CN113559066B - 一种nir响应型仿生膜纳米囊泡及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡及其构建方法和应用，其中，构建方法包括以下步骤：S1、收集肿瘤细胞，依次采用冻融法、梯度离心和重悬，获得肿瘤细胞膜溶液；S2、采用溶剂扩散法，获得热敏脂质给药系统；S3、将所述肿瘤细胞膜溶液与热敏脂质给药系统混合并用脂质体挤出器挤出过滤，得到NIR响应型仿生膜纳米囊泡。通过采用本发明方法制备得到的NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡，其具备肿瘤高效同源靶向的功能，并且进一步通过阻断PD‑1/PD‑L1通路，长期逆转肿瘤免疫抑制状态，协同发挥抗肿瘤免疫应答，抑制原发肿瘤及转移灶的生长。

Description

一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡及其构建方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过引入功能性的抗原特异性免疫反应，启动机体免疫系统，实现对肿瘤细胞长期的免疫记忆、预防和杀伤。但是，目前约85％肿瘤患者对免疫治疗响应不佳，研究发现，肿瘤微环境可保护肿瘤细胞，通过免疫抑制等机制进行免疫逃逸。
逆转肿瘤免疫抑制型微环境(Immunosuppressive tumor microenvironment，TME)的免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade，ICB)治疗已成为主要的免疫治疗方式。其中，针对PD-1/PD-L1通路的ICB疗法在各种类型的癌症(例如黑色素瘤，非小细胞肺癌和膀胱癌)中均具有显著临床疗效。
单独使用PD-1/PD-L1抑制剂，仅对10％～30％的患者有效，这可能受限于肿瘤组织PD-L1表达水平及肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)比例。大部分实体瘤深层缺乏TILs，称作“冷”肿瘤，对单一抗PD治疗并不敏感，是ICB治疗失败的重要原因。
研究发现，TILs常被限制于肿瘤微环境基质区域而非肿瘤细胞周围，其中，肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)通过激活PD-L2和FASL，使得CD8+T细胞耗竭，无法发挥细胞毒性T细胞的免疫应答效应。
因此，联合其他有效治疗策略，重塑肿瘤微环境，提高肿瘤深部TILs比例，激活效应T细胞攻击肿瘤细胞是增强PD-1/PD-L1阻断治疗的关键，有望大幅度抑制肿瘤复发或转移。
目前，已有研究者借助纳米技术将PD-1/PD-L1阻断疗法与放疗、光疗等手段联合，协同刺激宿主免疫系统产生抗肿瘤免疫响应来控制转移性肿瘤生长。研究发现，光热或光动力治疗通过产生高热或活性氧，可诱导肿瘤免疫原性细胞死亡(Immunogenic celldeath，ICD)，释放肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen，TAA)，激活体内免疫应答。光热疗法可能通过提高肿瘤深部TILs比例，并利于改善免疫抑制型肿瘤微环境，其可作为增强PD-1/PD-L1阻断治疗的有效联合策略。
而在体循环过程中，多数纳米给药系统均存在不同程度的免疫原性问题，细胞膜包被的仿生型药物递释系统能够显著降低免疫原性，同时可模拟体内物质或感染力较强的病原体功能，复制其生理过程，将药物准确递送至靶部位。肿瘤细胞膜表面高表达粘附蛋白、整合素、粘附激酶等特异性蛋白，使得同源肿瘤细胞之间具有较强的粘附力，细胞能高度自我识别，可实现同源肿瘤靶向。
同源肿瘤细胞膜可用于构建仿生型药物递释系统，通过联合光热疗法，有望提高PD-1/PD-L1阻断治疗在原发肿瘤及转移灶的靶向性和治疗效果，同时可降低脱靶效应，实现高效低毒的免疫治疗目标。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡的构建方法，有效地提高了PD-1/PD-L1阻断治疗在原发肿瘤及转移灶的治疗效果，同时还降低了脱靶效应，实现高效低毒的免疫治疗目标。
本发明的另一个目的在于提供一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡。
本发明的另一个目的在于提供NIR响应型仿生膜纳米囊泡在肿瘤诊断成像、制备肿瘤组织光热响应释放免疫检查点阻断剂以及光热治疗联合免疫疗法抑制肿瘤生长与转移中的应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
S1、收集肿瘤细胞，依次采用冻融法、梯度离心和重悬，获得肿瘤细胞膜溶液；
S2、采用溶剂扩散法，获得热敏脂质给药系统；
S3、将所述肿瘤细胞膜溶液与热敏脂质给药系统混合并用脂质体挤出器挤出和过滤，得到NIR响应型仿生膜纳米囊泡。
优选地，所述S3中，所述肿瘤细胞膜溶液与热敏脂质给药系统的质量比为1∶(1～5)。
优选地，所述S3中，所述肿瘤细胞膜溶液的浓度为0.5～2mg/mL。
优选地，所述S3中，所述过滤时，是依次采用450～350nm、250～150nm、150～50nm的聚碳酸酯滤膜进行过滤。
优选地，所述S2的具体方法为：
S21、将PD-1/PD-L1抑制剂、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG-DSPE)、热敏脂质DPPC以及胆固醇溶解于乙醇中，且在50～70℃的水浴中加热，得到乙醇相溶液；
其中，所述乙醇相溶液中PD-1/PD-L1抑制剂的质量百分比为5～20％、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物的质量百分比为10～20％、热敏脂质DPPC的质量百分比为65～75％、胆固醇的质量百分比为3～6％；
S22、按照F68水溶液与乙醇相溶液的体积比为(8～12)∶1的比例量取F68水溶液，并在55～65℃条件下，将所述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，且在300～600rpm的转速下搅拌5～10min，再冷却至室温，制备得到热敏脂质给药系统。
