CN113514415A - 一种基于红外光谱成像的液态样品的分子间相互作用表征方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于红外光谱成像的液态样品的表征方法。本发明利用薄膜截获待检测液体，干燥后使用显微红外光谱仪获取载体上待测样品的面红外光谱信息；通过对含多组分的待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解、结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布、扣除基线后对光谱进行优化，迭代上述步骤直至光谱稳定，最终得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差；经过可视化处理，研究相互作用是否发生以及相互作用的发生机理。本发明解决了传统红外光谱受水信号干扰以及常规红外光谱无法区分不同类型的相互作用的问题，实现了具有一定普适性的包括但不限于水环境中各类化合物相互作用信息的提取。
Description
技术领域
本发明属于红外光谱成像分析计算技术领域，涉及一种基于红外光谱成像的液态样品的表征方法，尤其涉及一种基于红外光谱成像的液态样品的分子间相互作用表征方法。
背景技术
生物大分子是构成生命的基础物质，在生物体水溶液环境中包括蛋白、多糖、核酸及脂质等生物大分子间发生的特异性或非特异性、可逆或不可逆相互作用是所有生物生命活动的基础。因此，对生物大分子相互作用的研究和分析在化学和生物学领域中都有着重要意义。在此前相关研究中，各种表征手段如荧光共定位、荧光能量共振转移(FRET)及表面等离子体共振(SPR)等被广泛使用，但这些表征方法对应的研究过程在原理、设计和操作上都较为复杂，仪器成本也相对较高。而傅立叶变换红光谱具有高检测灵敏度、高测量精度、高分辨率、测量速度快、散光低以及波段宽等特点。随着计算机技术的不断进步，傅立叶变换红光谱也在不断发展。该方法现已广泛地应用于有机化学、金属有机，无机化学、催化、石油化工、材料科学、生物、医药和环境等领域。
傅里叶变换红外光谱，简写为FTIR，是通过测量干涉图和对干涉图进行傅里叶变化的方法来测定红外光谱，是一种将傅立叶变换的数学处理，用计算机技术与红外光谱相结合的分析鉴定方法。主要由光学探测部分和计算机部分组成。当样品放在干涉仪光路中，由于吸收了某些频率的能量，使所得的干涉图强度曲线相应地产生一些变化，通过数学的傅立叶变换技术，可将干涉图上每个频率转变为相应的光强，而得到整个红外光谱图，根据光谱图的不同特征，可检定未知物的功能团、测定化学结构、观察化学反应历程、区别同分异构体、分析物质的纯度等。
虽然利用傅里叶变换红外光谱可以简便地表征、获取生物大分子各个基团的振动信息，但传统红外光谱会受水的干扰，同时单一的红外光谱无法区分不同类型的相互作用。
因此，如何找到一种更为适宜的方式，克服傅里叶变换红外光谱存在的上述缺陷，更好拓宽傅里叶变换红外光谱使用范围的宽度和深度，已成为本领域诸多研究人员广为关注的焦点之一。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于红外光谱成像的液态样品的表征方法，特别是一种基于红外光谱成像的液态样品的分子间相互作用表征方法。本发明提供的表征方法，基于荧光共定位分析结合空间分布信息分析化合物性质的基础，结合红外光谱获得和分析更加全面的优点，间接解决了红外透射模式下液态样品难以表征的问题。
本发明提供了一种基于红外光谱成像的液态样品的表征方法，包括以下步骤：
1)采用薄膜负载待检测液体，干燥后，得到待测物，通过显微红外光谱仪，获取待测物的载体上待测样品的面红外光谱数据；
2)通过对待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解，再结合相对浓度的空间分布，利用残差二维插值法，计算得到基线分布，再扣除基线，对光谱进行优化；
3)迭代步骤2)，直至光谱稳定，得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差。
优选的，所述薄膜包括超薄薄膜；
所述薄膜的厚度为0.1～50μm；
所述薄膜包括聚合物薄膜和/或无机物薄膜；
所述待测样品包括多组分的待测样品。
优选的，所述干燥的方法包括冷冻干燥；
所述显微红外光谱仪的面红外扫描模式包括液氮冷冻条件下的红外透射模式；
所述多组分分解中，使用非负最小二乘法去拟合光谱曲线。
优选的，所述多组分分解后，得到分解完全的各组分二维浓度矩阵和三维残差矩阵；
所述二维浓度矩阵作为数据点分类的依据；
所述三维残差矩阵中包含了相互作用的信息。
优选的，所述结合相对浓度的空间分布具体为，对每个像素点，计算其在浓度空间的位置到原点的欧几里得距离，再得到所有像素点欧几里得距离的中位数距离，将小于中位数距离的点归类为基线所属；
所述残差二维插值法具体为，根据所述基线属性的样点作自然临近内插，对外围点作e指数为权重的外插，外插得到的基线值；
所述优化的具体过程包括，对原面红外光谱数据扣除基线处理后，进行第二次多组分数据分解，同样得到浓度分布；
以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差强度和浓度值进行基于最小二乘法的回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长，去修正光谱数据。
