CN113514488A - 一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法 - Google Patents

一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了微流控体外诊断技术领域内的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，包括以下步骤：将待测靶标的捕获抗体与表面羧基修饰的磁珠偶联；将待测靶标的检测抗体、过氧化氢酶和官能团活化的聚苯乙烯微球三者偶联；将偶联有捕获抗体的磁珠、偶联有过氧化氢酶与检测抗体的聚苯乙烯微球和待测靶标三者通过惯性蛇形微流控芯片混合；免疫反应后，磁分离洗涤，加入过氧化氢溶液与免疫复合物发生酶催化反应；再将反应液中剩余的过氧化氢与银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒混合，得到银‑磁纳米颗粒探针，以上反应同样在微流控芯片中进行；测量银‑磁纳米颗粒探针的横向弛豫时间变化值；使用本发明实现全血中痕量靶标的快速定量检测。

Description

一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测 方法
技术领域
本发明属于微流控体外诊断技术领域，特别涉及一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法。
背景技术
免疫分析一直是诊断疾病、环境监测和药物评估中不可代替的手段。对生物靶标进行免疫检测的手段主要有胶体金免疫层析、化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附测定法，这些传统检测方法都很成熟，但也存在各自的缺陷。胶体金免疫层析法是将胶体金为标记物，对待测靶标进行检测的一种免疫层析技术，其步骤简便，试剂用量少，不需要辅助仪器，但存在灵敏度低、假阳率高和定量难等问题；化学发光免疫分析法利用分子吸收化学反应释放的能量后以光的形式辐射，根据信号强度确定待测靶标的能量，这种方法虽然灵敏度较高，但背景值高和稳定性差，样品的发光时间很短；酶联免疫吸附测定法通过检测待测靶标等吸光度来达到检测目的，具有较好的经济效益和稳定性等特点，但操作繁琐，且需多次洗涤，导致费时费力。更重要的是，以上免疫检测技术都是通过光信号读出，难以在临床上对全血样本检测。
随着微流控技术的飞速发展，芯片中的试剂存储，蛋白质吸附，样品分离和微流体流动特性以及方向控制的研究都很成熟，它已成为免疫检测和分析的重要工具。它可以将泵、阀和电子器件整合为一体，能解决上面检测中繁琐的处理程序，实现低成本、高通量、快速检测样本中的靶标。
基于核磁共振的磁弛豫时间传感器作为一种新型的检测传感技术，得到了广泛的关注。该方法通过磁性纳米颗粒分布的改变，使得水质子的横向弛豫时间(T2)发生改变，其样本前处理简单，背景信号低，样本前处理简单，能够在全血中直接检测目标物。但现有技术中，基于磁弛豫时间传感器的传感方法依赖于抗体-抗原的免疫识别来改变磁性纳米颗粒的聚集状态，进而影响T2信号值，此方法机理不足以检测痕量靶标，而且易受非特异性聚集的干扰，稳定性较差。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中的不足之处，一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，解决了现有技术中无法检测痕量靶标的技术难题，本发明通过酶介导的催化反应来调控磁性纳米颗粒的聚集状态发生变化，实现T2值的信号放大，可对痕量靶标进行检测，灵敏度高。
本发明的目的是这样实现的：一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，包括以下步骤：