优选地，所述S21中，所述PD-1/PD-L1抑制剂为BMS-1、BMS-1001、BMS202、BMS-1166中的至少一种。
优选地，所述S22中，所述F68水溶液的浓度为0.5～1.5mg/mL。
优选地，所述S21中，所述IR-780碘化物修饰脂质嫁接物是通过以下方法获得：
S211、称取5～15mg的IR-780碘化物和20～50mg的NH2-PEG-DSPE，精密称定，溶于二氯甲烷溶液中，得到含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液；
S212、以三乙胺(TEA)为缚酸剂，按三乙胺(TEA)与IR-780碘化物(IR780)的摩尔比为(1～3)∶1的比例称取三乙胺(TEA)，并加至所述含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应8～30h；
S213、反应结束后，将反应溶液加入至8～12倍体积的无水乙醚中，3～5℃条件下过夜，而后在转速为2500～3500rpm的条件下离心4～6min，去除副产物，再将沉淀物干燥，得到IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG-DSPE)。
优选地，所述NH2-PEG-DSPE为NH2-PEG1000-DSPE、NH2-PEG2000-DSPE、NH2-PEG3000-DSPE、NH2-PEG4000-DSPE中的至少一种。
本发明的第二个技术方案是这样实现的：如上所述的构建方法制得的一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡。
本发明的第三个技术方案是这样实现的：如上所述的NIR响应型仿生膜纳米囊泡在肿瘤诊断成像、在制备肿瘤组织光热响应释放免疫检查点阻断剂以及在光热治疗联合免疫疗法抑制肿瘤生长与转移中的应用。
与现有技术相比，通过采用本发明方法制备得到的NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡，其具备肿瘤高效同源靶向的功能，并且进一步通过阻断PD-1/PD-L1通路，长期逆转肿瘤免疫抑制状态，协同发挥抗肿瘤免疫应答，抑制原发肿瘤及转移灶的生长。
附图说明
图1为IR-780碘化物修饰脂质嫁接物IR780-PEG-DSPE的合成路线；
图2为IR780、DSPE-PEG-NH2和IR780-PEG-DSPE的1H NMR图谱；
图3为不同质量比的细胞膜纳米囊泡(M/IR NPs)在4T1荷瘤小鼠的体内分布图，其中，虚线圆圈代表肿瘤；
图4为IR NPs、M和M/IR NPs的粒径大小对比示意图；
图5为不同材料的Zeta电位对比示意图；
图6为NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡(M/IR NPs)的透射电镜照片；
图7为NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡(M/IR NPs)的膜蛋白分析结果示意图，其中，
图7A为SDS-PAGE分离蛋白，经考马斯亮蓝染色图像；其中，I：4T1细胞裂解液，II：4T1细胞膜溶液，III：M/IR NPs；
图7B为细胞膜特异性蛋白(EpCAM、N-cadherin和galectin-3)Western blot分析结果示意图；其中，I：4T1细胞裂解液，II：4T1细胞膜溶液，III：M/IR NPs；
图8为NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡(M/IR NPs)的体内分布情况示意图，其中：
图8A为4T1肿瘤小鼠模型经IR NPs或M/IR NPs尾静脉注射2h、8h、24h、48h和72h后的体内分布图；
图8B为4T1肿瘤小鼠模型经IR NPs或M/IR NPs尾静脉注射2h、8h、24h、48h和72h后肿瘤部位的平均荧光强度示意图，其中，n＝3；
图9为NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡M/IR NPs的紫外吸收光谱图；
图10为M/IR NPs经近红外激光照射(808nm，1W/cm2)5min的温度变化曲线图；
图11为NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡M/IR NPs在体外经激光照射(808nm，1W/cm2，3min)前后的药物释放曲线图；
图12为IR NPs和M/IR NPs在不同温度下的透射电镜图；
图13为NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡M/IR NPs体内抗肿瘤疗效示意图，4T1荷瘤小鼠21天内肿瘤生长曲线图；
图14为给药结束后不同组肿瘤组织重量对比图；
图15为NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡M/IR NPs体内抗肿瘤转移疗效，
图15A为各治疗组肺部组织照片；
图15B为各治疗组肺转移结节数量；其中，n＝5，**p<0.01，*{*p<0.001)；
图16为流式细胞仪测定给药后各组小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞浸润比例示意图；
图17为肿瘤组织中IFN-γ分泌水平示意图
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例所使用的物料、细胞等均可通过购买、自制或提取得到。
本实施例提供的一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
S1、收集肿瘤细胞，依次采用冻融法、梯度离心和重悬，获得肿瘤细胞膜溶液；
S2、采用溶剂扩散法，获得热敏脂质给药系统；
S3、按照所述肿瘤细胞膜溶液与热敏脂质给药系统的质量比为1∶(1～5)的比例将两者混合并用脂质体挤出器挤出，且在挤出的过程中依次采用450～350nm、250～150nm、150～50nm的聚碳酸酯滤膜进行过滤，得到NIR响应型仿生膜纳米囊泡。