优选的，所述迭代具体为，将多组分分解、结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布、扣除基线后再分解以及对光谱进行优化，四个步骤反复迭代，直至光谱稳定；
所述光谱稳定具体为，达到最大迭代次数或迭代前后的光谱差异度量值小于等于迭代阈值；
所述最大迭代次数为10～100次；
所述迭代阈值为10-3～10-6。
优选的，所述步骤2)具体包括以下步骤：
21)调取数据库中的纯组分的初始光谱，利用非负最小二乘法，将面红外光谱数据进行多组分分解，得到不同像素处对应的各组分浓度值；
22)对上述步骤得到的同像素处对应的各组分浓度值，求取相应的欧几里得距离，然后得到所有欧几里得距离的中位数值，依据该中位数值进行归类，对于欧几里得距离小于该中位数值的像素点，被归为基线插值样点；
通过对上述基线插值样点的分解残差逐波数进行插值，得到整个样品平面上的光谱基线；
23)对面红外光谱数据去除上述步骤得到的光谱基线后，进行第二次数据分解，同样得到浓度分布；
以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差和浓度值进行回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长修正光谱；
所述小角度点的阈值小于等于π/4。
优选的，所述步骤3)后，还包括可视化处理步骤；
所述可视化处理步骤用于研究液态样品中各组分之间的相互作用是否发生和/或相互作用的发生机理。
优选的，所述可视化处理包括通过颜色标度映射图进行可视化处理；
所述研究的方式包括，根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用；
和/或，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出，进行机理分析。
优选的，所述可视化处理的具体步骤包括以下过程：
依据最后一次迭代得到的浓度数据，在XOY平面作CA～CB的点分布图，在极坐标系下重新考察每个数据点；将极角θ∈[0,π/2]作m等分，每个数据点根据其θ值归入m个角度类中，每个角度中各光谱作权重为极径值ρ的加权平均，得到残差光谱关于角度分布的颜色标度映射图；
所述m为9～180；
根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出，进行机理分析。
本发明提供了一种基于红外光谱成像的液态样品的表征方法，包括以下步骤，首先采用薄膜负载待检测液体，干燥后，得到待测物，通过显微红外光谱仪，获取待测物的载体上待测样品的面红外光谱数据；然后通过对待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解，再结合相对浓度的空间分布，利用残差二维插值法，计算得到基线分布，再扣除基线，对光谱进行优化；最后迭代前一步骤，直至光谱稳定，得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差。与现有技术相比，本发明利用薄膜截获待检测液体，干燥后使用显微红外光谱仪获取载体上待测样品的面红外光谱信息；通过对含多组分的待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解、结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布、扣除基线后对光谱进行优化，迭代上述步骤直至光谱稳定，最终得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差；经过可视化处理，研究相互作用是否发生以及相互作用的发生机理。本发明解决了传统红外光谱受水信号干扰以及常规红外光谱无法区分不同类型的相互作用的问题，实现了具有一定普适性的包括但不限于水环境中各类化合物相互作用信息的提取。
实验结果表明，本发明提供的表征方法可以从复杂组分样品的面红外光谱数据中有效提取出一种或以上的相互作用对应的红外信号，该信号显著区分于各单一组分的红外信号。另外，该方法还可以对纯组分在混合体系环境中的红外光谱进行校正优化，利于分析每种组分自身在混合后发生的细微变化。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的模拟数据浓度分布图(分辨率为100×100)；
图2为本发明实施例1得到的不存在相互作用时残差沿浓度极坐标表示下，角度分布的颜色标度映射图；
图3为本发明实施例1得到的第3类数据残差光谱沿角度的颜色标度映射图；
图4为本发明实施例1得到的第4类数据残差光谱沿角度的颜色标度映射图；
图5为本发明实施例1得到的第3类数据计算得出的相互作用与输入正弦信号的对比；
图6为本发明实施例1得到的第4类数据计算得出的相互作用与输入正弦信号的对比；
图7为本发明实施例2得到的牛血清蛋白与葡聚糖体系相互作用光谱沿角度分布的颜色标度映射图；
图8为本发明实施例2得到的刀豆蛋白A与葡聚糖体系相互作用光谱沿角度分布的颜色标度映射图；
图9为本发明实施例2得到的5°到35°角度下牛血清蛋白同葡聚糖相互作用的红外光谱；
