CN113614244A - 通过选择性标记生物样品进行分析物检测 - Google Patents
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Abstract
本公开的特征在于包括以下的方法：将具有第一目标分析物的生物样品与第一试剂接触，其中第一试剂包括与第一目标分析物特异性结合的第一结合物质以及与该结合物质缀合的第一寡核苷酸；将该生物样品与第二试剂接触，其中第二试剂包括第一反应性物质以及与第一反应性物质缀合的第二寡核苷酸，以使第二寡核苷酸的至少一部分与第一寡核苷酸的至少一部分杂交；以及将该生物样品与第一标记物质接触，其中第一标记物质与第一反应性物质反应以将第一标记物质或其衍生物沉积在该生物样品中。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年2月4日提交的美国临时专利申请号62/801,011和于2019年2月4日提交的美国临时专利申请号62/801,009的优先权，其各自的全部内容均通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及通过选择性标记样品来检测该样品中的生物分析物。
背景技术
抗体已被用于选择性结合生物样品中的很多种蛋白质。免疫组织化学方法通常涉及将染料缀合的抗体与互补标志物结合，从而用该染料标记该标志物。检测来自染料标记的荧光发射揭示样品中标志物的存在。
发明内容
本公开的特征在于用于向样品选择性地施加染料和其他标记物质以鉴定和定量该样品中的特定目标分析物的方法。在鉴定和/或定量之后，可以向样品中加入另外的染料和标记试剂以鉴定和定量另外的特定目标分析物。以这种方式，可以进行一系列连续的标记和检测循环，以选择性地鉴定和定量样品中的特定目标分析物。
该方法可以通过将多个第一试剂与样品结合来进行，其中每个第一试剂包括与样品中的不同目标分析物特异性结合的结合物质以及与该结合物质缀合的不同的第一寡核苷酸。然后引入第二试剂，其包括与反应性物质缀合的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸与第一试剂之一的第一寡核苷酸杂交，将第二试剂定位于样品中对应于与第一试剂相关的目标分析物的位置。反应性物质和引入的标记试剂之间的反应将标记试剂沉积在目标分析物附近。然后可以在相对温和的条件下通过去杂交去除第二试剂，确保每个第一试剂保持与样品结合。随后，可以进行另外的标记循环，其中引入不同的第二试剂，每个试剂包括与反应性物质缀合的不同的第二寡核苷酸。通过选择具有与特定的第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸的第二试剂，可以用不同的标记试剂选择性地标记特定的目标分析物。从样品中除去第二试剂的相对温和的条件确保第一试剂保持与样品结合，并保持样品的完整性。
在一个方面，本公开的特征在于包括以下的方法：(i)将包含第一目标分析物的生物样品与第一试剂接触，其中第一试剂包含与第一目标分析物特异性结合的第一结合物质以及与该结合物质缀合的第一寡核苷酸；(ii)将该生物样品与第二试剂接触，其中第二试剂包含第一反应性物质以及与第一反应性物质缀合的第二寡核苷酸，以使第二寡核苷酸的至少一部分与第一寡核苷酸的至少一部分杂交；(iii)将该生物样品与第一标记物质接触，其中第一标记物质与第一反应性物质反应，以将第一标记物质或其衍生物沉积在该生物样品中；(iv)在第一标记物质或其衍生物沉积后，从生物样品中去除第二试剂；(v)将该生物样品与第三试剂接触，其中第三试剂包含与该生物样品中的第二目标分析物特异性结合的第二结合物质以及与第二结合物质缀合的第三寡核苷酸；(vi)将该生物样品与第四试剂接触，其中第四试剂包含第二反应性物质以及与第二反应性物质缀合的第四寡核苷酸，以使第四寡核苷酸的至少一部分与第三寡核苷酸的至少一部分杂交；以及(vii)将该生物样品与第二标记物质接触，其中第二标记物质与第二反应性物质反应，以将第二标记物质或其衍生物沉积在该生物样品中。
该方法的实施方案可以包括以下特征中的任何一个或多个。
第一反应性物质可以包括催化剂，例如，酶，诸如辣根过氧化物酶。第一标记物质可包括染料。第一标记物质可以包括无活性的酪酰胺或其衍生物与染料的缀合物。
将生物样品与第一标记物质接触可以包括将第一标记物质转化为活性酪酰胺或其衍生物与染料的缀合物，其中活性酪酰胺或其衍生物在第二试剂附近与生物样品结合。
第一结合物质可以包括抗体或抗体片段。
第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸可以包括至少10个核苷酸。第一和第二寡核苷酸的核苷酸序列可以是至少70％互补的。第二寡核苷酸可以包括比第一寡核苷酸更多数量的核苷酸。
第二寡核苷酸可以包括与第一寡核苷酸的序列的不同部分互补的多个连续(contiguous)、非连贯(non-consecutive)的核苷酸序列。
第一反应性物质和第二反应性物质可以是相同的。第一反应性物质和第二反应性物质可以各自包括酶，例如，辣根过氧化物酶。
第一寡核苷酸和第三寡核苷酸可以不同。第二寡核苷酸和第四寡核苷酸可以不同。
第一标记物质可以包括第一染料，而第二标记物质可包括不同于第一染料的第二染料。
第一结合物质可以包括第一抗体或第一抗体片段，第二结合物质可以包括第二抗体或第二抗体片段，并且第一结合物质和第二结合物质可以选择性地结合生物样品中的不同的第一目标分析物和第二目标分析物。
第一寡核苷酸可以包括RNA碱基的核苷酸序列，和/或DNA碱基的核苷酸序列。第一寡核苷酸可以包括至少一个合成核苷酸。第一寡核苷酸可以是完全单链的，或替代性地，部分双链的。
染料可以包括发色物质或荧光物质。
除非另有明确说明，否则该方法的实施方案还可以包括本文描述的任何其他特征，包括即使结合不同实施方案描述的特征的任何组合。
在另一方面，本公开特征在于试剂盒，其包括：第一试剂，其中第一试剂包含与生物样品的第一目标分析物特异性结合的第一结合物质，以及与第一结合物质缀合的第一寡核苷酸；第二试剂，其中第二试剂包含与生物样品的第二目标分析物特异性结合的第二结合物质，以及与第二结合物质缀合的第二寡核苷酸；第三试剂，其中第三试剂包含反应性物质以及与该反应性物质缀合的第三寡核苷酸；第四试剂，其中第四试剂包含反应性物质以及与该反应性物质缀合的第四寡核苷酸；第一标记物质；以及第二标记物质，其中第一标记物质和第二标记物质各自与反应性物质反应，以在生物样品中分别沉积第一标记物质和第二标记物质或其衍生物。
除非另有明确说明，否则试剂盒的实施方案可以包括本文描述的任何特征，包括即使结合不同实施方案描述的特征的任何组合。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本文主题的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是例示性的而非限制性的。
在附图和下面的描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。根据说明书、附图和权利要求书，其它特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1是显示用于分析生物样品的一系列示例性步骤的示意图。
图2A-2D是显示用于样品分析的方法的步骤的示意图。
图3A是显示用于分析生物样品的一系列示例性步骤的流程图。
图3B-3E是显示用于样品分析的方法的步骤的示意图。
图4A-4E是显示用于样品分析的方法的步骤的示意图。
图5A-5D是显示寡核苷酸实例的示意图。
图5E是显示示例性第一试剂的示意图。
图5F是显示示例性第二试剂的示意图。
图6是显示示例性多光谱成像系统的示意图。
图7是显示示例性控制器的示意图。
图8A-8D是用不同标记部分标记的组织切片的图像。
图9A-9C是用不同报告试剂和标记部分标记的组织切片的图像。
图10A-10F是用不同标记部分标记的组织切片的图像。
在各个附图中，相似的参考符号表示相似的元件。
详细描述
介绍
对生物样品中的多种目标分析物的分析是现代研究方法的一个重要方面。例如，通过鉴定和定量多种疾病标志物，可以阐明细胞中的复杂调控和共表达关系，这允许验证疾病进展的模型，并帮助开发靶向疗法以干扰该进展的关键方面。
已经使用多种不同的技术来鉴定和定量生物样品中的多种目标分析物。例如，用于靶向多种表达的生物标志物(例如，抗原、肽)的技术包括将样品暴露于一组探针，每个探针包括与生物标志物之一特异性结合并与不同染料物质缀合的抗体。为了靶向样品中的N种不同生物标志物，引入N种不同类型的探针，每种探针用N种不同染料中的一种染色一种类型的生物标志物。然后测量来自每种不同探针染料的发射(例如，荧光)以鉴定和定量样品中的N种不同生物标志物。
在此类方法中，区分来自每种不同探针染料的发射，以分别鉴定和定量由探针靶向的每种不同生物标志物。实际上，这可以对可以分析多种生物标志物的程度施加有效限制，因为随着样品中此类染料数量的增加，分离和定量对应于不同探针染料的发射测量会变得越来越困难。例如，即使利用探针染料的策略选择和用于将荧光发射测量分解为来自单个组分染料发射光谱的贡献的相对完善的方法，前述方法也可限于对样品中的约十种不同生物标志物的同时多路复用询问(multiplexed interrogation)。
用于目标分析物标记的前述免疫组织化学方法也会受到可以被递送以特异性标记样品中的目标分析物中的每种的探针染料的量的限制。由于探针染料与特定抗体缀合，因此可应用于样品中特定位置的探针染料的量直接取决于直接连接到抗体的探针染料部分的数量，该抗体与该位置处的分析物结合。因此，某些免疫组织化学方法在通过在对应于特定目标分析物的位置选择性地沉积更大量的探针染料来放大由这些目标分析物产生的信号的能力方面受到一定程度的限制。
为了进一步增加样品中可被鉴定和定量的目标分析物的数量，可以修改常规的组织化学标记方法以包括抗体去除步骤。例如，在样品分析的第一轮中，可以使用一组N种不同的染料缀合的抗体来标记样品，并且可以通过测量来自N种不同染料的发射来鉴定和定量样品中对应于N种不同探针的N种不同生物标志物。然后，可以进行抗体去除步骤，其中从样品中去除N种不同的探针。随后，使用新的一组M种不同的染料缀合的抗体来标记样品，其中M种抗体标记与先前N种探针不同的目标分析物。测量该第二组探针的M种不同染料的发射，可以鉴定和定量样品中的第二组M种不同生物标志物。这种方法可以通过抗体去除和多重标记的多个循环进行扩展。
然而，用于从样品中除去结合的探针抗体的制备条件可能是相对耗时的，攻击性的，并且可能对某些类型的样品的完整性产生不利影响。因此，可以限制在样品受损之前可以进行的这种标记和抗体去除循环的次数。此外，根据特异性抗体与样品中相应生物标志物之间结合的性质，在每个分析循环后从样品中完全除去每种探针可能是困难的。如果没有从样品中完全除去探针，则样品中会保留一定量的其相应染料标记。在随后的分析循环中，来自剩余染料标记的发射会干扰来自与其它探针缀合的染料的发射，导致样品中某些生物标志物的定量不准确。因此，可有效进行的多重标记和检测循环的数量可受到染料缀合的、基于抗体的探针可从样品中去除的程度的限制。
在某些常规分析程序中，染料-淬灭方法用于消除由样品中残留的抗体-缀合的染料产生的信号。然而，这些方法实施起来也是困难且耗时的。例如，应用染料淬灭试剂完全消除来自残余抗体-缀合染料的贡献，但不干扰由随后应用的抗体-缀合染料产生的信号，并且也不对样品的生物化学、结构和光谱特性产生不当影响，可能是具有挑战性的。
