CN113577312A - 多肽纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

多肽纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽纳米颗粒及其制备方法和应用。该多肽纳米颗粒包括聚乙烯亚胺，聚乳酸羟基乙酸和KALA多肽。本发明通过对PEI进行改性，即引入生物相容性优秀的PLGA大幅改善了PEI的细胞毒性，形成核壳结构的纳米颗粒，利用KALA多肽的穿膜性提高了基因载体被细胞吞噬的能力，其稳定的核壳结构延缓了目标基因的释放，从而增加了转染持续时间，在降低细胞毒性的同时提高了基因传递的效率，并且成本低，制作工艺简单，生产过程中不涉及有毒试剂，可广泛应用于基因治疗。

Description

多肽纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
基因疗法是指通过基因工程技术将外源基因转入目标细胞中，对缺陷基因进行修正或补偿，即从根源上治疗疾病的技术。例如通过导入外源基因以弥补基因缺失或变异所导致的蛋白表达的异常，以维持正常的细胞机能。现代基因编辑技术以及人类基因组的完善为基因疗法的进一步发展创造了条件，使基因治疗重新成为研究热点。
核酸分子容易水解且难于穿越细胞膜，难以直接被细胞吞噬，使得裸DNA传递的效率较为低下，因此需要基因载体完成负载外源基因进入宿主细胞的任务。研究并开发稳定、高转染效率、安全性可靠的基因传递材料是基因治疗的关键问题。
目前基因治疗的载体主要分为病毒载体以及非病毒载体两大类。病毒载体主要有腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、慢病毒等。病毒载体转染效率较高，但存在免疫原性和毒性等问题，严重限制了其在临床中的应用。非病毒载体因其安全性、无免疫原性、易于大量制备、运输及保存等优点，因此被广泛应用于基因疗法的相关研究中(参见Z.Zhou,X.Liu,D.Zhu,et al.,Nonviral cancer gene therapy:Delivery cascade andvector nanoproperty integration,Adv.Drug.Deliv.Rev.115(2017)115-154)。
非病毒载体主要是阳离子聚合物，借助静电作用，能与核酸分子形成稳定的复合物，完成目标基因的负载及传递。其中，聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)因其化学结构中伯胺基、仲胺基和叔胺基的不同pKa带来的优秀吸质子能力，具有独特的质子海绵效应，促进DNA在细胞内的转染(参见O.Boussif,F.Lezoualc'h,M.A.Zanta,et al.,A versatilevector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and invivo:polyethylenimine,Proc.Natl.Acad.Sci.92(16)(1995)7297-7301)。然而，PEI的转染效率受其相对分子质量的限制，研究表明相对分子质量高的PEI转染效率低下，而相对分子质量低的PEI虽然转染效率较高，但其细胞毒性大。因此，对PEI进行改性，开发细胞毒性低转染效率高的载体，对基因治疗研究有重要意义。
聚乳酸羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一种可降解的功能性有机化合物，具有良好的生物相容性及加工成型性能，被广泛用于制药和生物医用材料领域，以PLGA制备纳米颗粒封装药物或负载活性因子、抗原等已被广泛报道。利用PLGA支架负载改善基因载体也被证明是降低基因传递系统的细胞毒性的有效策略(参见N.Csaba,A.Sanchez,M.J.Alonso,PLGA:Poloxamer and PLGA:poloxamine blend nanostructuresas carriers for nasal gene delivery,J.Control.Release 113(2)(2006)164-72)。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是针对传统聚乙烯亚胺基因载体细胞毒性强、转染率低的缺点，提供一种多肽纳米颗粒，其能够降低细胞毒性，延缓基因在细胞内的释放以延长基因转染持续时间，提高基因转染效率。
本发明的第一方面提供一种多肽纳米颗粒，包括聚乙烯亚胺(PEI)，聚乳酸羟基乙酸(PLGA)和KALA多肽，其中所述KALA多肽为SEQ ID No.1或者与SEQ ID No.1有至少90％同源性的多肽；或者所述KALA多肽包括SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2有至少95％同源性的多肽。
