CN113507925A - 用于抑制术后粘连的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本文描述了使用可操作以形成用于抑制术后粘连的复合膜的颗粒组合物的方法。简言之，处理手术部位的方法包括使所述手术部位与包含靶向颗粒和支架颗粒的颗粒配制物接触。交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜抑制术后粘连的形成。

Description

用于抑制术后粘连的组合物和方法
政府权益
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号CA058223、CA178748和CA150391在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月6日提交的美国临时申请第62/802,033号的权益，其为了所有目的以全文引用的方式并入本文中。
对通过EFS WEB以文本文件形式提交的序列表的引用
以文件035052-542267_ST25.txt编写的序列表是491字节，在2020年2月4日创建，并且在此以引用的方式并入。
技术领域
本发明涉及用于抑制术后粘连形成的组合物和方法，且具体地说，涉及形成用于抑制术后粘连形成的复合膜的颗粒组合物。
背景技术
腹部手术是许多疾病，例如癌症和炎性肠病中的重要治疗手段。腹部手术的常见副作用是腹膜粘连的形成。据报道，高达93％接受腹部手术的患者被发现具有术后粘连。此类粘连可导致疼痛、肠阻塞以及其它严重并发症。粘连形成的生物学高度复杂，涉及许多化学介质、细胞因子和细胞类型。其被认为是由于炎性过程与愈合过程之间的不平衡。已知促炎性过程，例如巨噬细胞活化和成纤维细胞活化，在粘连形成中起重要作用。
使粘连降到最低的当前策略主要涉及在受伤腹膜表面之间使用解剖屏障以防止粘连形成。此类屏障包括减少粘连的液体和呈凝胶或膜形式的基于聚合物的屏障(例如纤维素)。防粘连液体通常含有聚合物，例如艾考糊精(icodextrin)或聚乙二醇(PEG)。它们通过占据腹腔并且允许受损伤表面不受干扰地愈合而起作用。近期的元分析显示，在腹部手术中使用粘连屏障(液体和膜/凝胶)可能会减少粘连的形成。然而，作用是适度的。此外，对于包括艾考糊精、PEG和氧化再生纤维素在内的几种配制物，没有明显证据可以证明它们可以减少由术后粘连引起的并发症。防粘连液体缺乏功效可能是由于其被腹膜腔吸收，因此不在受损伤表面上提供持久屏障。聚合物膜和凝胶已被用作屏障，但这些非靶向和块状屏障并不总是能够覆盖所有受损伤的腹膜表面。此外，这些屏障并不总是在术后保持在适当位置，因此限制了它们的治疗功效。
发明内容
鉴于这些缺陷，人们对能够防止术后粘连形成的策略和试剂的开发表现出强烈的兴趣。
在一个方面，本文描述了使用可操作以形成用于抑制术后粘连的复合膜的颗粒组合物的方法。举例而言，处理手术部位的方法包括使所述手术部位与包含靶向颗粒和支架颗粒的颗粒配制物接触。交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜抑制术后粘连的形成。如本文进一步详述的，靶向颗粒和支架颗粒可在施加到所述手术部位之后交联，从而使得能够在体内形成复合膜。在一些实施例中，手术部位包含腹膜表面。
在另一个方面，本文所述的主题涉及一种处理手术部位的方法，其包括使所述手术部位与包含载体颗粒和支架颗粒的颗粒配制物接触。
在另一方面，本文所述的主题涉及一种试剂盒，其包含：
(i)容纳包含靶向颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；以及
(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。
在另一方面，本文所述的主题涉及一种试剂盒，其包含：
(i)容纳包含载体颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；以及
(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。
在另一个方面，本文所述的主题涉及一种包含靶向颗粒和支架颗粒的组合物。
在另一个方面，本文所述的主题涉及一种包含载体颗粒和支架颗粒的组合物。
在另一个方面，本文所述的主题涉及一种复合膜，其通过使包含靶向颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
在另一方面，本文所述的主题涉及一种复合膜，其通过将包含载体颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
在另一个方面，本文所述的主题涉及一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与靶向颗粒接触；
使所述靶向颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
在另一个方面，本文所述的主题涉及一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与载体颗粒接触；
使所述载体颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述载体颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
这些方面和其它方面在以下进行描述。
附图说明
图1A示出了包含光可交联纳米贴片(pCNP)的两种纳米颗粒的设计。
图1B示出了在受损伤表面上形成pCNP以防止术后腹膜粘连的示意图。
图2A示出了在UV照射时从纳米颗粒形成pCNP。描绘的为经由NP-B的二氮杂环丙烯官能团的光诱导的纳米颗粒交联的反应示意图。
图2B示出了具有不同NP-A和NP-B浓度的交联反应的光DSC分析。
图2C示出了在二氮杂环丙烯交联期间的计算出的反应焓。
图3A到图3P示出了pCNP如何在体外IV型胶原蛋白富集表面上形成高密度纳米贴片。FESEM图像示出了使用不同方法的未涂布(a-h)和涂布IV型胶原蛋白(i-p)玻璃盖玻片上的纳米贴片的形成。(a，e，i，m)NP-A，无靶向配体(NP-A')；(b，f，j，n)NP-A；(c，g，k，o)NP-B；(d，h，l，p)pCNP。a-d和i-l，10,000放大率下的FESEM图像。比例尺＝5μm。e-h和m-p,40,000放大率下的FESEM图像。比例尺＝1μm。图3Q示出了a-d、i-l和图2A-2C中的灰度值的积分密度。数据表示平均值±平均值的标准误差(SEM)(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01。图3R示出了e-h、m-p和图2A-2C中的灰度值的积分密度。数据表示平均值±平均值的标准误差(SEM)(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01。
图4A描绘了示出使用不同方法在未涂布的玻璃盖玻片上形成纳米贴片的重复FESEM图像。
图4B示出了示出使用不同方法在涂布IV型胶原蛋白的玻璃盖玻片上形成纳米贴片的重复FESEM图像。
图5示出了在37℃下在PBS中在涂布IV型胶原蛋白的玻璃盖板上从pCNP释放地塞米松(Dex)和地塞米松21-棕榈酸酯(Dex-Pal)的释放概况。
图6显示了在涂布IV型胶原蛋白的96孔板上用UV照射和/或pCNP处理之后NIH/3T3成纤维细胞的细胞活力。
图7A-图7M展示了pCNP如何防止大鼠壁腹膜切除(PPE)模型中的术后腹膜粘连。图7A示出了示出PPE和pCNP的施用的代表性照片。图7B示出了展示大鼠在不同处理后14天的术后粘连的代表性照片：PBS，将受损伤区域与盐水一起温育10分钟，在UV照射下又温育10分钟；仅A，将受损伤区域与NP-A一起温育10分钟，洗涤并在UV照射下与盐水一起又温育10分钟；A+A，将受损伤区域与NP-A一起温育10分钟，用盐水洗涤两次，然后在UV照射下再次与NP-A一起又温育10分钟；A'+B，将受损伤区域与NP-A'(不含靶向配体的NP-A)一起温育10分钟，用盐水洗涤两次，然后在UV照射下与NP-B一起又温育10分钟；不含Dex的pCNP，将受损伤区域与不含地塞米松21-棕榈酸酯的NP-A一起温育10分钟，用盐水洗涤两次，然后在UV照射下与NP-B一起又温育10分钟；
Figure BDA0003241052720000051
将受损伤区域与盐水一起温育10分钟，在UV照射下又温育10分钟，去除盐水，并用
Figure BDA0003241052720000052
覆盖受损伤区域；pCNP，将受损伤区域与NP-A一起温育10分钟，用盐水洗涤两次，然后在UV照射下与NP-B一起又温育10分钟。(图7C-图7J)图7C描绘了代表性的H&E染色组织学组织图像，其示出未被处理，以及接受手术和随后用PBS(图7D)、仅NP-A(图7E)、NP-A+NP-A(图7F)、NP-A'+NP-B(图7G)、不含地塞米松21-棕榈酸酯的pCNP(图7H)、
Figure BDA0003241052720000053
(图7I)和pCNP(图7J)处理的大鼠中的粘连/纤维化的厚度。比例尺＝2mm。(图7K和图7L)对处理后14天大鼠的术后粘连的定性(图7K)和定量(图7L)评分分析。使用曼惠特尼(Mann Whitney)检验评估统计显著性。数据表示带有中值线的散点图(对于A+A，n＝6；对于不含Dex的pCNP，n＝7；对于
Figure BDA0003241052720000054
n＝8；对于其它组，n＝9)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。(图7M)对(d)-(j)中的粘连/纤维化厚度的定量评估。使用未配对的双尾t检验评估统计显著性。数据表示平均值±平均值的标准误差(SEM)(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图8描绘了壁腹膜切除(PPE)大鼠模型的照片，其显示了在腹部手术期间的受损伤区域和14天后的粘连。
图9显示了在壁腹膜切除(PPE)模型中大鼠腹壁的代表性免疫组织化学(IHC)分析。比例尺＝200μm。
图10A描绘了示出在术后处理期间使用的UV光导装置的照片。
图10B描绘了示出手术过程和pCNP的施用的照片。
图11A示出了在处理后14天，关于每个实验组中的大鼠的术后腹膜粘连。
图11B示出了在处理后14天，关于每个实验组中的大鼠的术后腹膜粘连。
图12示出了在处理后14天，关于大鼠的术后腹膜粘连的放大视图。
图13描绘了代表性的H&E染色组织学组织图像，其示出了腹部手术后的肌肉和粘连/纤维化。对于(a)和(b)，比例尺＝2mm；对于(c)和(d)，比例尺＝100μm。
图14描绘了代表性的H&E染色组织学组织图像，其示出了处理后的粘连/纤维化。对于PBS和A+A组，比例尺＝1mm；对于其它组，比例尺＝500μm。
图15A-15C展示了pCNP如何在大鼠的壁腹膜切除(PPE)模型中示出了低毒性。(图15A-图15C)处理后6小时、24小时、48小时和72小时的血液测试：红细胞计数(图15A)、白细胞计数(图15B)、血糖浓度(图15C)。数据表示平均值(SEM)±平均值的标准误差(对于A+A，n＝6；对于不含Dex的pCNP，n＝7；对于
Figure BDA0003241052720000061
n＝8；对于其它组，n＝9)。
图16示出了在处理后6小时、24小时、48小时和72小时大鼠的全血评估。a，血红蛋白计数。b，血细胞比容计数。c，网状红细胞计数。d，血小板计数。e，淋巴细胞计数。f，单核细胞计数。g，中性粒细胞计数。数据表示平均值±平均值的标准误差(SEM)。(对于A+A，n＝6；对于不含Dex的pCNP，n＝7；对于
Figure BDA0003241052720000071
n＝8；对于其它组，n＝9)。
图17示出了pCNP如何减少大鼠的壁腹膜切除(PPE)模型血清中的炎性细胞因子/趋化因子。(a，b)热图显示了在24小时(a)和72小时(b)之后所有处理组中每个样品中的血清细胞因子/趋化因子水平。样品(y轴)和细胞激素/趋化因子水平(x轴)是分层聚类的。色标反映细胞因子/趋化因子表达量值(红色：高，蓝色：低)。
