CN113512529A - 特异性抗病毒过继免疫细胞ab的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种特异性抗病毒过继免疫细胞LymaVir‑AB的制备方法，所述制备方法包括步骤：(1)收集外周血，离心分离获得外周血单个核细胞；(2)用病毒抗原肽激活外周血单个核细胞中的CD3+T细胞；(3)采用G‑REX10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量。本制备方法，采用G‑REX10瓶进行细胞的培养扩增，避免了操作中的污染和传代，采血量小、制备时间短，可以通过2周和4周培养分别输注一次VST，所获得的免疫细胞为抗病毒特异性T细胞，其纯度高、活力强，治疗效果更好。

Description

特异性抗病毒过继免疫细胞AB的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及抗病毒过继免疫细胞的制备方法。
背景技术
同种异体造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)已成为针对造血系统相关恶性疾病或遗传性疾病最佳治疗方式之一。然而除了需要对造血干细胞供者进行HLA配型之外，为避免出现移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVHD)，受者需要经历一段免疫空窗期，在此期间其自身免疫力受到巨大破坏，因此患者容易被病毒感染并引发一系列病症，严重者可能危及生命。根据报道，巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、BK多瘤病毒(BKV)和腺病毒(ADV)感染尤为常见，并且通常被描述为影响HSCT术后预后的关键危险因素。(Francesco Saglio et al.The time is now:moving towardvirus-specific T cells after allogeneic hematopoietic stem celltransplantation as the standard of care.Cytotherapy.2014Feb；16(2):149–159.)
腺病毒(adenovirus，ADV)和BK多瘤病毒(BK polyomavirus，BKV)属于无包膜的双链DNA病毒。ADV是引起呼吸道感染的常见病原体之一，可在冬、春季暴发流行。ADV能够感染多个脏器(如眼部、呼吸道、消化道和尿道等)的粘膜上皮，引起角膜结膜炎、咽结膜热、发热性呼吸系统疾病、胃肠炎和腹泻等疾病。当机体免疫监管功能显著降低时(如造血干细胞移植术和实体器官移植患者)，ADV大量复制引起重要脏器功能受损(如呼吸衰竭、脑脊膜炎、心肌炎等)具有致死性，死亡率高达40-75％。BKV最初在一位肾移植患者的尿样中发现，于是以该患者姓名的首个字母(B.K)命名。BKV主要感染尿路上皮，但感染后通常不会致病。在移植病人免疫保护机制严重受损(实体器官移植)和全面毁损(造血干细胞移植)时，则BKV既可以沿尿路感染形成疾病(如肾病、输尿管狭窄和出血性膀胱炎等)，也可以侵入血液循环形成病毒血症。(Thomas Lion.Adenovirus persistence,reactivation,and clinicalmanagement.FEBS Letters.2019Dec；593(24):3571-3582.)
迄今为止国内外均没有抗病毒药物获准用于控制ADV和BKV感染，临床治疗则以病毒DNA聚合酶抑制剂如西多福韦(Cidofovir)最为常见，但疗效在很大程度上取决于患者的特异性免疫功能。此外，该药具有较大的毒副作用如骨髓抑制和肾脏毒性，一些患者不易耐受。(Katherine A.Baugh et al.Infusion of cytotoxic T lymphocytes for thetreatment of viral infections in hematopoetic stem cell transplantpatients.Curr Opin InfectDis.2018Aug；31(4):292–300.)
过继细胞疗法(Adoptive cell therapy)是一种新兴的治疗平台，用于在器官移植或造血干细胞移植后诱导肿瘤消退或某些病毒感染的清除。其中病毒特异性T细胞(Virus-specific T cells，VST)指经过扩增培养后对病毒编码抗原具有特异性免疫应答能力的记忆T细胞(Memory T cells，TM)，VST是临床控制ADV和BKV感染的另一个有效选项，尤其对于抗病毒药物不能耐受或者治疗失效的感染患者，输注VST后临床获益率(clinicalbenefit)通常达到70％或以上。(Theresa Kaeuferle et al.Strategies of adoptive T-cell transfer to treat refractory viral infections post allogeneic stem celltransplantation.Journal of Hematology&Oncology.2019Feb；12:13.)