采用上述方案后，通过采用本发明方法制备得到的NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡，其具备肿瘤高效同源靶向的功能，并且进一步通过阻断PD-1/PD-L1通路，长期逆转肿瘤免疫抑制状态，协同发挥抗肿瘤免疫应答，抑制原发肿瘤及转移灶的生长。
此外，在具体的实施过程中，上述S1的具体方法为：
S11、收集肿瘤细胞，并采用PBS缓冲液对所述肿瘤细胞进行清洗，得到清洗后的肿瘤细胞；其中，所述清洗后的肿瘤细胞与低渗透压缓冲溶液的比例为(0.8×108～1.2×108)个∶(2～4)mL；
S12、将所述清洗后的肿瘤细胞重悬于低渗透压缓冲溶液中，并在-80℃和37℃的温度条件下反复冻融3～5次，得到冻融后的肿瘤细胞液；其中，所述低渗透压缓冲溶液是采用浓度为15～25mM且pH值为7.2～7.7的Tris-HCl、浓度为8～12mM的KCl、浓度为1.5～2.5mM的MgCl2以及浓度为0.8～1.2mM的PMSF混合而成；
S13、在3～5℃、3000～3200g的条件下对所述冻融后的肿瘤细胞液进行一次离心分离3～7min，收集上清液，得到一次分离上清液；在3～5℃、8000～12000g的条件下对一次分离上清液进行二次离心分离18～22min，收集上清液，得到二次分离上清液；在3～5℃、80000～120000g的条件下对二次分离上清液进行三次离心分离0.8～1.2h，分离完毕后，收集分离后的沉淀，并采用PBS缓冲液对所述沉淀进行清洗，得到细胞膜沉淀；
S14、采用PBS缓冲液对所述细胞膜沉淀进行重悬溶解，得到浓度为0.5～2mg/mL的肿瘤细胞膜溶液。
此外，上述S2中所述的热敏脂质给药系统载有的药物为PD-1/PD-L1抑制剂；所述PD-1/PD-L1抑制剂为BMS-1、BMS-1001、BMS202、BMS-1166中的至少一种，且优选为抑制剂BMS202，该给药系统通过如下步骤制得的：
S21、以抑制剂BMS202(BMS)作为模型药物，将抑制剂BMS202(BMS)、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG-DSPE)、热敏脂质(DPPC)以及胆固醇溶解于乙醇中，且在50～70℃的水浴中加热，得到乙醇相溶液；
其中，所述乙醇相溶液中抑制剂BMS202的质量百分比为5～20％、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物的质量百分比为10～20％、热敏脂质DPPC的质量百分比为65～75％、胆固醇的质量百分比为3～6％；
S22、按照F68水溶液与乙醇相溶液的体积比为(8～12)∶1的比例量取F68水溶液(其浓度为0.5～1.5mg/mL)，并在55～65℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，且在300～600rpm的转速下搅拌5～10min，再冷却至室温，制备得到热敏脂质给药系统，即IR-780碘化物修饰热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)。
此外，上述步骤S21中所述的IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG-DSPE)是通过如下方法得到：
S211、称取5～15mg的IR-780碘化物(IR780)和20～50mg的NH2-PEG-DSPE，精密称定，溶于二氯甲烷溶液中，得到含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液；其中，所述NH2-PEG-DSPE为NH2-PEG1000-DSPE、NH2-PEG2000-DSPE、NH2-PEG3000-DSPE、NH2-PEG4000-DSPE中的至少一种；优选为NH2-PEG2000-DSPE；
S212、以三乙胺(TEA)为缚酸剂，按三乙胺(TEA)与IR-780碘化物(IR780)的摩尔比为(1～3)∶1的比例称取三乙胺(TEA)，并加至所述含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应8～30h；
S213、反应结束后，将反应溶液加入至8～12倍体积的无水乙醚中，3～5℃条件下过夜，而后在转速为2500～3500rpm的条件下离心4～6min，去除副产物，再将沉淀物干燥，得到IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG-DSPE)。
以下为具体实施例
实施例1
1)关于一种IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)的制备
本实施例1提供的IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)是通过取代法合成，具体包括以下步骤：
称取10mg的IR-780碘化物和40mg的NH2-PEG2000-DSPE，精密称定，溶于二氯甲烷溶液中，得到含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液；以三乙胺(TEA)为缚酸剂，按三乙胺(TEA)与IR-780碘化物的摩尔比为2∶1的比例称取三乙胺(TEA)，并加至所述含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应24h；反应结束后，将反应溶液加入至10倍体积的无水乙醚中，4℃条件下过夜，而后在转速为3000rpm的条件下离心5min，去除副产物，再将沉淀物干燥，得到IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)。
所述IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)的具体合成路线如图1所示(注，图1中的n的取值范围为45～100，且当聚乙二醇选为PEG2000时，图1中的n＝46)。