图10为本发明实施例2得到的65°到89°角度下刀豆蛋白A同葡聚糖相互作用的红外光谱；
图11为本发明实施例2得到的15°到45°角度下刀豆蛋白A同葡聚糖相互作用的红外光谱。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明所有名词表达和简称均属于本领域常规名词表达和简称，每个名词表达和简称在其相关应用领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据名词表达和简称，能够清楚准确唯一的进行理解。
本发明提供了一种基于红外光谱成像的液态样品的表征方法，包括以下步骤：
1)采用薄膜负载待检测液体，干燥后，得到待测物，通过显微红外光谱仪，获取待测物的载体上待测样品的面红外光谱数据；
2)通过对待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解，再结合相对浓度的空间分布，利用残差二维插值法，计算得到基线分布，再扣除基线，对光谱进行优化；
3)迭代步骤2)，直至光谱稳定，得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差。
本发明首先采用薄膜负载待检测液体，干燥后，得到待测物，通过显微红外光谱仪，获取待测物的载体上待测样品的面红外光谱数据。
在本发明中，所述薄膜优选包括超薄薄膜。具体的，所述薄膜的厚度优选为0.1～50μm，更优选为1～40μm，更优选为5～30μm，更优选为10～20μm。
在本发明中，所述薄膜优选包括聚合物薄膜和/或无机物薄膜，更优选为聚合物薄膜或无机物薄膜。
在本发明中，采用薄膜负载待检测液体，干燥后，得到待测物。具体可以为，以静电纺丝为制备手段，纺制超薄聚合物薄膜截获待检测液体，干燥后，得到待测物。
本发明为更好的完整和细化整体表征方法，更好的分析多组分的待测样品的面红外光谱数据，减少红外光谱受水信号的干扰，以及区分不同类型组分之间的相互作用，优选还包括使用纺丝前驱液作为粘合剂，将制备的聚合物薄膜固定在塑料环上，待溶剂挥发后即可使用。
在本发明中，还包括对于水溶液体系，(负载)截获待测液体前，对聚合物薄膜进行预处理改变其表面亲疏水性质。在本发明中，对于非极性溶液体系则可以无需上述步骤。
在本发明中，所述干燥的方法优选包括冷冻干燥。
在本发明中，所述待测样品优选包括多组分的待测样品。
在本发明中，所述显微红外光谱仪的面红外扫描模式优选包括液氮冷冻条件下的红外透射模式。
本发明随后通过对待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解，再结合相对浓度的空间分布，利用残差二维插值法，计算得到基线分布，再扣除基线，对光谱进行优化。
在本发明中，所述多组分分解中，优选使用非负最小二乘法去拟合光谱曲线。特别的，所述多组分分解后，优选得到分解完全的各组分二维浓度矩阵和三维残差矩阵。具体的，所述二维浓度矩阵优选作为数据点分类的依据。所述三维残差矩阵中优选包含了相互作用的信息。
在本发明中，所述结合相对浓度的空间分布具体为，对每个像素点，计算其在浓度空间的位置到原点的欧几里得距离，再得到所有像素点欧几里得距离的中位数距离，将小于中位数距离的点归类为基线所属。
在本发明中，所述残差二维插值法具体为，根据所述基线属性的样点作自然临近内插，对外围点作e指数为权重的外插，外插得到的基线值。
在本发明中，所述优化的具体过程包括，对原面红外光谱数据扣除基线处理后，进行第二次多组分数据分解，同样得到浓度分布；
以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差强度和浓度值进行基于最小二乘法的回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长，去修正光谱数据。
本发明为更好的完整和细化整体表征方法，更好的分析多组分的待测样品的面红外光谱数据，减少红外光谱受水信号的干扰，以及区分不同类型组分之间的相互作用，所述步骤2)具体包括以下步骤：
21)调取数据库中的纯组分的初始光谱，利用非负最小二乘法，将面红外光谱数据进行多组分分解，得到不同像素处对应的各组分浓度值；
22)对上述步骤得到的同像素处对应的各组分浓度值，求取相应的欧几里得距离，然后得到所有欧几里得距离的中位数值，依据该中位数值进行归类，对于欧几里得距离小于该中位数值的像素点，被归为基线插值样点；
通过对上述基线插值样点的分解残差逐波数进行插值，得到整个样品平面上的光谱基线；
23)对面红外光谱数据去除上述步骤得到的光谱基线后，进行第二次数据分解，同样得到浓度分布；
以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差和浓度值进行回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长修正光谱。
在本发明中，所述小角度点的阈值优选小于等于π/4，更优选小于等于π/6，更优选小于等于π/12。
本发明最后迭代步骤2)，直至光谱稳定，得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差。