本公开的特征在于用于对生物样品中的目标分析物进行多重标记、鉴定、信号放大和定量的方法。该方法可用于进行多个循环的目标分析物标记、检测和去除标记过程中涉及的某些试剂，而不会破坏样品中的抗体-生物标志物结合。相反，标记过程中涉及的试剂的去除是通过在相对温和的条件下使试剂去杂交、保持样品完整性并且确保在每个标记和检测循环期间几乎完全去除试剂来进行的。因此，很少或没有交叉物质标记发生。相反，可以用不同的标记物质选择性地标记样品中的每种目标分析物，并且将每种标记物质的沉积高度限制到样品的特定地对应于特定目标分析物的位置的区域。
目标分析物的分析
本公开描述了用于鉴定和定量生物样品中的多个目标分析物的各种不同的分析方法。图1为流程图100，其示出了用于实现一种样本分析方法的一系列示例性步骤。在第一步骤102中，将包括目标分析物的生物样品与特异性结合目标分析物的第一试剂接触。该第一步骤在图2A中示意性地示出。在图2A中，生物样品202包括目标分析物210。样品202与第一试剂204接触。第一试剂204包括与目标分析物210特异性结合的结合物质206，以及与结合物质206缀合的第一寡核苷酸208。以此方式，第一试剂204特定地定位在样品中对应于目标分析物210的位置处。
如本文所用，术语“接触(contacts)”和“接触(contacting)”意指使试剂、物质、部分或其它元件与样品或另一试剂、物质、部分或元件相联合，使得两者彼此相互作用。例如，当样品202与第一试剂和第二试剂、标记物质和报告试剂“接触”时，这些试剂和物质与样品足够紧密地联合，使其与样品相互作用，并且可以与样品或与先前已经接触、结合、杂交和/或沉积在样品中的其它试剂、物质、部分和元件结合。
返回图1，在下一步骤104中，将样品与与第一试剂相联合的第二试剂接触。该步骤在图2B中示意性示出。在图2B中，第二试剂216与样品202接触。第二试剂216包括与反应性物质214缀合的第二寡核苷酸212。第二寡核苷酸212与第一寡核苷酸208至少部分互补，使得第一寡核苷酸和第二寡核苷酸杂交。以这种方式，第二试剂216定位于样品中与第一试剂204相同的位置，并因此定位于对应于目标分析物210的位置。
再次返回到图1，在步骤106中，将样品与标记物质接触。标记物质与来自步骤104的第二试剂的反应性物质反应，将标记物质沉积在样品中靠近第二试剂的位置处。该步骤在图2C中示意性示出，其中标记物质218与样品接触。如图2C所示，标记物质218在箭头220表示的反应中与反应性物质214反应。该反应将标记物质218或其衍生物沉积在样品中第二试剂216附近的位置222，并因此沉积在目标分析物210附近的位置处。以这种方式，沉积的标记物质218(或其衍生物)在空间上与目标分析物210共定位。
再次参考图1，在步骤106中沉积标记物质或其衍生物之后，在步骤108中检测标记物质以鉴定和/或定量样品202中的目标分析物210。在检测标记物质或其衍生物后，流程图100所示的程序结束。
前述程序和本文描述的其他方法可以用于鉴定和定量生物样品202中的多种不同分析物210。分析物210的实例包括，但不限于，抗原、肽、蛋白质和其它含有氨基酸的部分。分析物210的额外的实例包括，但不限于，寡核苷酸，包括含有DNA碱基、RNA碱基、DNA和RNA碱基两者以及合成碱基的寡核苷酸、核酸片段和脂质。
本文所述的方法适用于鉴定和定量生物样品中许多不同的临床相关生物标志物，特别是在肿瘤组织、肿瘤微环境和代表其他疾病状态的组织中表达的生物标志物。对应于分析物210的此类生物标志物的实例包括，但不限于，肿瘤标志物，诸如Sox10、S100、广谱角蛋白(pan-cytokeratin)、PAX5、PAX8；免疫细胞标识符诸如CD3、CD4、CD8、CD20、FoxP3、CD45RA、CD45LCA、CD68、CD163、CD11c、CD33、HLADR；活化标记物诸如Ki67、颗粒酶B；检查点相关标志物诸如TIM3、LAG3、PD1、PDL1、CTLA4、CD80、CD86、IDO-1、VISTA、CD47、CD26。
本文所述的方法可用于分析多种不同类型的生物样品202。在一些实施方案中，生物样品202可以是新鲜的、冷冻的或固定的。生物样品可以是动物来源的，诸如来自人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、猴、兔、果蝇、蛙、线虫或土拨鼠。生物样品可以包括福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织切片、冷冻组织切片、新鲜组织、从受试者获得的细胞(例如，经由细针抽吸或其它技术)、培养的细胞、生物组织、生物流体、匀浆或未知的生物样品。
在某些实施方案中，生物样品202可以被固定在表面上。例如，表面可以为载玻片、平板、孔、管、膜或薄膜。在一些实施方案中，生物样品202可以安装在载玻片上。在某些实施方案中，生物样品202可以使用固定剂(诸如醛、醇、氧化剂、汞剂、苦味酸盐、HOPE固定剂或其他固定剂)来固定。生物样品可以可替代地或另外地使用热固定来固定。还可以通过浸渍或灌注实现固定。
在一些实施方案中，生物样品202可以被冷冻。例如，生物样品可以在低于0℃，低于-10℃，低于-20℃，低于-30℃，低于-40℃，低于-50℃，低于-60℃，低于-70℃，或低于-80℃下冷冻。
在某些实施方案中，生物样品202可以以三维形式固定。该三维形式可以包括例如冷冻块、石蜡块或冷冻液体。例如，生物样品202可以是处于最佳切割温度复合物(compound)中的冷冻动物组织块。组织块可以被冷冻或固定。在一些实施方案中，组织块可以被切割以暴露表面，该表面可以是与如上所述的第一试剂接触的表面。
在一些实施方案中，在生物样品202对应于块的情况下，可以将该块切片以产生该块的连续切片，可以根据本文描述的方法来分析这些连续切片中的每一个。通过这样做，可以获得关于样品中一种或多种目标分析物的身份和/或数量的三维信息(例如，作为样品内深度的函数的信息)。
通常，选择结合物质206以靶向样品202中的特定分析物。本文所述的方法可用多种不同类型的结合物质实施。例如，为了靶向样品202中的特定抗原、肽、蛋白质或其它含氨基酸的物质，结合物质206可以包括抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可以包括不同类型抗体种类中的任一种，包括但不限于，免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、多克隆抗体、单克隆抗体、单链片段可变(scFv)抗体、纳米抗体、抗原结合片段(Fab)和双抗体。抗体和抗体片段可以是小鼠、大鼠、兔、人、骆驼科动物或山羊来源的。在一些实施方案中，抗体或抗体片段可以针对人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、猴、兔、果蝇、蛙、线虫或土拨鼠抗原产生。在某些实施方案中，抗体或抗体片段可以针对动物、植物、细菌、真菌或原生生物抗原产生。
结合物质206与在样品202中的目标分析物210之间可以发生各种不同的结合机制。在一些实施方案中，例如，结合物质206(例如，抗体或抗体片段)与目标分析物210可逆地结合。在某些实施方案中，结合物质206与目标分析物210不可逆地结合。在一些实施方案中，结合物质206和目标分析物210之间的结合可以通过形成一个或多个共价键而发生。或者，或另外，结合物质206与目标分析物210经由一个或多个非共价键结合。可以使用一种或多种固定剂来促进共价键和/或非共价键的形成。
结合物质206与在样品202中的目标分析物210之间发生的特异性结合机制取决于结合物质206和目标分析物210的性质。例如，当结合物质206为抗体或抗体片段并且目标分析物210为抗原时，结合发生在抗原表位和抗体或抗体片段的互补位之间。作为另一个实例，其中结合物质206为抗体或抗体片段并且目标分析物210为脂质，结合可以发生在抗体或抗体片段上的识别位点与脂质的头基(例如，磷脂头基)之间。
通常，结合物质206以特定的灵敏度与样品202中的目标分析物210结合，灵敏度指的是样品中被结合物质206正确识别和结合的目标分析物210实体的统计分数。在一些实施方案中，结合物质206对目标分析物210的灵敏度为60％或更高(例如，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，99％或更高)。
结合物质206通常还以特定特异性与目标分析物210结合，该特定特异性是指结合物质优先于生物样品中的其它目标分析物与特定目标分析物210选择性结合的统计率或效率(efficiency)。在一些实施方案中，结合物质206对目标分析物210具有至少60％(例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％)的特异性。
结合物质206对目标分析物210的亲和力通常是指结合物质206与目标分析物210之间的结合强度，并且可以通过解离常数Kd来表征。在一些实施方案中，结合物质206对目标分析物210的亲和力的特征在于不超过10-4M(例如，不超过10-5M，不超过10-6M，不超过10- 7M，不超过10-8M，不超过10-9M，不超过10-10M，不超过10-11M，不超过10-12M，不超过10-13M，不超过10-14M)的解离常数。
在一些实施方案中，结合物质206与样品202中至少20％(例如，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％)的目标分析物210结合。如上文所论述，一般来说，结合物质206与样品202中的目标分析物210选择性结合。如本文所用，“选择性结合”意指样品202中的至少70％或更多(例如，80％或更多，90％或更多，95％或更多)的结合物质206与目标分析物210结合，而不与样品202中的其它物质结合。
寡核苷酸和杂交
通常，第一寡核苷酸208包括多个核苷酸。核苷酸可以包括，例如，DNA碱基(例如，A、C、G、T)、RNA碱基(例如，A、C、G、U)，以及DNA和/或RNA碱基的任何组合。第一寡核苷酸208还可以包括非天然(例如，合成的)核苷酸，包括DNA类似物和/或RNA类似物。此类合成类似物的实例包括，但不限于，肽核酸、吗啉代核酸和锁核酸、醇核酸(glycol nucleic acid)和苏糖核酸(threose nucleic acid)。
第一寡核苷酸208中的碱基序列通常可以是任何序列。此外，一般而言，第一寡核苷酸208中的核苷酸和其他部分可以经由天然和/或非天然(例如，合成)连接而缀合。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸208包括一个或多个能够与互补核苷酸以高可靠性进行碱基配对的核苷酸。此类核苷酸的实例包括，但不限于，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶，2-脱氮-2-硫代鸟苷，2-硫代-7-脱氮鸟苷，2-硫代-腺嘌呤，2-硫代-7-脱氮腺嘌呤，异鸟嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，5,6-二氢尿苷，5,6-二氢胸腺嘧啶，黄嘌呤，7-脱氮黄嘌呤，次黄嘌呤，7-脱氮黄嘌呤，2,6-二氨基-7-脱氮嘌呤，5-甲基-胞嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，5-丙炔基-胞嘧啶，2-硫代-胸腺嘧啶和2-硫代-尿嘧啶。
