CN113528662B

CN113528662B - 一种检测宫颈癌的circRNA标志物、特异性引物对、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113528662B
Application number: CN202110556560.5A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 王红媛; 雒海瑕; 李元幸; 赵卫红; 张利利; 梁婷婷; 郝敏
Original assignee: Second Hospital of Shanxi Medical University
Current assignee: Second Hospital of Shanxi Medical University
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113528662A

Abstract

本发明提供了一种检测宫颈癌的circRNA标志物，所述circRNA标志物的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；本发明还提供了扩增检测宫颈癌的circRNA标志物的特异性引物对、检测宫颈癌的试剂盒及试剂盒在制备预测和诊断宫颈癌的试剂盒中的应用；本发明具有检测时间短、成本低、灵敏度高的有益效果，适用于基因工程及临床医学领域。

Description

一种检测宫颈癌的circRNA标志物、特异性引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及临床医学的技术领域，具体涉及一种检测宫颈癌的circRNA标志物、特异性引物对、试剂盒及其应用。

背景技术

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类由线性RNA前体的5’端和3’端共价连接形成的具有闭合环状结构特征的RNA分子，其广泛存在于生物界中，在基因表达调控中扮演着重要角色。circRNA早在1976年，人们就发现类病毒是由环形的RNA分子构成，但一直被认为是转录后的剪接中间产物、副产物或偶然的剪接错误而未引起重视。随着新一代高通量测序技术的发展和相应生物信息学分析方法的完善，人们对circRNA的结构及功能产生了新的认识，发现许多基因转录本可以被非线性地反向剪切或通过基因重排而形成circRNA，且circRNA在所有剪切转录本中含量丰富、结构稳定、序列保守，并具有组织特异性和时空特异性表达的特征，由此可见circRNA具备作为恶性肿瘤等疾病生物标志物的潜质。目前研究得到的circRNA功能主要是微小RNA(microRNA，miRNA)的分子海绵，circRNA上存在大量miRNA结合位点，可以与miRNA相互结合，通过海绵吸附作用抑制miRNA的表达，进而调控细胞内信号传导通路以及目的基因的表达。

宫颈癌是威胁全球女性健康的第四大常见恶性肿瘤，2020年预计全球子宫颈癌有604,127例新发病例和341,831例死亡病例；在低、中等发展水平的国家，宫颈癌的新发病例数和死亡病例数均在女性恶性肿瘤居第二位。2014年我国宫颈癌新发病例约为102,000例，发病率为15.30/10万，死亡病例约为30,400例，死亡率为4.57/10万。山西省属我国宫颈癌高发区，据文献报道山西省2013年宫颈癌发病率为20.58/10万、死亡率为4.53/10万，高于全国此病发病率及死亡率平均水平近2倍，已经成为宫颈癌发病的重灾区，严重的威胁着妇女的健康和生命。所以寻找宫颈癌早期预警指标，降低宫颈癌的发病率和死亡率对于我国尤其是山西仍然是迫切需要解决的重大公共卫生问题。

众所周知，高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持续感染是宫颈癌发生发展的重要致病因素。然而，80%的女性一生中至少有过一次生殖道HPV感染史，但其中90%的HPV感染能在3年内自行消除，只有5%-10%的感染人群发生持续感染，最终有1%的持续感染者发展为宫颈癌，充分说明宫颈癌的发生是多因素综合作用的结果。而且，宫颈癌的发生发展是一个渐进过程，绝大多数宫颈癌都是从宫颈上皮内瘤变（CIN）发展而来，其中CIN1被认为是低级别病变（LSIL），CIN2和CIN3是高级别病变（HSIL），绝大多数LSIL会自然消退，而HSIL则很有可能会进展为宫颈癌。虽然目前随着HPV疫苗的研发，宫颈癌已实现了一定程度的一级预防，但由于较高的HPV感染率却伴随着相对较低的宫颈癌发病率，使宫颈癌的筛查及一级预防面临卫生经济学的沉重负担。