(1)将待测靶标的捕获抗体与表面羧基修饰的磁珠反应，得到偶联有捕获抗体的磁珠；
(2)将待测靶标的检测抗体、过氧化氢酶和官能团活化的聚苯乙烯微球反应，得到检测抗体和酶修饰的聚苯乙烯微球偶联物；
(3)将氨水溶液滴加到硝酸银溶液中至澄清，加入氢氧化钾溶液，再滴加氨水溶液至澄清，然后加水溶液定容，最后加入磁性纳米颗，得到银氨溶液(Ag(NH3)2OH)稀释的磁性纳米颗粒；
(4)将偶联有捕获抗体的磁珠、偶联有过氧化氢酶与检测抗体的聚苯乙烯微球和待测靶标三者通过惯性蛇形微流控芯片混合，形成三明治免疫复合物；免疫反应一定时间后，检测芯片内的磁铁将富集磁性的免疫复合物，磁分离洗涤，分离掉不带磁性的颗粒；
(5)将过氧化氢溶液与带有酶的免疫复合物发生酶催化反应，待反应一定时间后，将反应液中剩余的过氧化氢(H2O2)与银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒混合，得到自主装的银-磁纳米颗粒探针；
(6)取检测芯片中反应池内的混合物溶液，通过核磁共振波谱仪测量以获得横向弛豫时间变化值ΔT2。
本发明中，使用带负电荷的磁性纳米颗粒与Ag(NH3)2OH溶液中带正电的银离子发生静电作用，银离子吸附在磁纳米颗粒表面，改变溶液中银离子的局部浓度，从而促进后续还原反应的进行，在基于酶调控的催化反应后，与免疫复合物反应后剩余的H2O2，跟银离子发生还原反应，形成银纳米颗粒，许多磁性纳米颗粒吸附在银纳米颗粒的表面上，迅速形成形状规则的银-磁纳米颗粒探针，银离子和磁性纳米颗粒的双重聚集使豫驰时间信号变化显著，实现对靶标的高灵敏度检测；可快速检测全血样本中的靶标。
作为本发明的进一步改进，所述羧基磁珠的粒径为250nm。
作为本发明的进一步改进，所述磁性纳米颗粒为氨基配位的磁性纳米颗粒或羧基配位的磁性纳米颗粒。
作为本发明的进一步改进，所述磁性纳米颗粒的粒径为30nm。
作为本发明的进一步改进，所述酶为过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)。
作为本发明的进一步改进，所述待测靶标为肿瘤标志物。
为了进一步实现混合物溶液的检测，所述检测芯片包括通道层芯片本体和基底层芯片本体，所述基底层芯片本体紧密贴合在通道层芯片本体下侧，所述通道层芯片本体上开有至少三个进液口一，所述通道层芯片本体朝下的一端设有微流体通道、至少一个蛇形通道、反应池和废液池，所述微流体通道的一端与三个进液口一相通，所述最前面的蛇形通道一端和微流体通道的另一端相接，最后面的蛇形通道末端的通道芯片本体上设有收集池，所述通道层芯片本体上开有上阀孔，所述反应池远离蛇形通道的一端与上阀孔连通，所述收集池经上阀孔可与反应池连通，收集池经上阀孔还可与废液池连通，通道层芯片本体上还开有进液口二，所述进液口二经上阀孔可与收集池连通，所述基底层芯片本体朝下的一端设有用于放置磁铁且与收集池所在位置对应的安置槽；此设计中，收集池覆盖安置槽，即安置槽小于收集池；检测时，。
为了进一步实现收集池、反应池、废液池和进液口二之间的不同通道的连通，所述检测芯片还包括压力阀体，所述基底层芯片本体上开有与上阀孔位置对应的下阀孔，所述压力阀体依次经上阀孔和下阀孔分别与通道层芯片本体和基底层芯片本体连接，所述压力阀体上开有从上往下依次设置的流通通道一、流通通道二和流通通道三，所述收集池可经流通通道三与废液池连通，所述收集池可经流通通道二与进液口二连通，所述收集池可经流通通道一与反应池连通；此设计中，压力阀体依次经上阀孔和下阀孔压装在通道层芯片本体和基底层芯片本体上，压力阀体在具有弹性的PDMS芯片中可升降，通过按压压力阀体，实现不同通道的连通。
