起的染色体畸变以及TP53和免疫球蛋白重链可变(IGHV)突变状态。术前癌胚抗原(CEA)血清水平来自医学报告并且可用于99例结直肠癌患者。手术前一天获得血清。
测定软件部分：基准方法和性能评估
实验在Windows 7环境下在Intel Core Duo 2 T6600、2.2GHz和3GB RAM中进行。将算法在R(R 3.5.1(www.R-project.org))中使用caret、gtools、openxlsx、reshape2、e1071、plyr、DMwR、randomForest、nnet和C50软件包进行编码。我们选择公知的学习算法(支持向量机(SVM)、RF、C5.0)与处理不平衡数据的流行的方法结合使用。所有算法均与综合少数类过采样技术(SMOTE)结合使用，也可以不结合使用。应用SMOTE来更改实例的数量，使得每一类中的实例数量变得更加平衡。为实现此目的，SMOTE将现有实例的特征与其最近邻居的特征相结合，以创建其它合成实例。K-最近邻(KNN)设置为默认(＝5)(Wang等人，(2015)，Comput Methods Programs Biomed 119(2)：63-76；Alghamdi等人，(2017)，PLoSOne 12(7)：e0179805)。将数据分为训练集和测试集(分别为70％和30％)。由于可获得患者的样品量较小，我们进行重复的k-重交叉验证(RkCV)，以避免过拟合。k-重交叉验证将训练数据分成大小相等的k组，并且使用k-1组来训练和预测其余组。对于每个子集，RkCV使用k个随机分割的训练数据执行k-重交叉验证数次。作为实现方式，我们使用Rpackage caret及其定义的trainControl设置来执行“repeatedcv”，重复10次，10重，并且使用smote采样参数来解决由拆分导致的类不平衡。为了进行训练，我们在执行交叉验证时使用网格搜索来调整分类算法的超参数。对于每种评估算法(SVMLinear、SVMRadial、RF、C5.0和两个神经网络(avNNet和pcaNNet))，模型均用于预测测试集的分类并且记录以下性能测量值：准确度、灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。为了确保结果是可靠的，将整个过程重复5次以对初始数据进行随机训练/测试分区。
为了评估有效性，我们比较了算法的准确度结果。此外，我们报告了灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、召回率、F1(F-量度)、患病率、检出患病率、检出率和平衡准确度。准确度计算如下：
1.准确度＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)
其中TP表示真阳性，TN表示真阴性，FP表示假阳性，以及FN表示假阴性。为了定义诊断灵敏度和特异性，使用以下等式：对于CLL：灵敏度[％]＝100x(高危患者数量(定义为CIT后2年内的进展)/高危患者总数量。特异性[％]＝100x(低危患者数量(定义为CIT后(2年内)无进展事件)/低危患者总数量。对于CRC：灵敏度[％]＝100x(高危患者数量(定义为手术后2年内复发)/高危患者总数。特异性[％]＝100x(低危患者数量(定义为手术后2年内未复发)/低危患者总数量。
测定硬件部分：样品制备和分析
根据制造商的说明用EnFin-CLL-TestTM试剂盒(CE IVD，#6102ENF，
Figure BPA0000307001190000541
GmbH，Germany)和EnFin-CRC-TestTM试剂盒(RUO，#980010-6101ENF)分别针对CLL和CRC进行样品制备和分析。简洁地说，每个患者的两个3cm培养皿补满3ml RPMI 1640(LifeTechnologies，Paisely，UK)和1*107个细胞(CLL)或碎片化(25mg)原发性肿瘤组织(CRC)。对于CLL和CRC，分别用不透氧的外壳(GasPakTM EZ，Becton Dickinson，New Jersey，USA)包裹以产生缺氧(＝厌氧)条件。在37℃和5％CO2(缺氧(Ax)和常氧(Nx)样品)下孵育(对于CLL样品：16-24h，对于冷冻CRC样品：5h)后，洗涤细胞并且溶于500μl提供的缓冲溶液中(图4)。通过超声(Diagenode
Figure BPA0000307001190000551