发明内容

针对相关技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于：提供一种灵敏度高的检测宫颈癌的circRNA标志物。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种检测宫颈癌的circRNA标志物，所述circRNA标志物的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明还提供了一种扩增所述的检测宫颈癌的circRNA标志物的特异性引物对，所述特异性引物对包括前引物和后引物；所述前引物的核苷酸序列如SEQID NO：2所示，所述后引物的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。

优选地，所述所述特异性引物对包括前引物和后引物；所述前引物的核苷酸序列如SEQID NO：4所示，所述后引物的核苷酸序列如SEQID NO：5所示。

优选地，所述试剂盒还包括：Trizol裂解液、氯仿；异丙醇；75％乙醇；DEPC水和qRT-PCR 反应液。

优选地，所述qRT-PCR 反应液包括：PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、SYBR、Taq DNA聚合酶、模板和ddH₂O。

本发明还提供了所述试剂盒在制备预测和诊断宫颈癌的试剂盒中的应用。

本发明的有益技术效果在于：

1、本发明提供的circRNA标志物能够在正常宫颈组织、HSIL组织及宫颈癌组织中差异表达，且circRNA标志物在宫颈癌组织和HSIL组织中的表达量较在正常宫颈组织中的表达量显著（p<0.05）。circRNA标志物在宫颈癌组织中的反应灵敏度高。

经ROC曲线分析发现，circRNA标志物能够以ROC曲线下面积0.8367(95％CI:0.5981~1.000,p＝0.0350)区分正常宫颈组织和宫颈癌组织，检测的敏感度为71.43％，特异度为85.71％；ROC曲线下面积0.8810(95％CI:0.6919~1.000,p＝0.0223)区分正常宫颈组织和HSIL，检测的敏感度为66.67％，特异度为85.71％；因此，本发明circRNA标志物可作为宫颈癌检测的生物学标志物，可用于辅助宫颈癌的临床诊断。

2、本发明中获得了我国高发区正常宫颈组织、HSIL和宫颈癌组织的circRNA表达谱，然后从circRNA表达谱中找出与宫颈癌发生发展相关的关键circRNA，发现高发区宫颈癌变潜在的circRNA标志物。

3、采用了qRT-PCR 反应液，在保证了检测灵敏度高的基础上，检测的时间较短、成本低，适于推广。

附图说明

图1为本发明实施例一提供的cirRNA的聚类分析结果图；

图2为本发明实施例一提供的cirRNA的主成分分析结果图；

图3为本发明实施例一提供的circRNA染色体分布图；

图4为qRT-PCR检测5种差异表达circRNA在正常宫颈、HSIL及宫颈癌组织中的差异表达结果柱形图（***代表p<0.05)；

图5为circRNA标志物在正常宫颈和宫颈癌中的ROC曲线分析结果图；

图6为circRNA标志物在正常宫颈和HSIL中的ROC曲线分析结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合具体实施例详细说明所述。实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold SpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一种检测宫颈癌的circRNA标志物，所述circRNA标志物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

实施例一：构建circRNA表达谱，筛选差异表达的circRNA

1、选取对照组和实验组

选取研究对象必须符合下列所有标准：①已婚至65岁女性；②本地区居住一年以上；③签署知情同意书。本研究为国家卫生公益性行业科研专项（201402010）基金项目；所有研究方案、知情同意书于2013年7月经山西医科大学第二医院伦理委员会批准；经中国临床试验中心注册（注册号：ChiCTR-ROC-15006479）。凡具备下列任一情况者不得入选：①妊娠期妇女。②有子宫切除术史者。③有宫颈及阴道病变治疗史者。④其他恶性肿瘤患者。⑤血液系统、消化系统疾病患者。

