CN113621628A - 一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途，属于生物工程技术领域，本发明提供oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途以及相应的抵御醇胁迫和酸胁迫的重组菌；本发明以遗传背景清晰的大肠杆菌BW25113为研究模型，利用RED重组系统改造构建了大肠杆菌突变株，该突变株在pH7.0或无丁醇胁迫条件下菌株的生长状态是远不及出发菌株的，但随着pH降低或丁醇浓度增高，其生长状态越来越有所改善；表明突变株在酸性和丁醇胁迫等逆境条件下的生长状态更优。本发明可为提高微生物耐受各环境胁迫能力、通过改善微生物抗逆性进而提高微生物发酵生产溶剂的高效性提供新的研究方向和策略。

Description

一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途。

背景技术

随着石油、煤炭等不可再生石化资源的日渐枯竭以及环境污染的日益加剧，生产可替代的生物资源和能源迫在眉睫。生物丁醇的辛烷值更接近汽油、适合在现有的燃料供应和分销系统中使用，是一种极具潜力的新型生物燃料，具有替代生物乙醇和生物柴油的潜能。目前，产溶剂梭菌作为生物丁醇最主要的工业化生产菌株，对其中间代谢产物(丁酸、乙酸和甲酸等有机酸)和发酵产物(丁醇、乙醇和丙酮等有机溶剂)的耐受能力均不强，进而限制了其生产效率，目前仍是亟待解决的世界性难题。要解决该难题，就必须弄清有机溶剂对丁醇合成的反馈抑制作用和细胞生长的毒害作用，进而改善细胞生理性能，提高丁醇生产效率。一般来说，产溶剂梭菌的ABE发酵过程可划分为两个阶段：产酸期(Acidogenicphase)与产溶剂期(Solventogenic phase)。在产酸期，微生物在乙酰-CoA和丁酰-CoA等相关酶作用下，将葡萄糖等底物转化为乙酸和丁酸等有机酸，导致发酵液pH值一直下降；当有机酸累积到一定浓度时，微生物细胞为抵抗此不利环境，细胞会重新利用有机酸作为底物，进行丙酮、丁醇及乙醇等产物的合成，即为产溶剂期。因此，虽然乙酸和丁酸等有机酸能直接作为产醇前体物质，但随着其浓度的积累，均会导致细胞质的酸化，引起酸胁迫，这些也将显著影响细胞生长及其代谢能力，进而降低生物丁醇的发酵效率和生产强度。除此之外，在产物醇的抑制和毒害作用下，细胞会产生大量能量来抵御有机溶剂的压力，且通过电子传递链产生ATP的同时会产生大量的H⁺。针对丁醇生产菌株细胞酸化的问题，我们检索文献发现，目前国内外大多是通过发酵过程的pH调控来解决，而通过同时改善菌株的酸和醇的耐受性来提高丁醇产量的相关研究鲜少报道。

丙酮丁醇梭菌作为丁醇的天然生产菌株，虽然产量相对较高，但由于是严格厌氧菌，在发酵条件上比较苛刻，同时作为革兰氏阳性菌，基因操作难度很大。产丁醇梭菌细胞内普遍存在着特殊的限制修饰系统，特异性识别-GCNGC-位点，多数来自大肠杆菌的质粒在这个位点没有甲基化，转入梭菌成功率低。而且梭菌的基因失活策略如自杀质粒基因敲除、反义RNA抑制、复制型质粒同源重组、Π型内含子基因敲除技术等遗传操作过程困难且周期长，限制了产溶剂梭菌产丁醇的工业应用。于是，人们将目光放在了其他更加成熟的模式菌株上，尝试用其他菌种进行丁醇发酵，酿酒酵母、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌及大肠杆菌都成了工业发酵丁醇的候选。通过将梭菌产丁醇途径进行外源表达，使其他微生物菌种获得产丁醇能力，其中大肠杆菌作为模式菌株收到了广泛关注。大肠杆菌进行厌氧发酵时会产生乙醇、乙酸、乳酸等有机物，引入梭菌的产丁醇途径后也会产生丁酸。在产溶剂梭菌生产丁醇的过程中，一般认为酸性环境是产溶剂开始的诱发因素，所以酸性环境也是大肠杆菌外源表达梭菌途径的重要条件。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途，为后期丁醇高产菌株的优化改造以及为逆境条件生长菌株的选育均提供重要的指导意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途。