进一步地，所述聚乙烯亚胺为相对分子质量在500Da～30kDa范围内的线性或枝状PEI，所述PLGA的相对分子质量为10000～200000。
本发明的第二方面提供一种多肽纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1将PEI和PLGA溶解于有机溶剂中，其中PEI:PLGA的重量比为1:5～1:25，搅拌得到有机相；
S2将乳化剂溶解于水中，搅拌得到水相；
S3将所述有机相滴入所述水相中，搅拌，离心后得到PEI-PLGA纳米颗粒；
S4取目标质粒，与所述PEI-PLGA纳米颗粒在水溶液中混合，得到负载目标基因的PEI-PLGA纳米颗粒的悬浮液；
S5取KALA多肽加入所述悬浮液中，混合得到负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散液，离心后得到PEI-PLGA-KALA纳米颗粒，其中所述KALA多肽为SEQ ID No.1或者与SEQ ID No.1有至少90％同源性的多肽；或者所述KALA多肽包括SEQ ID No.2或与SEQ IDNo.2有至少95％同源性的多肽。
进一步地，所述步骤1)中PEI:PLGA的重量比为1:5～1:25。
进一步地，所述步骤1)中PLGA在有机相的浓度为5～50mg/ml，所述步骤2)中乳化剂在水相的浓度为0.1％～1％。
进一步地，所述步骤3)中有机相:水相体积比为1:2～1:10。
进一步地，所述步骤1)中的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正丙醇、三乙胺和吡啶中的一种或多种，所述步骤2)中的乳化剂为正丁醇、聚乙烯醇、吐温80、乙二醇和甘油中的一种或多种。
进一步地，所述步骤4)中PEI-PLGA纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒浓度为0.2～5mg/ml。
进一步地，所述步骤5)中PEI-PLGA-KALA纳米颗粒呈核壳结构，粒径为100nm～285nm。
进一步地，所述PEI:目标质粒的重量比为1:8～12:1，所述KALA多肽:目标质粒的重量比为4:1～25:1，所述目标基因包括报告基因，细胞因子基因和抗癌基因中的一种或多种。
本发明的第三方面提供所述多肽纳米颗粒在制备基因治疗载体或者核酸转染中的应用。
本发明的优点在于：通过对PEI引入具有良好生物相容性的PLGA，大幅改善了PEI的细胞毒性，形成了核壳结构的纳米颗粒；进一步在纳米颗粒外壳引入KALA多肽，利用KALA多肽的穿膜性提高了基因载体被细胞吞噬的能力；PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的核壳结构延缓了目标基因的释放，从而增加了转染持续时间，在降低细胞毒性的同时提高了基因传递的效率；本发明公开的多肽纳米颗粒成本低，制作工艺简单，生产过程中不涉及有毒试剂，可广泛应用于基因治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1是本发明的多肽纳米颗粒制备的流程图；
图2是本发明的多肽纳米颗粒基因传递的机理示意图；
图3是本发明实施例1制备得到的纳米颗粒的透射电镜(TEM)图；
图4是本发明实施例6对PEI-PLGA-KALA纳米颗粒进行的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果图；
图5是PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的直径和zeta电位的测试结果图；
图6是本发明实施例8中制备得到的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒载体的细胞内吞实验的结果图；
图7是本发明实施例9通过CCK8法测试PEI-PLGA-KALA纳米颗粒载体的细胞毒性的实验结果统计图；
图8是本发明实施例10通过荧光蛋白定量表征PEI-PLGA-KALA纳米颗粒载体对细胞的转染效率结果统计图；
图9是本发明实施例10荧光显微镜观察PEI-PLGA-KALA纳米颗粒载体对细胞的转染GFP报告基因后在24h、48h和72h的GFP蛋白表达结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种多肽纳米颗粒，包括聚乙烯亚胺(PEI)，聚乳酸羟基乙酸(PLGA)和KALA多肽。优选地，所述PEI为相对分子质量在500Da～30kDa范围内的线性或枝状PEI，所述PLGA的相对分子质量为10000～200000，所述KALA多肽的氨基酸序列为:WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA(SEQ ID No.1)，其他实施例中，所述KALA多肽可以替换为与SEQ ID No.1同源性不低于90％的多肽。进一步优选地，所述KALA多肽为：WEAKLAKALAKALA(SEQ ID No.2)或与之有95％同源性的多肽序列。