图18示出了每个样品相对于其它样品(包括自身作为对角线)的皮尔逊(Pearson)相关性矩阵。矩阵展示不同处理组中炎症的相似性。
图19描绘了FESEM图像，其示出了在PPE手术和随后用pCNP处理后大鼠腹壁的愈合过程。
图20A-图20C示出了pCNP在大鼠壁腹膜切除(PPE)模型中在术后愈合过程中如何保留在胶原蛋白纤维上并减少局部炎症。图20A描绘了FESEM图像，其示出了在手术后6小时、24小时、72小时、1周和2周以及随后用pCNP处理的大鼠腹壁上pCNP的保留和生物降解。比例尺＝200nm。苏木精和伊红(H&E)染色图像(图20B)和CD45免疫组织化学(IHC)染色图像(图20C)显示在手术后6小时、24小时、72小时、1周和2周以及随后用pCNP处理时在大鼠腹壁上的局部炎症。对于(图20B)，比例尺＝500μm；对于(图20C)，比例尺＝100μm。
图21描绘了FESEM图像，其示出了在手术后6小时、24小时、72小时、1周和2周以及随后用pCNP处理的大鼠腹壁上pCNP的保留和生物降解。比例尺＝1μm。
图22示出了在手术后6小时、24小时、72小时、1周和2周以及随后用pCNP处理的大鼠腹壁的缩小的苏木精和伊红(H&E)染色图像。比例尺＝1mm。
图23示出了在手术后6小时、24小时、72小时、1周和2周以及随后用pCNP处理的大鼠腹壁的缩小的CD45免疫组织化学(IHC)染色图像。比例尺＝200μm。
图24示出用于颗粒交联的一系列不同化学机制。
具体实施方式
术后粘连是手术治疗的常见并发症。尽管其很盛行，但其治疗进展有限。这主要是由于在所有受损伤的上皮/间皮表面上提供屏障的困难。另外，例如抗炎剂的医学疗法具有限制其使用的全身副作用。本文描述了一种新型的生物靶向屏障系统(光可交联纳米贴片，pCNP)，其也可以并入医学疗法以防止术后粘连。
为了实现靶向，使用与胶原蛋白结合的肽作为靶向配体。由于在上皮/间皮受损伤时胶原蛋白/基底膜暴露，胶原蛋白靶向的纳米颗粒将与组织损伤区域(裸露的上皮和间皮)结合。使用体外和体内研究，生物靶向证实为高度特异性的。在某些实施例中，地塞米松还并入系统中以减少炎症并促进正常愈合。如在体内研究中所见，地塞米松的添加成功地进一步减少粘连形成。
使用大鼠PPE模型证实pCNP可以在体内有效地防止手术粘连，优于商业粘连屏障SEPRAFILM。此外，pCNP未显示任何显著毒性。pCNP可以改善手术患者的生活质量，以及减少由于腹膜粘连引起的手术并发症。
现在将在下文中更全面地描述当前公开的主题。然而，受益于前述描述中呈现的教导，当前公开的主题所涉及的领域的技术人员将想到本文所阐述的当前公开的主题的许多修改和其它实施例。因此，应当理解的是，当前公开的主题不限于所公开的具体实施例，并且修改和其它实施例旨在被包含在所附权利要求的范围内。换句话说，本文描述的主题涵盖所有替代、修改和等同形式。如果所结合的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包含但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入本文。
I.定义
如本文所用，“PPE”是指壁腹膜切除。
如本文所用，“手术部位”或“腹部手术部位”是指手术切口周围的组织、邻近切口的器官，通常为腹膜腔中的表面。例如，本文所述的组合物和方法可以在腹部手术后施加到受损伤的腹膜表面。
如本文使用，“腹膜粘连”是指在网膜、小肠和大肠、腹壁和其它腹内器官之间形成病理结合的病况。
如本文所用，“术后粘连”是指在术后发展的粘连。特别地，腹部粘连是形成于腹部器官上的纤维疤痕组织的条带。它们会导致器官彼此粘附或粘附在腹部壁上。
如本文所用，“减少腹膜粘连”是指与不使用复合膜的方法相比，通过施加本文所述的复合膜来将术后粘连减少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
如本文所用，与不使用复合膜的方法相比，通过复合膜“抑制术后粘连”是指术后粘连减少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
如本文所用，“腹部手术的后续”是指个体进行腹部手术之后的时间段(即，1小时、2小时、10小时、24小时、48小时、36小时、54小时、72小时、100小时、5天、7天、10天、12天、14天、20天、30天、40天、50天、60天)。
除非另外说明，否则本文所用的术语“组合物”和“配制物”旨在涵盖包含指定成分(和指定量(如果指示的话))的产品以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。另外，术语“组合物”和“配制物”是指化合物或颗粒的混合物。
下文提供额外的定义。
II.颗粒组合物和复合膜
在实施例中，本文所述的主题涉及一种包含靶向颗粒和支架颗粒的组合物。
如本文所用，靶向颗粒是指包含靶向位于腹膜损伤部位处的一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分的颗粒。腹膜损伤部位包括手术切口周围的组织、邻近切口的器官，通常为腹膜腔中的表面。生物分子物质的非限制性实例是IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、整合素、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、BM-40/骨粘连蛋白/SPARC、BM-90、bFGF。蛋白聚糖的实例包括硫酸肝素、串珠蛋白聚糖和集聚蛋白。通常，由靶向颗粒所靶向的细胞和/或组织包括靶，其通过颗粒的靶向部分特异性结合。例如，可以用具有任何所需功能的靶向配体使颗粒表面改性。在一些实施例中，靶向配体和/或其它靶向部分可以将靶向颗粒结合到手术部位的表面，例如腹膜表面。例如，靶向部分可以包含碳水化合物、脂肪酸、糖肽、糖蛋白、脂质、肽、聚合物、多核苷酸、蛋白质或小分子。在一些实施例中，靶向部分是叶酸类似物、抗体或抗体片段或适体。在一个优选实施例中，靶向部分是靶向IV型胶原蛋白的肽。在某些实施例中，靶向IV型胶原蛋白的肽具有KLWVLPKGGGC(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述序列表现出80％同源性、90％同源性、95％同源性或99％同源性。
此外，靶向颗粒还可以包含至少一种用于在手术部位处释放的药物组合物。通过靶向颗粒携带或传输的药物组合物可以破坏或抑制术后粘连形成的一个或多个机制或路径。例如，药物组合物可以通过减少炎性细胞因子和/或趋化因子在手术部位处的存在来抑制组织炎症。在一些实施例中，药物组合物包含地塞米松棕榈酸酯或相关化合物。相关化合物是地塞米松。靶向颗粒可具有任何需要加载的药物组合物。可以根据若干考虑因素来确定靶向颗粒的药物组合物加载，包括但不限于颗粒结构、粒度、药物的化学特性和/或所需剂量。在一些实施例中，靶向颗粒包含10μg/mg至500μg/mg的药物加载。在其它实施例中，靶向颗粒包含约15μg/mg、20μg/mg、25μg/mg、30μg/mg、35μg/mg、40μg/mg、45μg/mg、50μg/mg、55μg/mg、60μg/mg、65μg/mg、70μg/mg、75μg/mg、80μg/mg、85μg/mg、90μg/mg、95μg/mg、100μg/mg、150μg/mg、200μg/mg、250μg/mg、300μg/mg、350μg/mg、400μg/mg或450μg/mg的药物负载。在一个优选实施例中，靶向颗粒包含约65.2μg/mg的药物加载。
在某些实施例中，整个靶向颗粒是可生物降解的。在其它实施例中，仅一部分靶向颗粒是可生物降解的(例如，颗粒的外层)。一般来说，可生物降解物质是在生理条件下可以分解的物质。在一些实施例中，靶向颗粒的一种或多种组分是生物相容的。靶向颗粒可以是固体或中空的。靶向颗粒可以包含一个或多个层(例如，纳米壳、纳米环)。在一些实施例中，可以涂布靶向颗粒。在某些实施例中，颗粒包括外脂质单层。在其它实施例中，颗粒包括外脂质双层。在另外的实施例中，靶向颗粒包括聚合外层。
在一些实施例中，靶向颗粒可由一种或多种聚合材料形成。在一些实施例中，药物组合物和/或靶向部分可与聚合物基质的表面缔合、包封在聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散在整个聚合物基质中。例如，靶向颗粒可包括聚合核。在某些实施例中，用于颗粒中的聚合物可以包含天然或半合成聚合物。此类聚合物的非限制性实例包括白蛋白、海藻酸、羧甲基纤维素、交联钠盐(sodium sale cross-linked)、纤维素、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸偏苯三酸纤维素、甲壳素、壳多糖(chitos)、胶原蛋白、糊精、乙基纤维素、明胶、泊洛沙姆、多糖、乙醇酸淀粉钠、热改性淀粉、黄芪胶或黄原胶多糖。
在其它实施例中，靶向颗粒的聚合物可以是合成聚合物。合成聚合物的非限制性实例包括赛璐玢(涂布聚乙烯的)、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、尼龙、聚缩醛、聚丙烯酸酯、聚(环氧烷)、聚酰胺、多元胺、聚酸酐、聚精氨酸、聚氧化丁烯(PBO)、聚丁内酯、聚己内酯(PCL)、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚(二噁烷酮)(PDO)、聚酯、聚醚、聚乙烯、聚(乙烯-丙烯)共聚物、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯亚胺)、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙交酯(PGA)、聚羟酸、聚丙交酯(PLA)、聚赖氨酸、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚(甲基乙烯基醚)(PMV)、聚(N-乙烯基吡咯烷)(NVP)、聚鸟氨酸、聚(原酸酯)(POE)、聚磷腈、聚丙内酯、聚丙烯、聚(丙二醇)(PPG)、聚氧化丙烯(PPO)、聚富马酸丙酯、聚丝氨酸、聚苯乙烯、聚脲、聚氨酯、聚乙烯醇(PVA)、聚(氯乙烯)(PVC)、聚(乙烯基吡咯烷)或硅橡胶)。
靶向颗粒的聚合物可以是包含来自一种或多种上述聚合物的单体的均聚物、共聚物或嵌段共聚物。如果聚合物包含不对称单体，那么其可以是区域规则的、全同立构或间同立构(交替)；或区域无规的。如果聚合物包含手性单体，则聚合物可以是立体规则的或是外消旋混合物，例如聚(D-,L-乳酸)。其可以是无规共聚物、交替共聚物、周期共聚物，例如具有式(如[AnBm])的重复单元。聚合物可以是线性聚合物、环聚合物、分支聚合物，例如树枝状聚合物。聚合物可以交联或可以不交联。聚合物可以是包含亲水性嵌段聚合物和疏水性嵌段聚合物的嵌段共聚物。
聚合物可以包含用取代基化学改性的个别单体的衍生物，包括但不限于烷基化，例如(聚甲基丙烯酸C1-C16烷基酯)、酰胺化、酯化或盐形成。聚合物还可以通过特定共价连接聚合物的主链(主链改性)或末端(末端基团改性)来改性。此类改性的实例包括连接PEG(PEG化)或白蛋白。
在某些实施例中，靶向颗粒的聚合物可以是聚(二噁烷酮)，如聚(对二噁烷酮)，参见美国专利第4,052,988号；第4,643,191号；第5,080,664号；和第5,019,094号，所述专利的内容在此以全文引用的方式并入。聚合物可以是聚(氧化烯)和聚(对二噁烷酮)的共聚物，例如聚(乙二醇)(PEG)和聚(对二噁烷酮)的嵌段共聚物，其可以包括或可以不包括PLA，参见美国专利第6,599,519号，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。在一个优选实施例中，靶向颗粒是聚(乙二醇)-聚(乳酸-共乙醇酸)嵌段共聚物(PEG-PLGA)。