Sonication System，Diagenode，Seraing，Belgium)提取酶，遵照固定的移液规程(图5)，每个孔上样1μg蛋白质，确保稍后通过软件正确导入数据。PK-la(低亲和力)、PK-ha(高亲和力)和LDH的活性随着NADH的减少，在340nm在37℃在酶标仪(VICTOR X 2030，Perkin Elmer，Waltham，USA)中监测30min，重复运行，包括整个范围的酶活性，即线性和非线性动力学。阳性和阴性对照均在推荐范围内。
统计分析
使用统计软件R 3.5.1(www.R-project.org)进行统计分析。根据iwCLL标准或ESMO(欧洲肿瘤医学会)指南定义终点。通过对于分类参数的Fisher精确检验和对于度量参数的t检验或Mann-Whitney检验对两组中由临床高危对低危定义的患者特征进行比较。计算准确度估算值和95％的置信区间(CI)，将CI＞50的下限解释为优势胜过机会。
7.2结果
概述：化学免疫疗法(CIT)后，样品中携带厌氧细胞的CLL患者很早就复发。然而，CLL、TP53和IGHV突变分析中推荐的临床标记物未能预测对CIT的响应。在CRC中，CEA的高血清水平(高于2.5ng/ml)和厌氧细胞的存在均预示具有治愈意图的手术后的早期复发。两种癌症中，机器学习均胜过所有标记物。最佳结果显示，对于CLL的准确度为99％(95％CI 98-100)，对于结直肠癌的准确度为91％(95％CI 88-93)。
具体描述：CLL和CRC试验队列
在我们的试验中，前瞻性地招募96例慢性淋巴细胞病患者，其中74例有资格用EnFin-CLLTM试验试剂盒分析。使用试剂盒将27例分类为高风险(厌氧生长)，将47例分类为低风险(有氧生长)。两个风险组均显示相似的临床参数，包括细胞遗传异常、TP53突变和淋巴细胞倍增时间。临床特征示于表3中。
表3.患者特征CLL。
Figure BPA0000307001190000561
在CIT开始后两年内患有进行性疾病时，将患者分类为临床高风险(CLL-HR)；在CIT开始后两年内没有进行性疾病时，将患者分类为低风险(CLL-LR)。CIT包括苯达莫司汀与利妥昔单抗(BR)、环磷酰胺/阿霉素/长春新碱/泼尼松龙与利妥昔单抗(R-CHOP)组合使用、苯丁酸氮芥与利妥昔单抗(R-CBL)或阿托珠单抗(G-CBL)组合使用和氟达拉滨/环磷酰胺与奥法木单抗(O-FC)组合使用。22例患者接受CIT治疗。数据集用于机器学习。数据集中CLL-HR与CLL-LR的比例平衡为1∶1.2。
来自DACHS研究的101例结直肠癌患者中，有22例归类为高风险(手术后两年内复发)。数据集用于机器学习。数据集中CRC-HR与CRC-LR的比例不平衡，为1∶4.6，。临床特征示于表4中。
表4.患者特征CRC。
Figure BPA0000307001190000571
值得注意的是，两个风险组均由结肠癌和直肠癌组成，其中以直肠癌患者占优势(对于高危人群为71％直肠癌，对于低危人群为60％直肠癌)。根据治疗标准，两组中大多数直肠癌患者均接受放射疗法。两个风险组在Ras、BRAF和MSI方面均表现出相似的突变特征。重要的是，高风险组中有82％的患者接受辅助化疗，而低风险组中则为49％(表2)。
数据预处理和特征空间
为了正确标记机器学习算法的有监督训练的高风险(＝”1”)或低风险(＝”0”)，患者对来自酶标仪的未分类原始数据进行了分类，如图6所示。代码在GitHub存储库www.github.com/enfinlab中公开。使用整个范围的酶活性(底物(S)与酶(E)之比＝S＜＜E；S≈E和S＞＞E)，即包括在两个条件下(有氧和无氧，如上所述)的非线性范围内的酶活性，我们对时间序列进行矢量化处理，因此创建了单个矢量，其中所有单个时间序列数据堆积成单个矢量的(图6)。在针对每个二分类问题(CLL/CRC)的最简单方法中，特征空间分别由168个特征组成。因此，所有时间序列点、阳性和阴性对照(噪声)以及两个条件(有氧/厌氧)均以单个特征表示。
AI分类器的性能优于金标准生物标志物TP53、IGHV和CEA以及
Figure BPA0000307001190000581
测定
