CN113528622A

CN113528622A - 一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸

Info

Publication number: CN113528622A
Application number: CN202110881572.5A
Authority: CN
Inventors: 胡善文; 张晓荣; 叶为民
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-08-02
Also published as: CN113528622B

Abstract

本发明公开了一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，包括核酸检测试纸，所述核酸检测试纸包括野生检测区和至少一个突变检测区，所述野生检测区设有野生检测探针，所述野生检测探针和突变检测探针均设置荧光团和猝灭团；所述野生检测探针、突变检测探针分别能够识别野生型幽门螺杆菌核酸、突变型幽门螺杆菌核酸并进行链取代反应，且识别野生型幽门螺杆菌核酸后能够使荧光团和猝灭团分开，从而发出荧光；所述消耗探针能够识别野生型幽门螺杆菌核酸，并与野生型幽门螺杆菌核酸杂交。本发明提供的可视化试纸能够对幽门螺杆菌耐药突变体对应的野生型和点基因突变型序列进行高特异性检测。

Description

一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，涉及可视化检测、幽门螺杆菌耐药突变体检测及核酸检测，具体涉及一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性菌，是最常见的细菌病原体之一，主要生存于人体胃幽门部位，是胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等多种疾病的潜在诱因，67％-80％的胃溃疡和95％的十二指肠溃疡被认为是由幽门螺杆菌引起的。近年，幽门螺杆菌感染被发现和胃癌有密切的相关性，世界卫生组织将幽门螺杆菌定义为1类胃癌致病因子。在我国，根据对自然人群感染幽门螺杆菌的流行病学进行调查，显示全国范围内H.pylori感染率为56.22％，且大多数在儿童期即被感染，形式极为严峻。

临床上一般采用抗生素治疗H.pylori，包括甲硝唑类、大环内酯类、质子泵抑制剂类等抗生素，但H.pylori耐药性问题越来越严重。基因点突变导致敏感菌转变为耐药菌，这一现象在儿童群体中更普遍，使克拉霉素、阿莫西林等常用抗生素失去治疗效果。近年来，幽门螺杆菌耐药率逐步上涨，双重乃至多重抗生素耐药率也在不断提高，包含质子泵抑制剂、阿莫西林、克拉霉素/甲硝唑的三联疗法作为临床一线治疗方案的根除率逐年降低，药物根除H.pylori变得越来越困难。缺乏对耐药突变体的全面调查和个体化实时监控成为H.pylori防治工作的一大瓶颈。

检测幽门螺杆菌对防治肠胃疾病至关重要，据发明人研究了解，现有检测方法主要包括胃镜法、碳13尿素呼气法、血清法、粪便检查和尿液检查等。从粪便、唾液等样本中对H.pylori核酸进行检测也可以实现H.pylori定量分析，具有特异性强、检测速度快等优点。目前已经有电化学、荧光或者免标记方法用于H.pylori核酸的定量检测，也取得了较好的效果。然而，经发明人研究发现，临床检验H.pylori面临着诸多难题，首先，现有技术对于幽门螺杆菌突变型的区分能力不足，耐药H.pylori往往是点基因突变，突变碱基在核酸链中的占比很少，而突变型的占比也是随着病程和治疗情况变化的，所以这需要高特异性和高稳定性的检验方法；第二，临床所获的样本中幽门螺杆菌核酸均已经过了高倍稀释，只有高灵敏度的检测方法才可以通过核酸分析来检测感染情况；第三，幽门螺杆菌的感染具有普遍性和长期性，无论是对其进行控制、治疗还是预后跟踪，都需要长期、频繁、实时的检验，给病人带来了很大的负担，便捷、家用和廉价的检测方法对其防治工作有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，本发明提供的试纸能够对幽门螺杆菌耐药突变体对应的野生型和点基因突变型序列进行高特异性检测。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，包括核酸检测试纸，所述核酸检测试纸包括野生检测区和至少一个突变检测区，所述野生检测区设有野生检测探针，每个突变检测区均设置突变检测探针和消耗探针，所述野生检测探针、突变检测探针和消耗探针均为杂交的DNA，所述野生检测探针和突变检测探针均设置荧光团和猝灭团，猝灭团设置为靠近荧光团且能够使荧光团猝灭；