靶向颗粒的聚合物可以是聚酯、聚酯-聚阳离子共聚物、聚酯-聚糖共聚物，参见美国专利第6,410,057号，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，靶向颗粒采用聚合基质，例如聚氧化乙烯(POE)基质。POE嵌段共聚物的实例包括美国专利第5,612,052号和第5,702,717号，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，聚合基质可以是聚丙交酯(PLA)，包括聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D-,L-乳酸)；聚乙交酯PGA；聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)；聚(乳酸-共-二噁烷酮)(PLDO)，其可以包括或不包括聚乙二醇(PEG)。参见美国专利第4,862,168号；第4,452,973号；第4,716,203号；第4,942,035号；第5,384,333号；第5,449,513号；第5,476,909号；第5,510,103号；第5,543,158号；第5,548,035号；第5,683,7230 5,702,717号；第6,616,941号(例如表1)；第6,916,788号(例如表4，PLA-PEG、PLDO-PEG、PLGA-PEG)；第7,217,770号(PEG-PLA)；第7,311,901号(两性共聚物)；第7,550,157号(mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLDO、mPEG-PLGA和胶束)；美国专利公开第2010/0008998号(表2，PEG2000/4000/10,000-mPEG-PLA)；PCT公开第2009/084801号(mPEG-PLA和mPEG-PLGA胶束)，所述专利的内容在此以全文引用的方式并入。在一些实施例中，聚合基质可以包含蛋白质、脂质、表面活性剂、碳水化合物、小分子和/或多核苷酸。在一些实施例中，靶向颗粒包含涂有脂质(例如，脂质单层或脂质双层)的聚合核。在某些实施例中，颗粒是脂质体或胶束。待递送的药物组合物和/或靶向剂可以在颗粒内部(例如在核中)、颗粒的壳或涂层部分中，或与颗粒的表面缔合。
在另外的实施例中，靶向颗粒可以是非聚合物颗粒(例如金属颗粒、量子点、陶瓷、无机材料、骨等)。用于靶向颗粒的非聚合物材料的非限制性实例包括选自由以下组成的组的材料：氧化铝(Al2O3)、二氧化钛(TiO2)、氧化锆(ZrO2)、碳化硅(SiC)、二氧化硅(SiO2)、尖晶石(MgAl2O4)、选自3Al2O3-2SiO2或2Al2O3-SiO2的莫来石、氮化铝(AlN)、碳化铝(Al4C3)、氮化硅(Si3N4)、氮化硅碳(SiCN)、氮化硅铝碳(SiAlCN)、氧化锌(ZnO)、钛酸钡(BaTiO3)、氧化硼、氮化硼、氮化锆(ZrN)、碳化钛(TiC)、氮化钛(TiN)、Pd、Ag、Cu、Fe、Ni、W、Ti、Mo、Zn、Pt、Sn、Pb、Ga、Mg、Bi、Al、不锈钢、碳纳米管(CNT)、碳纳米纤维(CNF)、石墨烯、碳纳米角(CNH)、碳纤维和碳纳米颗粒(CNP)。在一些实施例中，待递送的药物组合物和/或靶向部分可以与非聚合颗粒共价缔合。在一些实施例中，待递送的药物组合物和/或靶向部分与非聚合颗粒非共价缔合。
靶向颗粒可以具有与本发明的目标一致的任何尺寸。例如，靶向颗粒可以是纳米颗粒、微粒或其混合物。在一些实施例中，靶向颗粒在至少一个维度(例如，直径或长度)上测量小于500μm或小于300μm。靶向颗粒还可在至少一个维度上测量小于100μm、小于75μm、小于50μm或小于10μm。在一些实施例中，靶向颗粒在至少一个维度上测量小于1000纳米(nm)。例如，靶向纳米颗粒可以在至少一个维度上测量小于900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm或100nm。在另外的实施例中，靶向纳米颗粒在至少一个维度上为约50nm至约200nm。在某些实施例中，靶向颗粒的直径为约125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm或170nm。在优选实施例中，靶向颗粒的直径为约166nm。
在实施例中，靶向颗粒携带电荷。在某些实施例中，靶向颗粒具有约-3至约-25mV的负表面电荷。在某些实施例中，靶向颗粒具有约-8mV、-9mV、-10mV、-11mV、-12mV、-13mV、-14mV、-15mV、-16mV或-17mV的表面电荷。在优选实施例中，靶向颗粒具有约-12mV的负表面电荷。
支架颗粒可以具有与本发明的目标一致的任何架构。在一些实施例中，支架颗粒展现聚合核/壳架构。如本文所用，术语“核-壳架构”是指包含至少两个不同组分的复合颗粒，其中一个组分作为核位于中心，并且第二组分作为壳包围核。核-壳架构聚合物类型的非限制性实例包括金属核和不同金属壳，金属核和非金属壳，金属核和聚合物壳，非金属核和非金属壳，聚合物核和非金属壳，和聚合物核和聚合物壳，其中两种聚合物不同。支架颗粒可用于赋予复合膜各种特性，包括但不限于：增加的密度和期望的机械特性和/或流变特性，如弹性模量、抗拉强度和抗压强度。在一些实施例中，支架颗粒是非水凝胶颗粒。如本文所用，水凝胶颗粒是指亲水的聚合物链网络，有时以胶体凝胶的形式存在，其中水是分散介质。支架颗粒可由任何材料形成，并且可具有上文针对靶向颗粒叙述的任何尺寸。在某些实施例中，支架颗粒的直径为约130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、171nm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm或180nm。在优选实施例中，支架颗粒的直径为约175nm。
可以独立于支架粒度来选择靶向颗粒的大小。或者，可以彼此结合选择靶向颗粒和支架颗粒的大小。另外，靶向颗粒和支架颗粒可以具有任何期望的形状或形态。靶向颗粒和支架颗粒可独立地展现球形形状、椭圆形形状、多边形形状或不规则形状。可选择颗粒的形状和尺寸以促进颗粒填充特征，以增强复合膜的一个或多个特性。在优选实施例中，颗粒具有球形形态。
在一些实施例中，靶向颗粒和支架颗粒在交联之前经由离子或静电相互作用彼此相互作用。例如，靶向颗粒和支架颗粒可以通过有吸引力的偶极-偶极力相互作用。替代地，靶向颗粒和支架颗粒还可以展现相反电荷表面，以促进颗粒之间的离子结合。
在实施例中，支架颗粒携带电荷。在某些实施例中，支架颗粒具有约3至约50mV的正表面电荷。在某些实施例中，支架颗粒具有约17mV、18mV、19mV、20mV、21mV、22mV、23mV、24mV、25mV、26mV、27mV、28mV、29mV或30mV的正表面电荷。在优选实施例中，支架颗粒具有约23mV的正表面电荷。
手术部位与包含靶向和支架颗粒的颗粒配制物接触。在一些实施例中，靶向颗粒和支架颗粒独立地施加到手术部位。例如，靶向颗粒可以在施加支架颗粒之前施加到手术部位。或者，支架颗粒在施加靶向颗粒之前施加到手术部位。在另外的实施例中，靶向和支架颗粒同时施加到手术部位。
如本文所述，靶向颗粒和支架颗粒交联以在手术部位处提供复合膜，其中复合膜抑制术后粘连的形成。特异性交联机制可以取决于靶向颗粒和支架颗粒的特定架构。例如，交联可以是光引发的。在优选实施例中，光引发用UV光进行。在某些实施例中，光的波长在250nm与450nm之间。在某些实施例中，UV光的波长为约300nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm、350nm、355nm、360nm、361nm、362nm、363nm、364nm、365nm、366nm、367nm、368nm、369nm或370nm。在优选实施例中，交联是用波长为约365nm的UV光来光引发的。在一些实施例中，支架颗粒或靶向颗粒包含用于实现交联的光不稳定基团。在优选实施例中，支架颗粒包含用于实现交联的光不稳定基团。在某些实施例中，所述光不稳定基团是二氮杂环丙烯基。在其它实施例中，可以在交联过程中采用与支架颗粒和靶向颗粒分离的光引发剂。光引发剂可以是颗粒配制物的一部分或独立地添加到手术部位。在另外的实施例中，可以采用非光引发的交联系统，例如异氰酸酯交联机构。表I提供了本文所述的颗粒交联的一些实施例中可以采用的各种系统的列表。图24描绘了这些系统中的若干系统。
表I-交联系统
Figure BDA0003241052720000171
靶向颗粒的药物组合物可以从复合膜释放。如上所述，药物组合物可以有助于抑制术后粘连的形成。药物组合物从复合膜的释放速率可取决于若干考虑因素，包括但不限于药物组合物的特性、靶向颗粒和/或支架颗粒的组成特性和复合膜的宏观特性，例如厚度、密度和孔隙度。在一些实施例中，大于10％的药物组合物在膜形成的24小时内释放。在某些实施例中，约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。在一个优选实施例中，约13.5％或19.1％的一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。在另一优选实施例中，约13.5％的Dex-Pal和约19.1％的Dex在膜形成的24小时内释放。此外，复合膜可以表现出药物组合物的持续释放。例如，一种或多种药物组合物可以在至少14天的时间段内释放。在某些实施例中，一种或多种药物组合物在至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50天的时间段内释放。在一些实施例中，支架颗粒可以含有一种或多种药物组合物。由支架颗粒携带的药物组合物可以与由靶向颗粒携带的药物组合物不同。
在另一方面，处理手术部位的方法包括使所述手术部位与包含支架颗粒和载体颗粒的颗粒配制物接触。在某些实施例中，本文所述的主题涉及包含载体颗粒和支架颗粒的组合物。如本文所用，“载体颗粒”是指将一种或多种药物组合物传输到手术部位的颗粒。支架颗粒和载体颗粒交联以在手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜抑制术后粘连的形成。药物组合物可以包含本文所述的任何药物组合物，包括抑制组织炎症的组合物。类似地，载体颗粒、支架颗粒和复合膜可以具有上文所述的任何组合物和/或特性。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及一种复合膜，其通过使包含靶向颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及一种复合膜，其通过使包含载体颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
如本文所用，“复合膜”是指通过个别靶向颗粒或载体颗粒和支架颗粒的交联产生的材料。在某些实施例中，当复合膜由包含纳米颗粒的配制物产生时，复合膜可被称为“纳米贴片”。
III.制造物品
在另一方面，本文描述了制造物品，例如含有可用于防止术后粘连的材料的“试剂盒”。在某些实施例中，所述试剂盒包含(i)容纳包含靶向颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；和(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。在其它实施例中，试剂盒包含(i)容纳包含载体颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；和(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。试剂盒还可包括容器上或与容器相关联的标签或包装插页。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗剂产品的商业包装中的说明，其含有关于使用此类治疗剂产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可由各种例如玻璃或塑料的材料形成。标签或包装插页指示颗粒可用于防止术后粘连。替代地或另外，制造物品还可包括第二容器，所述第二容器包含磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。其还可包含从商业和用户角度期望的其它材料，包括稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒还可包括用于施用颗粒的指示。例如，由于试剂盒包含含有第一颗粒配制物的小瓶以及含有第二颗粒配制物的小瓶，所述第一颗粒配制物包含靶向颗粒或载体颗粒，所述第二颗粒配制物包含支架颗粒，试剂盒还可包含用于同时、序贯或分开施用靶向或载体颗粒和支架颗粒的指示。试剂盒可另外包含关于如何使特定颗粒交联的说明。