OxyR，抗氧化基因，参与了细菌的抗氧化作用、抑制自发突变、致病性、铁代谢及外膜蛋白相变等多种生理代谢作用。对于活性氧对细菌的生理代谢造成的氧化损伤起防卫作用的oxyR调节子是最早发现的具有抗氧化的调节系统之一，也是实验研究最为广泛和深入的抗氧化系统之一。oxyR调节蛋白是细菌中LysR型转录调节因子家族的成员之一。oxyR调节蛋白主要的生理代谢作用有：抗氧化作用、致病性、外膜蛋白相变、抑制自发突变、耐药性、耐辐射、铁代谢等。

进一步地，所述用途为构建敲除oxyR基因片段相关的宿主菌。

进一步地，所述用途为敲除oxyR基因片段以改善宿主菌在醇胁迫和酸胁迫下的生长状态。

进一步地，所述基因可根据功能同步应用于丁醇高产菌株中进一步改善该菌株的健壮性或者丁醇生产能力。

进一步地，所述宿主菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)中的野生型菌株，或者为经过诱变筛选或遗传改造后的其他菌株。

进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BW25113。

进一步地，所述醇胁迫为丁醇胁迫。

本发明还提供一种抵御醇胁迫和酸胁迫的重组菌Escherichia coli Gxas-oxyR^-，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61852。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以遗传背景清晰的大肠杆菌BW25113为研究模型，在构建筛选一系列耐受醇和酸胁迫的强鲁棒性突变株的基础上，利用RED重组系统改造构建了大肠杆菌Gxas-oxyR^-突变株，该突变株在PH7.0条件下菌株的生长状态是远不及出发菌株BW25113的，但随着pH降低，其生长状态越来越有所改善。同样的，在无丁醇胁迫条件下，Gxas-oxyR^-突变株的生长状况也比出发菌株BW25113差很多，但随着丁醇胁迫浓度的增高，其生长状况越来越好。这些实验数据表明，突变株Gxas-oxyR^-突变株在酸性和丁醇胁迫等逆境条件下的生长状态更优。本发明可为提高微生物耐受各环境胁迫能力、通过改善微生物抗逆性进而提高微生物发酵生产溶剂的高效性提供新的研究方向和策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为oxyR基因替换氯霉素抗性验证电泳图；其中，M：DL2000；1：BW25113的oxyR基因片段大小952bp；2：工程菌Gxas-oxyR-cm⁺的片段大小1189bp；

图2为oxyR基因替换氯霉素抗性消抗后验证电泳图，其中，M：DL2000；1：BW25113的oxyR基因片段大小952bp；2：工程菌Gxas-oxyR^-的片段大小264bp；

图3为酸性条件下BW25113、BW25113-ΔoxyR的耐受存活情况；其中，B：BW25113；O：BW25113-ΔoxyR，由左到右分别为pH7.0、pH6.0和pH5.0条件的培养基；

图4为丁醇胁迫条件下BW25113、BW25113-ΔoxyR的耐受存活情况；其中，B：BW25113；O：BW25113-ΔoxyR，丁醇浓度由左到右第一排分别为8g/L、7g/L、0g/L，第二排分别为10g/L、9g/L。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

大肠杆菌Escherichia coli Gxas-oxyR^-，已于2021年8月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为GDMCC No：61852，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。

实施例1构建方法

1、材料

供试菌株和质粒如下表1所示，试验中所用到各种抗生素和其他试剂如表2所示。

表1供试菌株和质粒

表2抗生素和其它试剂使用浓度表

2、基因敲除方法与步骤

2.1大肠杆菌BW25113含质粒pKD3、pCP20及pKD46的菌株BW25113/pKD3、BW25113/pKD3及BW25113/pKD46复苏培养

用在酒精灯上烧过的接种环分别将四种-80℃保存的菌液在带有氨苄抗性的LB培养基平板上划线。其中BW25113/pKD46和BW25113/pCP20置于30℃培养箱培养30h，BW25113/pKD3置于37℃培养箱培养24h。

2.2菌种保存

在过夜培养活化的平板上挑取单菌落置于含有氨苄抗性的液体培养基中，菌液中BW25113/pKD46和BW25113/pCP20置于30℃，BW25113/pKD3置于37℃摇床培养过夜。分别取处于对数生长期的菌液，加入等体积的已灭菌的40％的甘油，置于-80℃冰箱可保存两至三年。