本研究经山西医科大学第二医院伦理委员会批准，获得患者及家属的知情同意，并签署书面知情同意书。

选择2020年1月~12月于山西医科大学第二医院就诊的妇科疾病患者，采用TCT检测宫颈脱落细胞，排除宫颈腺细胞异常者，对TCT结果为ASCUS及以上者进一步行阴道镜下活检和组织病理学检查。同时使用导流杂交芯片技术（HybriMax）进行HPV型别检测。将病理诊断证实为HSIL、宫颈癌（Ⅰa-Ⅱa）且单纯HPV16感染的患者作为实验组；同期选择病理诊断证实为正常宫颈组织且单纯HPV16感染的患者作为对照组。

对照组：选取正常宫颈组织7例；实验组：选取HSIL组织6例和宫颈癌组织7例。对对照组和实验组的组织块分别进行总RNA的提取、构建circRNA表达谱。

2、总RNA的提取和质检

（1）总RNA的提取：参照Invitrogen trizol试剂盒说明书进行操作

用眼科剪刀剪碎组织块，加少量液氮研磨，直至被磨为均匀白色粉末，得到组织粉末；

取50~100mg的组织粉末中加入1ml Trizol裂解液，充分匀浆约1~2min；

加入200μL的氯仿，快速震荡15s，室温下放置5min；

在温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心15min，此时离心管中的液体分为三层，RNA主要分布于上层的无色溶液（水相）中，转移上层无色液至新的1.5ml EP管(注：该步骤比较关键，为避免RNA被污染，千万不能吸到中间层)；

取与上层无色液等体积的异丙醇加入EP管，颠倒混匀，室温放置10min；

然后在温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心15min，弃上清液，收集管底沉淀；

洗涤：向管底沉淀中加入1ml 75％乙醇，温和震荡，悬浮沉淀；然后在温度为4℃、转速为7500rpm的条件下离心5min，弃上清液，重复一次洗涤后收集白色沉淀(注：离心后将乙醇尽可能吸干净，但不要吸到底部的白色沉淀)；

将白色沉淀在室温下晾干5~10min (注：RNA不要过于干燥，否则很难溶解)；然后将晾干后的白色沉淀用适量的纯净DEPC水溶解，待完全溶解，-80℃保存，即可得到总RNA备用。

（2）总RNA的质检

采用NanoDrop ND-1000分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，总RNA浓度即260nm~280nm处的光密度值(optical delnsity，OD)可自动生成，OD260/280在1.80~2.00之间说明总RNA纯度高，记录总RNA浓度。采用Agilent 2100生物分析仪系统RNA Nano 6000AssayKit检测总RNA样品的完整性。

3、构建circRNA表达谱

（1）反转录合成First Strand cDNA：

取总RNA 200~500ng，依据表1加入相应体积的Spike-in；

单个反应体系反转录反应混合物的配制方法如下：第一链酶混合物（FirstStrand Enzyme Mix）1μL，第一链缓冲混合物（First Strand Buffer Mix）4μL，共5μL，混匀并离心后冰浴。

将5μL 反转录反应混合物转移至含有总RNA的0.2ml EP管中，混匀并离心，在温度为42℃的条件下处理2h后冰浴，即可得到First Strand cDNA。

（2）合成Second Strand cDNA：

单个反应体系第二链反应混合物（Second Strand Master Mix）的配制方法如下：无核酸酶水（Nuclease-free Water）13μL，第二链酶混合物（Second Strand Enzyme Mix）2μL，第二链缓冲混合物（Second Strand Buffer Mix）5μL，共20μL，混匀并离心后冰浴。

向含有First Strand cDNA的样品管中加入Second Strand Master Mix 20μL混匀，在温度为16℃的条件下处理1h，然后在温度为65℃的条件下处理10min，冰浴，即可得到Second Strand cDNA。

（3）体外转录合成cRNA：

体外转录反应混合物的配制方法如下：依次加入Nuclease-free Water 4μL，Nuclease-free Water 20μL，T7 Enzyme Mix 6μL，共30μL，混匀并离心。

