CN113559270A - 抗菌组合物、应用及包含其的产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗菌组合物、应用及包含其的产品，涉及生物医药技术领域，本发明提供的抗菌组合物，创造性的将蛇床叶提取物和抗生素联合使用作为抗菌组合物的活性成分，上述两种组分协同抗菌，使得该抗菌组合物对多种致病菌均有抑制作用，且具有比单独应用蛇床叶提取物或抗生素更优异的抑菌性能，同时也能够有效降低抗生素的使用量，避免细菌耐药性的问题。

Description

抗菌组合物、应用及包含其的产品
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种抗菌组合物、应用及包含其的产品。
背景技术
细菌感染是当机体免疫系统防御功能降低时，外界侵入的细菌迅速繁殖引起的一类疾病，对人体健康存在较大威胁。目前，传染病成为世界上最主要的致死原因之一，全世界每年有超过1700万人死于细菌感染。世界卫生组织有报道，2050年因感染“超级细菌”死亡的人数可能超过1000万，因此抗菌药物和杀菌方法的研发和寻找刻不容缓。
自1929年Fleming发现对葡萄球菌有抑制作用的青霉菌，到1940年Florcy和Chain研制青霉素成功并应用于临床，抗生素逐渐在临床领域盛行。近百年间抗生素的出现造福了千万人，被誉为现代医学最伟大的进步之一。早在20世纪初期就发现强抗菌活性磺胺类药物百浪多息，在临床取得成果后，磺胺嘧啶（SD）、磺胺异噁唑（SIZ）和磺胺假噁唑（SMZ）等抗菌药以及抗菌增效剂陆续研制成功。二十世纪中叶，青霉素母核6-APA和头孢菌素母核7-ACA，为半合成β-内酰胺类抗生素打下基础。二十世纪六十年代，萘啶酸作为第一代喹诺酮类药物应用于肠道和尿道感染，其他类抗生素如四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和合成抗菌药呋喃类、咪唑类等经典药物研制也在不断进展。在过去对抗传染性疾病的2000年间，化学药物迅速发展的同时，中药也逐渐形成了一种诊断和治疗体系。自从屠呦呦教授从中医古籍《肘后备急方》创建有效方法提抗疟新药青蒿素并获诺贝尔奖后，中药以新面貌重新被世界认知。在新冠肺炎流行期间，中国国家卫生健康委员会指南为防治新冠推荐了15种口服和注射类中药，这些化合物具有广谱抗病毒和抗菌性能，在治疗病毒性肺炎等突发性传染病方面具有一定优势，许多中药还具有强大的抗炎和免疫调节作用。因此，中药在传染性疾病中占据越来越重要的地位。
抗生素的长期过量使用在一定程度上加速了细菌耐药性发展，无疑成为抗生素治疗细菌感染的最大阻碍。细菌主要通过突变和摄取外源DNA而获得对抗生素的耐药能力。自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MR-SA）被发现后，细菌耐药性不断出现向抗生素反抗，从革兰氏阴性菌（G-）到革兰氏阳性菌（G+），耐药菌不断进化的同时，为新型抗生素开发增加难度，也为抗菌药物的发展带来了极大危机。多重耐药菌（Multidrug-resistant bacteria，MDR）和广泛耐药（Extensively drug resisitent bacteria, XDR）甚至泛耐药菌（Pandrug-resistant bacteria, PDR）已在世界范围内广泛存在，通过崔煦然等总结，细菌的耐药机制主要有灭活酶或钝化酶的产生、抗菌药物作用靶位改变、主动外排作用、细菌生物被膜结构、外膜通透性降低、整合子等。大多数细菌的耐药机制目前清晰，也有可观察的指标，但是临床发现，即使采用了有效抗生素治疗仍会有反复感染和复发的现象，因此细菌耐受性定义出现，即细菌在不改变MIC的情况下，也可以在药物有效杀菌浓度下存活但保持数量不变，此时细菌将降低生长和代谢速度作为应对生长环境的生存策略。
细菌性耐药性问题随着抗生素的过量使用愈发严重，针对此现状目前主要由中草药替代用于感染疾病的治疗，但中草药的抑菌效果远不及抗生素，而中草药和抗生素联用不仅可以降低抗生素的耐药性，也能很好的提高抗生素的药效，具有较好的研究前景。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抗菌组合物，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供上述抗菌组合物的应用。