在本发明中，所述迭代具体为，将多组分分解、结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布、扣除基线后再分解以及对光谱进行优化，四个步骤反复迭代，直至光谱稳定。
在本发明中，所述光谱稳定具体为，达到最大迭代次数或迭代前后的光谱差异度量值小于等于迭代阈值。其中，所述最大迭代次数优选为10～100次，更优选为20～80次，更优选为30～60次。所述迭代阈值优选为10-3～10-6，更优选为10-4～10-5。
本发明为更好的完整和细化整体表征方法，更好的分析多组分的待测样品的面红外光谱数据，减少红外光谱受水信号的干扰，以及区分不同类型组分之间的相互作用，所述步骤2)和3)具体可以为以下步骤：
S1)调取数据库中的纯组分初始光谱，利用非负最小二乘法将面红外光谱数据进行多组分分解得到不同像素处对应的各组分浓度值。
S2)对不同像素点各组分浓度值求取L2范数(即欧几里得距离)，依据中位数点对应的值进行归类，小于此值的点归为基线；通过对这些点的残差逐波数进行插值，可构建整个样品平面上的光谱基线。
S3)对原数据去基线处理后进行第二次数据分解，同样得到浓度分布；以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差和浓度值进行回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长修正光谱。
S4)迭代上述步骤直至结果稳定。
在本发明中，所述步骤3)后，优选还包括可视化处理步骤；
所述可视化处理步骤用于研究液态样品中各组分之间的相互作用是否发生和/或相互作用的发生机理。
在本发明中，所述可视化处理包括通过颜色标度映射图进行可视化处理。
在本发明中，所述研究的方式包括，根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用；
和/或，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出，进行机理分析。更优选为根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用；或者，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出，进行机理分析
在本发明中，所述可视化处理的具体步骤优选包括以下过程：
依据最后一次迭代得到的浓度数据，在XOY平面作CA～CB的点分布图，在极坐标系下重新考察每个数据点；将极角θ∈[0,π/2]作m等分，每个数据点根据其θ值归入90个角度类中，每个角度中各光谱作权重为极径值ρ的加权平均，得到残差光谱关于角度分布的颜色标度映射图；
根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出，进行机理分析。
其中，m优选为9～180，更优选为20～160，更优选为40～140，更优选为60～120，更优选为80～100，具体可以为90。
在本发明中，极径值ρ是依据浓度数据计算出来的，由该数据点对应的CA和CB求平方和再开根号得到，是该点到原点的距离值。具体公式如下：
本发明为更好的完整和细化整体表征方法，更好的分析多组分的待测样品的面红外光谱数据，减少红外光谱受水信号的干扰，以及区分不同类型组分之间的相互作用，所述可视化处理步骤具体可以为以下步骤：
S1`)挑选要分析相互作用的两组分，依据最后一次迭代输出的浓度数据在XOY平面作两组分浓度CA～CB的点分布图，在极坐标系下重新考察每个数据点。
S2`)将极角θ∈[0,π/2]作m等分，每个数据点根据其θ值归入m个角度类中，每个角度中各光谱作权重为ρ的加权平均，作残差光谱关于角度分布的颜色标度映射图。
S3`)根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出以备更细致的分析。
本发明为更好的完整和细化整体表征方法，更好的分析多组分的待测样品的面红外光谱数据，减少红外光谱受水信号的干扰，以及区分不同类型组分之间的相互作用，上述基于红外光谱成像的液态样品的表征方法，具体可以为以下步骤：
以静电纺丝为制备手段，纺制超薄聚合物薄膜。
所述静电纺丝的制备手段应根据实际需求选取线性高分子材料和对应溶剂，按合适配比将高分子溶解在溶剂中形成高分子溶液作为静电纺丝的前驱液，调节静电纺丝机喷头到接收器的距离、正负高压和纺丝时长及往复模式等参数获得所述超薄聚合物薄膜。
利用纺制的薄膜截获待检测液体，冷冻干燥。
所述薄膜截获待检测液体的方法，包括：在聚合物细环上涂抹纺丝前驱液，将薄膜粘合在环上并绷紧，待溶剂完全挥发后粘接牢固，剪裁环边缘至整齐后待用。
使用待测样液浸润该载有薄膜的细环，对于亲水性不佳的膜材料，可采取乙醇水溶液预浸润等表面改性处理后再浸入待测样液中；对充分浸润样液的薄膜作冷冻干燥处理，使溶剂快速升华，溶质在保留原始空间分布的前提下被固定在膜上。
显微红外光谱仪获取载体上待测样品的面红外光谱信息。
所述面红外扫描模式宜选取液氮冷冻条件下的透射模式，尽量选取接近膜中心位置的区域以获得较好的成像效果。
所述面红外光谱信息由扫描结束后红外面扫描数据经基线矫正和气压抑制后生成的三维矩阵数据给出。
对含多组分的待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解，所述多组分分解使用了非负最小二乘法去拟合光谱曲线：