向含有Second Strand cDNA的样品管中加入体外转录反应混合物30μL，混匀并在温度为40℃的条件下放置8～14h，然后过柱纯化即可得到cRNA。

（4）cRNA反转录：

cRNA反转录反应混合物的配制方法为：依次加入4× CbcScriptⅡ Buffer 5μL，CbcScriptⅡ1.5μL，0.1M DTT 2μL，共8.5μL，混匀并离心。

取5μg cRNA，通过DEPC水调整体积至7.5μL，加入随机引物（Random Primer）4μL混匀，在温度为65℃的条件下反应5min，然后冰浴5min。加入cRNA反转录反应混合物 8.5μL混匀，在温度为25℃的条件下处理10min，然后在温度为37℃的条件下处理1.5h。加入Terminate Solution 5μL混匀，在温度为65℃的条件下处理10min，然后室温处理5min。加入1μL中和溶液（Neutralize Solution）混匀。按 Extract II试剂盒(MACHEREY-NAGEL德国)进行纯化，紫外分光光度计定量。即可得到cRNA反转录产物。

（5）荧光标记：

将制备的cRNA反转录产物浓缩至14μL，加入4μL Random Primer混匀并离心，在温度为95℃的条件下处理3min，然后冰浴5min。依次加入4×Klenow Buffer 5μL，Cy3-dCTP 1μL，Cy3-dCTP 1.2μL，吹打2~3次混匀，短暂离心后在温度为37℃的条件下反应1.5h，然后在温度为70℃的条件下处理5min。纯化并定量标记产物，带有荧光基团的DNA即可用作芯片杂交。

（6）芯片杂交：

按表2中的体积配制杂交体系(hybridization mixture)，在温度为95℃的条件下反应3min，然后冰浴2min。加入45μL(或105μL)的杂交液到杂交盖片上，放置circRNA芯片，旋紧杂交装置，置于杂交炉中过夜杂交约16h。

（7）芯片清洗及扫描：

芯片杂交结束后，用约42℃含0.2％的SDS，2×SSC的洗液I洗5min；再室温用0.2×SSC的洗液II洗5min。采用Agilent芯片扫描仪进行扫描，得到tiff格式的杂交图片。

（8）全样本预处理分析：

采用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件处理杂交图片得到.txt格式的原始数据文件，导入GeneSpring软件进行数据归一化和注释分析，Cluster 3.0软件进行聚类分析，treeview软件进行可视化图形输出。

（9）circRNA差异比较分析及差异circRNA的筛选：

显著差异circRNA筛选标准为差异倍数FC(abs)≥2.0，p<0.05。FC值越大说明两组间的差异越大；p越小说明差异基因的可靠性越高。

4、实验结果

1）cirRNA表达分析

图1为本发明实施例一提供的cirRNA聚类分析结果图，如图1所示，聚类分析显示正常宫颈组、HSIL组与宫颈癌组的3组样本间存在大量的circRNAs表达，符合预期分组情况。

图2为本发明实施例一提供的cirRNA相关性分析结果图，如图2所示，相关性分析显示本实验所选组织样本之间相关性高，具有表达相似性。

2）cirRNA差异表达分析

（1）筛选差异表达circRNA：以FC≥1.2，p<0.05为差异表达circRNA基因的筛选条件，结果显示，7例正常宫颈组织、6例HSIL组织及7例宫颈癌组织中circRNA的表达差异明显，共检出3172个差异表达circRNAs。

（2）可视化图形展示：图1分别以不同图形展示了对照组、HSIL组及宫颈癌组circRNA表达的显著差异情况。

图3为本发明实施例一提供的circRNA染色体分布图，如图3所示，差异表达的circRNA在人体染色体的分布情况显示：大多分布在chr1、chr2、chr3、chr5、chr7和chr17，以1号染色体上的差异表达circRNA最多，很少分布在chr21、chr22或chrX。