为了进一步提高溶液混合的高效性，所述蛇形通道的截面积呈骤增骤减交替变化，相邻两个蛇形通道之间经弯曲的连接通道连接在一起；此设计中，蛇形通道内收窄部分的截距为0.12mm，宽敞部分的截距为0.6mm，使流体在蛇形通道中产生不均匀的流速和压力，实现高效混合。
附图说明
图1为本发明基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法的工作原理图，图中，A为标记捕获抗体的磁珠，修饰过氧化氢酶和检测抗体的聚苯乙烯微球；B为过氧化氢被过氧化氢酶水解后与磁性纳米颗粒生成T2信号探针；C为利用酶调控纳米颗粒自组装的磁弛豫传感检测方法检测靶标的磁信号比较。
图2为本磁弛豫传感器检测时H2O2浓度与ΔT2值的关系图，图中，A为加样顺序对ΔT2信号的影响；B为MNPs30的浓度对ΔT2信号的影响；C为Ag+浓度对ΔT2信号的影响；D为反应时间对ΔT2信号的影响。
图3为本磁弛豫传感器与传统光信号检测H2O2灵敏度的比较图，A为使用本磁弛豫传感器检测时H2O2浓度与ΔT2值的关系图，B为使用本磁弛豫传感器检测时H2O2浓度与OD410nm值的关系图，C为使用传统的光信号检测时H2O2浓度与ΔT2值的关系图，D为传统的光信号检测时H2O2浓度与OD410nm值的关系图。
图4为本发明中检测芯片的立体图。
图5为本发明中检测芯片的爆炸图。
图6为本发明中通道层芯片本体的结构图。
图7为本发明中若干蛇形通道连接在一起的结构图。
图8为本发明中压力阀体的结构图。
图9为本发明中检测AFP的优化条件的结果图，A为不同Ab/CAT的摩尔比下AFP浓度与ΔT2值的曲线图，B为不同H2O2浓度下AFP浓度与ΔT2值的曲线图。
图10为本发明与碱性磷酸酶ELISA试剂盒检测AFP的比较图，A、C分别为使用本发明检测时AFP浓度与ΔT2值的关系、线性检测范围图；B、D分别为使用碱性磷酸酶ELISA试剂盒检测时AFP浓度与OD405nm、线性检测范围图。
图11为本发明中检测AFP的特异性时不同干扰物与ΔT2值的关系图。
其中，1通道层芯片本体，2注射孔一，3基底层芯片本体，4进液口二，5压力阀体，501流通通道一，502流通通道二，503流通通道三，6注射孔二，7进液口一，8磁铁，9安置槽，10下阀孔，11上阀孔，12收集池，13废液池，14微流体通道，15蛇形通道，16连接通道，17反应池。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行进一步说明。
在阐述本发明的具体实施方案之前，定义本文使用的术语如下：
术语“PDMS”是指：聚二甲基硅氧烷；
术语“MBs-Ab1”是指：有捕获抗体的磁珠；
术语“CAT-PS-Ab2”是指：检测抗体和过氧化氢酶修饰的聚苯乙烯微球；
术语“MBs-Ab1-Ag-CAT-PS-Ab2”是指：免疫复合物；
术语“MBs”是指：羧基磁珠；
术语“PS”是指：聚苯乙烯微球；
术语“CAT”是指：过氧化氢酶；
术语“Ab1”是指：捕获抗体；
术语“Ab2”是指：检测抗体；术语“BSA”是指：牛血清白蛋白；
术语“PBST”是指：含有吐温的磷酸盐缓冲液；
术语“PBS”是指：磷酸盐缓冲液；
术语“MNPs30”是指：磁性纳米颗粒；
术语“Ag NPs”是指：银纳米颗粒；
术语“AFP”是指：甲胎蛋白；
术语“IgG”是指：免疫球蛋白。
如图1～6所示的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，包括以下步骤：
(1)将待测靶标的捕获抗体与表面羧基修饰的磁珠反应，得到偶联有捕获抗体的磁珠，捕获抗体和磁珠的质量比为5～100；
(2)将待测靶标的检测抗体、过氧化氢酶和官能团活化的聚苯乙烯微球反应，得到检测抗体和酶修饰的聚苯乙烯微球偶联物，过氧化氢酶和检测抗体的摩尔比为5～50，过氧化氢酶和检测抗体的质量和为1mg；