所述野生检测探针能够识别野生型幽门螺杆菌核酸并进行链取代反应，且识别野生型幽门螺杆菌核酸后能够使荧光团和猝灭团分开，从而发出荧光；

所述突变检测探针能够识别突变型幽门螺杆菌核酸并进行链取代反应，且识别突变型幽门螺杆菌核酸后能够使荧光团和猝灭团分开，从而发出荧光；

所述消耗探针能够识别野生型幽门螺杆菌核酸，并与野生型幽门螺杆菌核酸杂交。

本发明提供的试纸基于荧光信号的核酸分析，由于野生型幽门螺杆菌核酸的大量混杂，影响突变型存在幽门螺杆菌核酸的检测，因而本发明在可视化试纸设置了野生检测探针、突变检测探针和消耗探针，并且将野生检测探针设置于野生检测区，实现野生型幽门螺杆菌核酸的检测，将突变检测探针和消耗探针设置在突变检测区，突变检测区内利用消耗探针与野生型幽门螺杆菌核酸杂交，实现对野生型幽门螺杆菌核酸的消耗，大大降低了野生型幽门螺杆菌核酸的量，同时利用突变检测探针对突变型幽门螺杆菌核酸进行检测，大大降低了野生型幽门螺杆菌核酸对突变型幽门螺杆菌核酸的影响，实现在野生型大量混杂的情况下实现对突变体的有效检测。

其中，野生检测探针、突变检测探针可以为单链DNA形成发夹结构探针，可以为双链DNA形成的普通双链结构探针，也可以为多链DNA形成的多臂结构(例如三链DNA形成的Y型探针，四链DNA形成的十字交叉型探针等)。然而，本发明经过进一步研究发现，单碱基突变引起的热力学差异较小，而普通DNA结构的链取代反应是由热力学控制的，普通DNA结构的单碱基错配的反应速率差异较低(仅有10％左右)，因而采用普通探针结构不容易对单碱基突变进行区分。

为了解决该问题，本发明中，野生检测探针、突变检测探针设置为十字交叉型探针，所述十字交叉型探针由四条单链DNA两两部分互补杂交形成。该十字交叉型探针是一种超稳态核酸结构，这种结构一旦形成，能够大大降低链取代反应的反应率及相应能力。

由于十字交叉型探针不易进行链取代反应，为了使目标核酸(野生型幽门螺杆菌核酸、突变型幽门螺杆菌核酸)能够更好的进行链取代反应，本发明中十字交叉型探针设置粘性末端，所述粘性末端能够与野生型幽门螺杆菌核酸进行完全互补，或能够与突变性幽门螺杆菌核酸突变碱基所在位置的序列进行完全互补。能够通过这种粘性末端的完全互补配对引发反应，从而将十字交叉型探针打破，从而产生信号。

另一方面，一种幽门螺杆菌的检测试剂盒，包括上述可视化试纸和缓冲液。通过缓冲液能够更方便处理待测样品。

第三方面，一种上述可视化试纸在区分幽门螺杆菌突变体的应用。

第四方面，一种区分幽门螺杆菌突变体的方法，提供上述可视化试纸，将待测样品滴加至所述可视化试纸，使待测样品进入野生检测区和突变检测区进行反应，反应后对可视化试纸进行荧光检测。

由于本发明提供的可视化试纸可以区分幽门螺杆菌的突变核酸，根据幽门螺杆菌核酸的突变类型找出突变幽门螺杆菌的治疗药物，因而第五方面，一种上述可视化试纸在筛选幽门螺杆菌治疗药物中的应用。

本发明的有益效果为：

1.本发明提供的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸通过设置消耗探针对野生型幽门螺杆菌核酸进行消耗，利用野生检测探针、突变检测探针分别对野生型幽门螺杆菌核酸及突变型幽门螺杆菌核酸进行检测，实现对耐药突变体的区分。