在某些实施方案中，第一寡核苷酸208可以对应于或含有特定核酸物质的一个或多个片段。例如，第一寡核苷酸208可以对应于或含有锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、非锁核酸(UNA)和/或吗啉代寡聚物的一个或多个片段。
通常可以根据需要选择第一寡核苷酸208的长度(例如，第一寡核苷酸208中的核苷酸数量)，以确保与第二寡核苷酸212的有效和选择性杂交。在一些实施方案中，第一寡核苷酸208可以包括至少5个(例如，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个，至少50个，至少55个，至少60个，至少65个，至少70个，至少75个，至少80个，至少85个，至少90个，至少95个，至少100个)核苷酸。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸208可以具有5-30，5-25，5-20，10-20，10-30，10-50，10-70，10-100，20-50，20-70，20-100，30-50，30-70，30-100，40-70，40-100，50-70，50-100，60-70，60-80，60-90或60-100个核苷酸。
在某些实施方案中，第一寡核苷酸208可以具有不超过5个(例如，不超过10个，不超过15个，不超过20个，不超过25个，不超过30个，不超过35个，不超过40个，不超过45个，不超过50个，不超过50个，不超过55个，不超过60个，不超过65个，不超过70个，不超过75个，不超过80个，不超过85个，不超过90个，不超过95个，或不超过100个)核苷酸。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸208可以是完全单链的。或者，在某些实施方案中，第一寡核苷酸208可以是至少部分双链的。第一寡核苷酸208的部分双链区域可以在寡核苷酸的3'端、寡核苷酸的5'端，或在寡核苷酸的5'端和3'端之间。
图5A是包括两个单链区域504和双链区域502的第一寡核苷酸208的示意图。如上所述，双链区域502可位于第一寡核苷酸208的3'端和第一寡核苷酸208的5'端，或位于3'和5'端之间的中间位置。在某些实施方案中，第一寡核苷酸208可以包括多于一个双链区域(例如，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或甚至更多个双链区域)。
双链区域可以由与第一寡核苷酸208的第一寡核苷酸链508结合(例如，杂交)的第二寡核苷酸链506形成，如图5A所示。或者，或另外，第一寡核苷酸208可包括允许单链第一寡核苷酸208折叠的二级结构。单链的不同部分之间的至少部分互补性允许这些部分杂交，从单链形成一个或多个双链区域。
第一寡核苷酸208的一个或多个双链区域502可以各自并且共同地在第一寡核苷酸208中的总长度(例如，核苷酸总数)的一定百分比上延伸。在一些实施方案中，例如，一个或多个双链区域单独延伸，或所有双链区域共同延伸第一寡核苷酸208的总长度的超过1％或更多(例如，5％或更多，10％或更多，15％或更多，20％或更多，25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，50％或更多)。
通常，第二寡核苷酸212可以包括第一寡核苷酸208的上述任何特征。在一些实施方案中，第二寡核苷酸212可以包括与第一寡核苷酸208相同数量的核苷酸。或者，在某些实施方案中，第二寡核苷酸212可以包括不同数量的核苷酸。
第二寡核苷酸212可以具有与第一寡核苷酸208相同或不同的链结构。即，第二寡核苷酸212可以是单链的、双链的或部分双链的，而与第一寡核苷酸208的结构无关。第二寡核苷酸212通常可以包括在第二寡核苷酸212的全长的一部分上延伸的任何数量的双链区域，如上关于第一寡核苷酸208所述。
如上所述，第二寡核苷酸212通过碱基配对与第一寡核苷酸208杂交，使得第一试剂204和第二试剂216共定位于样品中目标分析物210的位置。杂交效率部分地与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列之间的互补性程度相关。如本文所用，两个序列的序列互补的百分比是指在另一序列的互补位置具有互补对应物的两个序列的较短序列中的核苷酸的百分比，使得两个对应物在杂交期间配对。在一些实施方案中，例如，两个寡核苷酸的序列是至少70％(例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％)互补的。
如本文所用，术语“至少部分互补”意指两个核苷酸序列足够互补，以使它们杂交。通常，如果两个核苷酸序列至少50％互补，则它们是至少部分互补的。
通常，第二寡核苷酸212包括至少一个与第一寡核苷酸208的相应结合区杂交的结合区。结合区可以位于第二寡核苷酸的3'端、5'端，或两个末端中间。当第二寡核苷酸212包括多个结合区时，任何结合区可以如上所述定位。
在一些实施方案中，第二寡核苷酸212的结合区与第一寡核苷酸208的3'端至少部分互补并与之杂交。在某些实施方案中，第二寡核苷酸212的结合区与第一寡核苷酸208的5'端至少部分互补并与之杂交。图5B显示了分别具有结合区510a和510b的第一和第二寡核苷酸208和212的示意图。图5B中，第二寡核苷酸的结合区510b与第一寡核苷酸208的3'或5'端至少部分互补。
在某些实施方案中，第二寡核苷酸212的结合区510b与第一寡核苷酸208的中间区至少部分互补，并与之杂交。图5C显示了第二寡核苷酸212的结合区510b与第一寡核苷酸208的中间结合区510结合的示意图。
在一些实施方案中，第二寡核苷酸212的结合区510b与整个第一寡核苷酸208至少部分互补并杂交。在某些实施方案中，第一寡核苷酸208的结合区510a与整个第二寡核苷酸至少部分互补并杂交。
在某些实施方案中，第一和第二寡核苷酸208和212中的一个或两个包括由一个或多个非结合区隔开的多个结合区。图5D是显示第一和第二寡核苷酸208和212的示意图，其每一个分别包括分别被非结合区512a和512b隔开的多个结合区510a和510b。通常，每个结合区可具有上述与第一和第二寡核苷酸208和212及其各自结合区相关的任何特性。
非结合区512a和512b可以由多种不同的连接物质形成，包括非互补核苷酸序列和不包括核苷酸的间隔部分。非结合区512a-b可以具有相同或不同的几何长度，并且结合区510a-b可以具有相同或不同的长度(例如，相同或不同数量的核苷酸)。在每个寡核苷酸(例如，208和/或212)内，结合区和非结合区可以具有相同或不同的长度。
在一些实施方案中，结合物质206可以与第一试剂中的多个第一寡核苷酸208缀合。图5E是显示第一试剂204的示意图，其中结合物质206与三个第一寡核苷酸208缀合。通常，每个第一寡核苷酸208具有相同的核苷酸序列，使得第二寡核苷酸212可以与任何第一寡核苷酸杂交。虽然在图5E中三个第一寡核苷酸与结合物质206缀合，但更通常2个或更多个(例如，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个，7个或更多个，8个或更多个，或甚至更多个)第一寡核苷酸可以与结合物质206缀合。通过将多于一个的第一寡核苷酸与结合物质206缀合，可以将另外的反应性物质选择性地沉积在样品中目标分析物210的位置处，增加可以沉积在样品中靠近该位置的标记物质的速率和量。
在一些实施方案中，第二试剂216的第二寡核苷酸212与多个反应性物质214缀合。图5F是显示第二试剂216的示意图，其中第二寡核苷酸212与三个反应性物质214缀合。这三个反应性物质可以全部相同，或一个或多个可以彼此不同。虽然在图5F中三个反应物质214与第二寡核苷酸212缀合，但更通常地，2个或更多个(例如，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个，7个或更多个，8个或更多个，或甚至更多个)反应物质可以与第二寡核苷酸212缀合。通过将多个反应性物质与第二寡核苷酸212缀合，可以将另外的反应性物质选择性地沉积在样品中的目标分析物210的位置处，增加可以沉积在邻近该位置的样品中的标记物质的速率和量。
反应性物质和标记物质
如上所述，在第二试剂216中，第二寡核苷酸212缀合到与标记物质218反应的反应性物质214。反应性物质214可对应于多种不同化学或生化物质和部分中的任何一种或多种。在一些实施方案中，例如，反应性物质214对应于催化标记物质218的反应的催化剂。可对应于反应性物质214的催化剂的实例包括，但不限于，酶，基于过渡金属的有机金属部分，含过氧化物的部分和可光活化物质。合适的酶的实例包括，但不限于，辣根过氧化物酶(HRP)和大豆过氧化物酶。在一些实施方案中，反应性物质214可以包括可以模拟HRP的含有氯高铁血红素的复合物，诸如血红素。
通常，标记物质218包括至少一个标记部分。取决于用于鉴定和定量样品202中的目标210的方法的性质，可以使用多种不同的标记部分。在一些实施方案中，例如，标记物质218包括染料。如本文所用，“染料”是与入射光相互作用的部分，并且从其发射的光可以被测量并用于检测样品中染料的存在。通常，染料可以是荧光部分、吸收部分(absorptivemoiety)(例如，发色部分)或其他类型的发光部分，或修饰穿过其中存在染料的样品或从其中存在染料的样品中反射的入射光，使得可以通过测量来自样品的透射光或反射光的变化来确定染料的存在。
在某些实施方案中，标记部分可以包括半抗原。半抗原可随后(或同时)与染料部分结合以提供标记部分，该标记部分可通过测量来自样品的发射光、透射光或反射光来检测。
当标记物质218的标记部分包括染料时，可以使用多种不同的染料。例如，染料可以是呫吨基染料，诸如荧光素染料和/或罗丹明染料。合适的荧光素和罗丹明染料的实例包括，但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)，6-羧基荧光素(通常缩写为FAM和F)，6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)，6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)，N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)，6-羧基罗丹明(ROX或R)，5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)，6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110。
染料也可以为花青基染料。此类染料的合适实例包括，但不限于，染料Cy3、Cy5和Cy7。染料还可以为香豆素染料(例如，伞形酮)，苯甲酰亚胺染料(例如，Hoechst染料中的任一种，诸如Hoechst 33258)，菲啶染料(例如，德克萨斯红)，乙啶染料，吖啶染料，咔唑染料，吩嗪染料，卟啉染料，聚甲炔染料(例如，BODIPY染料中的任一种)以及喹啉染料。