(3)将氨水溶液滴加到硝酸银溶液中至澄清，加入氢氧化钾溶液，再滴加氨水溶液至澄清，然后加水溶液定容，最后加入磁性纳米颗粒，得到银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒；
(4)将偶联有捕获抗体的磁珠、偶联有过氧化氢酶与检测抗体的聚苯乙烯微球和待测靶标三者通过惯性蛇形微流控芯片混合，形成三明治免疫复合物；免疫反应一定时间后，检测芯片内的磁铁8将富集磁性的免疫复合物，磁分离洗涤，分离掉不带磁性的颗粒；
(5)将过氧化氢溶液与带有酶的免疫复合物发生酶催化反应，待反应一定时间后，将反应液中剩余的过氧化氢与银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒混合，得到自主装的银-磁纳米颗粒探针；
(6)取检测芯片中反应池17内的混合物溶液，通过核磁共振波谱仪测量以获得横向弛豫时间变化值ΔT2；
其中，羧基磁珠的粒径为250nm，磁纳米颗粒为氨基配位的磁纳米颗粒或羧基配位的磁纳米颗粒；磁纳米颗粒的粒径为30nm；酶为过氧化氢酶，待测靶标为癌症标志物，例如甲胎蛋白。
本发明中，使用带负电荷的磁性纳米颗粒与Ag(NH3)2OH溶液中带正电的银离子发生静电作用，银离子吸附在磁纳米颗粒表面，改变溶液中银离子的局部浓度，从而促进后续还原反应的进行，在基于酶调控的催化反应后，与免疫复合物反应后剩余的H2O2，跟银离子发生还原反应，形成银纳米颗粒，许多磁性纳米颗粒吸附在银纳米颗粒的表面上，迅速形成形状规则的银-磁纳米颗粒探针，银离子和磁性纳米颗粒的双重聚集使豫驰时间信号变化显著，实现对靶标的高灵敏度检测；可快速检测全血样本中的靶标。
实施例1
Ag(NH3)2OH溶液、MBs-Ab1偶联物和CAT-PS-Ab2偶联物的制备方法，
(1)Ag(NH3)2OH溶液的制备，具体为：
将200μL的NH3·H2O(15M)滴加到6mL的AgNO3(0.1M)中，同时搅拌混合溶液直至棕色沉淀溶解。然后加入3mL KOH溶液(0.8M)，并重新形成棕色沉淀。为了溶解沉淀物，再次添加200μL的NH3·H2O。最后，用离子水稀释至25mL，并在4℃的黑暗环境中存储；
(2)MBs-Ab1偶联物的制备，具体为：
首先，将5mg悬浮的MBs转移到1mL的MES缓冲液(80nM，pH＝6.0)中，之后，将80μL的EDC(10mg/mL)和40μL的NHS(10mg/mL)添加到MBs缓冲液中，并将混合物在室温下活化0.5小时，MBs用1mL的PBS缓冲液在磁性分离器洗涤3次；然后将MBs转移到0.5mL的PBS溶液中，将0.5mg的Ab1添加到上述溶液中，并在室温下以300rpm搅拌1.5小时；之后，添加0.5mL的3％BSA溶液以封闭MBs表面0.5小时；最后将MBs-Ab1偶联物与游离的Ab1磁分离，并使用1mL的PBST缓冲液(含0.5％Tween-20)将偶联物洗涤3次，得到的MBs-Ab1偶联物再重悬于0.5mL含0.1％BSA的PBS溶液中，并保存在4℃以便进一步使用；
(3)CAT-PS-Ab2偶联物的制备，具体为：
首先，将10mg悬浮的PS微球转移到0.9mL去离子水中，用干净的超滤管以8500rpm离心10分钟；将收集的PS微球重新悬浮在0.5mL的去离子水中；然后向其加入120μL EDC(10mg/mL)和60μL NHS(10mg/mL)，反应混合物在室温下以300rpm搅拌30分钟，并用1mL PBS溶液(pH＝7.4，0.01M)稀释；之后，将不同量的Ab2和CAT添加到微粒悬浮液中，将上述混合物溶液在室温下缓慢搅拌2小时，并要求倒出在200μL含5％BSA溶液轻轻摇动30分钟，得到的CAT-PS-Ab2偶联物以6000rpm离心10分钟，然后将其重新悬浮于1mL PBS溶液中。获得的混合物离心相同的时间并再次离心，上述步骤需要重复三遍；最后将充分洗涤干净呢的CAT-PS-Ab2偶联物重悬于1mL PBS(pH＝7.4，0.1％BSA)中，并保存在4℃以便进一步使用。