2.本发明提供的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸中，野生检测探针、突变检测探针均为十字交叉型探针，对单碱基错配产生一千倍以上的反应速率差异，从而能够对耐药突变体有强大的区分能力，单个碱基突变即可以引起信号值千倍以上的变化，因而具备了区分野生型和突变型幽门螺杆菌核酸的能力。

3.本发明提供的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，通过设置不同检测区，通过不同检测区的荧光信号区分不同的幽门螺杆菌核酸，实现对不同幽门螺杆菌核酸的可视化检测。

4.本发明可以实现对多个单碱基突变体的有效检测，可以在野生型大量混杂的情况下实现对突变体的有效检测。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例的探针对单碱基突变序列识别原理示意图。

图2为本发明实施例的使用两种探针完成对野生型非突变序列干扰作用的消除的同时对突变序列进行识别检测的原理示意图。

图3为本发明实施例的凝胶电泳表征加样表与结果表征图。

图4(a)荧光信号强度随体系氯化钠浓度变化曲线；(b)加样后荧光信号强度随时间变化曲线；(c)干扰链引起的响应随浓度变化曲线；(d)消除干扰对信号的改变，黑线为探针对目标链和干扰链混合样的响应，红线为探针在消除策略存在的情况下对目标链和干扰链混合样的响应；(e)荧光光谱随目标分子浓度变化曲线；(f)响应工作曲线。

图5为本发明实施例可视化试纸对不同浓度目标分子的检测结果图。

图6为本发明实施例可视化试纸对混合样品的检测情况图，(a)为可视化试纸的结构示意图，(b)为实际图片，(c)为(b)扣除环境背景光后的条带提取图，(d)为检测后的荧光柱状图，Sample A为野生型和突变体SNV-2的混合样，Sample B为野生型和突变体SNV-1的混合样。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于现有技术对于幽门螺杆菌突变型的区分能力不足，本发明提出了一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，包括核酸检测试纸，所述核酸检测试纸包括野生检测区和至少一个突变检测区，所述野生检测区设有野生检测探针，每个突变检测区均设置突变检测探针和消耗探针，所述野生检测探针、突变检测探针和消耗探针均为杂交的DNA，所述野生检测探针和突变检测探针均设置荧光团和猝灭团，猝灭团设置为靠近荧光团且能够使荧光团猝灭；

本发明在可视化试纸设置了野生检测探针、突变检测探针和消耗探针，并且将野生检测探针设置于野生检测区，实现野生型幽门螺杆菌核酸的检测，将突变检测探针和消耗探针设置在突变检测区，突变检测区内利用消耗探针与野生型幽门螺杆菌核酸杂交，实现对野生型幽门螺杆菌核酸的消耗，大大降低了野生型幽门螺杆菌核酸的量，同时利用突变检测探针对突变型幽门螺杆菌核酸进行检测，大大降低了野生型幽门螺杆菌核酸对突变型幽门螺杆菌核酸的影响，实现在野生型大量混杂的情况下实现对突变体的有效检测。

为了解决难以对单碱基突变体进行有效检测的问题，该实施方式的一些实施例中，野生检测探针、突变检测探针设置为十字交叉型探针，所述十字交叉型探针由四条单链DNA两两部分互补杂交形成。即第一条单链DNA的一部分与第二条单链DNA的一部分杂交，第二条单链DNA的另一部分与第三条单链DNA的一部分杂交，第三条单链DNA的另一部分与第四条单链DNA的一部分杂交，第四条单链DNA的另一部分与第一条单链DNA的另一部分杂交。该十字交叉型探针是一种超稳态核酸结构，该结构能够大大降低链取代反应的反应率及相应能力。十字交叉型探针对单碱基错配产生一千倍以上的反应速率差异，而普通碱基互补配对反应引发的链置换反应。

为了解决十字交叉型探针不易进行链取代反应的问题，在一种或多种实施例中，十字交叉型探针设置粘性末端，所述粘性末端能够与野生型幽门螺杆菌核酸进行完全互补，或能够与突变性幽门螺杆菌核酸突变碱基所在位置的序列进行完全互补。能够通过这种粘性末端的完全互补配对引发反应，从而将十字交叉型探针打破，从而产生荧光信号。