根据表型特征和生物学功能的差异可将TM分为四个亚群，即记忆干细胞(memorystemcells，TSCM)、中央记忆细胞(central memory cells，TCM)、效应记忆细胞(effectormemory cells，TEM)和组织定居记忆细胞(resident memory cells，TRM)。TSCM和TCM的表型特征是：
(1)表达TM核心标志如CD95等；
(2)表达淋巴结“归巢受体”(homing receptors)如CCR7和CD62L等；
(3)表达共刺激受体(co-stimulatory receptors)如CD28等；
(4)表达白细胞共同抗原CD45的剪辑变异体如CD45RA(TSCM)和CD45RO(TCM)。
上述两种TM亚群具有成体干细胞(somatic stem cells)的特性，如能够通过自我更新(self-renewal)在次级淋巴器官如淋巴结内长寿命(longevity)生存而不明显分化；当再次遭遇相应抗原时则高效增殖并分化成为TEM和效应细胞(effector cells，TEFF)，后者又称重新表达CD45RA的终末分化TEM(terminally differentiated effector memory Tcells re-expressing CD45RA，TEMRA)。目前认为TSCM和TCM承担了整体免疫监管功能，在免疫记忆中起着关键作用。与TSCM/CM不同，TEM不能表达CD28、CD45RA和上述归巢受体，因而主要分布在外周非淋巴样器官中并且生存时间也比较短暂，但部分TEM在外周器官的特殊微环境(niches)中可以分化成为TRM，后者具备长寿命生存的特性并承担区域免疫监管功能。(Charlotte M.Mousset et al.Comprehensive Phenotyping of T Cells Using FlowCytometry.Cytometry.2019Jun；95A(6):647-654.)
我国的人口基数大，ADV和BKV感染患者的数量也多，因而对VST的治疗需求明显，急需开发ADV和BKV病毒特异性T细胞的制备方法。
发明内容
本发明方法采用无动物源成分的培养基，即包含血清替代物的培养基，优选AIM-V培养基。
本发明的第一方面提供一种特异性抗病毒过继免疫细胞AB的制备方法，所述制备方法包括步骤：
(1)收集外周血，离心分离获得外周血单个核细胞；
(2)用BK病毒和腺病毒抗原肽激活外周血单个核细胞中的CD3+T细胞；
(3)采用G-REX 10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量。
上述步骤(2)中每种病毒抗原肽均采取二个不同位点的病毒抗原肽，激活同时还加入载荷CD3和CD28抗体的可降解微球。
上述步骤(2)之后，进一步检测CD3+T细胞和CD137+占比，如CD3+T细胞占比≥50％，CD137+占比≥2％，则继续步骤(3)；如有一指标不符合，则重新开始步骤(1)。
上述每种病毒抗原肽浓度为1-3微克/107细胞，每个病毒抗原肽长度为15肽。
上述步骤(3)中培养扩增T细胞时，加入10-30ng/ml IL2,IL4,IL7,IL15，并保持IL4,IL7,IL15浓度分别保持在10-30ng/ml，10-30ng/ml和10-50ng/ml，培养基为AIM-V培养基。
本发明的第二方面提供一种特异性抗病毒免疫细胞AB的制备方法，所述制备方法包括步骤：
(1)收集外周血，离心分离获得外周血单个核细胞；
(2)用病毒抗原肽激活外周血单个核细胞中的CD3+T细胞；
(3)采用G-REX 10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量；
(4)取部分步骤(3)中扩增的细胞，用与步骤(2)相同的病毒抗原肽再次激活；
(5)采用G-REX 10瓶优化培养扩增步骤(4)激活的T细胞至需要的数量。
上述步骤(2)和步骤(4)中病毒为BK病毒和腺病毒。
上述步骤(2)中每种病毒抗原肽均采取二个不同位点的病毒抗原肽，激活同时还加入载荷CD3和CD28抗体的可降解微球。
上述步骤(2)中可降解微球为TransACT；所述步骤(3)中加入IL7,IL15和IL2和IL4，培养扩增T细胞，所述IL4，IL7,IL15浓度分别保持在10-30ng/ml，10-30ng/ml和10-50ng/ml。
上述步骤(1)中外周血采用病人或健康人的外周血。
上述步骤(4)中，病毒抗原再次激活的六天内，加入IL21。
上述步骤(5)中，扩增培养中，多次补充IL7,IL15，保持其浓度分别在10-30ng/ml，10-50ng/ml，所述步骤(3)和步骤(5)中培养基为AIM-V培养基。
上述每种病毒抗原肽浓度为1-3微克/107细胞，每个病毒抗原肽长度为15肽。
本专利在消化吸收国际上在VST制备先进经验的基础上，通过创新发展形成了独具特色的VST规模化制备新工艺。该制备过程在符合GMP标准的洁净环境中实施，形成的细胞治疗产品本发明中命名为LymaVir-AB，即特异性抗病毒过继免疫细胞AB，其中LymaVir即lymphocytes against virus，而AB分别指ADV和BKV。培养的免疫细胞具有下列主要特征：
1)CD3+T细胞尤其是TSCM/CM亚群高度富集；
2)抗病毒的特异性T细胞纯度高、活力强；