本发明的目的之三在于提供包含上述抗菌组合物的产品。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种抗菌组合物，所述抗菌组合物包括：蛇床叶提取物和抗生素。
进一步地，所述蛇床叶提取物通过如下方法制备得到：
将蛇床叶部破碎后溶于水中，提取得到所述蛇床叶提取物。
进一步地，所述提取包括回流提取。
进一步地，每25 g蛇床叶所述回流提取的时间为3~5小时。
进一步地，提取后还包括萃取的步骤。
进一步地，使用有机溶剂进行萃取，优选使用正己烷进行萃取。
进一步地，所述抗生素包括链霉素和庆大霉素。
进一步地，所述蛇床叶提取物和抗生素的质量比为0~250:0~20，其中不包括0。
进一步地，所述蛇床叶提取物和链霉素的质量比为350~400:50~80；所述蛇床叶提取物和庆大霉素的质量比为350~400:1~10。
本发明还提供了上述的抗菌组合物在抑制病原菌中的应用。
进一步地，所述病原菌包括枯草芽孢杆菌。
此外，本发明还提供了一种抗菌产品，包括上述的抗菌组合物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的抗菌组合物，创造性的将蛇床叶提取物和抗生素联合使用作为抗菌组合物的活性成分，上述两种组分协同抗菌，使得该抗菌组合物对多种致病菌均有抑制作用，且具有比单独应用蛇床叶提取物或抗生素更优异的抑菌性能，同时也能够有效降低抗生素的使用量，避免细菌耐药性的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例提供的枯草芽孢杆菌纯化培养结果，其中a为Bacillus subtilis平板生长状况，b为单菌落，c为油镜照片（100×/1.25 oil）；
图2为本发明实验例提供的铜绿假单胞菌纯化培养结果，其中a为Pseudomonas aeruginosa平板生长状况，b为单菌落，c为油镜照片（100×/1.25 oil）；
图3为本发明实验例提供的Bacillus subtilis生长曲线；
图4为本发明实验例提供的Pseudomonas aeruginosa生长曲线；
图5为本发明实验例提供的Pseudomonas aeruginosa药敏结果图；
图6为本发明实验例提供的Bacillus subtilis药敏结果图；
图7为本发明实验例提供的链霉素对Bacillus subtilis抑制结果；
图8为本发明实验例提供的卡那霉素对Bacillus subtilis抑制结果；
图9为本发明实验例提供的庆大霉素对Bacillus subtilis抑制结果；
图10为本发明实验例提供的氨苄西林对Bacillus subtilis抑制结果；
图11为本发明实验例提供的蛇床叶提取物对Bacillus subtilis抑制结果；
图12为本发明实验例提供的蛇床叶提取物对Pseudomonas aeruginosa抑制结果；
图13为本发明实验例提供的链霉素对Pseudomonas aeruginosa抑制结果；
图14为本发明实验例提供的多粘菌素对Pseudomonas aeruginosa抑制结果；
图15为本发明实验例提供的庆大霉素对Pseudomonas aeruginosa抑制结果；
图16为本发明实验例提供的四环素对Pseudomonas aeruginosa抑制结果；
图17为本发明实验例提供的链霉素与蛇床叶提取物联合作用的结果图；
图18为本发明实验例提供的卡那霉素与蛇床叶提取物联合作用的结果图；
图19为本发明实验例提供的氨苄西林与蛇床叶提取物联合作用的结果图；
图20为本发明实验例提供的庆大霉素与蛇床叶提取物联合作用的结果图；
图21为本发明实验例提供的蛇床叶提取物对几株G-作用的结果图；
图22为本发明实验例提供的蛇床叶提取物对几株G+作用的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
随着不同类型抗菌药物的发展和耐药细菌的蔓延，寻找新型抗菌药物、降低病原菌耐药性、联合用药等已然成为临床感染性疾病治疗的主要问题。
相比于化学药来说，中药组分较复杂，各成分之间会相互关联，通常表现为整体量效作用，并不简单发挥单一作用，即通常会多靶点作用，故不容易产生耐药性。