首先对三维矩阵(L×X×Y)数据作数组重构转换为二维(L×XY)，再对其进行非负分解，
data(L×XY)＝reshape(data(L×X×Y))
其中，L表示红外光谱包含的不同波数的总个数，N表示组分数，X和Y分别表示面红外图的长宽像素数，XY表示X和Y的乘积：
data(L×XY)＝spectrum(L×N)×concentration(N×XY)+residual(L×XY)
最终通过重构得到分解完全的各组分二维浓度矩阵和三维残差矩阵。其中，浓度信息是数据点分类的依据，残差中则包含了相互作用的信息。
非负最小二乘算法本质是求解非负浓度矩阵使得L2范数，即欧几里得(Euclidian)距离下残差损失函数S取最小值的变分问题。
其中，s和c分别表示光谱和浓度矩阵，data为面红外光谱数据：
即，在约束浓度矩阵元素非负的前提下通过求解下式，其中N为浓度矩阵c的元素总数：
求得
结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布。
所述结合相对浓度的空间分布分析指对每个像素点计算其在浓度空间的位置到原点的欧几里得(Euclidian)距离，将欧几里得距离小于该中位数值的像素点归类为基线样点所属。
所述二维插值根据这些基线属性的样点作自然临近内插，对外围点作e指数为权重的外插，外插得到的基线值为：
其中Res(x，y)表示在坐标(x，y)处的基线值，G为包含所有样点的点集，card(G)表示点集G中元素的个数。
扣除基线后对光谱进行优化，迭代上述步骤直至光谱稳定，最终得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差。
所述对光谱进行优化的过程，包括：对原数据去基线处理后进行第二次数据分解，同样得到浓度分布；以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差强度和浓度值进行基于最小二乘法的回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长修正光谱。
其中小角度阈值优选为
再优选为
再优选为
修正项可被表示为：
Fi＝ki·Ri 2·step(t)
其中Fi第i个组分的修正项，ki表示该组分的回归斜率，Ri 2表示该组分线性回归模型中的决定系数，step(t)表示第t次循环时的步长。
将多组分分解、结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布、扣除基线后再分解，对光谱进行优化四个步骤反复迭代，直至光谱稳定，最终可得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差。
经过可视化处理，研究相互作用是否发生以及相互作用的发生机理，所述可视化处理包括针对任意两组分，依据最后一次迭代输出的浓度数据在XOY平面作CA～CB的点分布图，在极坐标系下重新考察每个数据点；将[0,π/2]作90等分，每个数据点根据其θ值归入90个角度类中，每个角度中各光谱作权重为ρ的加权平均，作残差光谱关于角度分布的颜色标度映射图；根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出以备更细致的分析。
本发明上述步骤提供了一种基于红外光谱成像的液态样品的分子间相互作用表征方法。本发明以静电纺丝为制备手段，纺制超薄聚合物薄膜截获待检测液体，干燥后使用显微红外光谱仪获取载体上待测样品的面红外光谱信息；通过对含多组分的待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解、结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布、扣除基线后对光谱进行优化，迭代上述步骤直至光谱稳定，最终得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差；经过可视化处理，研究相互作用是否发生以及相互作用的发生机理。本发明解决了传统红外光谱受水信号干扰以及常规红外光谱无法区分不同类型的相互作用的问题，实现了具有一定普适性的包括但不限于水环境中各类化合物相互作用信息的提取。
实验结果表明，本发明提供的表征方法可以从复杂组分样品的面红外光谱数据中有效提取出一种或以上的相互作用对应的红外信号，该信号显著区分于各单一组分的红外信号。另外，该方法还可以对纯组分在混合体系环境中的红外光谱进行校正优化，利于分析每种组分自身在混合后发生的细微变化。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种基于红外光谱成像的液态样品的分子间相互作用表征方法进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
实施例1
模拟数据的生成和解析
1.1
采用最简单的1:1相互作用比例，向大小固定的平面随机撒点生成分布，由两列不相关的随机数向量的坐标元素决定两种物质在平面上的位置，而当相互作用发生时参与相互作用的不同类点共享坐标，相互作用的点坐标由固定直径的均匀随机数按给定阈值选出，阈值的大小决定了参与相互作用的物质占总物质量的比例(向量直径定义为sup{|xi-xj|：xi，xj∈X})。共生成了存在相互作用的A类、B类点以及代表膜成分的M类点的三份不同的面密度数据作为浓度面分布，效果如附图1所示。