采血量小、制备时间短，可以通过2周和4周培养分别输注一次VST。这种“一次采血二次输注”的治疗新模式有利于提高或巩固临床疗效。
附图说明
图1过继免疫细胞的制备工艺流程图；
图2酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素能力实验结果示意图；
图3流式细胞术分析血样中免疫T细胞(CD3+)所占百分比示意图；
图4流式细胞术分析免疫细胞群中VST纯度及激活状态(CD137+/CD28+)示意图；
图5流式细胞术分析免疫细胞构成(CD3+/CD4+/CD8+)示意图；
图6流式细胞术分析免疫细胞亚型(TSCM/TCM/TEM/TEMRA)占比示意图。
图7常规方法培养2周所得细胞与本发明新方法培养2周及4周所得细胞之亚群占比柱状分析图；
图8常规方法培养2周所得细胞与本发明新方法培养2周及4周所得细胞之酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素能力柱状分析图。
具体实施方式
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。
实施例1LymaVir-AB过继免疫细胞的制备
1.血样甄别
健康成人外周血中T细胞占体内T细胞总数的2-2.5％，数量约为5-10×109。采用Ficoll梯度离心分离出PBMC后，粗略估算细胞得率为1×106/ml血样，其中CD3+T细胞占比50-80％，而CD3+T细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比值为2-3:1。
外周血T细胞中的VST可以分为二个细胞群体，一是CD8+CD28+细胞，主要成份是TCM，因为初始细胞(
Figure BDA0003172886860000041
cells，TN)和TSCM通常含量甚微；另一类是CD8+CD28-细胞，包括TEM和TEMRA。上述T细胞亚群的一个共性特征是曾经遭遇过相应抗原刺激，其再次激活主要取决于TCR信号而CD28共刺激信号的作用比较轻微。(Jae-Ouk Kim et al.NF-UB and AP-1regulate activation-depen CD137(4-1BB)expression in Tcells.FEBSLetters.2003Apr；541(1-3)；163-170.)
在PBMC中添加病毒抗原的重叠短肽(长度为15个氨基酸)足以激活VST，这种激活方式称为MLPC(Mixed lymphocyte peptide culture)。(Jae-Ung Lee etal.Revisitingthe Concept of Targeting NFAT to Control T Cell Immunity and AutoimmuneDiseases.Front Immunol.2018Nov；27(9):2747.)
德国研究组C Sukdolak等曾采用IFN-γ酶联斑点法(ELISPOT)对健康成年人外周血VST进行过检测，通过204例血样分析作者认为高应答者(high responder，斑点形成细胞SFC＞50/2.5×105待检细胞)更适合作为供者用于扩增培养VST。我们引进了这项检测技术，在MLPC激活细胞后进行IFN-γELISPOT检测，并与相同病毒抗原激活后CD137+细胞占比进行了同步比对，统计分析后显示上述ELISPOT数值大致相当于1％CD137+细胞(数据未列)。据此设定了合格血样的甄别标准，即CD3+T细胞占比≥50％和CD137+细胞占比≥2％(每种VST均采用2个病毒抗原肽段进行刺激)，这样更方便检测。(Cinja Sukdolak etal.CMV-,EBV-and ADV-Specific T Cell Immunity:Screening and Monitoring of PotentialThird-Party Donors to Improve Post-Transplantation Outcome.Biol BloodMarrowTransplant.2013Oct；)
本发明新方法制备过程中均采用流式细胞术对细胞表型及亚群占比进行分析鉴定，取PBMC(5×105细胞/100微克)，其中检测组加入PerCP-CD3抗体(5微升，美国Biolegend公司)，对照组不加抗体，4℃避光温育30min后加入PBS离心去除游离抗体后上机分析，即以前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)作图，设置淋巴细胞组份P1门，实验结果如图3A所示；选择淋巴细胞组份P1后检测CD3+细胞，根据未加CD3抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+细胞百分比，实验结果如图3B所示。
CD3+细胞占比分析方法如下：取PBMC(5×105/50微升)，添加ADV抗原(Hexon及Panten各100ng，德国梅天妮公司)或BKV抗原(Large T及VP1各100ng，德国梅天妮公司)，培养24小时后检测组加入APC-CD137抗体(5微升，美国Biolegend公司)及PE-CD28抗体(20微升，美国BD公司)，对照组不加抗体，4℃避光温育30min后加入PBS离心去除游离抗体后上机分析，以FSC对SSC作图，设置淋巴细胞组份P1门，实验结果如图4C所示。