KALA是一种具有优秀的细胞膜穿透能力的多肽，且能够通过离子相互作用与DNA稳定结合，能促进细胞对外源DNA的内吞作用(参见N.Miura,S.M.Shaheen,H.Akita,T.Nakamura,H.Harashima,A KALA-modified lipid nanoparticle containing CpG-freeplasmid DNA as a potential DNA vaccine carrier for antigen presentation andas an immune-stimulative adjuvant,Nucleic Acids Res.43(3)(2015)1317-31.)。本发明将其与PEI和PLGA结合，提高了转染的效率。
本发明的第二方面提供一种多肽纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1将PEI和PLGA溶解于有机溶剂中，PEI:PLGA的重量比为1:5～1:25，搅拌，得到有机相；
S2将乳化剂溶解于水中，搅拌，得到水相；
S3将步骤1)得到的有机相滴入步骤2)制备的水相中，搅拌后离心，得到PEI-PLGA纳米颗粒；
S4取目标质粒，与所述PEI-PLGA纳米颗粒在水溶液中混合，得到负载目标基因的PEI-PLGA纳米颗粒的悬浮液；
S5取KALA多肽加入所述悬浮液中，混合得到负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散液，离心后得到PEI-PLGA-KALA纳米颗粒。其中所述KALA多肽为SEQ ID No.1或者与SEQ ID No.1有至少90％同源性的多肽；或者所述KALA多肽包括SEQ ID No.2或与SEQ IDNo.2有95％同源性的多肽
通过上述方法可以制得本申请的PEI-PLGA-KALA多肽纳米颗粒，图1显示了该方法的流程。具体地，所述步骤S1中PLGA在有机相的浓度为5～50mg/ml，所述步骤S2中乳化剂在水相的浓度为0.1％～1％。
具体地，所述步骤S3中有机相:水相体积比为1:2～1:10。
具体地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正丙醇、三乙胺和吡啶中的一种或多种，所述乳化剂为正丁醇、聚乙烯醇、吐温80、乙二醇和甘油中的一种或多种。
优选地，所述步骤S4中PEI-PLGA纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒浓度为0.2～5mg/ml。
具体地，所述步骤S5中得到的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒呈核壳结构，粒径为100nm～285nm。
进一步地，所述PEI:目标基因的重量比为1:8～12:1，所述KALA多肽:目标基因的重量比为4:1～25:1，所述目标基因优选包括报告基因，细胞因子基因和/或抗癌基因。
本发明的第三方面提供所述多肽纳米颗粒在制备基因治疗载体或者核酸转染中的应用。图2为本申请的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒基因传递的原理示意图。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法均为本领域的常规方法。所用实际的来源、商品名及有必要列出组分者均在首次出现时标注，如无特殊说明，后续试剂均与首次表明内容一致。
实施例1：
a.PEI-PLGA纳米颗粒的制备
称取1mg(±0.02mg)聚乙烯亚胺(PEI)及10mg(±0.1mg)聚乳酸羟基乙酸(PLGA)，溶解于10ml吡啶溶剂中，常温搅拌6h得到有机相。称取20mg(±0.5mg)乳化剂(吐温-80)溶解于40ml(±0.02ml)去离子水中，得到水相。室温搅拌下将有机相以0.5ml/min的速度缓慢滴加入水相中，继续室温搅拌8h后，在9000rpm速度下离心1h，弃去上清液保留沉淀物，得到PEI-PLGA纳米颗粒。冷冻干燥沉淀物，保存于-80℃。
b.负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的制备
称取2mg的含有目标基因编码的质粒(pDNA)，溶解于6ml的水溶液中，称取6mg(±0.01mg)上述步骤制备的PEI-PLGA纳米颗粒加入pDNA水溶液中，振荡10s，室温孵育30min，得到负载pDNA的PEI-PLGA纳米颗粒的水溶液。称取32mg的KALA多肽，加入上述水溶液中，振荡10s，室温孵育0.5h，得到负载pDNA的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散液，8000rpm高速离心后冷冻干燥得到目标产物。