实施例2
本实施例优化了MNPs30浓度、Ag+浓度、反应时间和试剂添加顺序的选择来检测H2O2浓度与ΔT2值的关系，进一步得到本发明检测靶标的优化参数，具体方法如下：
(1)比较两个加样序列的结果：1)MNPs30、银氨溶液、H2O2，2)银氨溶液、H2O2、MNPs30(图2A)，显示最后加入MNPs30测出的ΔT2信号没有第一步加入MNPs30的强烈；原因是H2O2在添加MNPs30之前先将银氨溶液中的Ag+还原为Ag NPs，为了简化芯片设计和操作，我们先添加H2O2，然后添加不发生反应的银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒混合溶液；
(2)向不同浓度的H2O2溶液(0.1mM、1mM、10mM)分别添加含有0.05μg/mL、0.5μg/mL和10μg/mL MNPs30的银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒混合溶液，利用核磁共振波谱仪检测它们的ΔT2(图2B)，结果显示，0.5μg/mL处的磁信号变化率最大，而反应中含有过量的H2O2或MNPs30时，变化率不明显；
(3)将0.5μg/mL MNPs30、1mM H2O2溶液与含有不同浓度Ag+(0mM、1.2mM、2.4mM、4.8mM)的银氨溶液混合(图2C)，经氧化还原反应后，测得的在2.4mM处ΔT2出现最高峰；
(4)将0.5μg/mL MNPs30、1mM H2O2溶液和含2.4mM Ag+的银氨溶液混合均匀，测出不同时间下反应溶液的ΔT2值(图4D)，当时间为90秒时，信号值达到最高点，将90秒选为最佳反应时间；
其中，ΔT2为弛豫时间变化。
实施例3
用本发明对ΔT2值检测与传统的光信号检测的灵敏度对比：
通过实施例2中的优选结果，将0.5μg/mL MNPs30、2.4mM Ag+的银氨溶液和90秒的反应时间作为最优参数，来比较本磁弛豫传感器的ΔT2检测与传统光信号检测的灵敏度，具体方法如下：
将浓度从0.01μM到20mM的H2O2溶液，分别与实施例2中优化的试剂反应，用NMR分析仪读出溶液的ΔT2值，然后以H2O2浓度为横坐标，以ΔT2值为纵坐标，画出H2O2浓度与ΔT2值的关系(图3A)，用多功能酶标仪读出溶液的OD410nm值，以H2O2浓度为横坐标，以OD410nm值为纵坐标，画出H2O2浓度与OD410nm值的关系(图3B)；根据公式3S/M标定曲线计算两种方法的LOD值，其中S是空白样品的标准偏差值，M是标准曲线在低浓度范围内的斜率，其中，LOD为检测线，OD410nm为410nm波长的吸光度。
结果表明基于磁颗粒变化的磁弛豫传感器检测H2O2线性范围在1.6μM-1mM，LOD为0.53μM(图3C)；传统的光信号检测H2O2线性范围40μM-5mM，LOD为5.2μM(图3D)；因此，与传统的ELISA方法相比，基于磁颗粒变化的磁弛豫传感器检测H2O2的灵敏度提高了约10倍。
实施例4
如图4～8所示的检测芯片，检测芯片包括通道层芯片本体1和基底层芯片本体3，基底层芯片本体3紧密贴合在通道层芯片本体1下侧，通道层芯片本体1上开有至少三个进液口一7，通道层芯片本体1朝下的一端设有微流体通道14、至少一个蛇形通道15、反应池17和废液池13，微流体通道14的一端与三个进液口一7相通，最前面的蛇形通道15一端和微流体通道14的另一端相接，最后面的蛇形通道15末端的通道芯片本体上设有收集池12，通道层芯片本体1上开有上阀孔11，反应池17远离蛇形通道15的一端与上阀孔11连通，收集池12经上阀孔11可与反应池17连通，收集池12经上阀孔11还可与废液池13连通，通道层芯片本体1上还开有进液口二4，进液口二4经上阀孔11可与收集池12连通，基底层芯片本体3朝下的一端设有用于放置磁铁8且与收集池12所在位置对应的安置槽9，反应池17所在位置的通道层芯片本体1上开有注射孔一2，注射孔一2与反应池17连通，收集池12所在位置的通道层芯片本体1上开有注射孔二6，注射孔二6与收集池12连通。