基于此，本发明提供了一种抗菌组合物，包括：蛇床叶提取物和抗生素。
将蛇床叶提取物和抗生素联合使用作为抗菌组合物的活性成分，上述两种组分协同抗菌，使得该抗菌组合物对多种致病菌均有抑制作用，且具有比单独应用蛇床叶提取物或抗生素更优异的抑菌性能，同时也能够有效降低抗生素的使用量，避免细菌耐药性的问题。
可以理解的是，本发明提供的抗菌组合物可以为单一的复方制剂，或者为蛇床叶提取物和抗生素两种单独的制剂的组合，或者可以将两种单独的制剂同时施用，也可以将上述两种单独的制剂依次使用，本发明对此不做限定。
在一些优选的实施方式中，所述蛇床叶提取物通过如下方法制备得到：
将蛇床叶部破碎后溶于水中，提取得到所述蛇床叶提取物。
其中，典型的破碎方式可以为用剪刀将蛇床叶剪碎后，再进行研磨。原则上破碎的越彻底，后续提取率越高。
再具体的实施方式中，可以将25.0 g蛇床叶部剪碎研磨溶于纯水中，在挥发油提取器中回流提取4 h，正己烷萃取，得到蛇床叶提取物。
作为抗菌效果更好的优选方案，本发明中的抗生素包括链霉素和庆大霉素，本发明中的病原菌包括枯草芽孢杆菌。
在一些优选的实施方式中，所述蛇床叶提取物和抗生素的质量比为0~250:0~20，例如可以为，但不限于蛇床提取物浓度范围0~250 mg/mL，链霉素0~20 mg/L，庆大霉素0~0.4 mg/L，其中均不包括0。
本发明通过大量实验对上述浓度范围的进一步筛选，得出优选组合方案为：蛇床提取物3.91 mg/ml+链霉素0.625 mg/L，以及蛇床提取物3.91 mg/mL+庆大霉素0.0125 mg/L。
此外，本发明还提供了一种抗菌产品，包括了上述的抗菌组合物。该抗菌产品的活性成分为本发明提供的抗菌组合物，因此其至少具有与本发明提供的抗菌组合物相同的有益效果。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
本实施例提供了一种抗菌组合物，包括质量比为312.8:1的蛇床叶提取物和庆大霉素；
所述蛇床叶提取物通过如下方法制备得到：将25.0 g蛇床叶部剪碎研磨溶于纯水中，在挥发油提取器中回流提取4 h，正己烷萃取，得到蛇床叶提取物。
实施例2
本实施例提供了一种抗菌组合物，与实施例1的区别在于抗生素为链霉素，所述蛇床叶提取物和链霉素的质量比为6.256:1。
实验例
本发明实验例中所用到的试验材料及用品来源如下：
（一）样品来源
试验菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）均由山东大学海洋学院微生物综合实验室提供。
植物蛇床：2020年9月，采于山东滨州，植物学鉴定为蛇床（Cnidium monnieri）。
（二）试验药品及试剂
硫酸链霉素（Streptomycin Sulfate）USP、硫酸庆大霉素（Gentamicin sulfatesalt）USP、多粘菌素B（Polymyxin B）USP、硫酸卡那霉素（Kanamycin Sulfate）USP、氨苄西林（Ampicillin sodium salt）USP、氯霉素（Chloramphenicol）High Purity、盐酸四环素（Tetracycline hydrochloride）High Purity，均购自合肥博美生物科技有限责任公司；
PBS缓冲液，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；
二甲基亚砜，国药集团化学试剂有限公司；
吐温80，天津市光复精细化工研究所；
结晶紫草酸铵染色液，永安化验室出品；
番红染液，永安化验室出品。
（三）培养基
Luria-Bertani(LB)固体培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、氯化钠10.0g、琼脂粉15~20 g、1000 ml去离子水，5 mol/L NaOH调节pH至7.0，高压灭菌锅灭菌（121℃，20min）。
Mueller-Hinton(MH)固体培养基：MH培养基粉末21.0 g、琼脂粉15~20 g，加热搅拌至完全溶解于1000 ml去离子水，高压灭菌锅进行灭菌（121℃，20min）。
Mueller-Hinton(MH)液体培养基：MH培养基粉末21.0 g、琼脂粉15~20 g，加热搅拌至完全溶解于1000 ml去离子水，高压灭菌锅进行灭菌（121℃，20min）。
