CN113598003A - 一种提高三七皂苷合成的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于三七产业绿色可持续发展技术领域，公开了一种提高三七皂苷合成的方法及应用，在三七种植期间利用含有0.02％v/vSilwetL‑77的褪黑素溶液喷洒三七叶片。多次喷洒效果更好，建议每年喷两次，中间间隔4个月；0.3升一平米。结果表明，褪黑素促进了PnSE、PnDS、PnCAS、PnHMCAS、PnFGPS基因的表达，其中10μM褪黑素对这些基因表达水平的促进作用最为显著。与对照相比，叶片喷施10μM褪黑素使根中R1、Rg1和Rb1的含量分别增加了3.7％、19％和20％。本发明可促进皂苷在其根部的积累，具有成本低、操作简单、效益高、对植物和人体无毒害的特点，对三七农业绿色可持续性发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于三七产业绿色可持续发展技术领域，尤其涉及一种提高三七皂苷合成的方法及应用。
背景技术
目前：三七(Panax notoginseng(Bruk.)FH Chen)是五加科多年生草本植物。它是中国传统的药用植物，三七的根主要用于治疗人类心血管疾病。皂苷是三七根中主要的生物活性化合物，包括人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1，均属于达玛烷型四环三萜化合物。皂苷对治疗人类心血管系统具有积极作用，例如，治疗抗脑缺血、中风恢复和减少动脉粥样硬化。因此，通过生物方法促进皂苷合成是提高三七药效的重要手段。
褪黑素是动物和植物中普遍存在的信号分子。植物褪黑素在植物正常生长和应激反应中具有多种不同的功能，在植物生长调控和提高植物对不同形式的生物和非生物胁迫的抗性有效性方面具有独特的优势。褪黑素可以作为一种植物兴奋剂来促进种子发芽和植物生长，或作为响应胁迫的保护剂来提高植物对不利环境的耐受性，或作为水果成熟的生长调节剂。例如，褪黑素处理通过诱导NO产生触发番茄不定根形成。褪黑素还具有调节作物次生代谢产物的合成和降低农残等功能。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：褪黑素在三七药用成分皂苷含量调控中的作用机理还不清楚。目前也没有褪黑素提高三七皂苷合成的方法及其应用技术。
解决以上问题及缺陷的意义为：
本专利为三七提质增效的绿色可持续农业发展奠定理论和实践基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高三七皂苷合成的方法。
本发明是这样实现的，一种提高三七皂苷合成的方法，所述提高三七皂苷合成的方法包括：在三七种植期间利用褪黑素溶液喷施三七叶片。多次喷洒效果更好，建议每年喷两次，中间间隔4个月，0.3升一平米。
进一步，所述褪黑素溶液为含有0.01％～0.03％(v/v,最优为0.02％)Silwet L-77的10μM褪黑素的溶液。
进一步，所述在三七种植期间利用褪黑素溶液喷施三七叶片。
进一步，所述喷洒包括：考虑到褪黑素成本和效果，选用10μM褪黑素并将1L的含有10μM褪黑素的褪黑素溶液喷洒到种植在3m2/空的约350-400株三七植株上。
进一步，所述提高三七皂苷合成的方法还包括：
利用褪黑素溶液提高三七根中皂苷合成基因的表达促进皂苷的生物合成和累积，提高三七皂苷合成。
进一步，所述提高三七皂苷合成的方法具体包括：
(1)使用生长在中国云南省文山市三七基地(N 23.57°,E 104.13°,海拔1543m)的一年生三七植物。用含有0.02％v/v Silwet L-77的不同浓度褪黑素(0、1、10、100和500μM)对植物进行叶面喷洒两次。将1L的不同浓度褪黑素溶液喷洒到种植在3m2/空的约350-400株三七植株上。每个处理喷洒三空。
(2)使用五点抽样方法，在每个处理中收获五株随机选择的植物。从田间收获植物后，用ddH2O清洗叶子和根3-5次。RNAiso Plus试剂盒(Takara，日本)用于从叶或根中提取总RNA。使用PrimeScriptTM RT试剂盒(gDNA Eraser，Takara，日本)对RNA进行逆转录。使用2-ΔΔCT方法计算相对基因表达水平。
(3)将三七干根研成粉末，称取2.5g，用于检测每个重复的皂苷含量。使用70％(v/v)甲醇(Sigma)提取皂苷后，通过HPLC分析浓度
本发明的另一目的在于提供一种利用所述提高三七皂苷合成的方法培育的三七。