实施例2：
a.PEI-PLGA纳米颗粒的制备
称取5mg(±0.02mg)聚乙烯亚胺(PEI)及25mg(±0.1mg)聚乳酸羟基乙酸(PLGA)，溶解于10ml丙酮溶剂中，常温搅拌24h得到有机相。称取40mg(±0.5mg)乳化剂(聚乙烯醇，PVA)溶解于40ml(±0.02ml)去离子水中，得到水相。室温搅拌下将有机相以0.5ml/min的速度缓慢滴加入水相中，继续室温搅拌12h后，在10000rpm速度下离心45min，弃去上清液保留沉淀物，得到PEI-PLGA纳米颗粒。冷冻干燥沉淀物，保存于-80℃。
b.负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的制备
称取1mg的含有目标基因编码的质粒(pDNA)，溶解于5.5ml的水溶液中，称取3mg(±0.01mg)上述步骤制备的PEI-PLGA纳米颗粒加入pDNA水溶液中，振荡10s，室温孵育30min，得到负载pDNA的PEI-PLGA纳米颗粒的水溶液。称取8mg的KALA多肽，加入上述水溶液中，振荡10s，室温孵育1h，得到负载pDNA的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散液，8000rpm高速离心后冷冻干燥得到目标产物。
实施例3：
a.PEI-PLGA纳米颗粒的制备
称取5mg(±0.02mg)聚乙烯亚胺(PEI)及50mg(±0.1mg)聚乳酸羟基乙酸(PLGA)，溶解于10ml正丙醇溶剂中，常温搅拌12h得到有机相。称取80mg(±0.5mg)乳化剂(聚乙烯醇，PVA)溶解于40ml(±0.02ml)去离子水中，得到水相。室温搅拌下将有机相以0.5ml/min的速度缓慢滴加入水相中，继续室温搅拌12h后，在12000rpm速度下离心1h，弃去上清液保留沉淀物，得到PEI-PLGA纳米颗粒。冷冻干燥沉淀物，保存于-80℃。
b.负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的制备
称取2mg的含有目标基因编码的质粒(pDNA)，溶解于5.5ml的水溶液中，称取11mg(±0.01mg)上述步骤制备的PEI-PLGA纳米颗粒加入pDNA水溶液中，振荡10s，室温孵育30min，得到负载pDNA的PEI-PLGA纳米颗粒的水溶液。称取24mg的KALA多肽，加入上述水溶液中，振荡10s，室温孵育1h，得到负载pDNA的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散液，8000rpm高速离心后冷冻干燥得到目标产物。
实施例4：
a.PEI-PLGA纳米颗粒的制备
称取5mg(±0.02mg)聚乙烯亚胺(PEI)及50mg(±0.1mg)聚乳酸羟基乙酸(PLGA)，溶解于10ml正丙醇溶剂中，常温搅拌12h得到有机相。称取80mg(±0.5mg)乳化剂(聚乙烯醇，PVA)溶解于40ml(±0.02ml)去离子水中，得到水相。室温搅拌下将有机相以0.5ml/min的速度缓慢滴加入水相中，继续室温搅拌12h后，在12000rpm速度下离心1h，弃去上清液保留沉淀物，得到PEI-PLGA纳米颗粒。冷冻干燥沉淀物，保存于-80℃。
b.负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的制备
称取1mg的含有目标基因编码的质粒(pDNA)，溶解于5.5ml的水溶液中，称取5.5mg(±0.01mg)上述步骤制备的PEI-PLGA纳米颗粒加入pDNA水溶液，振荡10s，室温孵育30min，得到负载pDNA的PEI-PLGA纳米颗粒的水溶液。称取16mg的KALA多肽，加入上述水溶液中，振荡10s，室温孵育1h，得到负载pDNA的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散液，8000rpm高速离心后冷冻干燥得到目标产物。
实施例5：PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的形貌表征检测
实施例1制备得到的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散于去离子水中配置成1ml的0.01％重量体积比的纳米颗粒分散液，滴加到附有碳膜的铜网上，室温下自然干燥后，用透射电镜(FEI Talos F200X TEM)在200kV下观察样品形貌，结果如图3所示。获取的图片数据用ImageJ软件分析其尺寸，计算得到粒径在200nm左右。从表征结果可看出，制备得到的纳米颗粒呈均匀的球形，粒径平均，具有良好的分散性，并具有明显的核壳结构，能看到KALA多肽有序的排布在纳米颗粒的外层。
实施例6：琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