实施例二：从筛选出的5种差异表达的circRNA中找出关键circRNA

选取5例正常宫颈组织、5例HSIL组织和5例宫颈癌组织。

根据STEM分析、PPI网络和ceRNA网络分析，从实施例1中筛选出5种circRNA，分别为：hsa_circ_0016456、hsa_circ_0008617、hsa_circ_0001955、hsa_circ_0003954和hsa_circ_0076726，详细生物学信息见表3。采用qRT-PCR实验分别对5例正常宫颈组织、5例HSIL组织和5例宫颈癌组织中的5种circRNAs的表达均进行验证，从中找出关键circRNA。

本发明中获得了我国高发区正常宫颈组织、HSIL和宫颈癌组织的circRNA表达谱，然后从circRNA表达谱中找出与宫颈癌发生发展相关的关键circRNA，发现高发区宫颈癌变潜在的circRNA标志物。

实施例三：qRT-PCR实验验证5例正常宫颈组织、5例HSIL组织和5例宫颈癌组织中5种circRNAs的表达

1、试剂盒的使用方法：

（1）总RNA的提取

总RNA提取的具体操作与实施例1中提取总RNA的方法相同，在此不再赘述。提取出的总RNA随即进行反转录。

（2）总RNA反转录

配制Mix I的方法为：依次加入Primer(10μM)1.0μL，dNTP Mix(10mM)1.0μL，DEPC-treated water 10μL，共12μL。

把配制的Mix I 在温度为65℃的条件下温浴5min，冰浴1min后依次加入5×First-Strand Buffer 4.0μL，0.1M dTT 2.0μL，RNaseout 40U/μL 1.0μL，SuperScrip IIIRT(200U/μL)1.0μL，配制为Mix II，共20μL。把配制的Mix II 置于温度为25℃的条件下处理5min，然后依次置于温度为42℃的条件下处理60min，温度为70℃的条件下处理15min，使酶失活，立即放置到冰上待用或保存到-20℃的冰箱。

（3）设计特异性引物对

其中对照组A的基因为GAPDH；实验组B的基因为实施例二中筛选出的5中差异表达的circRNA，如表4所示。

具体地，所述特异性引物特异性地扩增所述circRNA标志物的核苷酸序列。

进一步地，所述特异性引物对包括前引物和后引物；所述前引物的核苷酸序列如SEQID NO：2所示，所述后引物的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。

进一步地，所述特异性引物对包括前引物和后引物；所述前引物的核苷酸序列如SEQID NO：4所示，所述后引物的核苷酸序列如SEQID NO：5所示。

（4）qRT-PCR扩增circRNA标志物

①配制qRT-PCR反应液：qRT-PCR反应液的主要成分如表5所示。

②qRT-PCR反应液的反应条件：qRT-PCR反应液的反应条件如表6所示。

③计算circRNA相对表达量：所有qRT-PCR均重复3次，观察扩增曲线，分析熔解曲线是否为单峰，确定引物是否特异。提取样本的Ct值，使用2-ΔΔCt公式计算circRNA在各个组织样本中的表达水平。

采用了qRT-PCR 反应液，在保证了检测灵敏度高的基础上，检测的时间较短、成本低，适于推广。

图4为qRT-PCR检测5种差异表达circRNA在正常宫颈、HSIL及宫颈癌组织中的差异表达结果柱形图（***代表p<0.05)。如图4所示，图中正常宫颈组织（NC），宫颈癌组织（SCC）。对比正常宫颈组织，hsa_circ_0016456和hsa_circ_0001955的表达在HSIL和宫颈癌组织中显著上调 (p<0.05) ，而hsa_circ_0003954、hsa_circ_0008617和hsa_circ_0076726的变化趋势不明显(p＞0.05)。5种差异表达circRNA在正常宫颈、HSIL及宫颈癌组织中的差异表达结果如表7所示。

本发明提供的circRNA标志物能够在正常宫颈组织、HSIL组织及宫颈癌组织中差异表达，且circRNA标志物在宫颈癌组织和HSIL组织中的表达量较在正常宫颈组织中的表达量显著（p<0.05）。circRNA标志物在宫颈癌组织中的反应灵敏度高。