在某些实施例中，试剂盒可包含促进两种颗粒交联以形成复合膜的材料、化学物或器件。
在某些其它实施例中，试剂盒的单独组分可以包含用于容纳单独组合物的容器，例如分瓶或分箔包装，然而，单独组合物也可容纳在单个未分开容器中。通常，试剂盒包括用于使用单独组分的指示。
IV.方法
在某些实施例中，本文所述的主题涉及一种处理手术部位的方法，其包含：
使所述手术部位与包含靶向颗粒和支架颗粒的颗粒配制物接触；以及
交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在所述手术部位处提供复合膜，其中术后粘连的形成被所述复合膜抑制。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与靶向颗粒接触；
使所述靶向颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
在上述方法的某些实施例中，在所述靶向颗粒与所述手术部位接触之后，所述靶向颗粒与盐水溶液接触。
在以上方法的某些实施例中，所述靶向颗粒包含靶向位于所述手术部位处的一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分。
在以上方法的某些实施例中，所述一种或多种生物分子物质选自由以下组成的组：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、整联蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、BM-40/骨粘连蛋白/SPARC、BM-90和bFGF。
在以上方法的优选实施例中，多种生物分子物质中之一为IV型胶原蛋白。
在以上方法的某些实施例中，靶向一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分是具有KLWVLPKGGGC(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的靶向IV型胶原蛋白的肽。
在以上方法的某些实施例中，靶向颗粒和/或支架颗粒是纳米颗粒、微粒或其混合物。
在上述方法的某些实施例中，靶向颗粒和/或支架颗粒是纳米颗粒。
在上述方法的某些实施例中，靶向颗粒包含聚合结构。
在以上方法的某些实施例中，靶向颗粒包含聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段聚合物。
在上述方法的某些实施例中，靶向颗粒还包含一种或多种药物组合物。
在以上方法的某些实施例中，一种或多种药物组合物抑制组织炎症。
在以上方法的某些实施例中，手术部位处发炎细胞因子和/或趋化因子的存在降低。
在以上方法的某些实施例中，所述方法还包含从所述复合膜释放所述一种或多种药物组合物。
在以上方法的某些实施例中，大于10％的一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。
在以上方法的某些实施例中，一或多种药物组合物在至少14天的时间段内释放。
在以上方法的某些实施例中，一种或多种药物组合物是地塞米松或地塞米松棕榈酸酯。
在以上方法的某些实施例中，支架颗粒是非水凝胶颗粒。
在以上方法的某些实施例中，支架颗粒包括核-壳架构。
在一个优选实施例中，支架颗粒包含聚(乳酸-共-乙醇酸)核和聚乙烯亚胺壳。
在以上方法的某些实施例中，靶向颗粒和支架颗粒在交联之前经由离子或静电相互作用彼此相互作用。
在以上方法的某些实施例中，靶向颗粒和支架颗粒带相反电荷。
在某些实施例中，靶向颗粒具有负电荷，并且支架颗粒具有正电荷。
在以上方法的某些实施例中，交联是光引发的。
在以上方法的某些实施例中，光引发的交联包含UV光的施加。
在以上方法的某些实施例中，UV光具有约365nm的波长。
在以上方法的某些实施例中，支架颗粒包含一个或多个光不稳定基团。
在以上方法的某些实施例中，所述一个或多个光不稳定基团为二氮杂环丙烯官能团。
在以上方法的某些实施例中，复合膜是可生物降解的。
在以上方法的某些实施例中，手术部位包含腹膜表面。
在以上方法的某些实施例中，在将所述支架颗粒施加到所述手术部位之前将所述靶向颗粒施加到所述手术部位。
在以上方法的某些实施例中，所述靶向颗粒与所述手术部位的一个或多个表面结合。如本文所用，“与一个或多个表面结合”是指靶向颗粒定位到所述表面，其中所述颗粒静止、静置或邻近于所述表面。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及一种处理手术部位的方法，其包含：
使所述手术部位与颗粒配制物接触，所述颗粒配制物包含支架颗粒和传输一种或多种药物组合物的载体颗粒；以及
交联所述载体颗粒和支架颗粒以在所述手术部位处提供复合膜，其中术后粘连的形成被所述复合膜抑制。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与载体颗粒接触；
使所述载体颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述载体颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
在上述方法的某些实施例中，在所述载体颗粒与所述手术部位接触之后，所述载体颗粒与盐水溶液接触。
在以上方法的某些实施例中，一种或多种药物组合物抑制组织炎症。
在以上方法的某些实施例中，手术部位处发炎细胞因子和/或趋化因子的存在降低。
在以上方法的某些实施例中，所述方法还包含从所述复合膜释放所述一种或多种药物组合物。
在以上方法的某些实施例中，一或多种药物组合物在至少14天的时间段内释放。
在以上方法的某些实施例中，一种或多种药物组合物是地塞米松或地塞米松棕榈酸酯。
在以上方法的某些实施例中，支架颗粒是非水凝胶颗粒。
在以上方法的某些实施例中，支架颗粒和/或载体颗粒是纳米颗粒、微粒或其混合物。
在上述方法的某些实施例中，支架颗粒和/或载体颗粒是纳米颗粒。
在以上方法的某些实施例中，载体颗粒包含聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段聚合物。
在以上方法的某些实施例中，支架颗粒包括核-壳架构。
在一个优选实施例中，支架颗粒包含聚(乳酸-共-乙醇酸)核和聚乙烯亚胺壳。
在以上方法的某些实施例中，载体颗粒和支架颗粒在交联之前经由离子或静电相互作用彼此相互作用。
在以上方法的某些实施例中，载体颗粒和支架颗粒带相反电荷。
在某些实施例中，靶向颗粒具有负电荷，并且支架颗粒具有正电荷。
在以上方法的某些实施例中，交联是光引发的。
在以上方法的某些实施例中，其中光引发的交联包含UV光的施加。
在以上方法的某些实施例中，UV光具有约365nm的波长。
在以上方法的某些实施例中，支架颗粒包含一个或多个光不稳定基团。
在以上方法的某些实施例中，所述一个或多个光不稳定基团为二氮杂环丙烯官能团。
在以上方法的某些实施例中，复合膜是可生物降解的。
在以上方法的某些实施例中，所述载体颗粒包含靶向位于所述手术部位处的一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分。
在以上方法的某些实施例中，所述一种或多种生物分子物质选自由以下组成的组：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、整联蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、BM-40/骨粘连蛋白/SPARC、BM-90和bFGF。
在以上方法的优选实施例中，多种生物分子物质中之一为IV型胶原蛋白。
在以上方法的某些实施例中，靶向一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分是具有KLWVLPKGGGC(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的靶向IV型胶原蛋白的肽。
在以上方法的某些实施例中，所述载体颗粒与所述手术部位的一个或多个表面结合。
在以上方法的某些实施例中，手术部位包含腹膜表面。
在所述方法的某些实施例中，大于10％的一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。在某些实施例中，约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。在一个优选实施例中，约13.5％或19.1％的一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。在另一优选实施例中，约13.5％的Dex-Pal和约19.1％的Dex在膜形成的24小时内释放。
在以上方法的某些实施例中，一或多种药物组合物在至少14天的时间段内从所述复合膜释放。在某些实施例中，一种或多种药物组合物在至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50天的时间段内释放。
在以上方法的某些实施例中，靶向颗粒或载体颗粒与基底膜结合。在某些实施例中，基底膜为IV型胶原蛋白。在靶向颗粒或载体颗粒与基底膜结合之后，任选地洗掉靶向颗粒或载体颗粒。在某些实施例中，任选地用盐水洗掉靶向颗粒或载体颗粒。随后，将支架颗粒施加到靶向颗粒或载体颗粒。在某些实施例中，支架颗粒通过静电或离子相互作用与靶向颗粒或载体颗粒相互作用。在某些实施例中，靶向颗粒或载体颗粒带负电荷，并且支架颗粒带正电荷。此后，交联支架颗粒与靶向颗粒或载体颗粒继续进行。在某些实施例中，交联可以是光引发的。在某些实施例中，光引发的交联包含UV光的施加。此后，任选地洗掉支架颗粒。在某些实施例中，任选地用盐水洗掉支架颗粒。
本文描述的主题针对以下实施例：
1.一种处理手术部位的方法，其包含：
使所述手术部位与包含靶向颗粒和支架颗粒的颗粒配制物接触；以及
交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在所述手术部位处提供复合膜，其中术后粘连的形成被所述复合膜抑制。
2.一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与靶向颗粒接触；
使所述靶向颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
3.如实施例1或2所述的方法，其中所述靶向颗粒包含靶向位于所述手术部位处的一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分。
4.根据实施例3所述的方法，其中所述一种或多种生物分子物质选自由以下组成的组：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、内联蛋白、整联蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、BM-40/骨粘连蛋白/SPARC、BM-90和bFGF。
5.根据实施例3或4所述的方法，其中所述多种生物分子物质之一是IV型胶原蛋白。
6.根据实施例3所述的方法，其中靶向配体包含所述一个或多个化学部分。
7.根据实施例1或2所述的方法，其中所述靶向颗粒和/或支架颗粒是纳米颗粒、微粒或其混合物。
8.根据实施例1、2或7中任一项所述的方法，其中所述靶向颗粒和支架颗粒是纳米颗粒。
9.根据实施例1或2所述的方法，其中所述靶向颗粒还包含一种或多种药物组合物。