（四）主要仪器
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（一）菌株活化
将待测菌株Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa自-80 ℃冰箱中取出，于37 ℃恒温培养箱自然融化，无菌棉签蘸取涂抹到LB固体培养基，于37 ℃恒温培养24 h，挑取生长状况较好的单菌落接种于LB固体培养基划线培养，纯化三次，得到单菌落。
结果：在LB固体培养基上枯草芽孢杆菌菌落较大，形状近圆形，边缘不规则有锯齿状突出，无光泽，乳白色不透明，菌苔表面干燥褶皱粗糙，在不同空气湿度下颜色稍有差异；革兰氏染色呈紫色，杆状菌形，有明显椭圆状到柱状芽孢，数量较多，为典型革兰氏阳性菌（如图1）。铜绿假单胞菌菌落表面光滑，形状近圆形，边缘圆滑，生长初期白色半透明，后期绿色半透明；革兰氏染色呈红色，短杆状，无芽孢，为典型革兰氏阴性菌（如图2）。
（二）蛇床提取物制备
将25.0 g蛇床叶部剪碎研磨溶于纯水中，在挥发油提取器中回流提取4 h，正己烷萃取，得到提取物2.0 g，盛放于青霉素瓶。
（三）生长曲线测定
1. 种子液制备
棉签刮取菌株单菌落1~2个溶解于100 ml MH液体培养基，置于37 ℃摇床中120r/min恒温培养24 h，作为菌株培养的种子液。
2. 生长曲线测定
移液枪取2 ml种子液接种于100 ml MH液体培养基的锥形瓶，于37 ℃摇床中120r/min震荡培养，采用紫外分光光度法每隔3 h进行OD600 nm测定，测得菌株培养0、3、6、9、12、15、18、21、24 h的OD600nm，每个时间点设置3组平行。绘制24h内以培养时间为横坐标、平均OD600nm为纵坐标的生长曲线。
如图3所示，枯草芽孢杆菌0~9 h内处于调整期，9~15 h为对数生长期，18 h进入平台期，未检测到衰亡期，因此为保证菌体鲜活且稳定，每次操作测定前培养时间均控制为18h；如图4所示，铜绿假单胞菌0~9 h内处于调整期，9~15 h为对数生长期，18 h进入平台期，未检测到衰亡期，因此为保证菌体鲜活且稳定，每次操作测定前培养时间均控制为18 h。
（四）抗生素筛选
1. 试验菌液制备
用无菌棉签从固体培养基上挑取培养18 h的单菌落，溶解于3 ml PBS溶液，震荡摇匀后，用细菌浊度比浊管做参照，将菌液浓度调至0.5麦氏单位（1.5×108 CFU / ml）。
2. 纸片扩散法测定抗生素敏感性
取制备的试验菌悬液100 μl于平板上，用灭菌棉签涂布均匀致密。超净工作台中干燥半小时，用灼烧过的镊子将药敏片从青霉素瓶中取出，轻轻贴在平皿培养基表面，轻轻按压，每皿4片。于37 ℃温箱中倒置培养18 h，菌落计数器测量抑菌圈直径。结果根据美国临床试验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）文件标准判断，试验结果判定标准见表1。
表1 26种抗生素的药敏性试验结果标准
Figure DEST_PATH_IMAGE004
结果：2株菌株的耐药程度如表2所示。结果表明，初步测定Pseudomonas aeruginosa对氯霉素、利福平、庆大霉素等15种抗菌药物耐药，对氧氟沙星、头孢哌酮、环丙沙星、链霉素、妥布霉素、多粘菌素B等9种敏感，对头孢曲松、四环素中度敏感（如图5所示）；Bacillus subtilis对氨苄西林、多粘菌素B等7种抗菌药物耐药，对万古霉素、红霉素、利福平、克拉霉素、妥布霉素等18种抗菌药敏感，对头孢噻肟中度敏感（如图6所示）。
表2 抗菌药物抑菌圈筛选结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
其中，I表示中度敏感，S表示敏感，R表示耐药。
（五）抗菌药物MIC值的测定
1. MIC测定用菌液的制备
无菌棉签从固体培养基上挑取培养18 h的单菌落，溶解于3 ml PBS溶液，震荡摇匀后，中国细菌浊度标准管做参照，采用比浊法将菌液浓度调至0.5麦氏单位（1.5×108CFU / ml），用MH肉汤液体培养基进行1：1000稀释菌液浓度至1.5×105 CFU/ml，作为试验用菌液，每次稀释都要用涡旋混合仪震荡混匀。15 min内接种配制好的接种物，并取一份在琼脂平板上传代培养，以检查菌种纯度。
