CN113564256A - 胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胃癌特异性LncRNA‑GACAT3的检测装置，包括：数据库，用于存储GACAT3核酸序列码，所述数据库为Genebank数据库；PCR扩增平台，用于对GACAT3核酸序列码进行PCR扩增，从而得到扩增目的片段；重组质粒构建体系，用于将扩增目的片段进行载体连接后得到目标重组质粒，同时设置阴性对照质粒；筛查体系，用于对上述目标重组质粒和阴性对照质粒进行筛选，并对经酶切及测序鉴定合格后的重组质粒进行浓度计算，以检测LncRNA‑GACAT3的含量。本发明将LncRNA‑GACAT3重组质粒标准品定量成1×102～1×108copies/ul一共七个浓度梯度，采用荧光定量PCR扩增平台进行扩增，结果显示，对LncRNA‑GACAT3的含量最低检测限为81.322copies/ul。临床胃癌血清样本检测结果显示，对10例胃癌患者血清LncRNA‑GACAT3检测结果在1.56×102～3.98×104copies/ul之间。

Description

胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置
技术领域
本发明涉及生物装置技术领域，特别涉及胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置。
背景技术
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，胃癌的发病率及死亡率都很高，居我国肿瘤发病率的第二和第三。尤其早期诊断、治疗的手段有限，加之现有的胃癌肿瘤标志物的灵敏度和特异性均比较低，如常用的癌胚抗原(CEA)的灵敏度和特异度仅为68.6％和59.3％。因此，寻找理想的肿瘤标志物在胃癌的临床早期筛查中将具有重要的社会意义。
长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA分子，广泛存在于各种微生物中。lncRNA在细胞内可参与信号传导、转录激活、转录后修饰及蛋白质翻译调控等多种调控环节，在肿瘤细胞的病理生理过程中发挥着关键调控作用。长链非编码RNA-GACAT3全称为长链非编码RNA-胃癌相关转录本3(Gastric cancerassociated transcripts3,GACAT3)。前期通过基因芯片的方法检测出来长链非编码RNA-GACAT3在胃癌组织中具有高表达，可参见Ensemble数据库(ID为ENSG00000236289)：
https://asia.ensembl.org/index.html
目前，有关于lncRNA-GACAT3在肝癌组织中的表达检测方法的报道，而对于其在胃癌组织中的表达存在检测效率低、特异性低、自动化程度低等问题。
所以，对胃癌组织中lncRNA-GACAT3的表达进行高效率、高特异性和高自动化的优化，对于胃癌的辅助诊断和预后监测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于对胃癌组织中lncRNA-GACAT3的表达进行高效率、高特异性和高自动化的优化，提供一种胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置。
为了实现上述发明目的，本发明实施例提供了以下技术方案：
胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，包括：
数据库，用于存储LncRNA-GACAT3核酸序列码，所述数据库为Genebank数据库；
PCR扩增平台，用于对LncRNA-GACAT3核酸序列码进行PCR扩增，从而得到目的扩增片段；
重组质粒构建体系，用于将目的扩增片段进行载体连接后得到重组质粒，并且设置阴性对照质粒；
鉴定体系，用于对所述重组质粒和阴性对照质粒进行筛选，并对经酶切鉴定及测序鉴定合格后的重组质粒进行浓度标准计算，以检测LncRNA-GACAT3的含量。
为了解决现有的GACAT3基因检测方法存在的检测效率低，检测时间长，准确性差等问题，本方案提供了用于检测人胃癌GACAT3基因的引物、探针及其检测装置。本方案检测灵敏度高，在体外实验中81个拷贝便能稳定地检出；对不含目的基因GACAT3样本进行检测，均无特异性条带，说明具有良好的特异性；本方案有效地解决了样品中GACAT3基因含量低、扩增效率不高的问题。
更进一步地，所述PCR扩增平台还有设计的引物、探针；所设计的引物为：
上游引物：5’-CCGGAATTCAAGGAGGCCCAATGATG-3’；