在一种或多种实施例中，所述粘性末端为5～8个碱基序列。研究表明，5～8个碱基序列能够更好得通过粘性末端完全互补配对引发反应打破。

十字交叉型探针的制备过程为：使用Rightup、Rightdown、Leftup、Leftdown四条DNA链等比例混合，以0.02M Hepes缓冲液(含有0.1M氯化钠)配制成终浓度为1μM的探针溶液。放入恒温加热器中进行退火。从95℃至60℃，以手动梯度降温的形式，间隔5℃，恒温持续10分钟，当60℃恒温10分钟之后，自然降至室温。

该实施方式的一些实施例中，所述消耗探针不含荧光团和猝灭团。

在一种或多种实施例中，所述消耗探针的结构与序列与野生检测探针相同。

该实施方式的一些实施例中，核酸检测试纸为醋酸纤维膜。扩散系数远低于普通滤纸(预滴涂后不扩散)，保证荧光信号的检测。

该实施方式的一些实施例中，包括质控区，所述质控区内设有野生检测探针和突变检测探针。

该实施方式的一些实施例中，包括校准区，所述校准区内设有含有荧光团的DNA。

该实施方式的一些实施例中，以待测样品滴加位置为起始点，按照待测样品扩散的方向依次设置野生检测区、至少一个突变检测区质控区和校准区。

本发明的另一种实施方式，提供了一种幽门螺杆菌的检测试剂盒，包括上述可视化试纸和缓冲液。

本发明的第三种实施方式，提供了一种上述可视化试纸在区分幽门螺杆菌突变体的应用。

本发明的第四种实施方式，提供了一种区分幽门螺杆菌突变体的方法，提供上述可视化试纸，将待测样品滴加至所述可视化试纸，使待测样品进入野生检测区和突变检测区进行反应，反应后对可视化试纸进行荧光检测。

本发明的第五种实施方式，提供了一种上述可视化试纸在筛选幽门螺杆菌治疗药物中的应用。由于本发明提供的可视化试纸可以区分幽门螺杆菌的突变核酸，因而可以根据幽门螺杆菌核酸的突变类型找出突变幽门螺杆菌的治疗药物。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中采用的核苷酸序列如下：

野生型(C-WT,Clarithromycin Wild-type):

AATGCGTCAGTCGCAAGATGAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGATGTTTCTGTTAGCTAAC，见SEQ ID NO.1。

突变型1(SNV-1,Clarithromycin A2143G):

AATGCGTCAGTCGCAAGATGAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGATGTTTCTGTTAGCTAAC，见SEQ ID NO.2。

突变型2(SNV-2,Clarithromycin A2142G):

AATGCGTCAGTCGCAAGATGAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGATGTTTCTGTTAGCTAAC，见SEQ ID NO.3。

其中，下划线为突变碱基的位置。

Right down:

CTTTCCGTCTTGCCGCGGGTAGGAGGTCGTCTACTATCCACGATTTAAC，见SEQ ID NO.4。

Left down:

GTTAAATCGTGGATAGTAGACTTCGCAC，见SEQ ID NO.5。

Labeled Left down:

GTTAAATCGTGGATAGTAGACTTCGCAC-FAM，见SEQ ID NO.6。

Left up:

GTGCGAACAGGTACATTTGCTCGTCCTT，见SEQ ID NO.7。

Labeled Left up:

Quench-GTGCGAACAGGTACATTTGCTCGTCCTT，见SEQ ID NO.8。

Right up:

AAGGCGAGCAAATGTACCTGGACCTCCTACCCGCGGCAAGAC，见SEQ ID NO.9。

RD-1:

CTCTCCGTCTTGCCGCGGGTAGGAGGTCGTCTACTATCCACGATTTAAC，见SEQ ID NO.10。

RD-2:

CTTCCCGTCTTGCCGCGGGTAGGAGGTCGTCTACTATCCACGATTTAAC，见SEQ ID NO.11。

检测探针-1由right-down、right-up、labeled left-down和labeled left-up杂交形成。

检测探针-2由RD-1、right-up、labeled left-down和labeled left-up杂交形成。

检测探针-3由RD-2、right-up、labeled left-down和labeled left-up杂交形成。

实施例

探针的制备：

使用Rightup、Rightdown、Leftup、Leftdown四条DNA链等比例混合，以0.02MHepes缓冲液(含有0.1M氯化钠)配制成终浓度为1μM的探针溶液。放入恒温加热器中进行退火。从95℃至60℃，以手动梯度降温的形式，间隔5℃，恒温持续10分钟，当60℃恒温10分钟之后，自然降至室温。

制备的荧光探针分别为检测探针-1、检测探针-2和检测探针-3，对应检测的目标分子分别为野生型、SNV-1和SNV-2。

制备的消耗探针，用于消耗野生型DNA。消耗探针与检测探针-1相同，不同之处在于没有连接荧光团和猝灭团。

目标分子检测：

取100μL探针溶液，扫描荧光光谱，随后加入10μL目标分子样品，再次扫描荧光光谱。设置目标分子样品的终浓度为0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM和1000nM，扫描信号后获得标准工作曲线。以此工作曲线可以检测特定浓度范围内的未知浓度目标分子样品。

纸上可视化检测：

将荧光修饰核酸链预滴涂于参比线区域，将猝灭状态的探针预滴涂于质控线区域，将对应探针预滴涂于检测区。

在使用纯水浸润后，将目标分子溶液滴加于试纸末端，从另一端以吸水纸引流，使样品流过检测区，在样品到达质控区之前，在激发灯照射下拍照测试荧光强度。

对于荧光探针对单碱基突变序列识别原理，如图1所示，荧光探针由Rightup、Rightdown、Leftup、Leftdown四条DNA链杂交形成十字交叉型探针，这种十字交叉型探针是一种超稳态核酸结构，该结构能够大大降低链取代反应的反应率及相应能力。所以本实施例在十字交叉型探针的末端有修饰荧光和猝灭基团，另一端预留六个碱基的粘性末端，对应于突变碱基序列，当完全互补时，启动反应，打破探针，产生信号，而当有任何一个碱基不互补时，反应无法启动，就不会产生信号。十字交叉型探针对单碱基错配产生一千倍以上的反应速率差异，而普通碱基互补配对反应引发的链置换反应，当单碱基错配时反应速率差异仅有10％左右。

对野生型非突变序列干扰作用的消除的同时对突变序列进行识别检测的原理，如图2所示。设置两种探针，一种为检测探针，为图1所示核酸结构，末端有修饰荧光和猝灭基团，另一端有启动反应的粘性末端，探针打破后会产生荧光信号，粘性末端的对应关系是，检测探针-1：野生型；检测探针-2：SNV-1；检测探针-3：SNV-2，也就是每一种核酸的特异性探针。第二种为消耗探针，命名为depleting，其结构是图2左下角所示核酸结构，末端没有荧光基团，仅有粘性末端，序列对应于野生型，其功能是消耗，当消耗探针存在时，由于它与野生型是对应关系，更容易反应，所以野生型会倾向于和消耗探针结合而不是去干扰检测探针探针，所以这一过程被称为消耗过程，其作用是消耗干扰链。当检测野生型序列时，突变体是干扰，但突变体存在无限多种，无法特定消除，当检测突变体时，野生型序列是最大干扰源，只要消除野生型序列就会改善检测效果。如果消耗探针结构不存在，等浓度情况下会产生千分之一左右的干扰，但实际样品中野生型浓度可能远远大于突变体(例如突变率千分之一意味着每个突变体周围有1000倍野生型存在)，检测到的信号里可能干扰链产生的信号占比很高，会产生假信号，当野生型消除后，产生的信号才是来自于突变体的真实信号。这也是常规探针无法实现幽门螺杆菌突变体区分的原因。