选择淋巴细胞组份P1门后检测CD137+和CD28+细胞，根据未加CD137或CD28抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD137+和CD28+的细胞百分比，实验结果如图4D所示。
对10例健康志愿者血样进行了检测，显示所有受检血样中CD3+T细胞占比均＞50％(平均值为65.5％，范围为54.8％-76.5％)，而CD137+细胞占比均≥2％(平均值分别为5.6％和6.1％，范围为2.0％-10.2％)，并且CD137+细胞中CD28+细胞约占半数(平均值分别为63.2％和62.9％，范围为44.4％-84.2％)。如CD137+细胞占比均≤2％，提示供血者自身体内存在的ADV/BKV特异性T细胞过少，激活并扩增后VST纯度及数量可能无法达到制剂回输标准且无法满足临床效果。则一般应重新取其他志愿者的外周血，重复上述实验步骤。
Figure BDA0003172886860000051
Figure BDA0003172886860000061
表1.志愿者外周血免疫细胞占比筛选及针对单种病毒抗原的特异性T细胞百分比检测。
注：ADVST为腺病毒特异性T细胞；BKVST为BK多瘤病毒特异性T细胞。
2.VST的初次激活与表型转换
血样甄别合格后采用MLPC激活PBMC中的VST，将PBMC(1.5×107)调整至1×107/ml，添加ADV抗原和BKV抗原(ADV Hexon、ADV Panten、BKV Large T及BKV VP1，德国梅天妮公司，浓度均为2微克/107细胞)，12孔板培养24小时。但上述VST激活并扩增培养2周后TCM亚群占据优势(数据未列)，为了促使TSCM亚群形成，额外在MLPC时再添加TransACT(载荷CD3和CD28抗体的可降解微球，德国梅天妮公司)，滴定实验显示，将TransACT用量控制在10-30微升/107细胞时，培养24小时后CD137+细胞占比与不加TransACT的病毒抗原激活组相比无显著差异，最佳用量为10微升/107细胞。在此条件下扩增培养2周，TSCM/CM亚群占比与不加TransACT组别比较数值更高。VST激活后收集细胞置于G-REX 10透气性培养瓶(美国Wilsonwolf manufacturing公司，底面积为10cm2)中，补充40ml培养基(AIM-V，美国GICO公司，其中添加3％UltraGRO Cell Culture Supplement，美国CliniScineces公司)及白介素(interleukins，IL)，包括IL2(50-500IU/ml，双鹭药业公司)、IL4(10-30ng/ml)、IL7(10-30ng/ml)和IL15(10-50ng/ml)，IL4/7/15均为同源海立公司。鉴于T细胞激活后的增殖分化与细胞代谢方式密切相关，如IL2优先激活葡萄糖酵解代谢、驱使T细胞增殖形成TEM/EMRA亚群，而IL7和IL15有利于氨基酸氧化代谢、促进T细胞增殖形成TSCM/CM亚群。为了扩增形成TSCM/CM亚群占优势的VST，通过大量实验最终确定添加以上4种细胞因子，然后对上述细胞因子不同浓度进行了优化排列组合，配伍形成最佳组合后用于实验。
本方法引入G-REX培养瓶，其优势在于：
(1)接种细胞(细胞密度控制在1×106/cm2或以下)后培养2周内无需传代，可显著降低人员操作造成病原体污染的风险；
(2)G-REX瓶由底部的微孔膜供氧，添加过量的培养基不仅不会造成细胞缺氧反而可以促进细胞代谢产物弥散稀释，因而明显提升细胞增殖效能。
VST激活后首先在G-REX瓶中培养6天，然后间隔3-4天添加IL4/7/15满足细胞生长需求。为了保障VST始终处于活跃增殖状态，可以在培养6天时取样计数，如发现细胞增殖＜4倍时则添加适量TransACT(用量控制在20-60微升/107细胞之间)。
3.质控检验
VST在G-REX 10瓶中扩增培养15天即可灌装用于临床治疗，因此在灌装前2天(即培养13天)收集部分细胞进行质控检验，检验项目包括：
1)细胞数量
细胞数量以台盼蓝拒染的活细胞为准，取20微升细胞与等量的台盼蓝溶液混合，细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)检测活细胞占比及数量。5例VST的检测结果显示，2周扩增培养后活细胞占比均＞97％，其中CD3+T细胞纯度平均为96.5％。T细胞数量平均扩增约7.8倍，其中将PBMC的培养密度控制在1.5×106/cm2时，T细胞的扩增效率更高。
Figure BDA0003172886860000071
表2：激活前及激活后扩增2周的免疫细胞总数及T细胞总数之比较；
*单位：106
2)T细胞构成及亚群
T细胞构成包括CD3+T细胞占比以及其中CD4+T细胞和CD8+T细胞占比，分析方法如下，取PBMC(5×105细胞/100微克)，其中检测组加入FITC-CD3抗体、PerCP-CD8抗体和PE-CD4抗体(5微升，美国Biolegend公司)，对照组不加抗体，4℃避光温育30min后加入PBS离心去除游离抗体后上机分析，即以前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)作图，设置淋巴细胞组份P1门，实验结果见图5E；选择淋巴细胞组份P1后检测CD3+细胞，根据未加CD3抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+细胞百分比，实验结果见图5F；选择CD3阳性细胞群，根据未加CD4抗体和CD8抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD4+和CD8+细胞百分比，实验结果见图5G。