采用1H NMR确证IR780-PEG2000-DSPE嫁接物化学结构，如图2所示。
从图2的核磁共振氢谱图中可以看出：1)位于0.96和1.29ppm处的特征峰归属于NH2-PEG2000-DSPE中-CH3和-CH2-上质子峰；2)位于8.33ppm附近的特征峰归属于IR780上苯环质子峰，这些结果显示IR780-PEG2000-DSPE已成功制备。
2)关于一种热敏脂质给药系统的构建
本实施例1提供的热敏脂质给药系统是通过以下步骤构建得到的：
以抑制剂BMS202(BMS)作为模型药物，分别称取抑制剂BMS202、实施例1获得的IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)、热敏脂质DPPC和胆固醇，并将称取的抑制剂BMS202、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)、热敏脂质DPPC以及胆固醇溶解于乙醇中，且在60℃的水浴中加热，得到乙醇相溶液(该溶液中，抑制剂BMS202的质量百分比为10％、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物的质量百分比为15％、热敏脂质DPPC的质量百分比为70％、胆固醇的质量百分比为5％)；按照F68水溶液与乙醇相溶液的体积比为10∶1的比例量取F68水溶液(其浓度为1mg/mL)，并在60℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，且在400rpm的转速下搅拌8min，再冷却至室温，制备得到热敏脂质给药系统，即IR-780碘化物修饰热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)。
采用高效液相色谱法(HPLC)测定IR-780碘化物修饰热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)中BMS(即抑制剂BMS202)的含量。测定时，色谱条件∶C18反相色谱柱，流动相为乙腈∶水＝95∶5(v/v，0.2‰甲酸)；流速：1.0mL/min；进样量：50μL；柱温：40℃。
标准曲线制作：制备1.0mg/mL BMS/DMSO溶液，流动相稀释至不同浓度梯度(0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、7μg/mL、10μg/mL)，HPLC检测214nm处紫外吸收峰。Chem-Station软件分析数据，以药物浓度C(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，制作标准曲线。包封率与载药量测定：精密移取IR780/DPPC/BMS溶液20μL，流动相稀释10倍，水浴超声30min，HPLC检测药物浓度，计算药物包封率及载药量：
包封率＝载药脂质纳米粒样品中的BMS质量/BMS投药质量×100％；
载药量＝载药脂质纳米粒样品中的BMS质量/载药脂质纳米粒样品中的BMS质量+脂质纳米粒的质量)×100％；
经计算得到，抑制剂BMS202(BMS)在IR NPs中的载药量为6.70％，包封率为74.0％。
实施例2
1)关于一种IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)的制备
本实施例2提供的IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG-2000-DSPE)的制备方法与实施例1中相同，在此不做过多的陈述。
2)关于一种热敏脂质给药系统的构建
本实施例2提供的热敏脂质给药系统是通过以下步骤构建制得：
以抑制剂BMS202(BMS)作为模型药物，分别称取抑制剂BMS202、实施例1获得的IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)、热敏脂质DPPC和胆固醇，并将称取的抑制剂BMS202、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)、热敏脂质DPPC以及胆固醇溶解于乙醇中，且在60℃的水浴中加热，得到乙醇相溶液(该溶液中，抑制剂BMS202的质量百分比为15％、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物的质量百分比为15％、热敏脂质DPPC的质量百分比为70％、胆固醇的质量百分比为5％)；按照F68水溶液与乙醇相溶液的体积比为10∶1的比例量取F68水溶液(其浓度为1mg/mL)，并在60℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，且在400rpm的转速下搅拌8min，再冷却至室温，制备得到热敏脂质给药系统，即IR-780碘化物修饰热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)。
采用高效液相色谱法(HPLC)测定IR-780碘化物修饰热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)中BMS(即抑制剂BMS202)的含量。测定时：色谱条件∶C18反相色谱柱，流动相为乙腈∶水＝95∶5(v/v，0.2‰甲酸)；流速：1.0mL/min；进样量：50μL；柱温：40℃。
标准曲线制作：制备1.0mg/mL BMS/DMSO溶液，流动相稀释至不同浓度梯度(0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、7μg/mL、10μg/mL)，HPLC检测214nm处紫外吸收峰。Chem-Station软件分析数据，以药物浓度C(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，制作标准曲线。包封率与载药量测定：精密移取IR780/DPPC/BMS溶液20μL，流动相稀释10倍，水浴超声30min，HPLC检测药物浓度，计算药物包封率及载药量：
包封率＝载药脂质纳米粒样品中的BMS质量/BMS投药质量×100％；