为了进一步实现收集池12、反应池17、废液池13和进液口二4之间的不同通道的连通，检测芯片还包括压力阀体5，基底层芯片本体3上开有与上阀孔11位置对应的下阀孔10，压力阀体5依次经上阀孔11和下阀孔10分别与通道层芯片本体1和基底层芯片本体3连接，压力阀体5上开有从上往下依次设置的流通通道一501、流通通道二502和流通通道三503，收集池12可经流通通道三503与废液池13连通，收集池12可经流通通道二502与进液口二4连通，收集池12可经流通通道一501与反应池17连通，蛇形通道15的截面积呈骤增骤减交替变化，相邻两个蛇形通道15之间经弯曲的连接通道16连接在一起；蛇形通道15内收窄部分的截距为0.12mm，宽敞部分的截距为0.6mm，使流体在蛇形通道15中产生不均匀的流速和压力，实现高效混合。
装配上述检测芯片时，在200W功率和1.5L/min氧流量条件下用等离子清洗机轰击除去灰尘后的PDMS通道层芯片本体1和PDMS基底层芯片本体3表面60秒，断开表面的硅氧键；然后将上阀孔11与下阀孔10对齐，用手挤压出双PDMS层中的气泡，使其紧密键合；压力阀插入双PDMS层的阀孔中，将磁铁8安装在安置槽9中，完成芯片的组装，初始状态下，收集池12刚好经流通通道三503与废液池13连通。
实施例5
对Ab2/CAT偶联率进行研究，具体为，
(1)在实施例1的CAT-PS-Ab2偶联物制备中，分别取摩尔比为1：5、1：10和1：50的Ab2/CAT来制备CAT-PS-Ab2偶联物；
(2)用100μL MBs-Ab1(0.2mg/mL)，100μL CAT-PS-Ab2(0.1mg/mL)和1mL不同浓度的AFP(0.1ng/mL-1000ng/mL)混合在单独的1.5mL离心管中，轻轻摇动20分钟；
(3)磁分离后，用PBS溶液(0.01M，pH＝7.4)洗涤免疫复合物3次，用25μL H2O2(1mM)重悬，将混合物在37℃下孵育15分钟；
(4)磁分离后，然后取上清液加入到160μL银氨溶液(2.4mM)和20μL MNPs30-COOH(0.5μg/mL)的银氨-磁颗粒混合溶液里，并通过NMR分析仪获得ΔT2信号值；
结果如图9A所示，当Ab2与CAT的摩尔比为1：10时，测出的ΔT2值最大，因此将其选作最终比例，该比率在PS微球表面产生足量的Ab2以识别用于免疫磁富集的AFP，并含有大量CAT来放大检测信号。
对H2O2浓度对检测性能的影响进行研究，具体为，
用100μL MBs-Ab1(0.2mg/mL)，100μL优化好的CAT-PS-Ab2(0.1mg/mL)和1mL不同浓度的AFP(0.1ng/mL-1000ng/mL)混合在单独的1.5mL离心管中，轻轻摇动20分钟；磁分离后，用PBS溶液(0.01M，pH＝7.4)洗涤免疫复合物3次，然后用不同浓度的25μL H2O2(125μM、250μM、500μM)重悬，将混合物在37℃下孵育15分钟；磁分离后，取上清液加入到160μL银氨溶液(2.4mM)和20μL MNPs30(0.5μg/mL)的银氨-磁颗粒混合溶液里，并通过NMR分析仪获得ΔT2信号值。
结果如图9B所示，当H2O2浓度为125μM和250μM时，两者测出的ΔT2值不明显；选择125μM浓度的H2O2作为优化参数。
一种基于酶诱导磁纳米颗粒磁弛豫信号的检测方法，包括以下步骤：
(1)往反应池17内预注射160μL Ag(NH)2OH(2.4mM)和20μLMNPs30(0.5μg/mL)的银氨-磁颗粒混合溶液；