2. 抗菌原液制备
根据质量、溶剂、浓度与分析效能的关系，计算溶质质量和溶剂体积，溶剂选用去离子水或者PBS缓冲液，此试验均选择去离子水。配制抗菌药物储存液时，其浓度不低于1000 μg/ml，具体根据药物溶解度适当调整。溶质质量和溶剂体积计算如下，配置结果如表3所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
配制好抗菌原液后采用封闭式薄膜过滤器过滤除菌，小量分装备用。所用的滤膜孔径应不大于0.45 μm，此试验采用0.22 μm滤膜过滤，弃掉前5 ml药液，使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。大部分抗菌药物原液-60 ℃保存时间不超过6个月，-20 ℃保存3个月，4 ℃保存一周。
表3 抗菌药物浓度配制
Figure DEST_PATH_IMAGE010
3. 蛇床提取物溶液配制
用微型移液枪吸取并用分析天平称量4 mg蛇床提取物，采用2％二甲基亚砜（DMSO）溶解或者2％吐温80（Tween 80）溶解，先加DMSO或Tween 80 40 μl再用水定容至2ml，此试验采用后者。最终提取物浓度为2 mg/ml，于4℃冰箱储藏备用。
4. 最低抑菌浓度（MIC）测定
取无菌96孔板，前11列加药，第12列做对照。先在1~6排加入MH培养基100 μL，第1列药液每孔100 μL，依次往右微量二倍稀释法加至第11列，后各孔中各加入100 μL菌液，每种药物做三排平行。阳性对照组处理为，试验组的药液换成等量无菌水，阴性对照处理为，阳性对照组的菌液替换为等量MH培养基。于37 ℃培养18 h，当阳性对照孔内细菌明显生长、阴性对照孔无明显变化试验才有意义，单一跳孔，重复试验。以酶标仪在600 nm处测定平板中各孔的吸光度值（Optical density，OD），根据如下公式计算抑菌率，数值80％以上为最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration, MIC）值。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
抗菌药物单用MIC值测定结果：
表4描述了试验用抗菌药物和蛇床提取物单独应用于2株试验菌株的MIC值。链霉素、卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素对枯草芽孢杆菌的MIC值分别为2.5 μg/ml、40.0 μg/ml、80.0 μg/ml、0.05 μg/ml，蛇床提取物对其MIC值为31.25 μg/ml；链霉素、庆大霉素、四环素、多粘菌素B对枯草芽孢杆菌的MIC值分别为2.5 μg/ml、0.4 μg/ml、40.0 μg/ml、5.0 μg/ml，蛇床提取物经试验验证在1000 μg/ml时对其抑菌效果仅有35％，作者认为继续探讨其MIC值没有实际应用价值。
表4 抗菌药物和蛇床提取物MIC检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE014
不同浓度抗菌药物对菌株的抑制率结果：
通过测量600 nm处的吸光度值，能够准确反映细菌浓度变化。结果显示，对枯草芽孢杆菌来说，MIC值处抑菌效果在86％左右，1/8 MIC值时抑菌效果降为9％，几乎失去作用效果；而卡那霉素对枯草芽孢杆菌的抑制结果在76％到100％之间，但在1/32~1/16 MIC值时，抑菌效果仍有37-38％左右；庆大霉素对于枯草芽孢杆菌的抑制率随药物浓度急剧降低，1/2 MIC时效果已减半，1/8 MIC时抑菌效果降为6％左右，几乎失去抑菌效果；氨苄西林对于枯草芽孢杆菌的抑制率在1/16-1/8 MIC时还维持在34~38％，1/3 MIC几乎失去作用；而物对枯草芽孢杆菌的抑制，在MIC-16 MIC值时均维持在80-90％之间，作用效果几乎一致，在1/4 MIC时抑制率还可达到64％（结果见图7~12），可见提取物浓度在一定范围内作用变化不大，由此可在使用过程中避免用量过大过小等不合宜操作。