当染料是荧光部分时，染料可以是对应于以下非限制性实例和/或其衍生物中的任一个的部分：芘，香豆素，二乙氨基香豆素，FAM，荧光素氯三嗪基，荧光素，R110，JOE，R6G，四甲基罗丹明，TAMRA，丽丝胺，萘荧光素(napthofluorescein)，德克萨斯红，Cy3和Cy5。
在某些实施方案中，染料可以包括一种或多种基于量子点的物质。基于量子点的荧光团可以使用在许多不同的光谱条带中的荧光发射光谱而获得，并且合适的基于量子点的染料在本文所述的方法中可以用作标记物质。
酪酰胺信号放大
在一些实施方案中，反应性物质214是参与酶介导的反应以将标记物质218(或其衍生物)沉积在样品中邻近第二试剂216的位置并因此接近目标分析物210的酶。作为酶介导的标记物质的沉积的实例，反应性物质214可以为辣根过氧化物酶(HRP)或模拟HRP活性的另一种物质。HRP可以在本文所述的方法中用作酪酰胺信号放大(TSA)的催化剂。
为了进行TSA，标记物质218包括与酪酰胺物质缀合的标记物质(例如上文所述的染料)。当样品202最初与标记物质218接触时，酪酰胺物质处于非活性形式。然而，HRP催化酪酰胺物质转化为能够与样品202结合的活性形式。在酪酰胺物质转化为其活性形式之后，标记部分在靠近其产生位置的位置(例如，在第二试剂216和目标分析物210的位置)结合到样品202。图2C示意性地示出了标记物质218(其可以包括与标记部分缀合的活性酪酰胺物质)在位置222处邻近目标分析物210的沉积。
通过调节引入到样品202中的含有酪酰胺的标记物质218的量和酶介导的活化过程持续的时间量，可以控制沉积在样品202中的标记物质218的量。结果，可以“放大”所检测的并且对应于标记物质218(并且因此对应于目标分析物210)的信号。在本公开的上下文中，放大是指将多于一种标记物质218连接至每个目标分析物210。关于免疫组织化学标记方法，其中每种结合抗体与单个标记物质(例如，单个荧光团部分)缀合，可以使用TSA技术在样品中沉积多个标记物质218(或其衍生物)以产生对应于单个目标分析物210的可测量信号，由此相对于否则将从单个标记物质测量的信号，增加对应于单个目标分析物的测量信号的幅度或强度。
通常，通过实施上述的TSA方法，可沉积在样品中靠近单个目标分析物210的标记物质218的数量比增加超过1:1。在一些实施方案中，例如，该比率为2:1或更高(例如，3:1或更高，4:1或更高，5:1或更高，6:1或更高，8:1或更高，10:1或更高，20:1或更高，30:1或更高，或甚至更高)。
放大提供了多种重要的优势。首先，由于对应于目标分析物的可测量信号具有比没有放大时更高的幅度或强度，因此可以减少暴露时间和测量时间。第二，由于测量信号的幅度或强度增加，可以以更高的可靠性检测以相对低的浓度存在于样品中的目标分析物，否则其相应的测量信号在没有放大的情况下将相对较弱。第三，由于测量信号的幅度或强度增加，更易于补偿组织自体荧光的混杂效应，因为这是相对于背景自发荧光信号的测量信号的检测，否则背景自发荧光信号可能会掩盖一些或全部测量信号。
放大也可用于调节对应于不同目标分析物的测量信号。例如，在其中某些分析物的浓度明显低于其它分析物的样品中，可以放大对应于低浓度分析物的测量信号的幅度或强度，以便它们更接近地匹配对应于样品中以更高浓度存在的其它目标分析物的信号的幅度或强度。以这种方式，可以降低测量信号的范围幅度或强度，使得用于检测测量信号的测量系统的动态范围也可以相对于在没有放大的情况下用于测量信号的动态范围更小。
此外，样品中低浓度分析物(诸如表达非常弱的生物标志物)的存在可与较高浓度分析物一起可视化，以用于共表达分析、蛋白质调节评估和其它比较分析，如果未同时检测和可视化低浓度分析物和较高浓度分析物两者，那么该共表达分析、蛋白质调节评估和其它比较分析将更具有挑战性。
当反应性物质214对应于酶或其他催化剂时，酶或催化剂可以经由多种不同类型的反应中的任一种来介导标记物质218在样品中的沉积。在一些实施方案中，例如(诸如具有HRP介导的酪酰胺缀合的标记部分的沉积的TSA)，由酶或催化剂介导的反应是氧化-还原反应。合适的酶或催化剂介导的反应的其它实例包括，但不限于，去质子化，消除反应，自由基生成反应，脱保护和重排。
对于氧化还原反应(诸如具有HRP介导的标记物质218的沉积的TSA)，可以使用多种不同的氧化剂和/或还原剂。在一些实施方案中，例如，氧化剂为H2O2。也可以使用多种其它试剂。
此外，还应当注意，尽管在一些实施方案中，标记物质218(或其衍生物)在样品202中的沉积是不可逆的，但在某些实施方案中，标记物质218在样品202中的沉积是可逆的，并且标记物质218可以在沉积之后通过诸如洗涤、释放标记物质218的一种或多种化学反应以及诸如加热和标记物质218暴露于辐射(例如，光裂解或光电离或溅射)的物理方法从样品202去除。
标记物质218可以在室温下与样品202稳定结合达48小时或更长时间。在一些实施方案中，在4℃下冷冻的用标记部分218标记的样品可以稳定长达至少4周，并且在-20℃或-80℃下冷冻的样品可以保持与标记物质218稳定结合长达4个月或更长时间。
标记物质218与样品202之间的结合的稳定性可以根据标记物质218和样品202两者的性质而变化。通常，当样品202相对接近室温或低于室温储存时，结合稳定至少48小时。例如，在某些实施方案中，当样品202保持在室温的约5℃内时，该结合稳定至少48小时。在某些实施方案中，当样品202保持在0℃至40℃之间(例如，10℃至40℃，15℃至40℃，20℃至40℃，25℃至40℃，30℃至40℃，35℃至40℃，0℃至35℃，0℃至35℃，5℃至35℃，10℃至35℃，15℃至35℃，20℃至35℃，25℃至35℃，30℃至35℃，0℃至30℃，5℃至30℃，10℃至30℃，15℃至30℃，20℃至30℃，25℃至30℃，0℃至25℃，5℃至25℃，10℃至25℃，15℃至25℃，20℃至25℃，0℃至20℃，5℃至20℃，10℃至20℃，15℃至20℃，0℃至15℃，5℃至15℃，10℃至15℃，0℃至10℃，5℃至10℃，0℃至5℃)的温度时，结合稳定至少48小时。
TSA的其它方法和方面描述于，例如，Faget et al.,Methods Mol.Biol.1318:161-72(2015)，其全部内容通过引用并入本文。
多重分析
再次参考图1和2C，在已经在样品中检测到标记物质218之后，可以任选地从样品中去除第二试剂216。特别地，由于第一寡核苷酸208和第二寡核苷酸212杂交，因此去除第二试剂216涉及使第一寡核苷酸和第二寡核苷酸去杂交。如上所述，去杂交通常可以在比发生在某些免疫组织化学方法中的从样品中去除抗体明显更温和的条件下完成。
去杂交还可用于控制沉积在样品202中的标记物质218的量(即，在放大期间)。更具体地，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的去杂交可用于终止反应性物质214与标记物质218之间的反应(例如，催化反应，诸如酶介导的标记物质218的沉积)，从而控制样品中标记物质218的沉积发生的时间量。
可以使用各种方法来实现第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的去杂交。在一些实施方案中，例如，寡核苷酸的去杂交可以通过将寡核苷酸暴露于一种或多种离液剂(chaotropicreagent)诸如二甲基亚砜(DMSO)和甲酰胺来实现，其中离液剂在其溶液中的摩尔浓度为60％或更高(例如，70％或更高，80％或更高，90％或更高)。或者，去杂交可通过洗涤样品202、加热样品202和前述技术的组合来进行。
将样品202中的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸去杂交，然后进行洗涤步骤以在去杂交后去除游离的第二试剂216，产生样品202，在该产生的样品202中第一试剂204通过结合物质206保持与目标分析物210结合，并且标记物质218保持与目标分析物210附近的样品202结合。实际上，去杂交使样品202返回到与图2A所示的状态类似的状态，同时进一步存在标记物质218。图2D以示意图形式显示了在第一寡核苷酸和第二寡核苷酸去杂交和随后从样品中去除游离的第二试剂216后的样品202。
可以任选地重复流程图100中所示的一些或所有步骤，以选择性地鉴定和定量样品202中的第二(和随后的)目标分析物210。具体而言，样品202可以与另一种第一试剂(其包括与样品202中的不同目标分析物210选择性结合的结合物质206和不同于先前第一试剂的第一寡核苷酸的第一寡核苷酸)接触。然后，可以将样品与另一种第二试剂(其包括反应性物质(例如，上述反应性物质中的任一种)和第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸与新添加的第一试剂的第一寡核苷酸至少部分互补并与之杂交)接触。
在添加另外的第二试剂之后，可以引入新的标记物质，其与反应性物质反应以将新的标记物质(或其衍生物)沉积在样品中靠近新添加的第一试剂和第二试剂的位置，并因此靠近新添加的第一试剂选择性结合的第二目标分析物210。对应于新添加的标记物质的测量信号可用于鉴定和定量样品中的第二目标分析物210。
可以通过如上所述的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的去杂交再次从样品中去除新添加的第二试剂，并且可以重复进行另外的循环以选择性地鉴定和定量样品202中的多种不同目标分析物210。
流程图100的一些或所有步骤的每次重复被称为分析循环，并且通常，可以执行任何数量的循环以选择性地鉴定和定量样品202中的不同目标分析物210。在一些实施方案中，例如，这样的循环的数量为N，其中N为2或更多(例如，3或更多，4或更多，5或更多，6或更多，7或更多，8或更多，10或更多，12或更多，15或更多，或甚至更多)。
通常，对于用于分析的靶向样品中的不同目标分析物210的第一试剂和第二试剂的每个不同组合，不同的标记物质218选择性地沉积在靠近特定目标分析物210的样品中。通过选择不同的标记物质，可以通过分离和任选地定量对来自样品的测量的发射光、反射光或透射光的贡献来选择性地询问不同的目标分析物，所述测量的发射光、反射光或透射光具体地来自不同的标记物质。由于每种物质被有效地“映射”到不同的目标分析物，因此可以通过分离对应于它们相关的标记物质的测量信号来实现特定分析物的鉴定和定量。
还可以通过将不同的第一试剂和第二试剂多路添加到样品中来分析多种目标分析物210。图3A为示出用于分析样品中的N种不同目标分析物的一系列示例步骤的流程图350。通常，N可以为2或更多(例如，3或更多，4或更多，5或更多，6或更多，7或更多，8或更多，10或更多，12或更多，15或更多，或甚至更多)。
在第一步骤352中，将样品与N种不同的第一试剂接触。N种不同的第一试剂中的每一种包括与N种不同的目标分析物中的一种特异性结合的结合物质，以及与该结合试剂缀合的独特的第一寡核苷酸。换言之，N种第一试剂中的每一种的结合试剂和缀合的第一寡核苷酸不同于N种第一试剂中的其它第一试剂的结合试剂和缀合的第一寡核苷酸。