VST经扩增培养后富集了CD3+T细胞，平均占比达到96.5％，其中CD+4和CD8+T细胞(包括CD4+CD8+细胞)占比分别为34.2％和62.0％。通常扩增后的T细胞可以分为二种类型，一是CD8+T细胞占优势；二是CD4+T细胞占比略超CD8+T细胞，类似情况国外也有报道。(MartaGrau-Vorster et al.Characterization of a Cytomegalovirus-Specific TLymphocyte Product Obtained Through a Rapid and Scalable Production Processfor Use in Adoptive Immunotherapy.Frontiers in Immunology.2020Feb；11(271))
Figure BDA0003172886860000072
Figure BDA0003172886860000081
表3：本发明新方法制备2周后的免疫细胞构成比例；
T细胞亚群采用四种荧光抗体(PerCP-CD3抗体、APC-CD95抗体、PE-CD62L和FITC-CD45RA抗体，均为美国Biolegend公司)染色，FCM分析首先以FSC对SSC作图，选择淋巴细胞组份P1门(图6H)，根据未加CD3或CD95抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+CD95+细胞(图6I)；选择CD3+CD95+细胞组份，根据未加CD45RA或CD62L抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+CD95+细胞中CD45RA+和CD62L+细胞百分比(图6J)；其中各亚群表型分别为TN(CD3+CD95-)、TSCM(CD3+CD95+CD45RA+CD62L+)、TCM(CD3+CD95+CD45RA-CD62L+)、TEM(CD3+CD95+CD45RA-CD62L-)和TEMRA(CD3+CD95+CD45RA+CD62L-)。
健康成年人外周血中的T细胞主要包括四个亚群,分别为TN(CD3+CD95-)、TSCM(CD3+CD95+CD45RA+CD62L+)、TCM(CD3+CD95+CD45RA-CD62L+)、TEM(CD3+CD95+CD45RA-CD62L-)和TEMRA(CD3+CD95+CD45RA+CD62L-)。其占比大体为40％、30％、20％和10％，而TSCM亚群较少，通常占比为2-6％。VST经扩增培养后形成的主要亚群为TSCM和TCM(平均占比分别为32.0％和57.4％)，TN基本检测不到并且TEM和TEMRA亚群平均占比分别降至6.3％和2.4％。
Figure BDA0003172886860000082
表4.本发明新方法制备2周后所获免疫细胞的亚群分布百分比；
3)VST占比及活力
利用酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素的能力(IFNγ-ELISPOT检测)，并将其视为VST活力。
将VST(1×106/管)调整至1×107/ml，分别添加ADV抗原、BKV抗原(10微克/107细胞)或不加抗原(阴性对照)，培养3-4小时后取2-5微升/管(即2-5×104细胞)用于IFNγ-ELISPOT检测(Mabtech)，剩余细胞继续培养20小时用于FCM检测CD137/CD28表达百分比。ELISPOT检测显示阴性对照组仅有少量斑点形成细胞(spot-forming cells，SFC)而抗原激活组中SFC显著增多，后者减去对照组的SFC数值并换算成SFC/2×105待检细胞。实验结果可见图2。
5例VST的检测结果显示，经过2周扩增培养后CD137+VST(包括ADVST和BKVST)占比通常超过60％，其中2例的CD137+VST纯度甚至＞90％，说明扩增后VST得到明显富集。此类CD137+VST中，CD28阳性率平均达到95.1％，明显高于培养前，提示此类CD137+CD28+VST属于TSCM/CM亚群，与表型检测结果吻合。IFNγ-ELISPOT检测显示SFC平均值分别为2607(ADVST)和1761(BKVST)，上述数值均高于国外的同类报道。(Ifigeneia Tzannou etal.Off-the-Shelf Virus-Specific T Cells to Treat BK Virus,Human Herpesvirus 6,Cytomegalovirus,Epstein-Barr Virus,and Adenovirus Infections After AllogeneicHematopoietic Stem-Cell Transplantation.Journal of Clinical Oncology.2017Nov；35(31):3547-3557.)