下游引物：5’-CGCGGATCCTCTTTGTGCTTAATTTGCA-3’；
所设计的探针为：
探针：5’-6FAM-TGCTTRACTTTTCAGTTGTC-MGB-3’。
本检测装置所设计的Taqman-MGB探针，相对于传统的Taqman探针来说，使用的探针长度更短，只需要13-25bp即可，同时GC含量，Tm值也更容易控制，因此探针设计的成功率会更高。
更进一步地，所述PCR扩增平台中，将LncRNA-GACAT3核酸序列码作为扩增模板，将扩增模板、引物、探针以及PCRMasterMix进行混合，以进行定量PCR扩增后得到PCR扩增产物。
更进一步地，所述PCR扩增平台还连接有电泳仪和电泳槽，将所述PCR扩增产物放置在电泳槽中，在一个100V恒定的电压下，PCR扩增产物由负极向正极进行泳动，根据自身分子量大小不同从而分离得到目的扩增片段。
更进一步地，所述重组质粒构建体系包括载体连接体系，所述载体连接体系中有pUC57载体；载体连接体系将目的扩增片段经过EcoRI、BamHI双酶切后，与所述pUC57载体进行连接，从而获得重组质粒。
更进一步地，所述载体连接体系将目的扩增片段与pUC57载体进行连接时，载入2ul的目的扩增片段、5ul的2×Buffer溶液、1ul的pUC57载体、1ul的T4DNA连接酶、1ul的无菌水进行混匀，混匀后室温放置一小时，4度连接过夜，从而获得重组质粒。
更进一步地，所述重组质粒构建体系还包括转化体系，所述转化体系用于将1ul重组质粒放入100ul的DH5α感受态细胞中混匀，再加入800ul的LB培养液经过振荡、离心后，均匀涂布在Amp+筛选平板上，设置未转化菌作为阴性对照质粒。
更进一步地，所述鉴定体系包括酶切鉴定体系、测序鉴定体系，所述酶切鉴定体系用于接入重组质粒和阴性对照质粒，并将重组质粒和阴性对照质粒酶切后进行电泳，根据分子量大小进行鉴定；所述测序鉴定体系将电泳后目标条带进行核酸测序，根据核酸序列进行鉴定。对鉴定合格的重组质粒进行后续操作。
更进一步地，所述鉴定体系还包括质量及浓度计算体系，所述质量及浓度计算体系对鉴定后的重组质粒测吸光度值计算出重组质粒的浓度，并且计算出重组质粒的原始拷贝数：
原始拷贝数＝(重组质粒浓度×重组质粒体积/重组质粒相对分子质量)×6.02×1023。
更进一步地，所述PCR扩增平台用于通过荧光定量对重组质粒进行扩增，以实现对LncRNA-GACAT3的定量检测；
当重组质粒中LncRNA-GACAT3的含量在1×102～1×108copies/ul范围内时，对LncRNA-GACAT3的含量最低检测限为81.322copies/ul。
所述荧光定量PCR扩增平台设计的引物、探针：
上游引物：5’-CCGGAATTCAAGGAGGCCCAATGATG-3’；
下游引物：5’-CGCGGATCCTCTTTGTGCTTAATTTGCA-3’；
探针：5’-6FAM-TGCTTRACTTTTCAGTTGTC-MGB-3’；
所述PCR扩增平台的扩增体系为：10ul的PCR Master Mix、0.4ul的上游引物、0.4ul的下游引物、0.8ul的探针、2ul的扩增模板、6.4ul的蒸馏水后，进行PCR扩增反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)为了解决现有的GACAT3基因检测方法存在的检测效率低，检测时间长，准确性差等问题，本发明提供了用于检测人胃癌GACAT3基因的引物、探针及其检测装置；本方案检测灵敏度高，在体外实验中81个拷贝便能稳定地检出；对不含目的基因GACAT3样本进行检测，均无特异性条带，说明具有良好的特异性；有效地解决了样品中GACAT3基因含量低、扩增效率不高的问题。
(2)本发明通过自定义的检测装置模拟胃癌组织中lncRNA-GACAT3的表达，得到结果：
特异性：通过实施例可以看出，设计的引物和探针对不含目的基因GACAT3核酸序列码进行反转录和PCR扩增处理，均无特异性条带，说明该引物和探针具有良好的特异性；
灵敏度：采用该引物、探针和荧光定量PCR检测方式可检测到极低丰度lncRNA-GACAT3的表达，说明其灵敏度高。
本发明将LncRNA-GACAT3重组质粒标准品定量成1×102～1×108copies/ul一共七个浓度梯度，采用荧光定量PCR扩增平台进行扩增，结果显示，对LncRNA-GACAT3的含量最低检测限为81.322copies/ul。临床胃癌血清样本检测结果显示，对10例胃癌患者血清LncRNA-GACAT3检测结果在1.56×102～3.98×104copies/ul之间，表明灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例检测装置结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项。因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