接下来，在步骤354中，选择n种目标分析物中的一种用于分析，并且将第二试剂与样品接触，第二试剂包括与第二寡核苷酸缀合的反应性物质，第二寡核苷酸与第一试剂的第一寡核苷酸至少部分互补并杂交，第一试剂与第n种目标分析物选择性结合。因此，第二寡核苷酸在对应于第n种目标分析物(和对应的第n种第一试剂)的位置与样品结合。
然后，在步骤356中，将样品与第n种标记物质接触，该第n种标记物质包括与其它(n-1)种标记物质的标记部分不同的标记部分。标记物质与第n种第二试剂的反应性物质反应，从而将第n种标记物质沉积在靠近第n种目标分析物的样品中。
接下来，在步骤360中，通过如前所述的去杂交和洗涤从样品中除去第n种第二试剂。在步骤362，如果所有N种目标分析物均已被分析，则该程序在步骤366终止。如果不是这样的话，则从N种目标分析物中选择另一第n种分析物用于分析，并且该程序返回到步骤354。
在图3A-3E中示意性示出用于包括N＝3种目标分析物的样品的前述程序。图3B是显示具有三种不同目标分析物310a-c的样品302的示意图。在分析样品302的第一步骤中，将三种不同的第一试剂与样品接触，每种试剂具有不同的结合物质306a-c，其与三种目标分析物310a-c中的不同的一种特异性结合。第一试剂各自包括不同的第一寡核苷酸308a-c。如图3A所示，使每种第一试剂与样品接触产生样品，其中第一试剂仅选择性地结合至与其结合物质306a-c匹配的相应目标分析物310a-c。
在分析的后续步骤中，将包括反应性物质314a和与第一寡核苷酸308a至少部分互补的第二寡核苷酸312a的第二试剂与样品接触。如图3C所示，第二寡核苷酸312a与第一寡核苷酸308a杂交，由此选择性地将该第二试剂结合到与目标分析物310a结合的第一试剂。由于第二寡核苷酸312a与第一寡核苷酸308b和308c之间缺乏互补性，第二试剂不与结合至目标分析物310b和310c的任一第一试剂结合。
然后，如图3C所示，标记试剂318a与样品接触，并以上述方式与反应试剂314a反应，以选择性地将标记试剂318a(或其衍生物)沉积在目标分析物310a附近。标记试剂318a的反应和沉积在图3C中由虚线箭头320a示意性示出。
在标记试剂318a沉积之后，如上所述，通过去杂交和洗涤从样品302中去除第二试剂(即，第二寡核苷酸312a和反应性试剂314a)。所得样品302在图3D中示意性示出。每种不同的第一试剂保持与相应的不同目标分析物310a结合，并且在目标分析物310a附近沉积的标记试剂318a也保持与样品302结合。
然后重复图3C所示和流程图350的步骤354-360中所述的循环，首先使用包括第二寡核苷酸的第二试剂，该第二寡核苷酸(通过至少部分互补性)与第一试剂的第一寡核苷酸308b选择性杂交，所述第一试剂与目标分析物310b结合，然后使用包括第二寡核苷酸的第二试剂，该第二寡核苷酸(通过至少部分互补性)与第一试剂的第一寡核苷酸308c选择性杂交，第一寡核苷酸308c与目标分析物310c结合。在每个循环中，不同的标记试剂接触样品并沉积在相应的目标分析物附近。
在三个完整的标记循环后，样品302如图3E中示意性所示出现，其中三种不同的第一试剂中的每一种保持与其相应的目标分析物310a-c结合，并且三种不同的标记试剂318a-c分别在三种不同的目标分析物310a-c中的每一种的附近沉积。
通常，不同标记试剂318a-c中的每一种可对应于上述标记试剂中的任一种。为了实现对样品中的多种目标分析物的分析，通常选择标记试剂，以使其产生不同的测量信号。例如，在每种标记试剂包括荧光或发色染料部分的实施方案中，选择试剂使得每个染料部分具有不同的光谱性质(例如，吸收、发射)，使得从样品发射、透射通过或反射的测量光可以分离成来自每种染料的贡献，并用于分别鉴定和定量样品中的每种目标分析物310a-c。
报告试剂
报告试剂可以结合上述方法使用。通常，报告试剂包括与标记部分直接或间接缀合的寡核苷酸。用于本文所述方法的报告试剂包括与上述第一试剂的相应第一寡核苷酸至少部分互补并杂交的寡核苷酸。因此，报告试剂的寡核苷酸通常可包括前面讨论的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的任何特征。此外，报告试剂可以包括上述不同类型的标记部分中的任何一种或多种。
报告试剂的使用可以在不同的点整合到本文描述的程序中，并实现各种目的。例如，在一些实施方案中，报告试剂可以用于验证样品中特定目标分析物的存在。图4A示出了包括三种不同目标分析物410a-c的样品402的示意图，类似于图3A中的样品302。将三种不同的第一试剂与样品302选择性结合，每种试剂与每种不同的目标分析物结合。每种第一试剂包括结合试剂406a-c和第一寡核苷酸408a-c。
在将第二试剂引入到样品402中之前(例如，如流程图350的步骤354中)，将样品与报告试剂450接触以验证样品402中目标分析物410a的存在。如图4A所示，报告试剂450包括与寡核苷酸452缀合的标记部分454。寡核苷酸452与寡核苷酸408a至少部分互补，并在将报告试剂450引入样品时与寡核苷酸408a杂交。寡核苷酸452的核苷酸序列与第一寡核苷酸408b和408c的序列充分非互补，使得寡核苷酸452不与这些第一寡核苷酸中的任一个杂交。在洗去未结合的报告试剂450之后，将样品402中剩余的报告试剂450与第一试剂选择性结合，该第一试剂与目标分析物410a结合。
样品402中目标分析物410a的存在可以通过测量从样品402发射、反射或透射通过的光来验证。特别地，通过检测到对应于标记部分454的被测光的一部分，可以验证样品402中目标分析物410a的存在。任选地，样品402中的目标分析物410a的量也可以基于可归因于标记部分454的测量的信号贡献来定量。
样品402中存在目标分析物410a的位置可用于确定感兴趣区域以进一步测量和/或将试剂递送至样品402。例如，如果目标分析物410a仅定位于样品402的一部分，则随后的样品光发射、反射或透射测量，和/或试剂向样品402的递送，可以任选地仅限于样品的该区域。
或者，当目标分析物410a不存在于样品中时，与目标分析物410a选择性结合的第一试剂(即，具有结合物质406a和第一寡核苷酸408a)将不与样品402结合。结果，由于不存在第一寡核苷酸408a，报告试剂450也将不与样品402结合，并且来自样品402的测量光将不包括标记部分454的贡献，表明样品中不存在目标分析物410a。结果，可省略使样品与第二试剂和标记物质接触以将标记部分特异性地沉积在目标分析物410a附近的步骤。
在前述示例中，使用单个报告试剂450来选择性地鉴定和任选地定量样品中的单个目标分析物410a。然而，可以用多种不同的报告试剂和不同的标记部分进行类似的标记和测量，这些报告试剂中的每一种包括仅与图4A中的第一寡核苷酸408a-c之一选择性杂交的不同寡核苷酸，使得每种报告试剂450靶向特定的目标分析物410a-c。可将每种报告试剂与样品连续地接触、测量以及去除，或者，可将多组多种报告试剂应用于样品。假设从样品中测得的发射光、透射光或反射光可以分解为来自每种单独报告试剂的标记部分的贡献，则可以对样品中的2种或更多种(例如，3种或更多种，4种或更多种，5种或更多种，6种或更多种，8种或更多种，10种或更多种，或甚至更多种)不同目标分析物进行平行分析。
报告试剂通常也可在本文所述的分析程序中的任何中间步骤使用。例如，参考结合图3A-3E描述的程序，报告试剂可用于验证任何目标分析物310a-c(以及图4A中的相应目标分析物410a-c)的存在。它们可以在样品与一种或多种第一试剂接触后的程序的任何阶段引入，如上所述。
在一些实施方案中，报告试剂可与标记物质一起使用或作为标记物质的替代物使用，用于鉴定和定量样品中的目标分析物。图4B示出了包括五种不同目标分析物410a-e的样品402的示意图。该样品已与五种不同的第一试剂接触，每种试剂具有不同的结合物质406a-e和不同的第一寡核苷酸408a-e，将五种不同的第一试剂中的每一种与五种不同的目标分析物中的一种选择性结合。
还对图4B中的样品402进行了三个分析循环，以将标记部分沉积在三种不同目标分析物附近，如上所述。结果，三种不同的标记物质418a-c已沉积在样品中靠近相应的目标分析物410a-c。
此外，将两种不同的报告试剂引入到样品中。第一种报告试剂包括寡核苷酸452d和标记部分454d。寡核苷酸452d与第一寡核苷酸408d至少部分互补，并与第一寡核苷酸408d杂交。寡核苷酸452d与样品中任何其他第一寡核苷酸的互补性不足以与其他第一寡核苷酸显著杂交。类似地，第二报告试剂的寡核苷酸452e与第一寡核苷酸408e至少部分互补，并与第一寡核苷酸408e杂交。寡核苷酸452e与样品402中的任何其它第一寡核苷酸互补性不足。
选择标记物质418a-c中的标记部分和报告试剂(即，标记物质454d-e)，使得各标记物质不同，因此具有不同的光谱吸收、反射或发射特性。通过分析从样品402发射的、透射的或反射的光，可以区分来自每种不同标记部分的贡献并将其选择性地归因于目标分析物410a-e。以这种方式，可以鉴定和定量样品402中的每种目标分析物410a-e。
图4B中的样品402包括来自标记物质的标记部分和报告试剂的混合物。然而，在一些实施方案中，报告试剂可用于标记和检测对应于生物样品中所有目标分析物的信号。
例如，图4C是包括M种不同的目标分析物410a…410M的样品402的示意图。M通常可以为2或更多(例如，3或更多，4或更多，5或更多，6或更多，8或更多，10或更多，15或更多，20或更多，30或更多，40或更多，50或更多，或甚至更多)。将样品与一组第一试剂404a…404M接触，以将第一试剂中的每一种与M种目标分析物中的不同的一种选择性结合，如上所述。
然后，将报告试剂450a…450M与第一试剂选择性杂交以标记M种目标分析物。每种报告试剂包括不同的标记部分，使得M种目标分析物中的每一种用不同的标记部分标记。在一些实施方案中，将报告试剂单独(即，连续)应用于样品402，并且测量从一次仅存在一种报告试剂的样品发射、反射或透射的光，以鉴定和定量对应于一种报告试剂的目标分析物。
然而，在某些实施方案中，将样品与报告试剂组(例如，2种或更多种报告试剂的组，3种或更多种报告试剂的组，4种或更多种报告试剂的组，报告试剂的组，5种或更多种报告试剂的组，6种或更多种报告试剂的组，8种或更多种报告剂的组，或甚至更多种报告试剂的组)接触，其中每种报告试剂仅与第一试剂之一(其与样品中的目标分析物之一结合)选择性杂交。测量从样品(其具有存在于样品中的一组多个报告试剂)发射、反射或透射的光，并将其分解为来自报告试剂的标记部分中的每个的贡献。这些贡献然后可用于鉴定和定量对应于该组的报告试剂的每种目标分析物。
然后可以通过如前所述的去杂交从样品中除去该组报告试剂，并引入一组新的报告试剂，其与不同的一组第一试剂(其与一组不同的目标分析物结合)选择性杂交。该新组可以包括与先前组相比相同数量的报告试剂或不同数量的报告试剂。
以这种方式继续分析样品中的目标分析物，连续的报告试剂组杂交、检测和去除，直到所有M种目标分析物均被分析。
在一些实施方案中，可以实施混合分析工作流程，其使用报告试剂和标记部分的沉积(例如，通过TSA)来分析目标分析物。此类程序可以用于，例如，包括相对大量的目标分析物的样品，其中一些(例如，其中的1至8种)是特别重要的。杂交程序对于包括相对大量目标分析物的样品也是有用的，并且目标分析物中的一些弱表达或者在标记后产生难以测量的信号。对应于特别重要或弱表达的目标分析物的测量信号的放大可用于实现高度多路复用的样品表征，特别关注某些分析物。