载药量＝载药脂质纳米粒样品中的BMS质量/载药脂质纳米粒样品中的BMS质量+脂质纳米粒的质量)×100％；
经计算得到抑制剂BMS202(BMS)在IR NPs中的载药量为11.2％，包封率为75.0％。
实施例3
1)关于一种IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)的制备
本实施例3提供的IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)的制备方法与实施例1中相同在此不做过多的陈述。
2)关于一种热敏脂质给药系统的构建
本实施例3提供的热敏脂质给药系统是通过以下步骤制得：
以抑制剂BMS202(BMS)作为模型药物，分别称取抑制剂BMS202、实施例1获得的IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)、热敏脂质DPPC和胆固醇，并将称取的抑制剂BMS202、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物(IR780-PEG2000-DSPE)、热敏脂质DPPC以及胆固醇溶解于乙醇中，且在60℃的水浴中加热，得到乙醇相溶液(该溶液中，抑制剂BMS202的质量百分比为20％、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物的质量百分比为15％、热敏脂质DPPC的质量百分比为70％、胆固醇的质量百分比为5％)；按照F68水溶液与乙醇相溶液的体积比为10∶1的比例量取F68水溶液(其浓度为1mg/mL)，并在60℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，且在400rpm的转速下搅拌8min，再冷却至室温，制备得到热敏脂质给药系统，即IR-780碘化物修饰热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)。
采用高效液相色谱法(HPLC)测定IR-780碘化物修饰热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)中BMS(即抑制剂BMS202)的含量。测定时：色谱条件∶C18反相色谱柱；流动相为乙腈∶水＝95∶5(v/v，0.2‰甲酸)；流速：1.0mL/min；进样量：50μL；柱温：40℃。
标准曲线制作：制备1.0mg/mL BMS/DMSO溶液，流动相稀释至不同浓度梯度(0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、7μg/mL、10μg/mL)，HPLC检测214nm处紫外吸收峰。Chem-Station软件分析数据，以药物浓度C(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，制作标准曲线。
包封率与载药量测定：精密移取IR780/DPPC/BMS溶液20μL，流动相稀释10倍，水浴超声30min，HPLC检测药物浓度，计算药物包封率及载药量：
包封率＝载药脂质纳米粒样品中的BMS质量/BMS投药质量×100％；
载药量＝载药脂质纳米粒样品中的BMS质量/载药脂质纳米粒样品中的BMS质量+脂质纳米粒的质量)×100％；
经计算得到抑制剂BMS202(BMS)在IR NPs中的载药量为14.70％，包封率为70.0％。
实施例4
本发明实施例4提供了一种NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡的制备方法，该方法包括以下步骤(该方法中的肿瘤细胞以4T1细胞为例进行举证和制备)：
收集4T1细胞(约1×108个)，PBS缓冲液对所述4T1细胞清洗三次，重悬于3mL低渗缓冲液(其是采用浓度为20mM且pH值为7.5的Tris-HCl、浓度为10mM的KCl、浓度为2mM的MgCl2以及浓度为1mM的PMSF的混合溶液)，并分别于-80℃和37℃的条件下反复冻融3次，得到冻融后的肿瘤细胞液；在4℃、3200g的条件下对所述冻融后的肿瘤细胞进行一次离心分离5min，收集上清液，得到一次分离上清液；在4℃、10000g的条件下对所述一次分离上清液进行二次离心分离20min，收集上清液，得到二次分离上清液；在4℃、100000g的条件下对所述二次分离上清液进行三次离心分离1h，收集分离后的沉淀，并用PBS缓冲液对所述沉淀进行清洗，得到细胞膜沉淀，再采用PBS缓冲液对所述细胞膜沉淀进行重悬溶解，获得4T1肿瘤细胞膜。采用BCA法，对收集的4T1肿瘤细胞膜，进行蛋白含量测定。细胞膜溶液-80℃保存备用。
采用滤膜挤出法制备NIR响应型仿生膜纳米囊泡(M/IR780/DPPC/BMS，M/IR NPs)，具体方法如下：
将提取的4T1肿瘤细胞膜(M)，与实施例1获得的热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)按照设定的质量比(IR NPs质量：M蛋白质量＝2∶1)混合，用脂质体挤出器挤出和过滤(在过滤的过程中依次采用400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯滤膜进行过滤)，得到NIR响应型仿生膜纳米囊泡(M/IR780/DPPC/BMS，M/IR NPs)。
实施例5
本发明实施例5提供了一种NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡的制备方法，该方法包括以下步骤(该方法中的肿瘤细胞以4T1细胞为例进行举证和制备)：
收集4T1细胞(约1×108个)，PBS缓冲液对所述4T1细胞清洗三次，重悬于3mL低渗缓冲液(其是采用浓度为20mM且pH值为7.5的Tris-HCl、浓度为10mM的KCl、浓度为2mM的MgCl2以及浓度为1mM的PMSF的混合溶液)，并分别于-80℃和37℃的条件下反复冻融3次，得到冻融后的肿瘤细胞液；在4℃、3200g的条件下对所述冻融后的肿瘤细胞进行一次离心分离5min，收集上清液，得到一次分离上清液；在4℃、10000g的条件下对所述一次分离上清液进行二次离心分离20min，收集上清液，得到二次分离上清液；在4℃、100000g的条件下对所述二次分离上清液进行三次离心分离1h，收集分离后的沉淀，并用PBS缓冲液对所述沉淀进行清洗，得到细胞膜沉淀，再采用PBS缓冲液对所述细胞膜沉淀进行重悬溶解，获得4T1肿瘤细胞膜。采用BCA法，对收集的4T1肿瘤细胞膜，进行蛋白含量测定。细胞膜溶液-80℃保存备用。