10.根据实施例9所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物选自由以下组成的组：地塞米松、地塞米松21-棕榈酸酯和其组合。
11.根据实施例9或10所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物抑制组织炎症。
12.根据实施例11所述的方法，其中所述手术部位处的炎性细胞因子和/或趋化因子的存在减少。
13.根据实施例9所述的方法，其还包含从所述复合膜释放所述一种或多种药物组合物。
14.根据实施例13所述的方法，其中大于10％的所述一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。
15.根据实施例13所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物在至少14天的时间段内释放。
16.根据实施例1或2所述的方法，其中所述支架颗粒是非水凝胶颗粒。
17.根据实施例1或2所述的方法，其中所述支架颗粒包含核-壳架构。
18.根据实施例1、2或17所述的方法，其中所述支架颗粒包含聚(乳酸-共-乙醇酸)核和聚乙烯亚胺壳。
19.根据实施例1或2所述的方法，其中所述靶向颗粒包含聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段聚合物。
20.根据实施例1或2所述的方法，其中所述靶向颗粒和支架颗粒在交联之前经由离子或静电相互作用彼此相互作用。
21.根据实施例1、2或20中任一项所述的方法，其中所述靶向颗粒和支架颗粒带相反电荷。
22.根据实施例1或2所述的方法，其中所述交联为光引发的。
23.根据实施例22所述的方法，其中所述光引发的交联包含紫外(UV)光的施加。
24.根据实施例23所述的方法，其中所述UV光具有约365nm的波长。
25.根据实施例1或2所述的方法，其中所述支架颗粒包含一个或多个光不稳定基团。
26.根据实施例25所述的方法，其中所述一个或多个光不稳定基团是二氮杂环丙烯官能团。
27.根据实施例1或2所述的方法，其中所述复合膜为生物可降解的。
28.根据实施例1或2所述的方法，其中所述手术部位包含腹膜表面。
29.根据实施例1所述的方法，其中在将所述支架颗粒施加到所述手术部位之前将所述靶向颗粒施加到所述手术部位。
30.根据实施例1或2所述的方法，其中所述靶向颗粒与所述手术部位的一个或多个表面结合。
31.根据实施例1或2所述的方法，其中所述靶向颗粒包含靶向一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分，其中所述一种或多种生物分子物质是IV型胶原蛋白，其中所述靶向颗粒包含聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段聚合物，并且所述靶向颗粒还包含一种或多种药物组合物，其中所述药物组合物是地塞米松和地塞米松21-棕榈酸酯；并且所述支架颗粒包含聚(乳酸-共-乙醇酸)核和聚乙烯亚胺壳，并且被一个或多个光不稳定基团进一步官能化，其中所述一个或多个光不稳定基团是二氮杂环丙烯官能团。
32.一种处理手术部位的方法，其包含：
使所述手术部位与颗粒配制物接触，所述颗粒配制物包含支架颗粒和传输一种或多种药物组合物的载体颗粒；以及
交联所述载体颗粒和支架颗粒以在所述手术部位处提供复合膜，其中术后粘连的形成被所述复合膜抑制。
33.一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与载体颗粒接触；
使所述载体颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述载体颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
34.根据实施例33所述的方法，其中所述载体颗粒传输一种或多种药物组合物。
35.根据实施例32到34中任一项所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物抑制组织炎症。
36.根据实施例35所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物选自由以下组成的组：地塞米松、地塞米松21-棕榈酸酯和其组合。
37.根据实施例35所述的方法，其中所述手术部位处的炎性细胞因子和/或趋化因子的存在减少。
38.根据实施例32到34中任一项所述的方法，其还包含从所述复合膜释放所述一种或多种药物组合物。
39.根据实施例38所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物在至少14天的时间段内释放。
40.根据实施例32或33所述的方法，其中所述支架颗粒是非水凝胶颗粒。
41.根据实施例32或33所述的方法，其中所述支架颗粒和/或载体颗粒是纳米颗粒、微粒或其混合物。
42.根据实施例32、33或41所述的方法，其中所述载体颗粒和支架颗粒是纳米颗粒。
43.根据实施例32或33所述的方法，其中所述载体颗粒和支架颗粒在交联之前经由离子或静电相互作用彼此相互作用。
44.根据实施例32、33或43中任一项所述的方法，其中所述载体颗粒和支架颗粒带相反电荷。
45.根据实施例32或33所述的方法，其中所述交联为光引发的。
46.根据实施例45所述的方法，其中所述光引发的交联包含UV光的施加。
47.根据实施例46所述的方法，其中所述UV光具有约365nm的波长。
48.根据实施例32或33所述的方法，其中所述支架颗粒或载体颗粒包含一个或多个光不稳定基团。
49.根据实施例48所述的方法，其中所述一或多个光不稳定基团为二氮杂环丙烯官能团。
50.根据实施例32或33所述的方法，其中所述复合膜为生物可降解的。
51.根据实施例32或33所述的方法，其中所述靶向颗粒包含靶向位于所述手术部位处的一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分。
52.根据实施例51所述的方法，其中所述一种或多种生物分子物质选自由以下组成的组：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、整联蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、BM-40/骨粘连蛋白/SPARC、BM-90和bFGF。
53.根据实施例52所述的方法，其中所述多种生物分子物质之一是IV型胶原蛋白。
54.根据实施例32或33所述的方法，其中所述载体颗粒与所述手术部位的一个或多个表面结合。
55.根据实施例32或33所述的方法，其中所述手术部位包含腹膜表面。
56.一种试剂盒，其包含：
(i)容纳包含靶向颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；以及
(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。
57.一种试剂盒，其包含：
(i)容纳包含载体颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；以及
(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。
58.一种包含靶向颗粒和支架颗粒的组合物。
59.一种包含载体颗粒和支架颗粒的组合物。
60.一种复合膜，其通过使包含靶向颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
61.一种复合膜，其通过使包含载体颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
所公开的主题进一步描述于以下非限制性实例中。应当理解的是，尽管这些实例说明了本发明的优选实施例，但是其仅仅通过说明的方式提供。
实例1-用于抑制术后粘连的复合膜
在此，我们报告了用于防止术后粘连的生物靶向、可光交联的纳米贴片(pCNP)的开发。pCNP由两种NP构成。第一NP(NP-A)被设计成携带抗炎货物(cargo)并且特异性结合到受损伤部位。由于受损伤的上皮/间皮表面的标志是暴露的基底膜，并且基底膜的组分是IV型胶原蛋白，因此我们选择使NP-A靶向IV型胶原蛋白。第二NP(NP-B)被设计成具有带正电荷的表面，与NP-A表面相反，以使得能够通过离子相互作用吸附于NP-A层(图1A)。所述两种NP随后可通过UV照射通过二氮杂环丙烯反应性基团交联以形成纳米贴片。pCNP被设计成按顺序腹膜内施用(图1B)。首先，在损伤部位温育NP-A悬浮液，以允许与基底膜特异性结合，所述基底膜在间皮损伤后暴露。提供稳定悬浮液用于施用的颗粒特性将会在施用单一颗粒时由于空间和离子位阻而产生不充分的低密度的屏障。因此，随后施用含有NP-B的悬浮液，以通过在带相反电荷的NP-A与NP-B之间的离子吸附快速形成致密层。然后用波长为365nm的UV光照射受损伤部位，以引发两种纳米颗粒的交联，从而在受损伤的腹膜表面之间形成特定且致密的生物屏障。
pCNP的配制和表征
使用聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段共聚物(PEG-PLGA)配制NP-A，所述PEG-PLGA用靶向IV型胶原蛋白的肽官能化。将防止粘连形成的抗炎剂地塞米松21-棕榈酸酯(Dex-Pal)以65.2±4.02μg/mg的加载量包封到NP-A中。NP-A的物理表征证实球状形态，平均流体动力学直径为166.1±1.8nm，表面带负电荷-12.1±0.3mV。NP-B被配制成含有PLGA-PEG核和分支聚乙烯亚胺(PEI)壳。NP-B的表面被官能化以显示二氮杂环丙烯基团以允许NP之间的光诱导交联。NP-B的特征在于平均流体动力学直径为175.1±28.7nm和表面带正电荷23.0±3.0mV。
为了确认pCNP形成纳米贴片的能力，我们首先使用光DSC分析验证NP-A与NP-B之间的交联反应(图2A-图2C)。我们发现，在暴露UV照射之后约1.5分钟出现反应峰并且在10分钟内完成反应。反应热看起来取决于NP-B的浓度，并且因此取决于二氮杂环丙烯基的浓度。值得注意的是，在没有NP-A或NP-B的情况下，通过UV照射不会在水中产生可检测到的热量。
pCNP在体外在富含IV型胶原蛋白的表面上形成高密度纳米贴片
然后，我们证明了NP方案可以在体外以生物学靶向方式形成致密且稳定的纳米贴片。将NP施加于未经涂布或经IV型胶原蛋白涂布的载玻片，并且检查纳米贴片的形成。IV型胶原蛋白表面用于模拟受损伤的腹膜表面，因为IV型胶原蛋白是基底膜的主要成分之一。纳米贴片的密度由FESEM确认(图3a-图3p，图4A和图4B)，并且使用FESEM图像的积分灰度值进行定量(图3Q，图3R)。我们发现，由生物靶向NP(NP-A)形成的纳米贴片密度比IV型胶原蛋白涂布表面上的非靶向(NP-A')的纳米贴片密度高约2.1倍(在10k和20k放大的FESEM图像中的灰度值积分密度的平均倍数)。另外，IV型胶原蛋白涂布表面上的pCNP的密度比仅NP-A高约2.6倍，并且比仅NP-B高约3.1倍，表明pCNP在形成高纳米贴片密度方面比其任一组成NP更有效。IV型胶原蛋白涂布表面上的pCNP的密度比未经涂布表面上的密度高约3.0倍，显示了pCNP对富含IV型胶原蛋白的表面的特异性。此处，NP-A与NP-B两者都与IV型胶原蛋白涂布的表面结合。NP-A层通过NP-A与IV型胶原蛋白之间的特异性结合形成。NP-B层通过NP-B与IV型胶原蛋白之间的光交联形成。然而，NP-A或NP-B由于空间和离子位阻而具有低密度的问题，这与我们的假设一致。因此，需要NP-A与NP-B两者以形成有效的纳米贴片屏障。我们的发现证明了靶向配体、NP-B的存在和UV诱导的交联在实现高纳米贴片密度中的重要性。
pCNP在体外的释放概况和安全性