此类样品402的示例在图4D中示出。该样品包括目标分析物410a…410M和410u、410v和410w。在这些目标分析物中，410u-410w是特别重要的。
混合分析工作流程的一个示例如下。将样品402与第一试剂404a…404M和404u-404w接触。这些第一试剂中的每一种包括选择性结合目标分析物之一的不同结合基团，以及不同的第一寡核苷酸。
在第一试剂已选择性地结合并定位于样品402中对应于其各自的目标分析物的位置处之后，以上面结合图4C描述的方式使用报告试剂450a…450M对目标分析物410a…410M进行分析。具体而言，报告试剂成组地或单独地与样品402中的第一试剂杂交。每个报告试剂包括与第一试剂404a…404M的第一寡核苷酸中的仅一个至少部分互补的一种不同的寡核苷酸，以及一种不同的标记部分。报告试剂450a…450M可以一次一种(例如，连续地)或在2个或更多个的组中与样品杂交。为了检测杂交后的报告试剂，测量从样品发射、反射或透射的光，并且如果其包含来自多个标记部分的贡献，则将其分解为来自每个标记部分的贡献。鉴定并任选定量对应于每组报告试剂的目标分析物，然后通过去杂交和洗涤从样品402中去除报告试剂组。剩余的目标分析物410a…410M的分析以类似的方式进行，通过将一种或多种选择性报告试剂的组与相应的第一试剂404a…404M杂交，测量对应于报告试剂的信号，然后去除制剂中的报告试剂，为另一个分析循环做准备。
接下来，依次分析每个高度重要目标分析物410u-410w。如图4E示意性所示，将样品与第二试剂接触，该第二试剂包括与第一寡核苷酸408u选择性杂交的第二寡核苷酸412u。与第二寡核苷酸412u缀合的是反应性物质414u。在第二试剂杂交之后，标记物质418u与样品接触并与反应性物质414u反应，在样品中靠近目标分析物410u的位置处沉积标记物质418u(或其衍生物)。在沉积标记物质418u之后，通过去杂交和洗涤从样品中去除第二试剂(例如，包括第二寡核苷酸412u和反应性物质414u)。
为了分析目标分析物410u，测量从样品发射、反射或透射的光，并确定来自标记物质418u的所测量的信号的贡献，以鉴定并任选地定量目标分析物410u。
然后重复上述分析目标分析物410u的步骤顺序以分析目标分析物410v和410w，其中第二试剂包括不同的第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸与特异性结合目标分析物410v和410w的第一试剂特异性杂交。在图4D和4E所示的实例中，执行针对目标分析物410u描述的步骤顺序的两个额外循环，以分别分析目标分析物410v和410w。
试剂盒和组合物
本文所述的试剂、物质和部分可以包括在以包含所述试剂、物质和部分的组合物为特征的多种试剂盒中。通常，试剂盒是一种或多种试剂的包装，每种试剂呈组合物的形式。可以制备以本文所述的任何不同试剂、物质和部分为特征的组合物并用于本文所述的目标分析物分析。这些组合物可以与其它特征(诸如用于制备组合物和将该组合物用于样品分析的说明书)一起包括在产品试剂盒中。产品试剂盒可以被密封或以其他方式包含在各种不同的容器中。
测量对应于标记部分的光信号
图6是示出用于采集样品的多个光谱分辨图像的系统600的示意图。系统600可以测量从样品发射、透射和/或反射的光，该样品包括本文所述的一种或多种标记部分。所测量的光通常包括来自样品中存在的每个标记部分的贡献，并且系统600可以分析在所测量的光中编码的多光谱图像信息，分解图像信息以分离样品中的每种标记部分的对所测量的光的贡献。对于样品中的每个标记部分，该分解产生作为样品内位置函数的一组幅度或强度测量值。该幅度或强度测量值可用于定量每种标记部分的量，并因此定量每种目标分析物的量以及样品中的每个位置。
光源602向光调节光学器件604提供光622。光622可以为非相干光，诸如从灯丝源产生的光，或光622可以为相干光，诸如由激光器产生的光。光622可以为连续波(CW)或时间门控(即，脉冲)光。此外，可以在电磁波谱的选定部分中提供光622。例如，光622可以具有落入紫外、可见、红外或其他光谱区域内的中心波长和/或波长分布。
光调节光学器件604可以配置成以多种方式变换光622。例如，光调节光学器件604可以对光622进行光谱过滤以提供光谱的选定波长区域中的输出光。可替换地，或者另外，光调节光学器件可以调节光622的空间分布和光622的时间特性。通过光调节光学器件604的元件的作用由光622产生入射光624。
入射光624被引导以入射到安装在照射台606上的样品608上。台606可以提供用于固定样品608的装置，诸如安装夹或其他紧固装置。或者，台606可以包括可移动轨道或带，多个样本608固定在该轨道或带上。驱动器机构可以被配置成移动轨道，以便将多个样品一次一个地连续平移通过台606上的照射区，入射光624入射在该照射区上。台606还可以包括平移轴和用于相对于照射台606的固定位置平移样品608的机构。平移机构可以是手动操作的(例如，螺纹杆)或可以通过电致动(例如，机动化驱动器、压电致动器)自动移动。
响应于入射光624，发射光626从样品608射出。可以以多种方式产生发射光626。例如，在一些实施方案中，发射光626对应于透射通过样品608的入射光624的一部分。在其它实施方案中，发射光626对应于从样品608反射的入射光624的一部分。在另外的实施方案中，入射光624可以被样品608吸收，并且发射光626对应于响应于入射光624来自样品608(例如，来自样品608中的荧光成分)的荧光发射。在更进一步的实施方案中，样品608可以是发光的，并且即使在没有入射光624的情况下也可以产生发射光626。在一些实施方案中，发射光626可以包括经由前述机制中的两个或更多个机制产生的光。
集光光学器件610被定位成接收来自样品608的发射光626。例如，集光光学器件610可以被配置为当光626发散时使所发射的光626平行。集光光学器件610还可以被配置为对发射光626进行光谱过滤。过滤操作可以是有用的，例如，为了将通过上述机制之一产生的发射光626的一部分与通过其他过程产生的光隔离。例如，本文所述的方法用于确定样品中一种或多种标记部分的荧光光谱的准确估计。集光光学装置610可以被配置为滤除发射光626的非荧光成分(例如，对应于透射和/或反射的入射光的成分)。此外，在实施方案中出于特定目的，集光光学器件610可以被配置为修改发射光626的空间和/或时间特性。集光光学器件610将发射光626转换为入射到检测器612上的输出光628。
检测器612包括一个或多个元件，诸如配置成检测输出光628的CCD传感器。在一些实施方案中，检测器612可以被配置为测量光628的空间和/或时间和/或光谱特性。检测器612产生对应于输出光628的电信号，并通过电通信线路630传送到电子控制系统614。
电子控制系统614包括处理器616、显示设备618和用户界面620。除了接收对应于由检测器612检测的输出光628的信号之外，控制系统614向检测器612发送电信号以调整检测器612的各种特性。例如，如果检测器212包括CCD传感器，则控制系统614可以向检测器612发送电信号以控制CCD传感器的曝光时间、有效面积、增益设置和其他特性。
电子控制系统614还分别通过电通信线路632、634、636和638与光源602、光调节光学器件604、照射台606和集光光学器件610通信。控制系统614向系统600的这些元件中的每一个提供电信号，以调节这些元件的各种特性。例如，提供给光源602的电信号可以用于调节光622的强度、波长、重复率或其他特性。例如，提供给光调节光学器件604和集光光学器件610的信号可以包括用于配置调节光的空间特性的设备(例如，空间光调制器)的特性以及用于配置光谱滤波设备的信号。例如，提供给照射台606的信号可以提供样品608相对于台606的定位和/或将样品移动到台606上用于照射的位置。
控制系统614包括用于显示系统特性和参数以及用于显示样品608的捕获图像的用户界面620。提供用户界面620以便于操作者与系统600交互并对系统600进行控制。处理器616包括用于存储使用检测器612捕获的图像数据的存储设备，并且还包括包含对处理器616实施指令的计算机软件，该指令使处理器616执行控制功能，例如上面讨论的那些。此外，软件指令使处理器616对检测器612捕获的图像进行数学处理，并执行将由系统600获得的图像分解成来自样品中特定标记物质的贡献的步骤。
在一些实施方案中，光调节光学器件604包括可调光谱滤光器元件，诸如滤光轮或液晶光谱滤光器。该滤光器元件可以被配置为使用不同光波段来提供对样品的照射。光源602可以提供具有宽光谱波长成分分布的光622。通过光调节光学器件604中的滤光器元件，这种宽波长分布的选定区域被允许作为入射光624通过，并被引导以入射到样品608上。随后，改变光调节光学器件604中的滤光器通带的波长以提供具有不同波长的入射光624。还可以通过采用具有产生不同波长的光的多个源元件的光源602，并且交替地打开和关闭不同的源元件以提供具有不同波长的入射光624，来记录光谱分辨的图像。
集光光学器件610可以包括与以上结合光调节光学器件604讨论的那些类似的可配置光谱滤光器元件。因此，可以在样品608的激发侧(例如，通过光调节光学器件604)和在样品608的发射侧(例如，通过集光光学器件210)提供光谱分辨。
收集样品的多个光谱分辨的图像的结果是“图像堆栈(image stack)”，其中堆栈中的每个图像是对应于特定波长的样品的二维图像。在概念上讲，该组图像可以被可视化为形成三维矩阵，其中矩阵维度中的两个是每个图像的空间长度和宽度，而第三矩阵维度为光谱指数。为此，这组光谱分辨图像可以被称为图像的“光谱立方体”。如本文所用，这样的一组图像(或图像堆栈或光谱立方体)中的“像素”指的是每个图像的共同空间位置。因此，一组图像中的像素包括与对应于该像素的空间位置处的每个图像相关联的值。
为了将样品中的多种标记物质中的每一种对包含在多光谱图像堆栈中的图像信息的贡献进行分离，可以使用光谱解混方法(spectral unmixing method)。光谱解混是一种定量分离由光谱上不同的源产生的图像中的贡献的技术。例如，样品可以含有三种不同类型的目标分析物，每种被标记物质标记。这三种不同的标记物质可以各自具有不同的吸收光谱。通常，标记物质的各个吸收光谱在其被使用之前是已知的，或者可以被测量。在最一般的情况下，受照射的样品的图像将包含来自三种标记物质的每一种的光谱贡献。例如，在含有多种不同荧光标记物质的样品中会出现类似的情况，其中每一种都有助于测量的荧光发射。
光谱解混将包括来自多个光谱源的贡献的一个或多个图像分解成一组分量图像(“解混图像(unmixed image)”)，该分量图像对应于来自样品中的每个光谱实体的贡献。因此，如果样品包括三种不同的标记物质，每种标记物质对特定的目标分析物具有特异性，那么样品的图像可以被分离成三个解混图像，每个解混图像主要反映来自染料中的仅一种的贡献。
解混过程基本上对应于将图像分解成一组光谱本征态。在许多实施方案中，如上所述，本征态是预先已知的。在其他实施方案中，有时可以使用诸如主成分分析的技术来确定本征态。在任一种情况下，一旦已识别本征态，可通过计算一组值(通常作为系数矩阵)来分解图像，该组值对应于整个图像中的每个本征态的相对权重。然后可以分离出每个单独的本征态的贡献，以产生解混图像集。