Figure BDA0003172886860000091
表5.本发明新方法制备2周后所获免疫细胞的CD137+/CD28+VST占比及酶联免疫斑点数据表；
*扩增细胞中CD137+VST占比(％)；**CD137+VST中CD28+细胞占比(％)；***SFC/2×105待检细胞
4)内毒素、支原体及细菌培养
细菌内毒素检查方法：取本品，按《中华人民共和国药典》2020年版第四部<1143细菌内毒素检查法>进行检测，应＜0.5EU/ml。细菌检测采用BacTALERT3D微生物检测系统，将样本加入BACT/ALERT培养瓶中培养5天，检测厌氧菌和需氧菌，样品测试结果应为阴性。支原体检测采用荧光染色方法，使用sigma公司hochest 33258染液进行染色，在荧光显微镜下观察，仅见细胞的细胞核呈现蓝色荧光为阴性。
4.VST的再次激活与优化扩增
国外的近期研究报道显示，约20-40％的患者需要输注2次或以上VST才能临床获益。(Ifigeneia Tzannou et al.“Mini”bank of only 8donors supplies CMV-directedTcells to diverse recipients.Blood advances.2019Sep；3(17):2571-2580.)
由此设想，在扩增培养2周获得VST后取其中一部分细胞继续扩增培养2周，然后再次输注，这种“一次制备二次输注”的治疗新模式将有可能提高或巩固临床疗效。
按此思路在2周扩增培养后取VST(3×107，调整至1×107/ml)，采用MLPC(添加TransACT)方式再次激活(与初次激活相同，抗原浓度减至1微克/107)。但是结果发现，这些VST经过2周扩增培养形成了TSCM/CM占优势的TM，相同抗原再次激活后仍添加IL4/7/15则导致明显的细胞分化，表现为上述亚群的占比下降。为了避免这种分化，实验以TM自稳增殖(homeostatic proliferation)因子IL7和IL15为基础进行优化组合，发现病毒抗原激活后6天内采用IL21(10-30ng/ml)替代IL4具有明显的分化遏制效应。培养第2周仍采用IL4/7/15扩增培养VST，上述2周扩增培养也采用G-REX10培养瓶。
在抗原再次激活VST后继续培养13天时取样进行四项质控检验，结果如下：
1)细胞数量
VST再次激活并扩增培养2周后，细胞数量平均增加约3倍。虽然T细胞扩增效率低于前2周培养，但纯度得到了提升(平均值≥99％)，并且最终细胞数量足以满足治疗所需。
Figure BDA0003172886860000101
*单位：106
表6：本发明方法二次细胞激活前及再激活后扩增2周的免疫细胞总数及T细胞总数之比较；
2)T细胞构成及亚群
VST再次激活并扩增培养后T细胞构成发生了显著变化，表现为CD8+T细胞占据优势(平均占比达到86.8％)，而CD4+T细胞占比均降至10％上下。由于CD8+T细胞是主要的抗病毒效应细胞，此类T细胞高度富集有利于提升临床疗效。
Figure BDA0003172886860000102
表7：本发明方法二次激活并扩增2周后获得细胞之构成；
VST再次激活并经过优化方案扩增2周后细胞的另一个显著变化是TSCM超越TCM成为优势细胞亚群(平均占比达到73.7％)。TSCM处于T细胞分化层级的顶端，是T细胞群体中干细胞特性最显著的一个亚群，因而TSCM富集的T细胞具有更明显的疗效。
Figure BDA0003172886860000111
表8：本发明方法二次激活并扩增2周后获得细胞之亚群占比；
3)VST占比及活力
除了TSCM亚群高度富集外，VST再次激活并采用优化的扩增体系培养2周后，VST占比也有所提升，其纯度(包括CD137+ADVST和BKVST)和SFC数值均超过前2周培养。
Figure BDA0003172886860000112