采用滤膜挤出法制备NIR响应型仿生膜纳米囊泡M/IR780/DPPC/BMS(M/IR NPs)，具体方法如下：
将提取的4T1肿瘤细胞膜(M)，与实施例1获得的热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)按照设定的质量比(IR NPs质量∶M蛋白质量＝5∶1)混合，用脂质体挤出器挤出和过滤(在过滤的过程中依次采用400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯滤膜进行过滤)，得到NIR响应型仿生膜纳米囊泡(M/IR780/DPPC/BMS，M/IR NPs)。
实施例6
本发明实施例6提供了一种NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡的制备方法，该方法包括以下步骤(该方法中的肿瘤细胞以4T1细胞为例进行举证和制备)：
收集4T1细胞(约1×108个)，PBS缓冲液对所述4T1细胞清洗三次，重悬于3mL低渗缓冲液(其是采用浓度为20mM且pH值为7.5的Tris-HCl、浓度为10mM的KCl、浓度为2mM的MgCl2以及浓度为1mM的PMSF的混合溶液)，并分别于-80℃和37℃的条件下反复冻融3次，得到冻融后的肿瘤细胞液；在4℃、3200g的条件下对所述冻融后的肿瘤细胞进行一次离心分离5min，收集上清液，得到一次分离上清液；在4℃、10000g的条件下对所述一次分离上清液进行二次离心分离20min，收集上清液，得到二次分离上清液；在4℃、100000g的条件下对所述二次分离上清液进行三次离心分离1h，收集分离后的沉淀，PBS缓冲液对所述沉淀进行清洗，得到细胞膜沉淀，再采用PBS缓冲液对所述细胞膜沉淀进行重悬溶解，获得4T1肿瘤细胞膜。采用BCA法，对收集的4T1肿瘤细胞膜，进行蛋白含量测定。细胞膜溶液-80℃保存备用。
采用滤膜挤出法制备NIR响应型仿生膜纳米囊泡M/IR780/DPPC/BMS(M/IR NPs)，具体方法如下：
将提取的4T1肿瘤细胞膜(M)，与实施例1获得的热敏脂质给药系统(IR780/DPPC/BMS，IR NPs)按照设定的质量比(IR NPs质量：M蛋白质量＝1：1)混合，用脂质体挤出器挤出和过滤(在过滤的过程中依次采用400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯滤膜进行过滤)，得到NIR响应型仿生膜纳米囊泡(M/IR780/DPPC/BMS，M/IR NPs)。
为了验证本发明实施例获得的NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡(M/IR780/DPPC/BMS，M/IR NPs)的性能，现以实施例4获得的NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡行如下检验：
1)采用小动物活体成像仪，观察不同质量比的NIR响应型仿生膜纳米囊泡在4T1荷瘤小鼠的体内分布。图3显示，尾静脉注射NIR响应型仿生膜纳米囊泡后，IR780热敏脂质给药系统与4T1肿瘤细胞膜按质量比为2∶1时，显示NIR响应型仿生膜纳米囊泡在肿瘤部位的分布明显强于其他各组，显示当IR780热敏脂质给药系统与4T1肿瘤细胞膜按质量比为2.0时，NIR响应型仿生膜纳米囊泡具有较强的肿瘤靶向能力，选用该比例作为肿瘤细胞膜与IR780热敏脂质给药系统的优选包被比例。
制备相同浓度IR780修饰热敏脂质给药系统(IR NPs)和NIR响应型仿生膜纳米囊泡(M/IR NPs)(1.0mg/mL)载药纳米粒溶液，采用微粒粒度与表面电位仪分别测定IR NPs和M/IR NPs的粒径及表面电位。测定结果如图4和图5所示，从图4和图5中可以看出，IR NPs和M/IR NPs的粒径分别为95.5±0.6nm和252.4±18.3nm，表面电位分别为12.7±0.46mV和-12.8±2.08mV。结果说明IR NPs纳米粒经细胞膜包裹后，粒径增大，电荷从正电荷反转成负电荷，与细胞膜本身电荷相近。
此外，取相同浓度IR NPs和M/IR NPs(1.0mg/mL)载药纳米粒溶液，去离子水稀释至0.1mg/mL，滴至覆有碳膜的铜网，2％(w/v)醋酸双氧铀染色，滤纸吸去多余液体，透射电镜分别观察M/IR NPs的形态与粒径。测定结构如图6所示，从图6中可以看出，M/IR NPs呈球形，具有明显的核壳结构，尺寸约为200nm，进一步验证了细胞膜成功包裹在IR NPs表面。
采用凝胶电泳和western blot法对M/IR NPs的肿瘤细胞膜蛋白进行表征。取含有等量蛋白的4T1细胞裂解液、4T1细胞膜溶液及M/IR NPs溶液，100℃条件下加热10min。采用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在Mini-PROTEAN Tetra系统中进行分离。考马斯亮蓝进行染色，脱色过夜后成像。然后将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上进行western blot分析。采用EpCAM抗体(abcam，A1177)、N-cadherin抗体(Immunoway，YM0465)和galectin-3抗体(Abcam，ab76245)，在4℃孵育膜过夜。辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠/兔二抗在室温下孵育1h。最后，采用ChemiDoc成像系统检测蛋白信号，检测结果如图7所示。从图7A中可以看出，M/IR NPs的蛋白图谱与纯化细胞膜的蛋白图谱一致，表明细胞膜与IR NPs纳米粒融合后的膜蛋白保持良好。
此外，western blot分析结果显示，纯化细胞膜和M/IR NPs上均存在肿瘤细胞膜生物标志物EpCAM、N-cadherin和galectin-3，如图7B所示，表明该方法保存了特定的膜蛋白。