例如，可以通过在一组不同的激发波长λk下照射样品来测量样品的一系列具有x和y坐标的二维图像。如上所述，可以将二维图像组合以形成三维图像立方体I(x,y,k)，其中图像立方体的前两个指数表示坐标方向，而第三个指数是与照射光的波长相对应的光谱指数。为了简单起见，假设样品的每个图像均包含来自两个不同光谱源F(λk)和G(λk)的光谱贡献，那么三维图像立方体I(x,y,k)中的值可以由下式给出
S(x,y,k)＝a(x,y)·F(λk)+b(x,y)·G(λk) (1)
其中λk用于表示给定波长(或波段)。函数a(x,y)和b(x,y)描述了样品中两个不同光谱源的光谱贡献的空间丰度。
根据方程(1)，三维图像立方体中的任何位置(即，在任何二维像素坐标处，以及在特定照射波长处)的净信号是由每个的相对丰度加权的两个贡献之和。这可以表示为
I(λk)＝aF(λk)+bG(λk) (2)
函数F和G可以称为系统的“光谱本征态”，因为它们对应于样品中光谱源的纯光谱，它们以不同的比例组合以产生样品的测量光谱图像。因此，样品光谱是对应于来自两个光谱源的单独的贡献的加权叠加。
如果光谱F(λk)和G(λk)是已知的(或可以被推导出)，则方程(2)可以被倒置以求解a和b，前提是光谱I包括至少两个元素(即，前提是一个具有用于至少两个波长的数据λk)。方程(2)可以改写为矩阵形式I＝EA，使得
A＝E-1I (3)
其中A为具有分量a和b的列向量，E为矩阵(matrix)，其列为光谱本征态，即[F G]。
使用方程(3)，所测量的样品的光谱图像可用于计算在特定像素位置处单纯地来自源F和单纯地来自源G的图像的贡献。可以针对所选择的图像上的每个像素位置(即，I中的值x和y的整个范围)重复该过程，以产生仅包括来自源F的贡献的样品的图像，以及仅包括来自源G的贡献的样品的另一图像。
在上述讨论中，光谱源的数量是两个(即，F和G)。然而，一般而言，解混技术不限于任何特定数目的源。例如，样品通常可以包含m个不同的光谱源。如果收集数据的波长的数目是n，即，k＝1…n，则矩阵E是n×m矩阵而不是如以上讨论的n×2矩阵。然后，可以以与上述相同的方式使用解混算法，以分离出来自m个光谱本征态中的每一个的图像中每个像素位置处的特定贡献。
限制算法区分来自不同光谱本征态的贡献的能力的一个因素是本征态之间的光谱区分程度。两个光谱(诸如两个光谱本征态I1和I2)之间的相关性可以通过光谱角θ来描述，其中：
对于两个成员θ较小的光谱组不容易分离成它们的分量。从物理上讲，其原因是容易理解的：如果两个光谱仅略有不同，则难以确定每个的相对丰度。
许多技术可用于测量或估计光谱源F和G(以及其它光谱源，其中样品包括两个以上)的纯光谱。通常，可以使用产生足够精度的光谱本征态的任何方法。一些样品可以含有光谱源，诸如染料或其他化学部分，对于这些光谱源，在公开的参考材料中存在可获得的已知光谱。或者，可以使用一个或多个测量系统直接测量源部件的光谱。在一些样品中，可以知晓样品的特定区域仅包括一个特定光谱源，并且可以从仅对样品的识别区域进行的测量中提取该源的光谱。
各种数据分析技术也可用于确定成分光谱以用于光谱解混，例如主成分分析(principal component analysis，PCA)，其从图像立方体中识别最正交的光谱特征向量并产生得分图像，其示出整个图像中每个特征向量的加权。这可以结合其他数学处理来完成，并且存在用于识别低维光谱向量的其他已知技术，诸如投影寻踪，一种描述于例如L.Jimenez and D.Landgrebe,“Hyperspectral Data Analysis and Feature ReductionVia Projection Pursuit”,IEEE Transactions on Geoscience and Remote Sensing,Vol.37,No.6,pp.2653-2667,November 1999的技术，其全部内容通过引用并入本文。其它技术包括例如独立成分分析(independent component analysis，ICA)和端成员检测算法。
这些技术通常不太适合于生命科学中的应用。例如，一些技术被优化用于包含具有密集光谱形状和定义明确的窄峰的光谱的光谱成像数据集。在一些技术中，与用于分析的各个光谱特征和峰相比，光谱范围很大。然后可以使用峰的存在或峰的比例将待分离的“端元(end-member)”分类。遗憾的是，生物样品中的组分通常不具有如此定义明确的窄峰。
这些技术中的一些产生与在原始图像立方体内某处以纯形式存在的光谱相关的图像。在生命科学中的许多情况下，图像立方体中存在的信号谱是成分的混合。如果感兴趣的成分不是原始图像立方体中某处的纯形式，则这些技术不太可能生成准确地表示感兴趣的成分的丰度的图像。
有一些技术，有时称为“凸包”算法，即使真实的端元不以纯形式存在于图像中，其也可估计真实的端元是什么，但有效性取决于图像立方体中的信号光谱与端元有多接近。
一种可用于在没有所有本征态的先验知识的情况下提取光谱本征态(或其表现)的技术涉及考虑给定像素的信号谱I(λk)，并从其中减去第一光谱源F(λk)的最大量，同时留下在所有谱通道中是正定的剩余信号。即，将每个像素的所谓“剩余谱(remainderspectrum)”Ua(λk)定义为
Ua(λk)＝I(λk)-aF(λk) (5)
然后选择与在每个光谱通道中具有非负值的Ua(λk)一致的参数a的最大值。然后，将所得谱Ua(λk)用作信号谱，去除由于第一光谱源F的贡献。也可以不基于上面列出的严格的非负标准，而是基于结合小的负分布的一些相关标准来确定参数α，以考虑诸如测量系统中的散粒噪声或检测器噪声的因素。用于去除最大量的光谱源F的优化准则的其他示例包括使用不同的误差函数。
或者，可以寻求提取归因于第二光谱源G的对测量光谱的贡献。类似于方程(5)，对于每个像素的剩余谱可以如下计算
Ub(λk)＝I(λk)-bG(λk) (6)
其中选择与在每个光谱通道中具有非负值的Ub(λk)一致的参数b的最大值。
余项技术可以扩展到这样的情况，其中样品的一种或多种附加组分的光谱是已知的，并且希望去除它们对信号的贡献。在这种情况下，剩余谱被写为基于附加谱并与每个光谱通道中的正余数一致地从观察信号中减去每个这样的成分的贡献。
在美国专利10,126,242和7,555,155以及PCT专利公开号WO2005/040769中记载了光谱解混的另外方面，其各自的全部内容通过引用并入本文。
图7示出了电子控制系统614的示例，其可以与本文公开的系统和方法一起使用。电子控制系统可以包括一个或多个处理器702(例如，对应于图6中的处理器616)、存储器(memory)704、存储设备(storage device)706以及用于互相连接的界面708。处理器702可以处理用于在电子控制系统614内执行的指令，包括存储在存储器704中或存储设备706上的指令。例如，指令可以指示处理器702执行本文公开的任何分析和控制步骤。
存储器704可以存储用于处理器702的可执行指令、关于系统的参数(诸如激发和检测波长)的信息以及所测量的光谱图像信息。存储设备706可以为计算机可读介质，诸如软盘设备、硬盘设备、光盘设备或磁带设备、闪存或其它类似的固态存储设备或设备阵列，包括存储区域网络中的设备或其它配置。存储设备706可以存储可以由上述处理器702执行的指令，以及可以由存储器704存储的任何其他信息。
在一些实施方案中，电子控制系统614可以包括图形处理单元以在诸如显示器716的外部输入/输出设备上显示图形信息(例如，使用GUI或文本界面)。图形信息可以由显示设备(例如，CRT(阴极射线管)或LCD(液晶显示器)监视器)来显示，用于显示本文公开的任何信息，诸如测量的和计算的光谱和图像。用户可以使用输入设备(例如，键盘、定点设备、触摸屏、语音识别设备)来向电子控制系统614提供输入。
本文公开的方法可以由电子控制系统614(以及处理器702和616)通过执行在电子控制系统614上可执行和/或可解释的(interpretable)一个或多个计算机程序中的指令来实现。这些计算机程序(也称为程序、软件、软件应用或代码)包括用于可编程处理器的机器指令，并且可以以高级过程和/或面向对象的编程语言和/或以汇编/机器语言来实现。例如，计算机程序可以包含可以存储在如上所述的存储器704、存储单元706和/或有形计算机可读介质上并由处理器702(处理器616)执行的指令。如本文所用，术语“计算机可读介质”是指用于向可编程处理器提供机器指令和/或数据的任何计算机程序产品、装置和/或设备(例如，磁盘、光盘、存储器、可编程逻辑器件(PLD)、ASIC和电子电路)，包括接收机器指令的机器可读介质。
通常，电子控制系统614可以在计算系统中执行以执行上述操作。例如，计算系统可以包括后端组件(例如，作为数据服务器)，或中间件组件(例如，应用服务器)，或前端组件(例如，具有图形用户界面的客户端计算机)，或其任意组合。
试剂和条件
通常，本文所述的各种步骤可在多种条件下使用不同的试剂实施。因此，本节中描述的试剂和条件应理解为仅代表合适的试剂和条件的示例。
通常，第一试剂可在制备后储存在缓冲溶液中，该缓冲溶液可以包括PBS、PBS-T、TBS、TBS-T、水、盐水溶液和Kreb's缓冲液中的一种或多种。该缓冲溶液可以任选地包括一种或多种封闭材料。合适的封闭材料的实例包括，但不限于，BSA，酪蛋白，剪切鲑鱼精子DNA，寡核苷酸，大鼠IgG抗体和小鼠IgG抗体。
第二试剂制备后也可保存在缓冲溶液中。该缓冲溶液可以包括PBS、PBS-T、TBS、TBS-T、水、盐水溶液和Kreb's缓冲液中的一种或多种。该缓冲溶液可以与用于储存第一试剂的缓冲溶液相同或不同。
为了促进第一试剂和第二试剂之间和/或第一试剂和报告试剂之间的杂交，可以将第一试剂和第二试剂(或第一试剂和报告试剂)浸入杂交缓冲液中。合适的杂交缓冲液可以包括浓度在5％和20％之间的DNA组分、蛋白质组分、去污剂和/或离液剂。
为了促进第一试剂和第二试剂之间和/或第一试剂和报告试剂之间的去杂交，可以将第一试剂和第二试剂(或第一试剂和报告试剂)浸入去杂交缓冲液中。合适的杂交缓冲液可以包括浓度在60％和90％之间的离液剂，诸如DMSO和/或甲酰胺。
为了促进第一试剂与样品中的目标分析物结合，可以例如通过移液将第一试剂分层到溶液中的样品上，并与样品一起温育。温育后，可使用例如包括PBS、PBS-T、TBS、TBS-T、水、盐水溶液和Kreb's缓冲液中的一种或多种的缓冲溶液从样品中洗涤未结合的第一试剂。
本文所述的任何杂交、反应、结合和去杂交步骤的温育时间可以为10分钟或更长(例如，20分钟或更长，30分钟或更长，40分钟或更长，60分钟或更长，1小时或更长，2小时或更长，3小时或更长，4小时或更长，5小时或更长，6小时或更长，8小时或更长，10小时或更长，16小时或更长，20小时或更长，24小时或更长，48小时或更长，7天或更长，30天或更长)。
实施例
为了证明本文所述的方法用于分析生物样品中的多种目标物质的功效，进行了若干研究。首先，获得人扁桃体组织的FFPE样品。在第一标记和成像循环中，将组织样品用第一试剂标记，该第一试剂包括特异性靶向生物标志物PD-1的抗体结合试剂。然后将第二试剂与样品一起温育，并与第一试剂杂交。第二试剂包括寡核苷酸缀合的HRP部分。将包含标记部分的标记试剂(