(2)使用分体式注射泵在三个进液口一7同时分别以2μL/s、10μL/s和2μL/s的速度注射20μL MBs-Ab1(0.1mg/mL)、100μL不同浓度的AFP(1280ng/mL，640ng/mL，320ng/mL，160ng/mL，80ng/mL，40ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，0.625ng/mL或0ng/mL)和20μL CAT-PS-Ab2，三种溶液在蛇形通道15中高效混合，安装在基底层芯片本体3上的磁铁8将带有磁性的PS-AFP-MBs免疫复合物和多余的MBs-Ab1捕获在收集池12中，其余没有磁性的物质经过压力阀体5的流通通道三503进入废液池13内；
(3)停留免疫反应15分钟，使用分体式注射泵分别在三个进液口一7注射PBS溶液(0.01M,PH＝7.4)，洗涤通道中残留的颗粒，洗涤液进入废液池13中；
(4)按压压力阀体5，当进液口二4经流通通道二502与收集池12刚好连通时，停止按压压力阀体5，使用分体式注射泵在进液口二4以2μL/s的速度注射25μL H2O2(250μM)；溶液从进液口二4经流通通道二502进入收集池12，在收集池12中与含有CAT的PS-AFP-MBs免疫复合物反应5分钟；
(5)按压压力阀体5，当收集池12经流通通道一501与反应池17刚好连通时，停止按压压力阀体5，使用分体式注射泵经进液口一7往微流体通道14内注入有压力的气体，将反应结束的H2O2经流通通道一501进入反应池17中，反应时间为5分钟；
(6)经注射孔一2抽取20μL反应池17中的混合物溶液，并通过NMR分析仪测量以获得ΔT2值，并且对不同浓度的AFP进行三次检测，取平均值，然后以AFP浓度为横坐标，以ΔT2值为纵坐标，画出AFP浓度与ΔT2值的关系和线性检测范围；
作为对比例，使用基于传统的碱性磷酸酶ELISA试剂盒，检测同样浓度的AFP，以AFP浓度为横坐标，以OD405nm值为纵坐标，画出AFP浓度与OD405nm值的关系和线性检测范围，OD405nm为405nm波长的吸光度。
如图10，结果表明本发明的检测方法和芯片检测处的ΔT2值与AFP浓度的线性范围在2.5-160ng/mL，LOD为0.56ng/mL；基于传统的光信号检测AFP线性范围在20-320ng/mL，LOD为7ng/mL，与紫外线吸收检测相比，基于酶诱导磁纳米颗粒磁弛豫信号检测AFP灵敏度提高了约15倍。
本发明中，利用酶介导的催化反应，通过H2O2还原银离子，使MNPs30聚集程度发生变化，实现磁信号的高效转化和多级放大，有效提高了靶标检测的灵敏度，联合检测芯片对靶标进行检测，集成度高，操作方便，实现高通量、快速、便捷检测；可快速检测样本中的靶标。
实施例6
对基于酶诱导磁纳米颗粒磁弛豫信号的检测方法进行特异性研究，具体为：
选择癌胚抗原(CEA)和哺乳类动物抗体(IgG)作为干扰物，
将100μL的IgG(5μg/mL)溶液，用分体式注射泵射入进液口一7中，其余操作步骤与实施例5相同，测出ΔT2值；
将100μL的CEA(100ng/mL)溶液，用分体式注射泵射入进液口一7中，其余操作步骤与实施例5相同，测出ΔT2值；
将100μL的AFP(160ng/mL)和IgG(5μg/mL)的混合溶液，用分体式注射泵射入进液口一7中，其余操作步骤与实施例5相同，测出ΔT2值；
将100μL的AFP(160ng/mL)和CEA(100ng/mL)的混合溶液，用分体式注射泵射入进液口一7中，其余操作步骤与实施例5相同，测出ΔT2值。
结果如图11所示，存在干扰物时，测出的ΔT2值的相对误差分别为1.6％(CEA作为干扰物)和5.4％(IgG作为干扰物)，而且，来自纯CEA或IgG溶液远低于纯AFP溶液测出的ΔT2值，表面使用本发明可为实际应用中检测复杂样品中的AFP提供了先决条件。