参见图1，图1为本发明实施例1得到的模拟数据浓度分布图(分辨率为100×100)。
1.2
由1.1方法共生成了四类模拟数据：1.两种物质光谱不发生变化，且无相互作用；2.两种物质光谱发生变化，但无相互作用；3.两种物质光谱不发生变化，但存在相互作用；4.两种物质光谱发生变化，同时存在相互作用。其中光谱发生变化指输入的初始光谱和实际模拟数据中混入的该组分光谱不同。
1.3
在模拟数据的生成过程中向A类点添加归一化牛血清蛋白(BSA)红外信号，光谱变化设置为0.1倍归一化聚苯乙烯(PS)的红外信号，分别向B类点和M类点添加归一化的葡聚糖和聚偏氟乙烯膜(PVDF)的红外信号，在相互作用发生的位置依据参与相互作用的点浓度加入正弦信号，最后在全平面附加不规则曲面作为干扰基线和较小的白噪声，使模拟数据更能反应真实情况。
定义算符⊙，C＝A⊙B表示对向量A作为标准谱逐元素扫描二维权重矩阵B生成三维红外面扫描矩阵C，其中C的每一层满足Ci＝Ai·B。则生成模拟数据(以第4类为例)的过程可以表示为：
simuData(L×X×Y)＝PVDF(L)⊙Mmap(X×Y)
+(0.1PS(L)+BSA(L))⊙Amap(X×Y)+Dextran(L)⊙Bmap(X×Y)
+0.1·sin(x/10)⊙Cmap(X×Y)
+baseline(L×X×Y)+noise(L×X×Y)
其中x∈[1,L]，simuData为模拟数据，baseline和noise表示基线和噪声，PVDF、PS、Dextran和BSA分别表示聚偏氟乙烯、聚苯乙烯、葡聚糖和牛血清蛋白对应的归一化红外光谱向量，Mmap表示膜的模拟面浓度分布，Amap和Bmap对应两种组分的分布，Cmap对应相互作用的发生位置和发生强度，同样以面浓度分布表示。括号内标注的是不同矩阵每个维度的长度。
1.4
将四组模拟数据输入算法，获得可视化输出。
结果分析：
本实例旨在分析算法对夹杂在红外面扫描数据中的相互作用信息的可分离性。上述可视化结果显示，在第1、2类模拟数据中不存在相互作用，解析得到的残差颜色标度映射图如图2所示。
参见图2，图2为本发明实施例1得到的不存在相互作用时残差沿浓度极坐标表示下，角度分布的颜色标度映射图。
其中光谱呈现为白噪声，不含任何有效的红外信息，该算法对不含相互作用数据的有效性得到验证。对于1、3类数据，迭代一次即退出循环，两组分光谱在优化过程中几乎不作任何修正。而2、4类数据迭代至收敛后观察到A组分由归一化BSA光谱被修正为BSA与0.1倍PS红外光谱信号的叠加，作图显示修正后的A组分红外信号同混入的信号基本一致且B组分光谱未发生明显变化。3、4类模拟数据存在相互作用，分别作光谱关于角度的颜色标度映射分布图，如图3和图4所示。
参见图3，图3为本发明实施例1得到的第3类数据残差光谱沿角度的颜色标度映射图。
参见图4，图4为本发明实施例1得到的第4类数据残差光谱沿角度的颜色标度映射图。
可以发现所有角度仅对应一种相互作用，相互作用的光谱表现为周期性渐变亮暗条纹，符合正余弦函数的颜色标度映射分布特征。部分角度没有光谱信号，原因在于撒点数不足，统计的连续性遭到破坏，但迭代结果良好，证明本算法对离散性较强的数据也有一定的耐受能力。去掉0°和90°对应的光谱信息，选取所有存在相互作用即显示明暗条带的角度对应的光谱进行求和，相当于联合密度函数对单一变量积分得到边际密度函数，最后求得相互作用在波数对应维度上的展开(以第4类模拟数据对应的角度为例)，其中interaction表示相互作用对应数据值：
引入正弦函数的目的在于模拟无机晶体材料在红外测试中由于多次反射出现的红外干涉谱，这种红外光谱与有机分子表征得到的红外谱有很大区别，因此作为模拟相互作用信息混入模拟数据。
3、4类模拟数据分解结果显示分解出的相互作用与输入的正弦信号重合程度较为理想(如图5和图6所示)，在一些波数范围内出现峰值的变化和信号峰的分裂现象，第4类模拟数据由于同时存在光谱变化和相互作用，分裂更加明显。原因在于混入时将正弦信号缩小了0.1倍，被频率较高且峰值较大的组分频率掩盖，因此在解析的过程中不可避免地受到了组分信号的影响。
参见图5，图5为本发明实施例1得到的第3类数据计算得出的相互作用与输入正弦信号的对比。
参见图6，图6为本发明实施例1得到的第4类数据计算得出的相互作用与输入正弦信号的对比。
实施例2
牛血清蛋白、刀豆蛋白A分别与葡聚糖相互作用的检测和对比
1.1
分别配制0.2mg/L的刀豆蛋白(ConA)溶液、0.2mg/L的牛血清蛋白(BSA)溶液和0.2mg/L的葡聚糖(Dextran)水溶液，实验组取5ml ConA与5ml葡聚糖混合，对照组取5mlBSA与5ml葡聚糖混合，完全溶解后均放置在摇床中振摇，取出静置以备使用。同时，考虑到膜材料对纯组分红外光谱可能产生影响，还应准备纯组分对应的溶液样品。
1.2
利用MATLAB工具包中MCR toolbox提供的多元曲线分辨-交替最小二乘(MCR-ALS)算法可将单组分光谱从单组分和膜的混合信号中较好地提取出来，建立薄膜载体环境下包含不同纯组分对应的初始光谱图的数据库，供后续迭代使用。
1.3