构建4T1乳腺癌荷瘤动物模型，对多功能仿生型膜纳米囊泡体内诊断成像能力进行检测。为验证M/IR NPs是否能够靶向肿瘤组织，我们将M/IR NPs尾静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内。取接种肿瘤细胞2w的4T1荷瘤动物模型，随机分为两组，分别尾静脉注射0.2mL IRNPs和M/IR NPs溶液(BMS剂量均为5mg/kg)，注射后2h、8h、24h、48h、72h，戊巴比妥钠(10mg/kg)麻醉小鼠，小动物活体成像仪观察IR NPs或M/IR NPs在荷瘤动物模型体内经时分布及肿瘤组织成像情况，拍摄荧光照片(滤光片为ICG)，并测量肿瘤部位载体的平均信号强度。检测结果如图8A所示，由图8A可知，注射2h后，M/IR NPs的荧光信号开始在肿瘤区域分布，而IR NPs组在肿瘤部位没有荧光信号。随着时间的延长，M/IR NPs组肿瘤部位的荧光较IRNPs组明显增强(图8A和8B)。具有同源肿瘤细胞膜包被的M/IR NPs在肿瘤组织积累更快、更强，表明M/IR NPs可以实现同源的主动靶向，用于肿瘤的诊断成像。
采用紫外-可见分光光度法测定IR NPs或M/IR NPs纳米载体在400～900nm波段的吸收光谱；检测结果如图9所示，通过分析图9可知，近红外(NIR)荧光探针IR780在795nm波长处有较强的特征吸收，经IR780修饰，IR NPs或M/IR NPs纳米载体在近红外区仍保持强烈的吸收，且最大吸收峰在795nm处，与IR780的吸收特性基本一致，表明IR NPs或M/IR NPs纳米载体具备良好的近红外吸收特性。
取等体积PBS、含IR780浓度为5.0μg/mL的游离IR780/DMSO溶液、IR NPs及M/IRNPs水溶液，置于保温箱。采用波长为808nm的近红外激光器照射(1W/cm2)各样品3min，采用红外热成像仪记录M/IR NPs纳米载体经激光照射的温度实时变化趋势，评价M/IR NPs的光热转换能力；检测结果如图10所示，通过分析图10可知，经1W/cm2激光持续照射3min，游离IR780、IR NPs和M/IR NPs溶液温度分别上升至53.8℃、54.4℃和58.8℃，而空白对照PBS组温度几乎没有变化，温度为35.4℃。表明多功能仿生膜纳米囊泡M/IR NPs具有较好的光热转换能力。
药物响应性释放研究
为了确定近红外激光照射诱导的光热转换是否能够触发药物的有效释放，进一步对M/IR NPs在不同时间点的药物释放行为进行测定。
分别移取一定体积的IR NPs和M/IR NPs载药纳米粒溶液，去离子水稀释至1.0mL，置于透析袋(MWCO 3.5kDa)。以20mL pH 6.8PBS为释放介质，恒温振荡(37℃，75rpm)，分别于0.5h、1h、2h、4h定时取样，并更换新鲜释放介质。4h时，激光照射(808nm，1W/cm2)3min后，继续定时取样，并更换新鲜释放介质。HPLC法测定各组药物BMS浓度，根据标准曲线计算载药纳米粒经过激光照射前后的BMS累积释放量和累积释放百分率，具体结果如图11所示。
从图11中可以看出，在开始4h，M/IR NPs和IR NPs的药物释放都较为缓慢。但当M/IR NPs或IR NPs溶液经808nm激光(1W/cm2，3min)照射后，BMS的释放速度较快，72h时，M/IRNPs和IR NPs的累积释放率分别达到77.1％和80.8％。M/IR NPs与IR NPs的累积释放效率无显著差异，说明细胞膜的包裹对药物释放没有影响。而在没有激光照射的情况下，M/IRNPs和IR NPs在整个释放过程中均表现出缓慢的释放行为，72h累积释放率分别为45.9％和49.1％。
采用透射电镜观察了不同温度(37℃和56℃)下M/IR NPs和IR NPs的形态变化，具体结果如图12所示，从图12可以看出，当温度为37℃时，M/IR NPs和IR NPs呈规则的球形，尺寸分别约为200nm和100nm；当温度升高到56℃时，M/IR NPs表面的膜结构开始膨胀和破裂，M/IR NPs的尺寸明显增大到约400nm；而IR NPs结构开始崩解，融化成粒径小于10nm的小颗粒。
多功能仿生膜纳米囊泡体内抗肿瘤疗效评价
本发明以4T1荷瘤小鼠为动物模型，评价多功能仿生膜纳米囊泡M/IR NPs的体内抗肿瘤疗效。取4T1乳腺癌体积为200mm3左右的荷瘤小鼠25只，随机分成5组(n＝5)，未激光照射组1组：生理盐水，激光照射组4组：生理盐水、BMS、IR NPs、M/IR NPs，(BMS剂量均为为5mg/kg)。第一次给药记为第1d，隔天尾静脉给药200μL/只/d，激光照射组在每次给药1d后对肿瘤区域进行激光照射3min(808nm，0.5W/cm2)，未激光照射组不处理，共给药5次，激光照射5次。治疗周期内，每隔1d用数显游标卡尺测量各组裸鼠肿瘤大小，参见公式(1)，计算肿瘤体积，记录体重。
肿瘤体积V(mm3)＝a×b2/2 (1)
式中：a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径
如图13显示，生理盐水组肿瘤体积持续增长，而M/IR NPs激光照射后，肿瘤体积明显减小；与BMS Laser(+)和IR NPs Laser(+)治疗组相比，等剂量M/IR NPs治疗组在激光照射下抑制肿瘤生长最有效，治疗周期结束后，剖取荷瘤小鼠肿瘤组织进行称重，如图14所示，M/IR NPs激光照射组肿瘤重量最小，抗肿瘤效果最明显。
多功能仿生膜纳米囊泡体内抗肿瘤转移研究
原发肿瘤和肿瘤转移的治疗对癌症患者都很重要，但抑制肿瘤转移具有更高的挑战性。本发明进一步评价多功能仿生膜纳米囊泡(M/IR NPs)诱导的免疫-光热联合治疗转移性肿瘤的潜力。采用4～6周BALB/c雌性小鼠，右侧乳腺脂肪垫注射100μL 4T1细胞悬液(含1×106个细胞)，建立4T1原位乳腺癌转移模型。继续培养荷瘤小鼠，取原发肿瘤不同体积大小的荷瘤小鼠，剖取肺组织，通过HE染色观察肺转移情况。当肿瘤体积达到要求时，采用上述给药方法处理小鼠模型(n＝5)。