表9:本发明方法二次激活并扩增2周后获得细胞之VST纯度和SFC数据表；
*扩增细胞中CD137+VST占比(％)；**CD137+VST中CD28+细胞占比(％)；***SFC/2×105待检细胞
5.VST灌装及低温贮藏
通过质控检验达到放行标准(release criteria)即可进行VST灌装。参照国际上临床研究的相关报道，放行标准需同时达到下列要求：
Figure BDA0003172886860000113
Figure BDA0003172886860000121
表10：VST过继免疫细胞放行标准表；
*单位：EU/ml；**VST扩增培养2周时，因存在个体差异CD8 T细胞占比不作为放行标准。
VST灌装数量因人而异，常用标准为：
①按照体表面积，通常为2×107细胞/m2；②依据患者体重，要求1×106细胞/kg。
VST灌装需先离心洗涤清除培养基中的蛋白成份包括细胞因子，然后将细胞重悬在氯化钠注射液(生理盐水)或复方氯化钠注射液(林格氏液)中，在聚丙烯输液袋(体积为50ml)中封装，冷链运输。如果患者对人血清白蛋白(HSA)没有过敏反应，则适量添加(如1-2％)可以改善细胞活力。VST灌装时采用的容器、液体及蛋白均需符合中国药典标准并有药监部门核准的批号。
VST灌装后尚余下大量细胞，这种情况在低体重患者(如儿科病人)尤为明显，因此需采用适当的方法将细胞低温贮藏下来，可以为可能需要的后续治疗节省制备时间和费用。低温贮藏(cryopreservation)是指在深低温(如液氮)条件下保存活体组织或细胞的一项技术，其中涉及2个基本要素，即低温保护剂和降温速率。
当人体细胞的环境温度从37℃降至冰点以下时，细胞内的水分就会凝聚成冰，这种细胞内冰晶(intracellular ice crystals，ICIC)对细胞存活及功能具有显著伤害。低温保护剂(cryoprotective agents，CPA)的主要作用就是遏制ICIC形成，不同类型的T细胞对CPA的要求存在差异，为此我们对VST的CPA组方进行了优化，从中筛选出的最佳配方如下：林格氏液与20％HAS按1:1比例混合形成10％HSA溶液，后者再与CryoStor CS10按1:1比例混合(简称HSA-CS10)。采用上述CPA将VST的细胞密度调整为5-20×106/ml，以1.25ml/管(冻存管)或20ml/袋(冻存袋)分装，采用程序降温仪(赛默飞世尔科技公司)缓慢降温(降温速率控制在-1℃/min)至-80℃后液氮保存。
低温贮藏的VST经37℃水浴融化复苏后具有较高的活细胞占比(通常＞75％)，此时添加生理盐水及1-2％HSA可以直接灌装；也可以将细胞离心去除蛋白成份后培养2-3天再灌装。与复苏后直接灌装比较，培养后VST的活细胞占比更高(通常＞85％)，因而更适合灌装后需要冷链运输较长时间的患者。根据我们对LymaVir-AB的系列测试结果，选择的最佳培养条件为IL7(20ng/ml)和IL15(10ng/ml)。在此条件下培养1-3天，活细胞占比均＞85％而活细胞数量保持相对恒定。
实施例2本发明制备方法所得细胞亚群与常规方法之数据比较
常规方法利用MLPC法，取1.5×107细胞置于15ml离心管中，加入病毒抗原编码的重叠肽段(CMV/EBV/ADV/BKV)(100ng/1.5×107细胞)37℃培养30min，转至G-REX10后加IL4(400U/ml)和IL7(10ng/ml)培养。细胞培养约2周左右进行安全性及功能性检测，并且收集所有细胞制备成细胞制剂用于回输。(Anastasia Papadopoulou et al.Activity ofbroad-spectrum T-cells as treatment for AdV,EBV,CMV,BKV and HHV6 infectionsafter HSCT.Sci Transl Med.2014June 25；6(242):242ra83.)