实施例1：
本发明通过下述技术方案实现，如图1所示，胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，包括数据库、PCR扩增平台、重组质粒构建体系、鉴定体系，其中：
所述数据库为Genebank数据库，里面存储了目的RNA的GACAT3核酸序列码。
所述PCR扩增平台用于对LncRNA-GACAT3核酸序列码进行PCR扩增，从而得到目的扩增片段。
更详细的，所述PCR扩增平台在对LncRNA-GACAT3核酸序列码进行PCR扩增之前，加入预先设计引物、探针，所设计的引物为：
上游引物：5’-CCGGAATTCAAGGAGGCCCAATGATG-3’；
下游引物：5’-CGCGGATCCTCTTTGTGCTTAATTTGCA-3’；
所设计的探针为：
探针：5’-6FAM-TGCTTRACTTTTCAGTTGTC-MGB-3’。
然后PCR扩增平台将LncRNA-GACAT3核酸序列码作为扩增模板，将扩增模板、引物、探针以及PCRMasterMix进行混合，以进行定量PCR扩增，从而得到PCR扩增产物。
PCR扩增平台连接有电泳仪和电泳槽，将所述PCR扩增产物放置在电泳槽中，在一个100V恒定的电压下，PCR扩增产物由负极向正极进行泳动，根据PCR扩增产物自身分子量大小不同从而分离得到目的扩增片段。
所述重组质粒构建体系用于将目的扩增片段进行载体连接后得到重组质粒，并且设置阴性对照质粒。详细来说，所述重组质粒构建体系包括载体连接体系、转化体系：
所述载体连接体系中存储有pUC57载体；载体连接体系将目的扩增片段经过EcoRI、BamHI双酶切后，与所述pUC57载体进行连接，从而获得重组质粒。载体连接体系将目的扩增片段与pUC57载体进行连接时，载入2ul的目的扩增片段、5ul的2×Buffer溶液、1ul的pUC57载体、1ul的T4 DNA连接酶、1ul的无菌水进行混匀，混匀后放置1小时，4度连接过夜，从而获得重组质粒。
所述转化体系用于将1ul重组质粒放入100ul的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30min，42℃休克90s，随即冰浴2min后，再加入800ul的LB培养液经过220r/min振荡1h，1200r/min离心5min后，弃上清后剩余约100ul菌液，将剩余菌液均匀涂布在Amp+筛选平板上，设置未转化菌作为阴性对照质粒。
所述鉴定体系包括酶切鉴定体系、测序鉴定体系，所述酶切鉴定体系用于接入重组质粒和阴性对照质粒，并将重组质粒和阴性对照质粒酶切后进行电泳，根据分子量大小进行鉴定。所述测序鉴定体系将电泳后目标条带进行核酸测序，根据核酸序列进行鉴定。
详细来说，所述鉴定体系还包括质量及浓度计算体系，所述质量及浓度计算体系对鉴定后的重组质粒测吸光度值计算出重组质粒的浓度，并且计算出重组质粒的原始拷贝数：
原始拷贝数＝(重组质粒浓度×重组质粒体积/重组质粒相对分子质量)×6.02×1023。
所述PCR扩增平台还用于接入鉴定好的重组质粒后，将重组质粒的稀释为1×102～1×108copies/ul一共七个浓度梯度；通过荧光定量对稀释后的质粒进行扩增，扩增体系为：10ul的PCR Master Mix、0.4ul的上游引物、0.4ul的下游引物、0.8ul的探针、2ul的扩增模板、6.4ul的蒸馏水后，95℃预变性5min，90℃变性30s，60℃退火1min，40个循环。
所述荧光定量PCR扩增平台设计的引物、探针：
上游引物：5’-CCGGAATTCAAGGAGGCCCAATGATG-3’；
下游引物：5’-CGCGGATCCTCTTTGTGCTTAATTTGCA-3’；
探针：5’-6FAM-TGCTTRACTTTTCAGTTGTC-MGB-3’。
本发明使用PCR扩增平台用于通过荧光定量对重组质粒进行扩增，以实现对LncRNA-GACAT3的定量检测；当重组质粒中LncRNA-GACAT3的含量在1×102～1×108copies/ul范围内时，对LncRNA-GACAT3的含量最低检测限为81.322copies/ul。临床胃癌血清样本检测结果对10例胃癌患者血清GACAT3检测结果在1.56×102～3.98×104copies/ul之间。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：包括：