凝胶电泳表征的加样表与结果，如图3所示。如图3a所示，泳道1-5代表目标(SNV-1)和检测探针中的每条单链，在每个泳道中可以分别观察到单条带。在泳道6中，四个单链被添加在一起。出现了一条迁移率较低的明显带，表明形成了交叉结构的检测探针。在泳道7中，目标分子与检测探针发生反应，产生了两条新条带，表明反应按照原始设计发生。生物传感反应的表征见图3b。在泳道1中，将1μM SNV与1μM检测探针混合在一起，代表检测探针的条带变暗，而代表产物的两个条带加强。然后用相同浓度的野生型核酸在泳道2中与检测探针反应，可以看到明显不同的结果。检测探针的条带强度基本不变，但反应产物所代表的条带也有一定强度，表明少数检测探针被干扰链非特异性的打开。在泳道3和泳道4中，验证了消耗野生型探针的消耗探针的策略。由于消耗反应与检测反应获得的产物碱基数一致，为表示区别在凝胶电泳实验中消耗探针仅使用了带有黏性末端的双链结构，其序列为

C_s:TGTTAATA CCTCCTACCCGCGGCAAGAC，见SEQ ID NO.12；

P_s:CCTCTC GTCTTGCCGCGGGTAGGAGGTATTAACA，见SEQ ID NO.13。

泳道5结果表明消耗探针不会干扰对目标链的响应。在泳道6中，使用检测探针和消耗探针检测干扰链，可以看到干扰链打开的检测探针明显减弱，这果表明消耗反应可以有效地降低干扰链的干扰。在泳道7中，我们使用检测探针和消耗探针检测目标链SNV-1,产物条带清晰可见。这些结果证实，本实施例提供的生物传感策略可以成功地检测SNV-1目标链，并消除野生型序列的干扰。

图4a为使用1μM探针对100nM目标链进行响应，改变溶液中氯化钠的浓度，不同氯化钠浓度下的信号情况(响应信号减去初始信号)，由于低浓度氯化钠会使检测探针结构不稳定(猝灭不完全，初始信号值高)、高浓度氯化钠会使检测探针结构超稳定(响应能力下降，目标链打不开，响应后信号值低)，因此只有在一定氯化钠浓度(0.02～0.2M，尤其浓度为0.1M)区间内才能获得最佳信号(初始信号值低、响应信号值高)。

图4b为使用1μM探针对100nM目标链进行响应的时间曲线图，从加入目标链为起始，显示反应进展情况，5分钟内有明显信号，10分钟内趋于饱和，表明本反应非常迅速。

图4c为检测探针-2探针对c-wt(干扰链)的响应情况，1μM探针检测不同浓度c-wt的信号值。

图4d为消除干扰曲线，混合样品为1μM野生型+30nM突变体1，上方曲线为使用检测探针-2进行检测的时间曲线，下方曲线为使用检测探针-2+消耗探针进行检测的时间曲线，两者差值表明高浓度野生型也会产生信号值，而消耗探针可以有效消除这个干扰信号。

图4e使用检测探针-2+消耗探针对1μM野生型干扰存在情况下不同浓度突变体的响应情况-光谱图，图4f使用检测探针-2+消耗探针对1μM野生型干扰存在情况下不同浓度突变体的响应情况-工作曲线图。随着突变体浓度的升高，荧光强度增强，表明在野生型干扰的存在下，能够对突变体进行定量检测。

图5为检测不同浓度的目标链的检测结果，左上图为手机拍摄的实际照片，左下图为图像处理软件扣除环境背景光之后的条带提取图，右图为对左下图上条带处的RGB色度分析数据(像素强度)。右图色度分析结果表明纸上荧光条带的强弱与目标链浓度有显著相关性。

图6表明检测SNV-1时SNV-1条带有明显的荧光信号而SNV-2条带没有信号，检测SNV-2时SNV-2条带有明显的荧光信号而SNV-1条带没有信号，证明试纸有区分能力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建医科大学