染料HX0046，可获自Akoya Biosciences,Inc.,Menlo Park,CA)通过HRP介导的TSA沉积在组织样品中。去除第二试剂后，对样品进行成像以揭示PD-1的存在。
再进行两个分析循环。在第二个循环中，将样品用第一试剂标记，该第一试剂包括特异性靶向生物标志物PDL1的抗体结合试剂，并将标记部分(
染料HX043，可获自Akoya Biosciences,Inc.)通过HRP介导的TSA沉积以标记PDL1。在第三个循环中，将样品用第一试剂标记，该第一试剂包括特异性靶向生物标志物FOXP3的抗体结合试剂，并将标记部分(
染料HX031，可获自Akoya Biosciences,Inc.)通过HRP介导的TSA沉积以标记FOXP3。
图8A-8C是分别显示组织样品中生物标志物PD-1、PDL1和FOXP3的分布和相对浓度的图像。图8D是示出样品内所有三种标志物的分布的叠加图像。如从图像明显看出的，当适当地选择所应用的标记部分时，可以在样品中独立地鉴定和定量每种不同的生物标志物，而几乎没有或没有交叉通道干扰。
为了研究通过HRP介导的TSA放大的效果，获得扁桃体组织的人FFPE切片，并将超过15种不同的第一试剂(每种具有靶向不同生物标志物的结合试剂)与样品结合。然后将相应的报告试剂与第一试剂杂交，并获得具有不同报告试剂的子集的样品图像。然后通过如上所述的去杂交从样品中去除报告试剂，并且在三个单独的HRP介导的TSA标记循环中将靶向三种不同标志物PD-1、PDL-1和FOXP3的标记部分沉积在样品中。然后获得具有对应于标志物PD-1、PDL-1和FOXP3的信号放大的样品图像。
图9A为显示组织切片中标志物CD8、CD31、CD20、CD45RO、CD4、全细胞角蛋白和CD34的分布和相对浓度的图像，而图9B为显示组织切片中CD11c、Ki67、PDL-1、E-钙粘蛋白、CD3和FOXP3的分布和相对浓度的图像。针对PD-1、PDL-1和FOXP3的放大信号显示于图9C的图像中。图9C中对应于PDL-1和FOXP3的信号的强度明显大于图9B中的这些标志物的对应信号。对应于第一试剂(第一寡核苷酸)、报告试剂和第二试剂(第二寡核苷酸)的核苷酸序列如下表1所示。
表1
为了证明从样品中去除了第二试剂，获得扁桃体组织的FFPE切片，并使其经受三个循环的HRP介导的TSA以沉积标记部分。在第一个循环中，将
染料570(AkoyaBiosciences,Inc.)通过HRP介导的TSA沉积在样品中。然后从样品中去除第二试剂，并通过引入
染料690(Akoya Biosciences,Inc.)进行第二个循环，其中无第二试剂杂交，因此样品中不存在HRP反应性试剂。在第三个循环中，将
染料690通过HRP介导的TSA沉积。在第二和第三个循环后获得样品图像。
图10A和10D显示循环2和3后的核染色图像，图10B和10E显示循环2和3后的
染料570图像，图10C和10F显示循环2和3后的
染料690图像。从图10C和10F明显看出，在循环1和2之间实现了第二试剂的完全去除。
对于前述实施例，
染料570和670的标记方案如下：
(a)将组织用20％DMSO洗涤3次。
(b)将组织用200μl杂交缓冲液温育10分钟。10分钟后，将组织用20％DMSO(3X)洗涤，然后用1X
测定缓冲液洗涤3X。
(c)加入200μl分别用1X plus扩增稀释试剂以1：200和1：400的比例稀释的
染料(O570或O670)。温育20分钟。
(d)20分钟后，将组织用1X
测定缓冲液(3X)洗涤。用去离子水(3X)洗涤并在20X物镜下成像。
(a)将组织用20％DMSO洗涤3次。将组织用200μl杂交缓冲液温育10分钟。10分钟后，将组织用20％DMSO(3X)洗涤，然后用1X
测定缓冲液洗涤3X。
(b)加入200μl用1X plus扩增稀释试剂以1：50的比例稀释的TSA dig。温育15分钟。
(c)15分钟后，将组织用1X
测定缓冲液洗涤。
(d)加入200μl用1X plus扩增稀释试剂以1：50的比例稀释的OPAL780。温育1小时。用1X
测定缓冲液(3X)洗涤。用去离子水(3X)洗涤并在20X物镜下成像。
其它实施方案
虽然本公开描述了特定的实施方案，但是这些不应被解释为对本公开的范围的限制，而应解释为对某些实施方案中的特征的描述。在单独实施方案的上下文中描述的特征通常也可以在单个实施方案中组合实现。相反，在单个实施方案的上下文中描述的各种特征也可以在多个实施方案中单独地或以任何合适的子组合来实现。此外，尽管特征可以描述为存在于某些组合中并且甚至最初如此要求保护，但是来自要求保护的组合的一个或多个特征通常可以从该组合中去除，并且要求保护的组合可以涉及子组合或者子组合的变体。
除了本文明确公开的实施方案之外，应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行各种修改。因此，其它实施方案也在所附权利要求的范围内。
Claims (27)
1.一种方法，其包括：
(i)将包含第一目标分析物的生物样品与第一试剂接触，其中所述第一试剂包含第一结合物质以及与所述结合物质缀合的第一寡核苷酸，所述第一结合物质与所述第一目标分析物特异性结合；
(ii)将所述生物样品与第二试剂接触，其中所述第二试剂包含第一反应性物质以及与所述第一反应性物质缀合的第二寡核苷酸，以使所述第二寡核苷酸的至少一部分与所述第一寡核苷酸的至少一部分杂交；
(iii)将所述生物样品与第一标记物质接触，其中所述第一标记物质与所述第一反应性物质反应以将所述第一标记物质或其衍生物沉积在所述生物样品中；
(iv)在沉积所述第一标记物质或其衍生物之后，从所述生物样品中去除所述第二试剂；
(v)将所述生物样品与第三试剂接触，其中所述第三试剂包含第二结合物质以及与所述第二结合物质缀合的第三寡核苷酸，所述第二结合物质与所述生物样品中的第二目标分析物特异性结合；
(vi)将所述生物样品与第四试剂接触，其中所述第四试剂包含第二反应性物质以及与所述第二反应性物质缀合的第四寡核苷酸，以使所述第四寡核苷酸的至少一部分与所述第三寡核苷酸的至少一部分杂交；以及
(vii)将所述生物样品与第二标记物质接触，其中所述第二标记物质与所述第二反应性物质反应以将所述第二标记物质或其衍生物沉积在所述生物样品中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一反应性物质包含催化剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一反应性物质包含酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酶包含辣根过氧化物酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一标记物质包含染料。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一标记物质包含无活性的酪酰胺或其衍生物与染料的缀合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述生物样品与所述第一标记物质接触包括将所述第一标记物质转化为活性酪酰胺或其衍生物与染料的缀合物，其中所述活性酪酰胺或其衍生物在所述第二试剂附近与所述生物样品结合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合物质包含抗体或抗体片段。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含至少10个核苷酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含至少10个核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的核苷酸序列至少70％互补。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含比所述第一寡核苷酸更多数量的核苷酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含与所述第一寡核苷酸的序列的不同部分互补的多个连续、非连贯的核苷酸序列。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一反应性物质和第二反应性物质是相同的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一反应性物质和第二反应性物质各自包含酶。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一反应性物质和第二反应性物质各自包含辣根过氧化物酶。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和第三寡核苷酸是不同的。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸和第四寡核苷酸是不同的。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一标记物质包含第一染料，并且其中所述第二标记物质包含不同于所述第一染料的第二染料。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合物质包含第一抗体或第一抗体片段，并且其中所述第二结合物质包含第二抗体或第二抗体片段，并且其中所述第一结合物质和第二结合物质与所述生物样品中不同的第一目标分析物和第二目标分析物选择性结合。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含RNA碱基的核苷酸序列。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含DNA碱基的核苷酸序列。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含至少一个合成核苷酸。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸是完全单链的。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸是部分双链的。
26.根据权利要求5所述的方法，其中所述染料包含发色物质或荧光物质。
27.一种试剂盒，其包含：
第一试剂，其中所述第一试剂包含第一结合物质以及与所述第一结合物质缀合的第一寡核苷酸，所述第一结合物质与生物样品的第一目标分析物特异性结合；
第二试剂，其中所述第二试剂包含第二结合物质以及与所述第二结合物质缀合的第二寡核苷酸，所述第二结合物质与所述生物样品的第二目标分析物特异性结合；
第三试剂，其中所述第三试剂包含反应性物质以及与所述反应性物质缀合的第三寡核苷酸；
第四试剂，其中所述第四试剂包含所述反应性物质以及与所述反应性物质缀合的第四寡核苷酸；
第一标记物质；以及
第二标记物质，
其中所述第一标记物质和第二标记物质各自与所述反应性物质反应以在所述生物样品中分别沉积所述第一标记物质和第二标记物质或其衍生物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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