pCNP在IV型胶原蛋白涂布的玻璃盖上形成，并且在PBS中在37℃下温育。在有或无酯酶出现的情况下，测试了Dex-Pal和其活性形式药物地塞米松(Dex)的释放(图5)。在24小时内观察到Dex-Pal和Dex的爆发性释放(burst release)分别为13.5％和19.1％，这可以减少炎症。在两周内持续释放Dex-Pal和Dex将进一步在愈合过程期间提供抗炎。为了确认pCNP的安全性，我们在IV型胶原蛋白涂布的96孔板上使用NIH/3T3成纤维细胞进行MTS测定。在具有或不具有UV照射的情况下在通过pCNP处理后2小时、24小时、72小时的细胞活力高于约80％(图6)，表明pCNP以及UV照射的安全使用。
pCNP防止大鼠壁腹膜切除(PPE)模型中的术后腹膜粘连我们检查了pCNP在体内防止术后腹膜粘连的能力(图7A-图7M)。使用大鼠壁腹膜切除(PPE)模型研究术后粘连(图8)。进行存活手术，从左腹壁切除一片约2×5cm的腹膜与下面的肌肉层。我们在大鼠PPE模型中进行腹壁的免疫组织化学(IHC)分析，并且显示受损伤的腹膜表面确实暴露IV型胶原蛋白、I型胶原蛋白和纤连蛋白(图9)。此类发现表明，我们的靶向IV型胶原蛋白的策略是可行的。切除后，将大鼠放置在切除部位的同侧上，以便暴露受损伤腔进行NP温育。向腹膜腔施用NP-A溶液并温育10分钟。在去除NPA溶液之后，腹膜腔用盐水洗涤两次。在NP-A之后，施用NP-B并且在UV照射下温育10分钟。然后用盐水再洗涤腹膜腔两次。然后用缝合线封闭腹部手术伤口。(图7A、图10A和图10B)。对照实验组包括盐水温育(PBS组)、仅NP-A(仅A)、NP-A +NP-A温育(A+A)、非靶向NP-A与NP-B和UV交联(A'+B)、不包封Dex-Pal的pCNP(不含Dex的pCNP)，以及可商购的粘连屏障
Figure BDA0003241052720000331
为了评估术后粘连的质量和数量，在手术后14天进行二次剖腹术。基于先前描述的评分系统对粘连进行分级。
如图7B中所见，PPE模型在PBS对照组中诱导强术后粘连。相比之下，在用pCNP处理的大鼠中观察到最少粘连(图7B、图11和12)。其它实验组(仅A、A+A、A'+B、不含Dex的pCNP、
Figure BDA0003241052720000332
)均表现出中间水平的防止粘连。使用四点量表定性评分系统对粘连水平进行定量(图7K)。我们证明了pCNP是防止粘连最有效的，中值得分为1，随后为
Figure BDA0003241052720000333
(2)、A+A(2.5)。我们还用5点定量评分系统评估粘连的质量(图7L)。与数量得分类似，pCNP处理在防止粘连方面最为有效(中值得分为1)，并且PBS为最不有效的。所有含有NP-A的组都能够减少粘连，这可能是由于包封在NP内的地塞米松的作用。重要的是，我们观察到pCNP比NP-A+NP-A、NP-A'+NP-B和不含Dex的pCNP显著更有效，这分别证明了与NP-B交联、生物靶向和控制释放Dex-Pal的重要性。综观来说，大鼠PPE模型中pCNP的特性使其在防止术后腹膜粘连方面比商业上使用的粘连屏障
Figure BDA0003241052720000335
更有效。
为了进一步定量粘连水平，我们在组织学上检查了粘连(图7C-图7J，图13和14)。为了比较大鼠在不同处理之间的粘连，我们随机选择组织学图像中的三个位置并且测量粘连/纤维化的厚度。粘连的平均厚度在PBS组中为2.31±0.13mm，在仅NP-A组中为2.05±0.17mm，在NP-A加NP-A组中为2.41±0.23mm，在NP-A'加NP-B组中为2.23±0.11mm，在不含Dex的pCNP组中为1.32±0.11，在
Figure BDA0003241052720000334
组中为1.00±0.19，并且在pPCN组中为0.24±0.04mm(图7M)。我们证明了pCNP是抑制术后粘连最有效的处理，损伤区域中具有最少纤维化。
pCNP在大鼠壁腹膜切除(PPE)模型中显示出低毒性
我们在大鼠中评估了潜在的全身性不良事件。潜在副作用包括贫血、地塞米松全身暴露导致的高WBC、出血或感染。在PPE手术后，在动物中获得全血细胞计数(CBC)。(图15a和b，图16)。在实验组中手术后，红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)和血小板都在正常范围内。网织红细胞的增加指示在手术期间失血和手术后RBC恢复。在24小时检测到白细胞计数(WBC)减少，但在72小时后回到正常范围。在手术后观察到淋巴细胞的有限减少以及中性粒细胞和单核细胞的增加，与术后反应一致。在手术与二次剖腹术之间的14天内，所有大鼠都存活，身体症状没有明显恶化，表明pCNP在大鼠中是安全的。Dex-Pal的另一个潜在副作用是血糖增加。我们在手术后6小时、24小时、48小时和72小时监测了大鼠的血糖水平(图15C)。在手术后6小时，在所有处理组中观察到初始增加，可能是由于应激和响应于应激释放糖皮质激素。从那时起，血糖降低并且在手术后72小时达到正常水平。
pCNP减少大鼠壁腹膜切除(PPE)模型中血清中的炎性细胞因子/趋化因子
由于炎性水平在粘连形成中起重要作用，我们使用免疫学多重测定，评估在使用不同处理的手术后24小时和72小时血清中的细胞因子/趋化因子(图17、图18)。分层聚类示出了PBS、不含Dex的pCNP和
Figure BDA0003241052720000341
组聚集在一起并且示出了炎性标记物的高表达，如白介素家族、TNFα、IFNγ、G-CSF和MCP-1。相反，pCNP组显示出与未手术组相似的炎性水平，表明在术后愈合过程期间炎症水平降低会阻止粘连形成。
pCNP在大鼠壁腹膜切除(PPE)模型中在术后愈合过程中保留在胶原蛋白纤维上并 减少局部炎症
为了进一步理解pCNP在愈合过程中的功能，我们用pCNP处理接受PPE的大鼠，并且在6小时、24小时、72小时、1周和2周后获得其受损伤的腹壁。FESEM图像显示胶原蛋白纤维在PPE模型中暴露，并且在2周后恢复受损伤表面(图19)。通过放大表面，我们观察到在整个过程中形成并保留在胶原蛋白纤维上的致密NP层(图20A，图21)。我们还发现NP密度在2周后降低，表明pCNP的生物降解。苏木精和伊红(H&E)染色显示，轻度炎症在6小时发生，主要是由于手术，并且其它实验组中没有重度活动性炎症(免疫浸润)(图20B，图21)。通过CD45免疫组织化学(IHC)进一步证实局部炎性程度，与H&E染色结果一致(图20C，图23)。这表明pCNP是生物相容的并且在施用pCNP的组织中不引起任何重度炎症。
讨论
这项研究中的挑战涉及粘连形成是定性和定量的事实。为了充分捕获粘连的两个量度，我们利用完善的粘连评分系统来分析我们的体内数据。为了避免偏倚，我们在此实验期间对外科医生设盲。此外，本文我们还包括了原始图像，以实现无偏倚的解释。
我们也想指出，pCNP在我们的研究中是安全的。鉴于pCNP的材料一般被看作是安全(GRAS)材料，我们认为这种技术很容易转化为临床实践。
总之，我们报告了防止术后粘连的首个生物学靶向方法。我们将靶向IV型胶原蛋白的NP与光可交联NP组合，以生物靶向方式在受损伤的上皮/间皮表面上形成致密屏障。屏障(pCNP)还能够递送抗炎治疗剂以进一步防止粘连形成。我们的研究还展示了生物靶向纳米材料的潜在应用。
材料和方法
材料
甲氧基-聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段共聚物(mPEG-PLGA)(AK029；LA：GA＝50:50(w：w)；MW：约3000:36,000Da)；聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚(乙二醇)-顺丁烯二酰亚胺嵌段共聚物(PLGA-PEG-Mal)(AI110；MW：约30,000-5,000Da)、聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚(乙二醇)-羧酸嵌段共聚物(PLGA-PEG-COOH)(AI034；MW：约3,400：17,000Da)从
Figure BDA0003241052720000361
获得。具有KLWVLPKGGGC(SEQ ID NO：1)氨基酸序列的靶向IV型胶原蛋白的肽购自UNC高通量肽合成与阵列工厂(High-Throughput Peptide Synthesis and Array Facility)。肽经由自动Fmoc固相肽合成方法合成，并且通过高效液相色谱法(HPLC)纯化。通过MALDI-TOF质谱和分析型HPLC确认肽均质性。地塞米松21-棕榈酸酯从多伦多研究化工公司(TorontoResearch Chemicals)获得。聚乙烯亚胺(M.N.60,000，50重量％的水溶液，分支)、丙酮、无水二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇(MeOH)、水(HPLC级)从飞世尔科技公司(Fisher Scientific)获得。磺基琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SDA)、EDC/磺基-NHS、三乙胺从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得。
Figure BDA0003241052720000362
从赛诺菲(SanofiBiosurgery)获得。
pCNP制备
pCNP分开制备。通过纳米沉淀技术(28，29)制造NP-A。首先根据先前报告合成经靶向IV型胶原蛋白的肽官能化的聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)(Col-PEG-PLGA)。简言之，将马来酰亚胺官能化的PEG-PLGA(Mal-PEG-PLGA)和靶向IV型胶原蛋白的肽(KLWVLPKGGGC-NH2)(SEQ ID NO:1)以1：1.2摩尔比溶解于5mL无水DMF中。添加三乙胺(5μL)，并将反应物在室温下在氮气下搅拌24小时。将溶液在冷MeOH中沉淀，并以3,000g离心10分钟。将离心块用MeOH洗涤两次，并在真空下干燥。为了制备NP-A，将Col-PEG-PLGA和PEG-PLGA(1：4重量比)溶解于丙酮中，最终聚合物浓度为10mg/mL。将Dex-Pal(总聚合物的5重量％)添加到溶液中。在1：2的油与水比率下，通过注射器将有机相滴加到水相(不含内毒素的H2O)中。将溶液在室温下在真空下搅拌，直到丙酮完全蒸发。将溶液离心并用无内毒素的H2O洗涤。为了制备NP-B，首先通过使用COOH-PEG-PLGA和PEG-PLGA(1：1重量比)，通过类似的纳米沉淀技术制备NP-COOH。将NP-COOH(1mg/mL)与EDC/磺基-NHS在PBS中反应10分钟，随后添加浓度为2mg/mL的分支PEI，最终NP与PEI重量比为5：4。然后将具有PEI层的纳米颗粒(NP-PEI)洗涤两次并收集。接下来，在室温下，将NP-PEI与磺基-LC-SDA(3：1重量％)一起在PBS中搅拌半小时。在用无内毒素H2O洗涤两次之后，最终收获纳米颗粒。
pCNP表征
pCNP的特征在于使用Zetasizer Nano ZS仪器(马尔文公司(Malvern,Inc.))可知的强度平均直径(Dh，也称为流体动力学直径)和平均ζ电位(ζ平均值)。所有测量均基于三个单独测量的平均值。
通过HPLC测试了NP-A中的Dex-Pal的载药量(Dex-Pal的重量除以NP-A的重量)。将已知量的冷冻干燥NP-A溶解于1mL DCM中。在蒸发DCM之后，添加1mL的50％乙腈(ACN)水溶液以溶解所提取的药物。然后通过0.45mm PVDF膜过滤溶液，用于HPLC分析。在236nm下，以20分钟内水中50％至100％ACN的连续梯度流动相检测柱流出物。所有值均基于三个单独重复测量的平均值。
pCNP的体外分析
通过在室温下将聚-D-赖氨酸(PDL)涂布的玻璃盖片(Neuvitro，GG-12-1.5-PDL)在100μg/mLIV型胶原蛋白溶液中温育过夜，制备IV型胶原蛋白涂布的玻璃盖用于体外分析。在使用前洗涤IV型胶原蛋白涂布的玻璃盖两次。
将具有靶向IV型胶原蛋白的配体(NP-A)或不具有靶向IV型胶原蛋白的配体(NP-A')的10mg/mL NP与IV型胶原蛋白涂布或未涂布的玻璃盖一起在室温下温育10分钟。然后用盐水和水洗涤玻璃盖两次。接下来，在365nm和50mW/cm2的UV照射下，将10mg/mL NP-B与玻璃盖一起温育10分钟。然后，用盐水和水洗涤玻璃盖，并在室温下风干。通过蔡司(Zeiss)Supra 25场发射扫描电子显微镜(FESEM)检查NP层形成。