本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将待测靶标的捕获抗体与表面羧基修饰的磁珠反应，得到偶联有捕获抗体的磁珠；
（2）将待测靶标的检测抗体、过氧化氢酶和官能团活化的聚苯乙烯微球反应，得到检测抗体和酶修饰的聚苯乙烯微球偶联物；
（3）将氨水溶液滴加到硝酸银溶液中至澄清，加入氢氧化钾溶液，再滴加氨水溶液至澄清，然后加水溶液定容，最后加入磁性纳米颗，得到银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒；
（4）将偶联有捕获抗体的磁珠、偶联有过氧化氢酶与检测抗体的聚苯乙烯微球和待测靶标三者通过惯性蛇形微流控芯片混合，形成三明治免疫复合物；免疫反应一定时间后，检测芯片内的磁铁将富集磁性的免疫复合物，磁分离洗涤，分离掉不带磁性的颗粒；
（5）将过氧化氢溶液与带有酶的免疫复合物发生酶催化反应，待反应一定时间后，将反应液中剩余的过氧化氢与银氨溶液稀释的磁性纳米颗粒混合，得到自主装的银-磁纳米颗粒探针；
（6）取检测芯片中反应池内的混合物溶液，通过核磁共振波谱仪测量以获得横向弛豫时间变化值ΔT2。
2. 根据权利要求1所述的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，所述羧基表面修饰的磁珠的粒径为250 nm。
3.根据权利要求1所述的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为氨基配位的磁性纳米颗粒或羧基配位的磁性纳米颗粒。
4. 根据权利要求3所述的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的粒径为30 nm。
5.根据权利要求4所述的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，所述待测靶标为肿瘤标志物。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，所述检测芯片包括通道层芯片本体和基底层芯片本体，所述基底层芯片本体紧密贴合在通道层芯片本体下侧，所述通道层芯片本体上开有至少三个进液口一，所述通道层芯片本体朝下的一端设有微流体通道、至少一个蛇形通道、反应池和废液池，所述微流体通道的一端与三个进液口一相通，所述最前面的蛇形通道一端和微流体通道的另一端相接，最后面的蛇形通道末端的通道芯片本体上设有收集池，所述通道层芯片本体上开有上阀孔，所述反应池远离蛇形通道的一端与上阀孔连通，所述收集池经上阀孔可与反应池连通，收集池经上阀孔还可与废液池连通，通道层芯片本体上还开有进液口二，所述进液口二经上阀孔可与收集池连通，所述基底层芯片本体朝下的一端设有用于放置磁铁且与收集池所在位置对应的安置槽。
7.根据权利要求6述的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，所述检测芯片还包括压力阀体，所述基底层芯片本体上开有与上阀孔位置对应的下阀孔，所述压力阀体依次经上阀孔和下阀孔分别与通道层芯片本体和基底层芯片本体连接，所述压力阀体上开有从上往下依次设置的流通通道一、流通通道二和流通通道三，所述收集池可经流通通道三与废液池连通，所述收集池可经流通通道二与进液口二连通，所述收集池可经流通通道一与反应池连通。
8.根据权利要求6所述的一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法，其特征在于，所述蛇形通道的截面积呈骤增骤减交替变化，相邻两个蛇形通道之间经弯曲的连接通道连接在一起。
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