通过琼脂糖凝胶电泳阻滞实验检测PEI-PLGA-KALA纳米颗粒结合DNA能力。首先配置pH＝8，浓度为1％tris-Borate-EDTA(TBE)溶液，以此溶液制备1％重量体积比的琼脂糖溶液，加入2μl浓度为1mg/ml的溴化乙锭(EB)染料，倒入胶槽后降至室温得到琼脂糖凝胶。取实施例1制备的产物，将负载目标基因的PEI-PLGA纳米颗粒(PEI与目标基因重量比为1:8,1:4,1:2,1:1，标记为K0组)以及PEI-PLGA-KALA纳米颗粒(KALA多肽与目标基因重量比为1:1,1:2,1:4；PEI与目标基因重量比为1:8,1:4,1:2,1:1，标记为PP@KALA组)与上样缓冲液混匀后加入琼脂糖凝胶的胶孔中，在电压为120mV下进行45min实验，结束后用凝胶成像分析仪观察基因在凝胶中的迁移状况。在不同的PEI:目标基因和KALA:目标基因比值下，目标基因与载体的结合能力不同，结果如图4所示，其中PP组不含有KALA多肽，PP@KALA组中K1，K2，K4分别表示KALA多肽与目标基因的质量比为1：1；2:1；和4:1，图中K4组(KALA:目标基因＝4:1)的纳米颗粒没有明显条带出孔，表明目标基因与载体紧密结合，没有出现游离的情况。本实施例证明KALA与目标基因的最优比例为4:1。
实施例7：动态光散射表征纳米颗粒的粒径及zeta电位
利用动态光散射仪(Zetasizer,Nano-ZS，Malvern)，在温度为25℃，背景散射角173°的条件下表征实施例2制备的PEI-PLGA纳米颗粒，负载目标基因的PEI-PLGA纳米颗粒，以及负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒(KALA:目标基因＝16:1及20:1)的粒径以及zeta电位。结果如图5所示，纳米颗粒的直径在200nm之间，在负载目标基因后有所增大，但在外层结合KALA多肽后，由于超分子DNA与阳离子化合物间的缩合作用，纳米粒子具有更紧凑的结构，因此粒径在复合KALA后反而略为下降。Zeta电位的变化说明纳米颗粒在负载目标基因后由于DNA分子的特性使整体带负电。在外层结合KALA多肽后因为KALA多肽带正电，因此纳米颗粒整体带正电。
实施例8：PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的被细胞内吞能力测试
用HEK293T细胞(人胚胎肾细胞)为基因转染对象，测试实施例2制备得到的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒，负载MFP488荧光探针标记的目标基因对目标细胞进行转染。具体操作步骤为：在30mm直径的细胞培养皿中加入30万个HEK293T细胞，以含10％胎牛血清(FBS)及1％双抗的DMEM培养基在37℃和5％二氧化碳条件下过夜培养。加入负载探针标记目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒转染20h。舍弃培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞后用4％多聚甲醛固定30min，分别用Hoechst33528及AlexaFluor568两种荧光探针对细胞核及细胞膜进行染色。染色后的细胞用聚光共聚焦显微镜(Leica SP8)进行观察。结果如图6所示，其中绿色荧光的质粒经过20h共培养后成功在细胞内被观察到，说明该纳米颗粒能有效被细胞吞噬。
实施例9：PEI-PLGA-KALA纳米颗粒细胞毒性测试
使用CCK8法测定所述纳米颗粒的细胞毒性，测试了实施例1、实施例2、实施例3、PEI及空白对照组(无纳米颗粒和载体)的细胞毒性。具体操作步骤为：在96孔板中培养MS-1细胞，密度为每孔1.5万个，每孔加入0.5μg的纳米颗粒或PEI，以含10％胎牛血清(FBS)及1％双抗的DMEM培养基在37℃和5％二氧化碳条件共培养12h，然后替换新培养基培养48h。培养结束后每孔加入10μl的CCK-8溶液，37℃下孵育2h，用酶标仪测定溶液在450nm处的吸光度，测定平行数据三组，并以测定数据作图。结果如图7所示，其中实施例1-3中制备的纳米颗粒的细胞活性均高于PEI，证明了经改性后的基因载体纳米颗粒的细胞毒性有显著的下降，更有利于此纳米颗粒载体在基因治疗中的应用。
实施例10：PEI-PLGA-KALA纳米颗粒的转染效率测定
采用对HEK293T细胞转染绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA研究实施例3和实施例4中所制备的纳米颗粒载体的转染效率，并与PEI进行对比。具体操作步骤为：在96孔板中培养MS-1细胞，密度为每孔5万个，每孔加入0.5μg的负载GFP质粒DNA的纳米颗粒或PEI，以含10％胎牛血清(FBS)及1％双抗的DMEM培养基在37℃和5％二氧化碳条件共培养12h，12h后更换新培养基，继续培养至72h。培养结束后，每孔加入100μl的Bright-Glo溶液，轻微振荡2min，并用酶标仪测定转染后细胞表达荧光素蛋白的吸光度，测定平行数据三组，并以测定数据作图，测试结果如图8所示。另外分别在转染48h和72h后，观察细胞中的GFP蛋白的荧光，用荧光显微镜拍照，结果如图9所示。结果显示，实施例3和实施例4中所制备的纳米颗粒载体的转染效率略高于PEI转染效率；且整体转染效率随时间的延长而提高。