对于体外药物释放概况，pCNP首先在如上所述的IV型胶原蛋白涂布的玻璃盖上形成。将玻璃盖置于具有100U/mL酯酶(嗜热真菌(Tlanuginosus)脂肪酶，西格玛(Sigma))或不具有酯酶的PBS中，并在37℃下振荡。在6小时、24小时、48小时、72小时、120小时、9天和14天时取代释放缓冲液，并且冷冻干燥用于定量分析。用配备有二极管阵列检测器和C1825cm*4.6mm，5μm柱(苏佩克(Supelco)，西格玛)的岛津(Shimadzu)SPD-M20A高效液相色谱(HPLC)进行Dex-Pal及其活性形式地塞米松的累积释放。对于Dex-Pal使用50％乙腈水溶液至100％，并且对于地塞米松使用10％-80％的梯度二元溶剂系统以1mL/分钟的流速洗脱样品。分别以236nm和240nm监测Dex-Pal和地塞米松。重复实验三次。
对于体外细胞毒性分析，用IV型胶原蛋白涂布96孔板，并且用NIH/3T3鼠成纤维细胞以10,000/孔接种2小时和24小时，以5,000/孔接种72小时。将NP-A与Dex-Pal一起或不与Dex-Pal一起温育10分钟，且用盐水洗涤两次。将NP-B在365nm和50mW/cm2UV照射下或不在UV照射下温育10分钟。然后将板用盐水洗涤两次，并且以100微升/孔添加细胞培养基。5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的不同NP浓度用于NP-A和NP-B两者。在2小时、24小时和72小时之后，用MTS测定(CellTiter
Figure BDA0003241052720000381
AQueous One Solution细胞增殖测定，普洛麦格公司(Promega))测试板。
光DSC分析
使用具有PCA配件的Discover DSC，通过光量热法确定交联动力学，所述PCA配件配备有Omnicure S-2000汞UV光源，其具有365nm外部滤光器(特拉华州纽卡斯尔TA仪器)。将20μL纳米颗粒溶液添加到不带盖的铝DSC样品盘中，并放置在DSC池中，在10mL/min氮气流动下保持在5℃的恒定温度下。在2.5分钟的等温步骤之后，将样品在50mW cm-2下暴露于UV光20分钟。焓是通过在暴露20分钟后使用热流值处的水平基线对归一化热流曲线进行积分来计算的。
用于体内功效研究的样本量计算和分析
根据我们的初步数据计算样本量。我们计算出的效应大小为1.821。此效应大小的非参数类比可以p1＝Pr(X<Y)表示，或当H1为真时，组X中的观测值小于组Y中的观测值。正在测试的零假设为p1＝0.5。对于效应大小1.821，p1＝0.099。使用双侧显著性水平为0.05的威尔科克森(Wilcoxon)(曼惠特尼)秩和检验，每组8个样本量将具有80％的能力来检测到组X中的观测值小于组Y中的观测值的概率为0.099。
动物模型
体内分析利用壁腹膜切除(PPE)在大鼠上产生粘连(图8)。简言之，对史泊格多利(Sprague Dawley)大鼠进行存活手术，其中从远离中线剖腹术的左腹壁切除约2x5 cm的腹膜和下面的肌肉层。将伤口用盐水洗涤并闭合。在14天之后，进行二次剖腹术以根据文献中描述的评分系统评估粘连形成。简言之，进行用于定性评估粘连的四点量表，其中0＝无粘连；1＝膜性粘连；2＝中等厚度粘连；3＝致密厚度粘连。进行用于定量评估粘连的定五点量表，其中粘连区域到相对于手术区域的百分比定量为0＝0％粘连；1＝小于25％；2＝25％到49％；3＝50％到74％；4＝75％到100％粘连。
用pCNP处理大鼠上的受损伤表面
25-45周龄和400-600g体重的史泊格多利大鼠经历上述存活手术。在闭合之前，将大鼠放置在切除物同侧上以形成袋状腔用于NP温育(图10A和图10B)。首先向腹膜腔施用10mg/mL的NP-A(2mL)，并允许温育10分钟。将受损伤表面用盐水洗涤两次。然后将10mg/mL的NP-B(2mL)施用于腹膜腔，并且同时用365nm UV光以50mW cm-2的强度从光导照射受损伤部位10分钟，所述光导安装在如光DSC装置中使用的Omnicure S-2000光源上。在温育后用盐水洗涤腹膜腔两次，并且闭合伤口。持续监测大鼠，并在手术后6小时、24小时、48小时和72小时采集血液用于分析。采集100μL全血用于全血细胞计数(CBC)测试，并采集20μL血清用于血糖测试。14天后，通过CO2对大鼠实施安乐死。经由右侧U形剖腹术打开腹部以防止干扰粘连区域。通过光学照片记录经过处理的侧和不进行任何操纵的另一侧。两名对手术不知情的实验者根据上述评分系统评估所有粘连。将包括肌肉、皮肤和腹膜粘连的相关组织切除，并固定在10％中性缓冲福尔马林中用于组织学分析。
组织学分析
将组织在室温下固定在10％中性缓冲福尔马林中大约3天。在Leica ASP 6025组织处理器上处理固定组织，包埋在石蜡中，并且在Leica RM2245薄片切片机上以4μm厚度切片，并安装在VWR Superfrost Plus显微镜载玻片上。使用Richard-Allen苏木精2和伊红Y对组织切片进行染色，并盖上盖玻片。组织学变化由经委员会认证的兽医病理学家评价。
免疫组织化学分析
使用抗I型胶原蛋白抗体(34710，艾博抗(Abcam))、抗IV型胶原蛋白抗体(6586，艾博抗)、抗纤连蛋白抗体(23751，艾博抗)和抗CD45抗体(10558，艾博抗)，对石蜡载玻片进行免疫组织化学分析。使用Ventana的CC2(pH 6.0)在90℃下对于抗I型胶原蛋白进行8分钟；使用Ventana的CC2(pH 6.0)在100℃下对于抗IV型胶原蛋白进行40分钟的抗原修复；使用Ventana的CC1(pH 8.5)在90℃下对于抗纤连蛋白进行8分钟的抗原修复；使用Ventana的CC2(pH 6.0)在90℃下对于抗CD45进行40分钟的抗原修复。使载玻片获得过氧化氢阻断32分钟，然后在室温下在阻断试剂(啮齿动物阻断剂R，RBR962G，贝欧科(Biocare))中温育1小时。使用Discovery Ab稀释剂，760-108，以1：100添加针对抗胶原I，并且以1：50添加针对其它抗体的初级抗体，随后在室温下添加二级抗体(Ventana Omap OmniMap抗Rb-HRP，760-4311，即用)32分钟。然后用DAB处理载玻片，并用苏木精II复染12分钟，然后用蓝化试剂复染4分钟。
时间点组织分析
通过pCNP处理接受PPE手术的大鼠。在治疗6小时、24小时、72小时、1周和2周后，取受损伤组织，用PBS短暂地冲洗以去除表面碎屑，随后浸没固定在10％中性缓冲福尔马林中用于组织学分析、免疫组织化学分析和FESEM。为了制备FESEM样品，在福尔马林中初始固定数小时到过夜后，将所关注区域解剖并置于2％多聚甲醛/2.5％戊二醛/0.15M磷酸钠缓冲液pH 7.4中。在4℃下将样本存储在固定剂中过夜到几天，随后处理以进行SEM。在用0.15M磷酸钠缓冲液pH 7.4(PB)洗涤三次之后，将样品在包含1％的四氧化锇的PB中后固定一小时，然后在去离子水中洗涤三次30分钟。将样品在一系列乙醇中脱水，转移到Samdri-795临界点干燥器中，并使用二氧化碳作为过渡溶剂(马里兰州罗克维尔的金斯纳德研究公司(Tousimis Research Corporation,Rockville,MD))来干燥。使用银膏将组织安装在铝片上，并且涂上15nm金-钯合金(60Au：40Pd，Hummer X Sputter Coater，Anatech USA，加利福尼亚州联合市(Union City，CA))。使用在5kV下操作的蔡司Supra 25FESEM，使用SE2检测器、30微米孔径和10至12mm的大致工作距离(马萨诸塞州皮博迪卡尔蔡司光学显微镜公司(Carl Zeiss Microscopy,LLC,Peabody,MA))拍摄图像。
术后炎性水平的分析
用不同实验组处理接受PPE手术的大鼠。在手术后24小时和72小时用SSTTM血清分离管(BD VacutainerTM静脉采血管)采集血清。使用milliplex map大鼠细胞因子/趋化因子磁珠板(RECYMAG65K27PMX，密理博(Millipore))进行免疫多重测定。为了检查和观察不同处理后的炎性水平，将每种细胞因子/趋化因子水平进行log2转化和标准化。以欧几里得距离和完全连接进行分层聚类并且使用热图进行观察。还计算并绘制了样品之间的皮尔逊相关性。所有聚类和热图分析均在R版本3.5.1下使用gplots包(热图.2)进行。
统计
使用未配对的双尾司徒登氏t检验或曼惠特尼检验比较实验组。对于*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)，差异被认为是显著的。Prism软件用于数据分析和制图(GraphPad，版本6.0c)。数据表示平均值±SEM。以欧几里得距离和完全连接进行分层聚类。计算并绘制了样品之间的皮尔逊相关性。所有聚类和热图分析均在R版本3.5.1下使用gplots包(热图.2)进行。
上述实施例仅打算为示例性的，并且所属领域的技术人员顶多使用常规实验就将识别或将能够确认特定化合物、材料和程序的许多等效物。所有这类等效物被认为是在本公开的范围内并且由所附权利要求书涵盖。
在本申请案中对任何参考文献的引用或识别都并非是承认所述参考文献可作为现有技术获得。
已努力确保关于所使用的数量(例如量、温度等)的准确性，但应当说明存在一些实验性误差和偏差。
当量、浓度或其它值或参数作为范围、优选范围或优选上限值和优选下限值的列表给出时，这应被理解为具体地公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任何对形成的所有范围，无论范围是否单独公开。除非另有说明，本文中引用的数值范围旨在包含其端点以及所述范围内的所有整数和分数。当限定范围时，本发明的范围并不旨在限于所叙述的具体值。
当提供数值范围时，应理解，除非上下文另外明确规定，否则包涵在所述范围上限值与下限值之间的达到下限值单位十分之一的每一中间值，以及所述范围内的任何其它所述值或中间值。还涵盖这些小范围的上限和下限，这些小范围可以独立地包括在较小范围内，但受所述范围内的任何特别排除的限制。在所述范围包括界限值中的一或两者的情况下，还包括排除那些所包括的界限值中的任一者或两者的范围。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义，并且与以下一致：Singleton等人(1994)《微生物学与分子生物学辞典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)》，第2版，J.威利父子公司(J.Wiley&Sons)，纽约州纽约(New York,NY)；和Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)《免疫生物学(Immunobiology)》，第5版，纽约加兰出版社(Garland Publishing,New York)。
本公开所有引用的参考文献，包括公开案、专利和专利申请，明确地以全文引用的方式并入本文中。
贯穿本说明书和权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”在非排他性意义上使用。应当理解，本文描述的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
如本文所用，当提及值时，术语“约”意指在一些实施例中，在一些实施例中，涵盖从指定量±50％、在一些实施例中±20％、在一些实施例中±10％、在一些实施例中±5％、在一些实施例中±1％、在一些实施例中±0.5％，以及在一些实施例中±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。