采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂，取聚偏氟乙烯(PVDF)粉末在磁力搅拌条件下分批缓慢加入溶剂中，每次加入时应保证前一次加入时的粉末已完全溶解，否则粉末极易团聚使溶解过程延长至数小时。静电纺丝所使用的前驱液，在DMF溶剂条件下应保证质量百分比浓度在10wt.％～15wt.％左右才能保证较好的纺丝效果。配制完成的前驱液不宜长期保存，最好是现配现用。
1.4
用注射器抽取2ml左右的前驱液，固定在静电纺丝机滑动模块上，将带孔金属板连接负极，针头连接正极，调节正负高压值、针头到接收板距离和注射泵的挤出效率，使针头前出现稳定的泰勒锥和纤维丝运动形成的放射状的扩散锥形包络面，等待金属板上出现均匀且各向同性的薄膜即可停止纺丝。
1.5
用前驱液作粘接剂，将金属板上孔间的薄膜收集到聚四氟乙烯环上(内径约10mm，板孔略大于环的12mm外径)。
1.6
PVDF材料本身接触角大于90°，属于疏水材料，因此直接用水溶液浸润薄膜效果通常不佳，可采取乙醇水预浸润的策略，浸润后在蒸馏水中使乙醇扩散脱离薄膜，再用来浸润样品溶液，只需30s至数分钟即可截留待测溶质。
1.7
将浸润样液后的膜环放在敞口离心管中置于液氮中冷冻，再放入冷冻干燥机中升华脱去溶剂。
1.8
干燥后的样品置于开口载物台上，利用可见光对焦，选取BSA+Dextran、ConA+Dextran两种混合样品和BSA、Dextran、ConA三种纯品对应膜中央的感兴趣区域，在冷却和投射模式下使用Nicolet iN10傅立叶变换显微红外光谱仪扫描该区域的红外谱，单位像素的积分时间选为3s。扫描完成后作自动基线矫正和气压抑制的处理后即可导出数据。
1.9
将牛血清蛋白和葡聚糖的纯组分光谱作为初始光谱，选取牛血清蛋白与葡聚糖混合体系对应的数据输入迭代程序。迭代收敛的条件是光谱改变小于阈值1×10-4，定义光谱差异为前后两次光谱向量的差的模，其中ΔS为光谱差异，
为修正前光谱向量，
为修正后光谱向量：
30次迭代后光谱的变化小于阈值，终止循环并输出残差和面浓度信息。沿两物质浓度CBSA(牛血清蛋白浓度)和CDex(葡聚糖浓度)的极坐标系下θ坐标0～π/2的90等分画出光谱关于角度的颜色标度映射分布图，如图7所示。
参见图7，图7为本发明实施例2得到的牛血清蛋白与葡聚糖体系相互作用光谱沿角度分布的颜色标度映射图。
1.10
将刀豆蛋白A和葡聚糖的纯组分光谱作为初始光谱，选取对应数据输入迭代程序。收敛阈值仍设为1×10-4。经20次迭代后收敛，终止循环输出数据，沿两物质浓度CConA(刀豆蛋白A浓度)和CDex(葡聚糖浓度)在极坐标系下θ坐标0～π/2以90等分画出光谱关于角度的颜色标度映射分布图，如图8所示。
参见图8，图8为本发明实施例2得到的刀豆蛋白A与葡聚糖体系相互作用光谱沿角度分布的颜色标度映射图。
结果分析：
刀豆蛋白A在pH≥7时，多呈四聚体形态，其中每个亚基含一个糖结合部位，能与α-甘露糖、α-葡萄糖等糖类发生专一性结合。本发明选用葡聚糖作为多糖的代表，恰能与刀豆蛋白A发生相互作用。另一方面牛血清蛋白不具备这样结合糖的能力，可以作为对照。
自定义彩色颜色棒(colorbar)，调整颜色标度映射图中颜色棒的RGB值，使颜色标度图更易分辨。从标度映射图中可分辨出牛血清蛋白和葡聚糖组成的体系中仅存在一种微弱的相互作用，且仅发生在BSA浓度较大的位置。根据其分布信特征，画出BSA与葡聚糖体系残差在角度θ∈[5°，35°]的范围求和所得到的相互作用的归一化红外光谱图(由于受到多种因素如初始光谱和采样平面大小等的影响，相互作用的红外光谱吸收强度只有相对值意义而失去绝对值意义，因此对红外光谱作极大值sup{spectrum}＝1，极小值inf{spectrum}＝-1的归一化处理)如图9所示。
参见图9，图9为本发明实施例2得到的5°到35°角度下牛血清蛋白同葡聚糖相互作用的红外光谱。
同时，刀豆蛋白A与葡聚糖有明显不同的两种相互作用形式，对应的角度范围分别为65°～89°和15°～45°。画出ConA与葡聚糖体系残差在θ∈[65°,89°]的角度范围内求和所得到的相互作用的归一化红外光谱，如图10所示。
参见图10，图10为本发明实施例2得到的65°到89°角度下刀豆蛋白A同葡聚糖相互作用的红外光谱。
再画出ConA与葡聚糖体系残差在θ∈[15°,45°]的角度范围内求和所得到的相互作用的归一化红外光谱，如图11所示。
参见图11，图11为本发明实施例2得到的15°到45°角度下刀豆蛋白A同葡聚糖相互作用的红外光谱。
对比牛血清蛋白与葡聚糖体系相互作用(图9)和刀豆蛋白A与葡聚糖体系65°～89°的相互作用(图10)，不难发现无论是对于糖类羟基伸缩峰范围的形状相似的高频信号，还是-CH2反对称和对称伸缩峰的漂移行为，甚至是指纹区，两者都存在一定的相似性。两者的角度分布区域并不重合，表明此相互作用与浓度比关系不大。因此认为对于蛋白质，可能普适地存在一种与糖类的相互作用，其特征反映为与上述两光谱相似的红外特征信号。
此外，刀豆蛋白A与葡聚糖体系15°～45°的相互作用(图11)是牛血清蛋白与葡聚糖体系所不具备的，且发现在同一颜色标度映射图(图8)上其吸收强度明显高于65°～89°区域对应的吸收强度，据此可判定ConA与葡聚糖存在特异性的相互作用，其特征方式反映在红外光谱信号上，如图11所示。