2.3质粒DNA的制备

(1)挑取平板上的单菌落于5ml LB(含100ug/ml Amp)培养基中过夜培养；

(2)取菌液1.5ml于EP管中离心1min；

(3)弃上清，留沉淀，沉淀用200μl冰上预冷过的溶液I吹打重悬；

(4)再加200μl溶液II，轻柔的颠倒混匀至溶液呈透明粘稠状；

(5)加入250μl溶液III，吹打混匀后冰浴2-5min；

(6)置于离心机上13000g离心10min；

(7)小心地吸出上清液转移至试剂盒所配备的柱子中，静待3min后于12000g离心1min；

(8)倒掉液体，加入600μl漂洗液，于12000g离心1min；

(9)重复步骤(8)一次；

(10)倒掉液体，于12000g离心2min；

(11)取出柱子置于室温晾干，闻不到酒精的味道为好；

(12)将已晾干的柱子放入1.5ml的EP管，于柱子正中央滴入30μl ddH₂O，存于-20℃备用。

2.4 PCR反应

2.4.1引物设计

根据需要扩增的模板序列，利用Vector NTI软件设计出所需的PCR引物。验证引物的长度一般为18-22个碱基；敲除引物的长度一般为56-59个碱基，少了不利于敲除，多了费用会高出很多；一般引物浓度配成10-12.5μM。

本实施例所用引物如下：

敲除引物：

OxyRcmF：5'-ATGAATATTCGTGATCTTGAGTACCTGGTGGCATTGGTCTTGAGCGATTGTGTAGG-3'；

OxyRcmR：5'-TTAAACCGCCTGTTTTAAAACTTTATCGAAATGGCCCTTAACGGCTGACATGGGAA-3'；

验证引物：

OxyRF：5'-CGCGGATCCGTGGCGATGGAGGATGGATA-3'；

OxyRR：5'-CCCAAGCTTGGGTAGCTGCGTTAAACGGT-3'。

2.4.2模板制备

提取的所需模板的质粒DNA或总DNA，质粒DNA、总DNA或通过热裂解的菌体均可作为PCR的模板来使用。质粒DNA和总DNA作为模板时需要稀释100-150倍才可使用；过热裂解菌体作为模板的操作如下：将从平板上挑取的单菌落的菌泥或菌液经离心的菌体用适量ddH₂O洗涤一次后重悬，95℃水浴处理10min，迅速置于冰上裂解细胞10min以释出DNA，后取1-3μl DNA释出液作为反应模板。

2.4.3反应体系

用Taq Polymerase进行PCR验证或扩增所需目的片段，但以克隆表达为目的的目的片段扩增则主要使用Pfu Polymerase(保真性比较高)。PCR的反应体系参照如下：

反应体系：

2.4.4反应条件

PCR扩增反应程序如下：

2.4.5 PCR扩增产物检测

根据所需PCR扩增的产物片段的大小，采用不同浓度的琼脂糖凝胶(0.7％-1.5％)，对扩增产物进行电泳检测。然后扩增产物用试剂盒纯化或胶回收后溶于30-50μlTE，储存于-20℃以备后用。

2.5制备大肠杆菌电转化感受态

(1)取保存的菌液接种适量到新鲜的LB平板上，37℃培养12h；

(2)挑单菌落于装有5mLLB培养基的指型瓶中，37℃，培养过夜，其OD₆₀₀≥0.6；

(3)取过夜培养的菌液于装有100mLB培养基中，37℃，培养2h后测其OD₆₀₀,当OD₆₀₀长至0.45-0.65时取出；

(4)将菌液于冰浴上冰浴10min或更久；

(5)将冷却的菌液分装置50ml的已灭菌并冷冻过的离心管中，放入已预冷好的冷冻离心机中4℃、4000r/min离心10min，去上清；

(6)各加40mL预冷却至0℃的灭菌水，重悬；

(7)于4℃、4000r/min离心10min，去上清；

(8)各加20ml预冷却至0℃的已灭菌的10％甘油，重悬；

(9)于4℃、4000r/min离心10min，去上清；

(10)各加500μl预冷却至0℃的已灭菌的10％甘油，重悬；

(11)分装后进行转化或保存于-80℃以备后用。

2.6电转化

(1)将用无水乙醇泡过的直径1cm的电转化杯置于超净工作台中吹干，紫外灭菌后盖上盖子置于冰上预冷；

(2)取带有同源臂的引物扩增的氯霉素抗性基因片段(使用DPN1消化并纯化后的)约200ng加入刚做好的感受态细胞中，混匀，一起转入1cm的已经预冷好的电转化杯中；

(3)将电转化杯用纸巾尽快擦拭干净后用Bio-Rad电击仪进行电转化；(电击条件:电阻200Ω，电容25μF，电压2.5kV，电击时间均为4～5ms之间)