<120> 一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatgcgtcag tcgcaagatg aagcgttgaa ttgaagcccg agtaaacggc ggccgtaact 60

ataacggtcc taaggtagcg aaattccttg tcggttaaat accgacctgc atgaatggcg 120

taacgagatg ggagctgtct caaccagaga ttcagtgaaa ttgtagtgga ggtgaaaatt 180

cctcctaccc gcggcaagac ggaaagaccc cgtggacctt tactacaact tagcactgct 240

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<210> 2

<211> 345

<212> DNA

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ataacggtcc taaggtagcg aaattccttg tcggttaaat accgacctgc atgaatggcg 120

taacgagatg ggagctgtct caaccagaga ttcagtgaaa ttgtagtgga ggtgaaaatt 180

cctcctaccc gcggcaagac ggagagaccc cgtggacctt tactacaact tagcactgct 240

aacgggaata tcatgcgcag gataggtggg aggctttgaa gtaagggctt tggctcttat 300

ggagccatcc ttgagatacc acccttgatg tttctgttag ctaac 345

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aatgcgtcag tcgcaagatg aagcgttgaa ttgaagcccg agtaaacggc ggccgtaact 60

ataacggtcc taaggtagcg aaattccttg tcggttaaat accgacctgc atgaatggcg 120

taacgagatg ggagctgtct caaccagaga ttcagtgaaa ttgtagtgga ggtgaaaatt 180

cctcctaccc gcggcaagac gggaagaccc cgtggacctt tactacaact tagcactgct 240

aacgggaata tcatgcgcag gataggtggg aggctttgaa gtaagggctt tggctcttat 300

ggagccatcc ttgagatacc acccttgatg tttctgttag ctaac 345

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttccgtct tgccgcgggt aggaggtcgt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttaaatcgt ggatagtaga cttcgcac 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttaaatcgt ggatagtaga cttcgcac 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgcgaacag gtacatttgc tcgtcctt 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtgcgaacag gtacatttgc tcgtcctt 28

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaggcgagca aatgtacctg gacctcctac ccgcggcaag ac 42

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctctccgtct tgccgcgggt aggaggtcgt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttcccgtct tgccgcgggt aggaggtcgt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgttaatacc tcctacccgc ggcaagac 28

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctctcgtct tgccgcgggt aggaggtatt aaca 34

Claims

1.一种可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，其特征是，包括核酸检测试纸，所述核酸检测试纸包括野生检测区和至少一个突变检测区，所述野生检测区设有野生检测探针，每个突变检测区均设置突变检测探针和消耗探针，所述野生检测探针、突变检测探针和消耗探针均为杂交的DNA，所述野生检测探针和突变检测探针均设置荧光团和猝灭团，猝灭团设置为靠近荧光团且能够使荧光团猝灭；

2.如权利要求1所述的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，其特征是，野生检测探针、突变检测探针设置为十字交叉型探针，所述十字交叉型探针由四条单链DNA两两部分互补杂交形成；

优选地，十字交叉型探针设置粘性末端，所述粘性末端能够与野生型幽门螺杆菌核酸进行完全互补，或能够与突变性幽门螺杆菌核酸突变碱基所在位置的序列进行完全互补；

优选地，所述粘性末端为5～8个碱基序列。

3.如权利要求1所述的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，其特征是，所述消耗探针不含荧光团和猝灭团；

优选地，所述消耗探针的结构与序列与野生检测探针相同。

4.如权利要求1所述的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，其特征是，核酸检测试纸为醋酸纤维膜。

5.如权利要求1所述的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，其特征是，包括质控区，所述质控区内设有野生检测探针和突变检测探针；

或，包括校准区，所述校准区内设有含有荧光团的DNA。

6.如权利要求1所述的可区分幽门螺杆菌耐药突变体的可视化试纸，其特征是，以待测样品滴加位置为起始点，按照待测样品扩散的方向依次设置野生检测区、至少一个突变检测区质控区和校准区。

7.一种幽门螺杆菌的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1～6任一所述的可视化试纸和缓冲液。

8.一种权利要求1～6任一所述的可视化试纸在区分幽门螺杆菌突变体的应用。

9.一种区分幽门螺杆菌突变体的方法，其特征是，提供权利要求1～6任一所述的可视化试纸，将待测样品滴加至所述可视化试纸，使待测样品进入野生检测区和突变检测区进行反应，反应后对可视化试纸进行荧光检测。

10.一种权利要求1～6任一所述的幽门螺杆菌的可视化试纸在筛选幽门螺杆菌治疗药物中的应用。