以上对本发明提供的一种基于红外光谱成像的液态样品的分子间相互作用表征方法进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种基于红外光谱成像的液态样品的表征方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用薄膜负载待检测液体，干燥后，得到待测物，通过显微红外光谱仪，获取待测物的载体上待测样品的面红外光谱数据；
2)通过对待测样品的面红外光谱数据进行多组分分解，再结合相对浓度的空间分布，利用残差二维插值法，计算得到基线分布，再扣除基线，对光谱进行优化；
3)迭代步骤2)，直至光谱稳定，得到待测物样品中各组分的修正光谱和残差。
2.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述薄膜包括超薄薄膜；
所述薄膜的厚度为0.1～50μm；
所述薄膜包括聚合物薄膜和/或无机物薄膜；
所述待测样品包括多组分的待测样品。
3.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述干燥的方法包括冷冻干燥；
所述显微红外光谱仪的面红外扫描模式包括液氮冷冻条件下的红外透射模式；
所述多组分分解中，使用非负最小二乘法去拟合光谱曲线。
4.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述多组分分解后，得到分解完全的各组分二维浓度矩阵和三维残差矩阵；
所述二维浓度矩阵作为数据点分类的依据；
所述三维残差矩阵中包含了相互作用的信息。
5.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述结合相对浓度的空间分布具体为，对每个像素点，计算其在浓度空间的位置到原点的欧几里得距离，再得到所有像素点欧几里得距离的中位数距离，将小于中位数距离的点归类为基线所属；
所述残差二维插值法具体为，根据所述基线属性的样点作自然临近内插，对外围点作e指数为权重的外插，外插得到的基线值；
所述优化的具体过程包括，对原面红外光谱数据扣除基线处理后，进行第二次多组分数据分解，同样得到浓度分布；
以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差强度和浓度值进行基于最小二乘法的回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长，去修正光谱数据。
6.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述迭代具体为，将多组分分解、结合相对浓度的空间分布进行残差二维插值得到基线分布、扣除基线后再分解以及对光谱进行优化，四个步骤反复迭代，直至光谱稳定；
所述光谱稳定具体为，达到最大迭代次数或迭代前后的光谱差异度量值小于等于迭代阈值；
所述最大迭代次数为10～100次；
所述迭代阈值为10-3～10-6。
7.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括以下步骤：
21)调取数据库中的纯组分的初始光谱，利用非负最小二乘法，将面红外光谱数据进行多组分分解，得到不同像素处对应的各组分浓度值；
22)对上述步骤得到的同像素处对应的各组分浓度值，求取相应的欧几里得距离，然后得到所有欧几里得距离的中位数值，依据该中位数值进行归类，对于欧几里得距离小于该中位数值的像素点，被归为基线插值样点；
通过对上述基线插值样点的分解残差逐波数进行插值，得到整个样品平面上的光谱基线；
23)对面红外光谱数据去除上述步骤得到的光谱基线后，进行第二次数据分解，同样得到浓度分布；
以n组分浓度为坐标绘制各点在n维空间的分布，依据各点对各坐标轴的夹角归类；挑选小角度点作为对应组分代表，对其残差和浓度值进行回归分析，依据斜率、拟合优度值和迭代步长修正光谱；
所述小角度点的阈值小于等于π/4。
8.根据权利要求1～7所述的表征方法，其特征在于，所述步骤3)后，还包括可视化处理步骤；
所述可视化处理步骤用于研究液态样品中各组分之间的相互作用是否发生和/或相互作用的发生机理。
9.根据权利要求8所述的表征方法，其特征在于，所述可视化处理包括通过颜色标度映射图进行可视化处理；
所述研究的方式包括，根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用；
和/或，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出，进行机理分析。
10.根据权利要求8所述的表征方法，其特征在于，所述可视化处理的具体步骤包括以下过程：
依据最后一次迭代得到的浓度数据，在XOY平面作CA～CB的点分布图，在极坐标系下重新考察每个数据点；将极角θ∈[0,π/2]作m等分，每个数据点根据其θ值归入m个角度类中，每个角度中各光谱作权重为极径值ρ的加权平均，得到残差光谱关于角度分布的颜色标度映射图；
所述m为9～180；
根据颜色标度映射图判断是否存在或存在几种相互作用，选取角度范围将不同种类相互作用对应的红外光谱分离出，进行机理分析。
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