TP53畸变和IGHV未突变状态的CLL患者对CIT的响应较差。迄今为止，隐藏层中有一个神经元的非常简单的前馈神经网络(pcaNNet)的表现优于原始CLL数据集中这些标准临床标记(TP53突变分析和IGHV突变分析)(对于TP53和IGHV，无明显结果，表3)。在发现CLL-HR病例中，PcaNNet与试剂盒测定法(检测患者PBMC样品中的厌氧性白血病细胞)一样准确，然而，在阳性/阴性预测值方面，PcaNNet略优于试剂盒测定法，这对于临床决策特别重要(pcaNNet：PPV＝90％-98％，NPV＝64％-100％；EnFin-CLL-TestTM试剂盒：PPV＝100％，NPV＝50％，表5、6)。另外，创建具有与原始数据集中相同的数据分布的综合过采样(SMOTEd)数据集，以在更大样品量上测试算法性能。在综合过采样的CLL数据集中，所有算法均显示出接近完美的分类结果(平均准确度结果99％，表5)。
表5：机器学习性能，CLL数据集(n＝22)：第一值：无SMOTE，第二值：10x3交叉验证重采样程序中的SMOTE，第三值：SMOTEd CLL数据集。所有机器学习结果都是用看不见的试验数据集(留出法(hold-out)集)5次运行的平均值。P-值：IGHV，p＝0.52；del17p，p＝0.64；试剂盒-CLL，p＝0.037；CEA，p＝0.027；试剂盒-CRC，p＝0.049。SE＝灵敏度；SP＝特异度；PPV＝阳性预测值；NPV＝阴性预测值，*优胜机会。
Figure BPA0000307001190000591
表6：机器学习性能，CRC数据集(n＝101)：第一值：10x10交叉验证重采样程序中的SMOTE，第二值：SMOTEd CRC数据集。所有机器学习结果都是用看不见的测试数据集(留出法集)5次运行的平均值。P-值：IGHV，p＝0.52；del17p，p＝0.64；试剂盒-CLL，p＝0.037；CEA，p＝0.027；试剂盒-CRC，p＝0.049。SE＝灵敏度；SP＝特异度；PPV＝阳性预测值；NPV＝阴性预测值，*优胜机会。
Figure BPA0000307001190000601
众所周知，CEA在检测CRC复发方面非常不一致。然而，没有替代选择，既经过批准的又是更可靠的生物标志物，因此CEA与其它监测措施的结合仍然是临床上用于复发检测的金标准。然而，它不能用于预测无病生存期(DFS)。例如，在手术时间点，尽早通过试验来预测CRC中的DFS会对患者的随访和治疗非常有益。特别地，重要的是在手术后两年内检测出治愈性手术后复发的患者(如果存在则切除原发肿瘤和转移灶)，因为多项研究表明，他们的肿瘤具有很强的侵袭性。这些患者可以受益于积极管理综合化学疗法/放射疗法加上替代性靶向药物和强化随访。这项研究中，我们比较了CEA、EnFin-CRC-TestTM和AI算法(通过EnFin-CRC-TestTM的原始数据进行训练)在预测预期治愈性手术后DFS方面的分类性能。EnFin-CRC-TestTM检测CRC组织中的厌氧细胞和术前CEA血清水平升高(阈值2.5ng/ml)显示出相似性能，准确度为69％或66％，PPV为24％或22％，NPV为79％或85％(表6)。神经网络(pcaNNet)具有相当的准确度(68％，表6)，然而，它们显示出较好的预测价值表现(PPV＝32％；NPV＝84％，表6)，这对于临床常规决策至关重要。在综合过采样CRC数据集中，所有算法均显示出优异的分类结果(平均准确度结果范围为87％-91％，表6)。此处，pcaNNet达到最佳结果(准确度为91％，表6)。
总之，AI算法胜过临床批准或推荐的/实验性的生物标志物。具有默认设置28的非常简单的神经网络(pcaNNet)总体上具有最佳性能。他们在未见的现实生活临床数据上表现出优异的性能，在未见的综合过采样数据集(来自本研究中使用的现实生活数据集)上表现出近乎完美的分类结果。尽管使用的样品量小且使用ML算法的默认设置，但我们已经表明，有可能从酶动力学数据中学习并且优于长期以来广泛用于临床决策的经广泛验证的临床标记物。
实施例8：福尔马林固定和包埋细胞(“FFPE蛋白质组”)提取物对酶活性的调节
使用具有不同的临床过程(UICC I至IV期，I：浅表浸润，II：结肠肌肉层浸润，III：浸润局部淋巴结，IV：远处转移)的10种结肠癌的20个FFPE组织切片(10μm)(每位患者2个切片)。提取约500μg蛋白质组，将其4μg添加到反应体积中。特别地，PKLA表现出其活性上的差异。总体而言，每个肿瘤共有168个数据点(特征空间)。从数据点的复杂关系中，取决于每个测量点上存在的对照活性(含提取缓冲液或不含提取缓冲液(并且分别不含蛋白质组)的活性)，特别地，机器学习可以搜索与疾病进展/个人治疗相关的模式。