对于铜绿假单胞菌，链霉素对其抑制作用在1/4 MIC时效果减半；多粘菌素B在1/16 MIC处对铜绿假单胞菌几乎失去作用；庆大霉素的MIC对其抑制效果在72％~97％之间，1/8 MIC时几乎失去抑制作用；四环素的MIC抑制率在78-100％之间，1/16 MIC处几乎失去抑制作用；物提取物在浓度为1 mg/ml时，对铜绿假单胞菌的抑制率仅为35％，相比于对阳性菌枯草芽孢杆菌的MIC 31.25 μg/ml（结果见图13~16），再提高其浓度检测蛇床提取物对铜绿假单胞菌的MIC违背少量高效的实际应用原则，因而继续对物对铜绿假单胞菌的研究意义不大，因此，后续联合作用试验仅在枯草芽孢杆菌进行，探索枯草芽孢杆菌在提取物和抗菌药物共同作用下的效果。
（六）抗菌药物联合应用的体外作用研究
1. 单药药液的配制
在测得各单药和物MIC值的基础上，将药物原液稀释为32倍MIC浓度，试管架放置两排试管，分别标记为不同浓度药物。在第1排试管中，每管加入2.5 ml试验菌液，然后在第1管加入2.5 ml 32MIC药物，混匀后吸取2.5 ml到第2管，依次稀释至第7管，最后一管弃去2.5 ml，那么第1~7管的药物浓度依次为32MIC、16MIC、8MIC、4MIC、2MIC、1MIC、1/2MIC；物原液用2％吐温80溶解，操作方法同上。
2. 棋盘法测定蛇床提取物与各抗菌药物联合作用
棋盘法为测定两种药物联合作用的常用方式。将上述制备的1号管药液依次加到96孔板第1列的8个孔中，每孔50μL，2号管的药物溶液依次加入到第2列的8个孔中，依次类推，加满1-7列，第8列加入50 μL无菌水；将1号管的提取物溶液加到96孔板第A排的8个孔中，每孔50 μL，2号管的药液加入到第B排的8个孔中，依次类推，加满A~G排，第H排加入50 μL无菌水。这样使得1-8列药物浓度依次为8MIC、4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、0；第A~H排提取物溶液浓度依次为8MIC、4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、0。第9列设置菌液阳性对照、第10列设置肉汤阴性对照，试验设置3个重复。抑制情况读取同（三）3所述。
3. 分数抑制指数（FICI）计算
药物相互作用结果采用FICI模型进行解释和评价。FICI模型由Loewe additivity(LA)理论而来，其认为药物自身不会产生相互作用，因此把药物单用与联用产生相同效果的浓度点放一起比较，从而评判两种不同药物之间的关系，也是目前国际公认的最常用的评价联合用药方法之一。
计算数据获得一系列ΣFICs，当最大FIC值小于4时，FICI定义为最小FIC值；否则FICI将定义为最大FIC值计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST，2010），评估标准如下：
表5 FICI与抗菌药物联合作用效果的相关性
Figure DEST_PATH_IMAGE018
运用棋盘法设计链霉素、卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素与蛇床提取物联合作用于Bacillus subtilis，结果分别显示为协同作用、相加作用、无关作用和协同作用。棋盘法测定药物联合作用结果如表6及图17~20所示。
表6 抗菌药物与物联合作用结果
Figure DEST_PATH_IMAGE020
（七）测定菌株的生物膜形成能力
1. 不同浓度试验菌液制备
无菌棉签从固体培养基上挑取培养18 h的单菌落，溶解于3 ml PBS溶液，震荡摇匀后，中国细菌浊度标准管做参照，采用比浊法将菌液浓度调至0.5麦氏单位（1.5×108CFU / ml），依次将菌液浓度稀释为1.5×107、1.5×106、1.5×105 CFU / ml。
2. 结晶紫半定量法测定生物膜形成能力
试验采用结晶紫半定量法测定枯草芽孢杆菌18 h的生物膜形成能力。96孔板中加入200 μl不同浓度试验菌液及空白MH对照液，37℃培养18 h，PH 7.0的PBS清洗3次，风干。加入200 μl 95%乙醇，10 min后酶标仪测定OD600。生物膜形成能力判定标准如表7。
表7 生物膜形成能力判定标准
Figure DEST_PATH_IMAGE022
A为试验菌株OD600，C为生长对照OD600。