治疗周期21天结束后，收集不同组肺部组织，分析各治疗组肺转移结节数量(图15A和15B)。结合图15A和15B可知，与生理盐水治疗组相比，激光照射下BMS、IR NPs和M/IRNPs治疗组肺转移结节平均数量分别减少52.3％、67.1％和91.9％。M/IR NPs激光照射治疗组转移抑制率显著高于BMS Laser(+)和IR NPs Laser(+)治疗组。这些结果表明，具有免疫-光热联合治疗与同源靶向能力的M/IR NPs比单独免疫治疗或光热治疗更能有效地抑制微转移的形成。
肿瘤微环境T细胞浸润情况
抗肿瘤免疫反应主要依赖于活化的T细胞。其中，CD8+T细胞激活后通常分化为细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells，CTLs)，能特异性杀伤肿瘤细胞。给药结束后，取各组模型动物的肿瘤组织，细胞匀浆器研磨，制备单细胞悬浮液，检测肿瘤组织中CD8+T细胞的比例。采用荧光标记的抗体APC anti-mouse CD3ε和PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a标记细胞，4℃孵育20min，PBS清洗3次，流式细胞仪分析肿瘤组织中的CD8+T细胞百分比。
结果如图16所示，从图16中的数据可知，M/IR NPs激光照射组CD3+CD8+T细胞百分比为71.2％，是生理盐水激光组的2.70倍，提示CTLs有效渗入肿瘤组织。值得注意的是，M/IR NPs激光照射组肿瘤组织浸润的CD8+T细胞比例是IR NPs激光照射组的1.30倍，表明具有同源靶向能力的光热免疫联合制剂M/IR NPs可增强T淋巴细胞的免疫应答，使“冷”肿瘤对免疫治疗更加敏感。
细胞因子检测
CD8+T细胞可产生细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)，这是辅助T细胞1(Th1)型免疫应答有效抑制肿瘤生长和进展的关键指标。进一步采用流式细胞术和免疫荧光染色方法检测原发肿瘤中分泌的IFN-γ水平，发现M/IR NPs Laser(+)治疗组中IFN-γ分泌量最大，结果见图17。
由此可知，M/IR NPs诱导的免疫光热治疗结合同源靶向和NIR响应释放的优势，可使“冷”肿瘤对抗PD免疫治疗敏感度增加，增强全身免疫反应，有效抑制肿瘤生长和转移。
综上所述，通过采用本发明方法制备得到的NIR响应型仿生细胞膜纳米囊泡，其具备肿瘤高效同源靶向的功能，并且进一步通过阻断PD-1/PD-L1通路，长期逆转肿瘤免疫抑制状态，进而协同发挥抗肿瘤免疫应答，抑制原发肿瘤及转移灶的生长。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：
S1、收集肿瘤细胞，依次采用冻融法、梯度离心和重悬，获得肿瘤细胞膜溶液；
S2、采用溶剂扩散法，获得热敏脂质给药系统；具体方法为：
S21、将PD-1/PD-L1抑制剂、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物、热敏脂质DPPC以及胆固醇溶解于乙醇中，且在50～70℃的水浴中加热，得到乙醇相溶液；
其中，所述乙醇相溶液中PD-1/PD-L1抑制剂的质量百分比为5～20％、IR-780碘化物修饰脂质嫁接物的质量百分比为10～20％、热敏脂质DPPC的质量百分比为65～75％、胆固醇的质量百分比为3～6％；
S22、按照F68水溶液与乙醇相溶液的体积比为(8～12)∶1的比例量取F68水溶液，并在55～65℃条件下，将所述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，且在300～600rpm的转速下搅拌5～10min，再冷却至室温，制备得到热敏脂质给药系统；
此外，所述IR-780碘化物修饰脂质嫁接物是通过以下方法获得：
S211、称取5～15mg的IR-780碘化物和20～50mg的NH2-PEG-DSPE，溶于二氯甲烷溶液中，得到含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液；
S212、以三乙胺为缚酸剂，按三乙胺与IR-780碘化物的摩尔比为(1～3)∶1的比例称取三乙胺，并加至所述含有IR-780碘化物的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应8～30h；
S213、反应结束后，将反应溶液加入至8～12倍体积的无水乙醚中，3～5℃条件下过夜，而后在转速为2500～3500rpm的条件下离心4～6min，去除副产物，再将沉淀物干燥，得到IR-780碘化物修饰脂质嫁接物；
S3、将所述肿瘤细胞膜溶液与热敏脂质给药系统混合，并用脂质体挤出器挤出和过滤，得到NIR响应型仿生膜纳米囊泡；所述肿瘤细胞膜溶液与热敏脂质给药系统的质量比为1∶(1～5)；所述肿瘤细胞膜溶液的浓度为0.5～2mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡的构建方法，其特征在于，所述S3中，所述过滤时，是依次采用450～350nm、250～150nm、150～50nm的聚碳酸酯滤膜进行过滤。
3.根据权利要求2所述的一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡的构建方法，其特征在于，所述S21中，所述PD-1/PD-L1抑制剂为BMS-1、BMS-1001、BMS202、BMS-1166中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的一种NIR响应型仿生膜纳米囊泡的构建方法，其特征在于，所述S22中，所述F68水溶液的浓度为0.5～1.5mg/mL。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述的构建方法制得的NIR响应型仿生膜纳米囊泡。
6.一种如权利要求5所述的NIR响应型仿生膜纳米囊泡在制备肿瘤组织光热响应释放免疫检查点阻断剂中的应用。
7.一种如权利要求5所述的NIR响应型仿生膜纳米囊泡在制备抑制肿瘤生长与转移的光热免疫联合制剂中的应用。
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