引用的非标准文献：
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Figure IPA0000307001150000021
Figure IPA0000307001150000031
Figure IPA0000307001150000041
Figure IPA0000307001150000051
Figure IPA0000307001150000061

Claims (20)

1.一种确定感兴趣的活实体针对第一组环境条件和第二组环境条件的代谢适应性的方法，所述方法包括
(a)用第一底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；
(b)用第二底物浓度确定在所述第一组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的至少一种酶的至少两种活性和在所述第二组环境条件下维持的所述活实体的样品中包含的所述至少一种酶的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中，所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM；以及
(c)基于将步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种非线性活性与步骤(a)和/或(b)中确定的至少一种其它活性进行比较，确定所述活实体的代谢适应性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一底物浓度(i)为所述酶针对所述底物的KM的至少两倍，优选至少五倍，更优选至少十倍；或(ii)其中，所述第一底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM并且与所述第二底物浓度不相同。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，至少步骤(c)由计算机实施，优选地通过利用具有已知代谢适应性的细胞的步骤(a)和(b)的数据训练自动机器学习算法来实施。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述第一环境条件为常氧，并且其中，所述第二环境条件为缺氧，并且其中，所述代谢适应性为能量代谢从常氧下的氧化磷酸化到缺氧下的糖酵解的转变。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述至少一种酶为丙酮酸激酶，优选丙酮酸激酶M2。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述底物为丙酮酸，并且其中，所述第一底物浓度为10mM，并且其中，所述第二底物浓度为0.1mM。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，在缺氧条件下高亲和力丙酮酸激酶(PKHA)或低亲和力丙酮酸激酶(PKLA)的活性相较于常氧条件下的活性的强烈变化指示从常氧下的氧化磷酸化成功转变为缺氧下的糖酵解，和/或其中，在缺氧条件下PKHA或PKLA的活性相较于常氧条件下的活性的适度变化或无变化或者PKHA和PKLA两者的并行变化指示从常氧下的氧化磷酸化未成功转变为缺氧下的糖酵解。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，步骤(a)和(b)中确定的所述活性至少之一为非线性活性。
9.一种包括微处理器并且有形地嵌入算法的设备，当在所述微处理器上执行时，所述算法至少执行根据权利要求1至9中任一项所述方法的步骤(c)。
10.一种用于确定包含免疫细胞的测试样品中的所述免疫细胞的激活状态的方法，所述方法包括
(a)在常氧条件下孵育所述包含免疫细胞的测试样品的第一子部分，
(b)在缺氧条件下孵育所述包含免疫细胞的测试样品的第二子部分，
(c)确定在所述第一子部分和第二子部分的细胞中至少高亲和力丙酮酸激酶(PKHA)和低亲和力丙酮酸激酶(PKLA)的活性，
(d)比较步骤(c)中确定的所述活性，以及