经结晶紫半定量法测定，细菌在浓度为1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105CFU/ml时生物膜形成能力均显示阳性，如表8所示。
表8 Bacillus subtilis生物膜形成能力测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE024
（八）形态学观察
1. 药物处理
将药物分别配制成提取物MIC浓度、抑菌药物MIC浓度、提取物2MIC和抑菌药物2MIC混合，以及无菌水处理作为对照。采用牛津杯打孔法，每孔注入50 μL药液；菌液配制成0.5浊度，棉签均匀涂抹于MH固体平板上，观察生长状态，如果在培养18 h后没有明显抑菌圈出现，则可采用增加药液浓度或降低菌液浓度重新试验。
2. 光镜观察
对培养18 h的新鲜枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌使用结晶紫和碱性复红染色。
3. 电镜观察
将分别用无菌水、蛇床提取物、链霉素、庆大霉素、卡那霉素以及三种抗生素与蛇床提取物联合处理的菌株进行扫描电镜观察。
（九）菌种保藏
采用甘油冷冻保藏法，移液枪取1.5 ml保种液于2 ml保种管中，高温灭菌。无菌棉签刮取新鲜菌苔，于保种液中均匀搅拌，封口后于-80℃冰箱冷冻保存。
（十）统计学处理
采用Excel 2016软件对获得的数据进行分析，检验水平为p < 0.05时为差异显著，具有统计学意义，并用Excel 2016、Origin 2019、Matlab R2020a进行数据统计及处理。
（十一）蛇床提取物对其他革兰氏阳性菌和阴性菌作用
初步判断蛇床物提取物对枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌作用效果相差大，是因其分属革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，细胞壁构造差异大而导致的作用效果不同。为验证蛇床提取物确实对阳性菌作用可观而对阴性菌作用效果不尽人意，试验选择其他革兰氏阳性菌S.aureus、M.luteus，革兰氏阴性菌E.coli、V.harveyi、A.baumannii进行试验，在蛇床提取物浓度1000 μg/ml情况下，E.coli、V.harveyi、A.baumannii、Pseudomonas aeruginosa抑菌率分别为76.37%、89.71％、61.73%、35.17%，随着浓度下降抑菌作用减弱快；对S.aureus在1000 μg/ml下刚刚达到80％，对M.luteus仅有45％，初步判定其对菌株的作用效果并不是以阴性菌和阳性菌为界限，在接受试验的菌株中，对枯草芽孢杆菌具有显著效果（如图21和22）。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物包括：蛇床叶提取物和抗生素；
所述蛇床叶提取物通过如下方法制备得到：
将蛇床叶部破碎后溶于水中，提取得到所述蛇床叶提取物；
所述抗生素包括链霉素和庆大霉素。
2.根据权利要求1所述的抗菌组合物，其特征在于，所述提取包括回流提取，每25 g蛇床叶所述回流提取的时间为3~5小时。
3.根据权利要求1所述的抗菌组合物，其特征在于，提取后还包括使用正己烷进行萃取的步骤。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗菌组合物，其特征在于，所述蛇床叶提取物和抗生素的质量比为0~250:0~20，其中不包括0。
5.根据权利要求4所述的抗菌组合物，其特征在于，所述蛇床叶提取物和链霉素的质量比为350~400:50~80；所述蛇床叶提取物和庆大霉素的质量比为350~400:1~10。
6.权利要求1-5任一项所述的抗菌组合物在非疾病的诊断和治疗目的的抑制病原菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病原菌包括枯草芽孢杆菌。
8.一种抗菌产品，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的抗菌组合物。
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