数据库，用于存储LncRNA-GACAT3核酸序列码，所述数据库为Genebank数据库；
PCR扩增平台，用于对LncRNA-GACAT3核酸序列码进行PCR扩增，从而得到目的扩增片段；
重组质粒构建体系，用于将目的扩增片段进行酶切及载体连接后得到重组质粒及阴性对照质粒；
鉴定体系，用于对所述重组质粒和阴性对照质粒进行筛选，并对经酶切鉴定及测序鉴定合格后的重组质粒进行浓度计算，以检测LncRNA-GACAT3的含量。
2.根据权利要求1所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述PCR扩增体系还包括：设计的引物、探针；所设计的引物为：
上游引物：5’-CCGGAATTCAAGGAGGCCCAATGATG-3’；
下游引物：5’-CGCGGATCCTCTTTGTGCTTAATTTGCA-3’；
所设计的探针为：
探针：5’-6FAM-TGCTTRACTTTTCAGTTGTC-MGB-3’。
3.根据权利要求2所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述PCR扩增平台中，将LncRNA-GACAT3核酸序列码做为扩增模板，将扩增模板、引物、探针及PCRMaster Mix进行混合，进行定量PCR扩增，得到PCR扩增产物。
4.根据权利要求3所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述PCR扩增平台还连接有电泳仪和电泳槽，将所述PCR扩增产物放置在电泳槽中，在一个100V恒定的电压下，PCR扩增产物由负极向正极进行泳动，根据PCR扩增产物自身分子量大小不同从而分离得到目的扩增片段。
5.根据权利要求4所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述重组质粒构建体系包括载体连接体系，所述载体连接体系中有pUC57载体；载体连接体系将目的扩增片段经过EcoRI、BamHI双酶切后，与所述pUC57载体进行连接，获得重组质粒。
6.根据权利要求5所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述载体连接体系将目的扩增片段与pUC57载体进行连接时，载入2ul目的扩增片段、5ul的2×Buffer溶液、1ul的pUC57载体、1ul的T4 DNA连接酶、1ul的无菌水进行混匀，混匀后室温放置一小时，4度连接过夜。
7.根据权利要求5所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述重组质粒构建体系还包括转化体系，所述转化体系将1ul重组质粒放入100ul的DH5α感受态细胞中混匀，再加入800ul的LB培养液经过振荡、离心后，均匀涂布在Amp+筛选平板上，设置未转化菌作为阴性对照质粒。
8.根据权利要求7所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述鉴定体系包括酶切鉴定体系、测序鉴定体系，所述酶切鉴定体系用于接入重组质粒和阴性对照质粒，并将重组质粒和阴性对照质粒酶切后进行电泳，根据分子量大小进行鉴定；所述测序鉴定体系将电泳后目标条带进行核酸测序，根据核酸序列进行鉴定。
9.根据权利要求8所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述鉴定体系还包括质量及浓度计算体系，所述质量及浓度计算体系对鉴定后的重组质粒测吸光度值计算出浓度，并且计算出重组质粒的原始拷贝数：
原始拷贝数＝(重组质粒浓度×重组质粒体积/重组质粒相对分子质量)×6.02×1023。
10.根据权利要求8所述的胃癌特异性LncRNA-GACAT3的检测装置，其特征在于：所述PCR扩增平台用于通过荧光定量对重组质粒进行扩增，以实现对LncRNA-GACAT3的定量检测；
所述PCR扩增平台的引物、探针：
上游引物：5’-CCGGAATTCAAGGAGGCCCAATGATG-3’；
下游引物：5’-CGCGGATCCTCTTTGTGCTTAATTTGCA-3’；
探针：5’-6FAM-TGCTTRACTTTTCAGTTGTC-MGB-3’；
所述PCR扩增平台的扩增体系为：10ul的PCR Master Mix、0.4ul的上游引物、0.4ul的下游引物、0.8ul的探针、2ul的扩增模板、6.4ul的蒸馏水后，进行PCR扩增反应。
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