(4)电击完后迅速加入1ml的SOC混匀转移至1.5ml的EP管中，用封口胶封口置于200r/min，37℃培养箱培养1h；

(5)将预培养好的菌液取500μl涂于氯霉素抗性平板上(其中氯霉素浓度浓度为34ng/ml。

(6)16至20h之内收平板，将平板上长出的单菌落已灭菌的牙签转移至液体培养基中培养，取已培养的菌液提总DNA作为模板用PCR法鉴定筛选到的阳性克隆。

2.7消抗

(1)将PCP20化转转入带有验证所得目的基因成功替换成抗性的阳性转化子中，30℃培养过夜；

(2)依次转点于Amp、Cm、空白板上，42℃培养过夜丢失PCP20。Amp、Cm板上不长，空白板上长的单菌落进行菌落PCR以及测序验证。

(3)验证所得阳性克隆子经过反复分离传代保存。

3、工程菌的生长状态检测

3.1点板法测定丁醇耐受性

(1)取保存的菌液接种适量到新鲜的LB平板上，37℃培养12h；

(2)挑单菌落于装有5mLLB培养基的指型瓶中，37℃，培养过夜，其OD₆₀₀≥1离心收集(10000×g,20s)，用无菌水清洗两遍后重悬；

(3)将菌体悬浮液分别稀释为OD600为1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6六个浓度留存；

(4)准备含不同丁醇浓度(0g/L丁醇、7g/L丁醇、8g/L丁醇、9g/L丁醇、10g/L丁醇)的LB琼脂平板，取不同浓度的菌体悬浮液一次于含有不同丁醇浓度的琼脂平板上标记(每个5μL)。用乙烯基塑料胶带密封，以防止丁醇蒸发，并在37℃下培养过夜，拍照留存。

3.1点板法测定酸耐受性

(1)取保存的菌液接种适量到新鲜的LB平板上，37℃培养12h；

(2)挑单菌落于装有5mLLB培养基的指型瓶中，37℃，培养过夜，其OD₆₀₀≥1离心收集(10000×g,20s)，用无菌水清洗两遍后重悬。

(3)将菌体悬浮液分别稀释为OD600为1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6六个浓度留存；

(4)准备pH5.0、pH6.0以及pH7.0的LB琼脂平板，取不同浓度的菌体悬浮液一次于含有不同丁醇浓度的琼脂平板上标记(每个5μL)，并在37℃下培养过夜，拍照留存。

实施例2大肠杆菌重组菌的构建

(1)抵御酸和丁醇胁迫突变菌株的构建

OxyR，抗氧化基因，参与了细菌的抗氧化作用、抑制自发突变、致病性、铁代谢及外膜蛋白相变等多种生理代谢作用。采用Red敲除系统完成OxyR基因的敲除突变。用验证引物对突变株BW25113-ΔoxyR进行PCR验证，验证结果如图1和图2，扩增野生型大肠杆菌BW25113产物长度0.952kb，其测序结果如SEQ ID No.1所示，扩增Gxas-oxyR-cm⁺(被氯霉素基因替换后)产物长度1.189kb，扩增BW25113-Δoxy^-(消抗后)产物长度是0.264kb，其测序结果如SEQ ID No.2所示，片段测序证明OxyR缺失突变体构建成功。

SEQ ID No.1：

TTGGGGGGGCGGGAGATAAGAATATCGGATCTTGAGTACCTGGTGGCATTGGCTGAACACCGCCATTTTCGGCGTGCGGCAGATTCCTGCCACGTTAGCCAGCCGACGCTTAGCGGGCAAATTCGTAAGCTGGAAGATGAGCTGGGCGTGATGTTGCTGGAGCGGACCAGCCGTAAAGTGTTGTTCACCCAGGCGGGAATGCTGCTGGTGGATCAGGCGCGTACCGTGCTGCGTGAGGTGAAAGTCCTTAAAGAGATGGCAAGCCAGCAGGGCGAGACGATGTCCGGACCGCTGCACATTGGTTTGATTCCCACAGTTGGACCGTACCTGCTACCGCATATTATCCCTATGCTGCACCAGACCTTTCCAAAGCTGGAAATGTATCTGCATGAAGCACAGACCCACCAGTTACTGGCGCAACTGGACAGCGGCAAACTCGATTGCGTGATCCTCGCGCTGGTGAAAGAGAGCGAAGCATTCATTGAAGTGCCGTTGTTTGATGAGCCAATGTTGCTGGCTATCTATGAAGATCACCCGTGGGCGAACCGCGAATGCGTACCGATGGCCGATCTGGCAGGGGAAAAACTGCTGATGCTGGAAGATGGTCACTGTTTGCGCGATCAGGCAATGGGTTTCTGTTTTGAAGCCGGGGCGGATGAAGATACACACTTCCGCGCGACCAGCCTGGAAACTCTGCGCAACATGGTGGCGGCAGGTAGCGGGATCACTTTACTGCCAGCGCTGGCTGTGCCGCCGGAGCGCAAACGCGATGGGGTTGTTTATCTGCCGTGCATTAAGCCGGAACCACGCCGCACTATTGGCCTGGTTTATCGTCCTGGCTCACCGCTGCGCAGCCGCTATGAGCAGCTGGCAGAGGCCATCCGCGCAAGAATGGATGGCCATTTCGATAAAGTTTAAAACAGGGGTTAACCGTTTTACCGCCCCCACCCCC。