实施例11 KALA多肽核心序列效果验证
取多肽WEAKLAKALAKALA(SEQ ID No.2)，通过实施例4同样的操作步骤(采用同样的试剂)制备PEI-PLGA-KALA纳米颗粒，然后进行实施例6的实验，结果表明结合效果基本跟实施例4的结合效果相同，且KALA与目标基因的最优比例依然为4:1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南方科技大学
<120> 多肽纳米颗粒及其制备方法和应用
<130> 21A0997CN
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His
1 5 10 15
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala
20 25
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala
1 5 10

Claims (10)

1.一种多肽纳米颗粒，包括聚乙烯亚胺，聚乳酸羟基乙酸和KALA多肽，其中所述KALA多肽为SEQ ID No.1或者与SEQ ID No.1有至少90％同源性的多肽；或者所述KALA多肽包括SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2有至少95％同源性的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙烯亚胺为相对分子质量在500Da～30kDa范围内的线性或枝状聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求1或2所述的多肽纳米颗粒，其特征在于，所述聚乳酸羟基乙酸的相对分子质量为10000～200000。
4.一种制备多肽纳米颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将聚乙烯亚胺和聚乳酸羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌得到有机相；
S2将乳化剂溶解于水中，搅拌得到水相；
S3将所述有机相滴入所述水相中，搅拌，离心后得到PEI-PLGA纳米颗粒；
S4取目标质粒，与所述PEI-PLGA纳米颗粒在水溶液中混合，得到负载目标基因的PEI-PLGA纳米颗粒的悬浮液；
S5取KALA多肽加入所述悬浮液中，混合得到负载目标基因的PEI-PLGA-KALA纳米颗粒分散液，离心后得到PEI-PLGA-KALA纳米颗粒，其中所述KALA多肽为SEQ ID No.1或者与SEQID No.1有至少90％同源性的多肽；或者所述KALA多肽包括SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2有至少95％同源性的多肽。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中聚乙烯亚胺:聚乳酸羟基乙酸的重量比为1:5～1:25。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正丙醇、三乙胺和吡啶中的一种或多种，所述步骤S2中的乳化剂为正丁醇、聚乙烯醇、吐温80、乙二醇和甘油中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中PEI-PLGA纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒浓度为0.2～5mg/ml。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多肽纳米颗粒呈核壳结构，粒径为100nm～285nm。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺:目标质粒的重量比为1:8～2:1，所述KALA多肽:目标质粒的重量比为4:1～25:1，所述目标基因包括报告基因，细胞因子基因和抗癌基因中的一种或多种。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽纳米颗粒在制备基因治疗载体或者核酸转染中的应用。
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