得益于前述描述和相关图式中呈现的教示，使本主题所涉及的本领域的技术人员将想到本文中阐述的许多修改和其它实施例。因此，应当理解的是，所述主题不限于所公开的具体实施例，并且修改和其它实施例旨在包含于所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在通用意义和描述性意义上使用，而不用于限制目的。所属领域的技术人员将认识到与本文中所述的那些方法和材料类似或等效的许多方法和材料，所述方法和材料可以用于实践本文所述的主题。本公开决不限于所述的方法和材料。
序列表
<110> 北卡罗来纳大学教堂山分校
<120> 用于抑制术后粘连的组合物和方法
<130> 035052/542267
<150> US 62/802,033
<151> 2019-02-06
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Lys Leu Trp Val Leu Pro Lys Gly Gly Gly Cys
1 5 10

Claims (60)

1.一种处理手术部位的方法，其包含：
使所述手术部位与包含靶向颗粒和支架颗粒的颗粒配制物接触；以及
交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在所述手术部位处提供复合膜，其中术后粘连的形成被所述复合膜抑制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向颗粒包含靶向位于所述手术部位处的一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种生物分子物质选自由以下组成的组：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、整联蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、BM-40/骨粘连蛋白/SPARC、BM-90和bFGF。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多种生物分子物质之一是IV型胶原蛋白。
5.根据权利要求2所述的方法，其中靶向配体包含所述一个或多个化学部分。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向颗粒和/或支架颗粒是纳米颗粒、微粒或其混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述靶向颗粒和支架颗粒是纳米颗粒。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向颗粒还包含一种或多种药物组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物选自由以下组成的组：地塞米松、地塞米松21-棕榈酸酯和其组合。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物抑制组织炎症。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述手术部位处的炎性细胞因子和/或趋化因子的存在减少。
12.根据权利要求8所述的方法，其还包含从所述复合膜释放所述一种或多种药物组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中大于10％的所述一种或多种药物组合物在膜形成的24小时内释放。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物在至少14天的时间段内释放。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述支架颗粒是非水凝胶颗粒。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述支架颗粒包含核-壳架构。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述支架颗粒包含聚(乳酸-共-乙醇酸)核和聚乙烯亚胺壳。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向颗粒包含聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段聚合物。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向颗粒和支架颗粒在交联之前经由离子或静电相互作用彼此相互作用。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶向颗粒和支架颗粒带相反电荷。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联是光引发的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述光引发的交联包含紫外(UV)光的施加。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述UV光具有约365nm的波长。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述支架颗粒包含一个或多个光不稳定基团。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一个或多个光不稳定基团是二氮杂环丙烯官能团。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合膜为生物可降解的。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述手术部位包含腹膜表面。
28.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述支架颗粒施加到所述手术部位之前将所述靶向颗粒施加到所述手术部位。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向颗粒与所述手术部位的一个或多个表面结合。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向颗粒包含靶向一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分，其中所述一种或多种生物分子物质是IV型胶原蛋白，其中所述靶向颗粒包含聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段聚合物，并且所述靶向颗粒还包含一种或多种药物组合物，其中所述药物组合物是地塞米松和地塞米松21-棕榈酸酯；并且所述支架颗粒包含聚(乳酸-共-乙醇酸)核和聚乙烯亚胺壳，并且被一个或多个光不稳定基团进一步官能化，其中所述一个或多个光不稳定基团是二氮杂环丙烯官能团。
31.一种处理手术部位的方法，其包含：
使所述手术部位与颗粒配制物接触，所述颗粒配制物包含支架颗粒和传输一种或多种药物组合物的载体颗粒；以及
交联所述载体颗粒和支架颗粒以在所述手术部位处提供复合膜，其中术后粘连的形成被所述复合膜抑制。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物抑制组织炎症。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物选自由以下组成的组：地塞米松、地塞米松21-棕榈酸酯和其组合。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述手术部位处的炎性细胞因子和/或趋化因子的存在减少。
35.根据权利要求31所述的方法，其还包含从所述复合膜释放所述一种或多种药物组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种药物组合物在至少14天的时间段内释放。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述支架颗粒是非水凝胶颗粒。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述支架颗粒和/或载体颗粒是纳米颗粒、微粒或其混合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述载体颗粒和支架颗粒是纳米颗粒。
40.根据权利要求31所述的方法，其中所述载体颗粒和支架颗粒在交联之前经由离子或静电相互作用彼此相互作用。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述载体颗粒和支架颗粒带相反电荷。
42.根据权利要求31所述的方法，其中所述交联是光引发的。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述光引发的交联包含UV光的施加。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述UV光具有约365nm的波长。
45.根据权利要求31所述的方法，其中所述支架颗粒或载体颗粒包含一个或多个光不稳定基团。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述一个或多个光不稳定基团是二氮杂环丙烯官能团。
47.根据权利要求31所述的方法，其中所述复合膜为生物可降解的。
48.根据权利要求31所述的方法，其中所述载体颗粒包含靶向位于所述手术部位处的一种或多种生物分子物质的一个或多个化学部分。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种生物分子物质选自由以下组成的组：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、整联蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、BM-40/骨粘连蛋白/SPARC、BM-90和bFGF。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述多种生物分子物质之一是IV型胶原蛋白。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述载体颗粒与所述手术部位的一个或多个表面结合。
52.根据权利要求31所述的方法，其中所述手术部位包含腹膜表面。
53.一种试剂盒，其包含：
(i)容纳包含靶向颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；以及
(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。
54.一种试剂盒，其包含：
(i)容纳包含载体颗粒的第一颗粒配制物的小瓶；以及
(ii)容纳包含支架颗粒的第二颗粒配制物的小瓶。
55.一种包含靶向颗粒和支架颗粒的组合物。
56.一种包含载体颗粒和支架颗粒的组合物。
57.一种复合膜，其通过使包含靶向颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
58.一种复合膜，其通过使包含载体颗粒的第一颗粒组合物与包含支架颗粒的第二颗粒组合物交联而形成。
59.一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与靶向颗粒接触；
使所述靶向颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述靶向颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
60.一种减少腹膜粘连的方法，其中所述腹膜粘连在腹部手术后形成，所述方法包含：
使腹部手术部位与载体颗粒接触；
使所述载体颗粒与支架颗粒接触；以及
交联所述载体颗粒和支架颗粒以在所述腹部手术部位处提供复合膜，其中所述复合膜减少所述腹膜粘连。
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