SEQ ID No.2：

TTCGCGGATCCGTGGCGATGGAGGATGGATAATGAATATTCGTGATCTTGAGTACCTGGTGGCATTGGTCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAAGGGCCATTTCGATAAAGTTTTAAAACAGGCGGTTTAAACCGTTTAACGCAGCTACCCAAGCTTGGGACC。

如图3和4所示，BW25113-Δoxy^-在pH7.0条件下菌株的生长状态是远不及出发菌株BW25113的，但随着pH降低，其生长状态越来越有所改善。同样的，在无丁醇胁迫条件下，BW25113-ΔoxyR的生长状况也比出发菌株BW25113差很多，但随着丁醇胁迫浓度的增高，其生长状况越来越好。这些实验数据表明，突变株BW25113-ΔoxyR在逆境条件下的生长状态更优。这为后期逆境条件生长菌株的生长健壮性改善提供了实验基础。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广西科学院

<120> 一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 952

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgggggggc gggagataag aatatcggat cttgagtacc tggtggcatt ggctgaacac 60

cgccattttc ggcgtgcggc agattcctgc cacgttagcc agccgacgct tagcgggcaa 120

attcgtaagc tggaagatga gctgggcgtg atgttgctgg agcggaccag ccgtaaagtg 180

ttgttcaccc aggcgggaat gctgctggtg gatcaggcgc gtaccgtgct gcgtgaggtg 240

aaagtcctta aagagatggc aagccagcag ggcgagacga tgtccggacc gctgcacatt 300

ggtttgattc ccacagttgg accgtacctg ctaccgcata ttatccctat gctgcaccag 360

acctttccaa agctggaaat gtatctgcat gaagcacaga cccaccagtt actggcgcaa 420

ctggacagcg gcaaactcga ttgcgtgatc ctcgcgctgg tgaaagagag cgaagcattc 480

attgaagtgc cgttgtttga tgagccaatg ttgctggcta tctatgaaga tcacccgtgg 540

gcgaaccgcg aatgcgtacc gatggccgat ctggcagggg aaaaactgct gatgctggaa 600

gatggtcact gtttgcgcga tcaggcaatg ggtttctgtt ttgaagccgg ggcggatgaa 660

gatacacact tccgcgcgac cagcctggaa actctgcgca acatggtggc ggcaggtagc 720

gggatcactt tactgccagc gctggctgtg ccgccggagc gcaaacgcga tggggttgtt 780

tatctgccgt gcattaagcc ggaaccacgc cgcactattg gcctggttta tcgtcctggc 840

tcaccgctgc gcagccgcta tgagcagctg gcagaggcca tccgcgcaag aatggatggc 900

catttcgata aagtttaaaa caggggttaa ccgttttacc gcccccaccc cc 952

<210> 2

<211> 264

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcgcggatc cgtggcgatg gaggatggat aatgaatatt cgtgatcttg agtacctggt 60

ggcattggtc ttgagcgatt gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag 120

agaataggaa cttcggaata ggaactaagg aggatattca tatggaccat ggctaattcc 180

catgtcagcc gttaagggcc atttcgataa agttttaaaa caggcggttt aaaccgttta 240

acgcagctac ccaagcttgg gacc 264

Claims (7)

1.一种oxyR基因片段在宿主菌抵御醇胁迫和酸胁迫中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为构建敲除oxyR基因片段相关的宿主菌。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为敲除oxyR基因片段以改善宿主菌在醇胁迫和酸胁迫下的生长状态。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述宿主菌选自大肠杆菌(Escherichiacoli)中的野生型菌株，或者为经过诱变筛选或遗传改造后的其他菌株。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BW25113。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述醇胁迫为丁醇胁迫。

7.一种抵御醇胁迫和酸胁迫的重组菌Escherichia coli Gxas-oxyR^-，其特征在于，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61852。

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