(e)基于比较步骤(d)的结果，确定所述测试样品中所述免疫细胞的激活状态。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法还包括根据权利要求1至8任一项中所述方法的步骤。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述免疫细胞为外周血单核细胞(PBMC)，优选T细胞或造血干细胞，更优选CD34+造血干细胞。
13.一种用于确定至少一种酶的活性的方法，所述方法包括使所述至少一种酶与固定细胞样品的提取物接触，并且确定所述酶的活性。
14.一种通过固定细胞样品的提取物确定至少一种酶的活性的调节的方法，所述方法包括
(i)提供所述至少一种酶的至少第一和第二等份试样；
(ii)使所述第二等份试样与所述固定细胞样品的提取物接触；
(iii)确定步骤(i)的所述第一等份试样的活性和步骤(ii)的所述第二等份试样的活性；
(iv)比较步骤(iii)中确定的所述第一等份试样和所述第二等份试样的活性，并且进而
(v)通过固定细胞样品的提取物确定至少一种酶的活性的调节。
15.一种为患有疾病的患者提供风险分类的方法，所述方法包括根据权利要求13确定酶的活性和/或根据权利要求14通过固定组织样品的提取物确定酶的活性的调节，其中，所述固定细胞样品为所述对象的样品。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述方法包括根据权利要求15所述的方法的步骤，并且其中，所述确定步骤(iii)还包括
(I)用第一底物浓度确定所述第一等份试样的至少两种活性和所述第二等份试样的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t1和t2确定所述活性；以及
(II)用第二底物浓度确定第一等份试样的至少两种活性和所述第二等份试样的至少两种活性，其中，在开始确定反应后的两个不相同的时间点t3和t4确定所述活性；其中，所述第二底物浓度为所述酶针对所述底物的KM的至多两倍，优选约等于或低于所述酶针对所述底物的KM。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中，所述固定细胞样品为醛固定的细胞样品，优选甲醛和/或戊二醛固定的样品，优选甲醛固定的样品。
18.一种激活免疫细胞的方法，所述方法包括使激活状态为未活化的免疫细胞与激活剂化合物接触，其中，所述激活剂化合物选自HMGB1多肽或其衍生物和PKM2抑制剂；优选地
其中，所述激活剂化合物选自：
(i)包含HMGB1多肽，优选至少包含HMGB1的Box B，更优选包含SEQ ID NO：2的多肽；
(ii)包含磷酸化的HMGB1多肽、优选包含人HMGB1的多磷酸化的Box B的多肽；
(iii)包含寡磷酸化的HMGB1多肽或其衍生物的多肽，其中，对应于所述HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为不可磷酸化的氨基酸，优选谷氨酰胺；
(iv)包含HMGB1多肽的多肽，其中，至少两个半胱氨酸残基，优选A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45通过烷基桥，优选乙基桥共价连接；
(v)包含磷酸化模拟的HMGB1多肽的多肽，其中，对应于所述HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸；
(vi)包含SH-烷基化的HMGB1多肽的多肽；以及
(vii)(i)至(vi)的任何组合和/或混合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，在所述接触之前，根据权利要求10至12中任一项所述方法确定所述免疫细胞的激活状态，并且其中，将确定为激活状态为未活化的免疫细胞与所述激活剂化合物接触。
20.一种氧化还原固定的HMGB1衍生物多肽，优选为磷酸化模拟的HMGB1衍生物，更优选地，其中，(i)至少两个半胱氨酸残基，优选A-box的两个半胱氨酸残基，更优选C23和C45通过烷基桥，优选乙基桥共价连接；并且其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸；或(ii)所述多肽为SH-烷基化的HMGB1多肽，其中，对应于HMGB1多肽的氨基酸Y109、Y144、Y155和Y162的酪氨酸残基中的至少一个被交换为酸性氨基酸，优选谷氨酸。
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