本发明制备方法在常规方法上进行了创新：取1.5×107细胞置于12孔板中，加入病毒抗原编码的重叠肽段(CMV/EBV/ADV/BKV)37℃隔夜，第二天转至G-REX10后加IL4(10-30ng/ml)IL7(10-30ng/ml)和IL15(10-30ng/ml)培养2周后进行安全性及功能性检测，取部分细胞制备成细胞制剂用于回输，剩余细胞进入第二轮激活扩增阶段，并于2周后进行二次回输。
不同于常规方法，一次采血二次回输的新模式不仅利于临床治疗效果，本发明制备方法第4周所得细胞在亚群分布上更加趋向干具有成体干细胞的特性，即TSCM/CM占比更高，细胞维持其干细胞属性未见分化，且IFNγ-ELISPOT检测所得SFC值高于常规方法，显示本发明制备方法所得细胞在功能上有明显优势。
如图7所示，使用新方法得到的T细胞具有更高的CD8+占比，提示其具有更高的杀伤活性。使用常规方法培养易使TSCM亚群(CD45RA+CD62L+)分化成TCM(CD45RA-CD62L+)和TEM(CD45RA-CD62L-)，因此常规方法只能获得TCM的占比数据。与常规方法相比较，新方法所得细胞的TSCM/CM占比更高，尤其是新方法可以避免TSCM亚群细胞的分化，培养2周后TSCM/CM占比接近90％。
如图8所示，常规方法所得到的细胞中，ADVST分泌IFNγ量约为300SFCs/2×105细胞，BKVST分泌IFNγ量约为400SFCs/2×105细胞；而同样是培养2周所得细胞，本发明新方法细胞中ADVST分泌IFNγ量约为2607SFCs/2×105细胞，BKVST分泌IFNγ量约为1761SFCs/2×105细胞，提示本发明新方法可显著提升病毒特异性T细胞的杀伤功能；4周所获细胞之VST活力也维持在较高水平阶段，表明前后回输两次细胞制剂或可巩固或提升临床效果。
此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。

Claims (12)

1.特异性抗病毒过继免疫细胞AB的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：
(1)收集外周血，离心分离获得外周血单个核细胞；
(2)用BK病毒和腺病毒抗原肽激活外周血单个核细胞中的CD3+T细胞；
(3)采用G-REX 10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中每种病毒抗原肽均采取二个不同位点的病毒抗原肽，激活同时还加入载荷CD3和CD28抗体的可降解微球。
3.如权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)之后，进一步检测CD3+T细胞和CD137+占比，如CD3+T细胞占比≥50％，CD137+占比≥2％，则继续步骤(3)；如有一指标不符合，则重新开始步骤(1)。
4.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述每种病毒抗原肽浓度为1-3微克/107细胞，每个病毒抗原肽长度为15-25个氨基酸。
5.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养扩增T细胞时，加入10-30ng/ml IL2,IL4,IL7,IL15，并保持IL4,IL7,IL15浓度分别保持在10-30ng/ml，10-30ng/ml和10-50ng/ml，培养基为AIM-V培养基。
6.一种特异性抗病毒免疫细胞AB的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：
(1)收集外周血，离心分离获得外周血单个核细胞；
(2)用病毒抗原肽激活外周血单个核细胞中的CD3+T细胞；
(3)采用G-REX 10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量；
(4)取部分步骤(3)中扩增的细胞，用与步骤(2)相同的病毒抗原肽再次激活；
(5)采用G-REX 10瓶优化培养扩增步骤(4)激活的T细胞至需要的数量。
7.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(4)中病毒为BK病毒和腺病毒。
8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中每种病毒抗原肽均采取二个不同位点的病毒抗原肽，激活同时还加入载荷CD3和CD28抗体的可降解微球。
9.如权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中可降解微球为TransACT；所述步骤(3)中加入IL7,IL15和IL2和IL4，培养扩增T细胞，所述IL4，IL7,IL15浓度分别保持在10-30ng/ml，10-30ng/ml和10-50ng/ml。
10.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中外周血采用病人或健康人的外周血。
11.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，病毒抗原再次激活的六天内，加入IL21。
12.如权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，扩增培养中，多次补充IL7,IL15，保持其浓度分别在10-30ng/ml，10-50ng/ml，所述步骤(3)和步骤(5)中培养基为AIM-V培养基。
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Denomination of invention: Preparation of specific antiviral Adoptive immunity cell AB

Effective date of registration: 20230717

Granted publication date: 20221125

Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Shanghai Changning sub branch

Pledgor: SHANGHAI ICELL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.|Guangzhou victory Biotechnology Co.,Ltd.|Chongqing Saiao Biotechnology Co.,Ltd.|Beijing victory Biotechnology Co.,Ltd.|Xuzhou cell Medical Co.,Ltd.

Registration number: Y2023310000379