本发明的另一目的在于提供一种所述提高三七皂苷合成的方法在三七种植中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明可促进皂苷在其根部的积累，具有成本低、操作简单、效益高、对植物和人体无毒害的特点，可用于改善三七农业实践中的皂苷生物合成，对三七农业绿色可持续性发展具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的提高三七皂苷合成的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的外源褪黑素促进了与皂苷生物合成相关的基因的表达示意图。
图3是本发明实施例提供的外源褪黑素促进三七根皂苷的积累示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高三七皂苷合成的方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的提高三七皂苷合成的方法包括：
S101，于每年第一次利用褪黑素溶液喷施三七叶片；
S102，于每年第二次(间隔四个月)利用褪黑素溶液再喷洒一次三七叶片。
本发明实施例提供的褪黑素溶液为含有0.02％v/v Silwet L-77的10μM褪黑素的溶液。
本发明实施例提供的喷洒包括：将1L的含有10μM褪黑素的褪黑素溶液喷洒到种植在3m2/空的约350-400株三七植株上。
本发明实施例提供的提高三七皂苷合成的方法还包括：
利用褪黑素溶液提高三七根中皂苷合成基因的表达促进皂苷的生物合成和累积，提高三七皂苷合成。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1：
本发明提供的促进三七农业实践中皂苷生物合成的方法及应用，即向三七叶面喷施褪黑素溶液，促进皂苷在三七根部的合成和积累。
实施例2：
本发明分析不同浓度褪黑素处理后三七根中皂苷代谢关键酶基因表达水平的差异。研究结果表明，褪黑素促进了PnSE、PnDS、PnCAS、PnHMCAS、PnFGPS的表达，上述这些基因均参与三七皂苷合成途径中，其中10μM褪黑素对这些基因表达水平的促进作用最为显著(图2)。
实施例3：
为了调查三七中皂苷的含量是否与褪黑素有关，本发明检测了三七根中皂苷的含量。结果表明，褪黑素(10μM，100μM)预处理能够显著增加三七根中的皂苷含量(图3)。特别地，在进行10μM褪黑素预处理时，其皂苷含量明显高于在进行100μM褪黑素预处理时的皂苷含量，即我们分析了三七根中皂苷的浓度，其中包括R1，Rg1和Rb1作为主要的生物活性次生代谢化合物。从图3可以得出，与对照处理相比，施用10和100μM使R1，Rg1和Rb1的浓度分别增加3.7％，19％和20％。这些结果表明适当浓度的外源褪黑激素有助于增加三七次生代谢产物的积累。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种提高三七皂苷合成的方法，其特征在于，所述提高三七皂苷合成的方法包括：在三七种植期间利用褪黑素溶液喷施三七叶片；每年喷两次，中间间隔4个月，0.3升一平米。
2.如权利要求1所述的提高三七皂苷合成的方法，其特征在于，所述褪黑素溶液为含有0.02％v/v Silwet L-77的10μM褪黑素的溶液。
3.如权利要求1所述的提高三七皂苷合成的方法，其特征在于，所述喷洒包括：将1L的含有10μM褪黑素的褪黑素溶液喷洒在350-400株三七植株上。
4.如权利要求1所述的提高三七皂苷合成的方法，其特征在于，所述提高三七皂苷合成的方法还包括：利用褪黑素溶液提高三七根中皂苷合成基因的表达促进皂苷的生物合成和累积，提高三七皂苷合成。
5.如权利要求1所述的提高三七皂苷合成的方法，其特征在于，所述提高三七皂苷合成的方法具体包括：
(1)使用生长在N 23.57°，E 104.13°，海拔1543m的一年生三七植物；用含有0.02％v/vSilwet L-77的不同浓度褪黑素(0、1、10、100和500μM)对植物进行叶面喷洒两次。将1L的不同浓度褪黑素溶液喷洒到种植在3m2/空的约350-400株三七植株上；每个处理喷洒三空；
(2)使用五点抽样方法，在每个处理中收获五株随机选择的植物；从田间收获植物后，用ddH2O清洗叶片和根3-5次；RNAiso Plus试剂盒用于从叶或根中提取总RNA；使用PrimeScriptTM RT试剂盒对RNA进行逆转录；使用2-ΔΔCT方法计算相对基因表达水平；
(3)将三七干根研成粉末，称取2.5g，用于检测每个重复的皂苷含量；使用70％(v/v)甲醇(Sigma)提取皂苷后，通过HPLC分析浓度。
6.一种利用如权利要求1-5任意一项所述提高三七皂苷合成的方法在三七种植中的应用。
7.一种利用如权利要求1-5任意一项所述提高三七皂苷合成的方法在培育三七中的应用。
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