图5为circRNA标志物在正常宫颈和宫颈癌中的ROC曲线分析结果图，如图5所示，circRNA标志物能够以ROC曲线下面积0.8367(95％CI: 0.5981~1.000,p＝0.0350)区分正常宫颈组织和宫颈癌组织，检测的敏感度为71.43％，特异度为85.71％；图6为circRNA标志物在正常宫颈和HSIL中的ROC曲线分析结果图，如图6所示，ROC曲线下面积0.8810(95％CI:0.6919~1.000,p＝0.0223)区分正常宫颈组织和HSIL，检测的敏感度为66.67％，特异度为85.71％；因此，本发明circRNA标志物可作为宫颈癌检测的生物学标志物，可用于辅助宫颈癌的临床诊断。

本发明中，除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸（往往称为“靶多核苷酸”）结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。本发明中，术语“引物”是指能够互补地与模板结合并使逆转录酶或DNA聚合酶能够启动模板复制的具有自由3’羟基的核酸序列。引物是具有与特定基因核酸序列互补的序列的核苷酸。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

另外，上述实施例中的“第一”、“第二”等是用于区分各实施例，而并不代表各实施例的优劣。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 山西医科大学第二医院

<120> 一种检测宫颈癌的circRNA标志物、特异性引物对、试剂盒及其应用

<130> 001

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 815

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaaggtct cccacaggtg tattactttg gaccatgtgg gaaatataat gccatggtgc 60

tggagctcct tggccctagc ttggaggact tgtttgacct ctgtgaccga acatttactt 120

tgaagacggt gttaatgata gccatccagc tgctttctcg aatggaatac gtgcactcaa 180

agaacctcat ttaccgagat gtcaagccag agaacttcct gattggtcga caaggcaata 240

agaaagagca tgttatacac attatagact ttggactggc caaggaatac attgaccccg 300

aaaccaaaaa acacatacct tatagggaac acaaaagttt aactggaact gcaagatata 360

tgtctatcaa cacgcatctt ggcaaagagc aaagccggag agatgatttg gaagccctag 420

gccatatgtt catgtatttc cttcgaggca gcctcccctg gcaaggactc aaggctgaca 480

cattaaaaga gagatatcaa aaaattggtg acaccaaaag gaatactccc attgaagctc 540

tctgtgagaa ctttccagag gagatggcaa cctaccttcg atatgtcagg cgactggact 600

tctttgaaaa acctgattat gagtatttac ggaccctctt cacagacctc tttgaaaaga 660

aaggctacac ctttgactat gcctatgatt gggttgggag acctattcct actccagtag 720

ggtcagttca cgtagattct ggtgcatctg caataactcg agaaagccac acacataggg 780

atcggccatc acaacagcag cctcttcgaa atcag 815

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgaaatcag gtgaaggtct cc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctccagcac catggcatta 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgagtttga gccagaggga c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaggcgtag ttccaactca t 21

Claims

1.包含扩增检测宫颈癌的circRNA标志物的特异性引物对的试剂盒在制备预测和诊断宫颈癌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述扩增检测宫颈癌的circRNA标志物的特异性引物对包括前引物和后引物；

所述前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述后引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

2.根据权利要求1所述的包含扩增检测宫颈癌的circRNA标志物的特异性引物对的试剂盒在制备预测和诊断宫颈癌的试剂盒中的应用，其特征在于：

所述包含扩增检测宫颈癌的circRNA标志物的特异性引物对的试剂盒还包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇、75％乙醇、DEPC水和qRT-PCR反应液。

3.根据权利要求2所述的包含扩增检测宫颈癌的circRNA标志物的特异性引物对的试剂盒在制备预测和诊断宫颈癌的试剂盒中的应用，其特征在于：

所述qRT-PCR反应液包括：PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、SYBR、Taq DNA聚合酶、模板和ddH₂O。