CN113502307B - 一种利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法，涉及低聚木糖制备技术领域。本申请采用水热法预处理木本原料，获得含低聚木糖的水溶液和滤渣即水热预处理固液混合物；接着加入由内切木聚糖酶和半纤维素支链酶组成的复配酶对水热预处理固液混合物进行一锅法定向酶解，实现高含量木二糖和木三糖的低聚合度低聚木糖的制备。其中，半纤维素支链酶为乙酰酯酶和葡萄糖醛酸酯酶。与水热预处理结果相比，本专利的水热耦合酶法所得聚合度为2～6的低聚木糖得率显著提高，达到51.3％～65.0％；木二糖和木三糖的比例提高至85.0～90％。本方法预处理工艺绿色简单，无毒无污染，产品得率高，更具有实际操作价值。
Description
技术领域
本发明涉及低聚木糖制备技术领域，具体涉及一种利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法，实现高含量木二糖和木三糖的低聚合度低聚木糖的制备。
背景技术
由于人类社会对化石资源需求的日益增长和过度开采，使得地球上化石资源不可避免地面临着枯竭殆尽的命运，寻求可替代、可再生的资源迫在眉睫。木质纤维资源具有价格低廉、来源广泛、种植面积广、可再生等众多优势，被认为是最有潜力的化石资源替代品。杨木作为我国重要的速生林，被广泛用于板材加工产业，因此产生了大量的杨木废弃物。这些杨木废弃物焚烧所造成的大气污染问题亟待解决，因此杨木的规模化利用备受关注。利用可再生的生物质资源生产生物能源、生物基化学品和生物材料是我国可持续发展的长效机制。其中以木质纤维原料为来源生产燃料乙醇的第二代生物炼制模式是现今研究的热点。由于工艺复杂、成本高、产量低等问题，以木本原料为来源生产燃料乙醇的工业化实施受限。联产高价值产品是成功实现第二代生物炼制模式工业化的重要措施。
低聚木糖主要是由2～6个木糖单元通过β-1，4糖苷键连接而成。据报道，低聚木糖在2017年全球销售额为9300万美元，然而在2023年将增加至1.3亿美元，其增长率可以达到5.3％。作为被国际益生菌和益生元协会所认定的一种新兴益生元，低聚木糖被广泛用于食品、医疗和化妆品行业。低聚木糖可以降低血液胆固醇，促进营养吸收，清除体内自由基，调节胃肠道菌群生长。双歧杆菌是人类肠道中重要的微生物，而木二糖和木三糖对双歧杆菌的增殖活性最高。联产富含木二糖和木三糖的低聚合度低聚木糖可以显著增强低聚木糖的生理功能，从而进一步增加第二代生物炼制的收益。
低聚木糖的制备方法可以分为水热法、酸法和酶法。其中，水热法具有仅以水作为试剂、绿色环保的特点，最常被用于制备低聚木糖。在高温高压下，木质纤维原料中半纤维素上的乙酰基脱落形成乙酸会进一步降低体系的pH，使得半纤维素发生优先降解。半纤维素主要被降解为低聚木糖、木糖及糖衍生物。而低聚木糖的溶出与预处理强度有重要关联。当预处理强度过低，溶出的低聚木糖存在聚合度范围广、木二糖和木三糖含量低以及得率低等问题，而当预处理强度过高，低聚木糖会进一步降解成木糖及衍生物，低聚木糖得率显著下降。合理控制预处理强度对于低聚木糖的生产至关重要。研究发现，当水热预处理在最优条件下进行时，所得低聚木糖中木二糖和木三糖含量低，并且存在一部分低聚合度木聚糖(聚合度大于6)。将水热预处理液中高聚合度低聚木糖(聚合度4～6)和聚合度大于6的低聚合度木聚糖高效转化为木二糖和木三糖，是提高低聚木糖产品生理活性的有效手段。酶法作为工业化生产低聚木糖的主要方法，具有反应温和、副产物少、操作简单的特点，可以用于定向将聚合度较高(聚合度大于3)的低聚木糖进一步转化为木二糖和木三糖。低聚木糖可通过定向水解禾草和阔叶材的木聚糖制备得到。然而不同原料中的木聚糖结构有所不同，禾草类木聚糖主要成分是木聚糖，木糖单元通过β-1，4糖苷键连接形成主链，其支链上主要连接着阿拉伯糖基等基团；阔叶材木聚糖主要成分是木聚糖，由木糖单元通过β-1，4糖苷键连接形成主链，其支链上主要连接着葡萄糖醛酸基、O-乙酰基等基团。木本原料木聚糖上的支链可能会对内切木聚糖酶造成空间阻碍，影响其定向水解制备低聚木糖的效率。此外，禾草原料结构较为疏松，木质化程度低，而木本原料自身结构复杂，木质化纯度高，水热预处理木本物料中残留的部分木聚糖会和木质素连接形成木质素碳水化合物，因此更加难以被降解。克服木本原料木聚糖特殊的结构障碍，高效转化预处理物料中残留木聚糖，是进一步提高木本原料制备低聚合度低聚木糖生产效率的有效措施。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法具体为：采用水热耦合复配酶法处理木本原料，复配酶由内切木聚糖酶和半纤维素支链酶组成，通过内切木聚糖酶和半纤维素支链酶克服木本原料木聚糖特殊的结构障碍，高效转化预处理物料中残留木聚糖，实现高含量木二糖和木三糖的低聚合度低聚木糖的制备。
具体包括以下步骤：采用水热法预处理木本原料，获得含低聚木糖的水溶液和滤渣即水热预处理固液混合物；接着加入由内切木聚糖酶和半纤维素支链酶组成的复配酶对水热预处理固液混合物进行一锅法定向酶解，实现高含量木二糖和木三糖的低聚合度低聚木糖的制备。
此处的酶解底物为水热预处理固液混合物，而不仅仅是水热预处理的上清液，采用水热预处理固液混合物作为酶解底物，能提高低聚木糖得率以及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。
本申请采用富含木聚糖的阔叶木，比如杨木锯木屑和/或桦木锯木屑作为木本原料，以期实现生物质资源的有效利用。采用水热法预处理木本原料时，在木本原料中加入固液比为1：10的水，单位为g/mL；其中，木屑的质量按木屑绝干重计。
进一步的，水热预处理温度为150-190℃，水热预处理时间为5-70min。
作为优选，水热预处理温度为170℃，水热预处理时间为5-70min。
更优选地，水热预处理温度为170℃，水热预处理时间为50min。
定向酶解体系中，内切木聚糖酶酶活为30IU/mL，酶添加量为300U/g木聚糖。半纤维素支链酶为乙酰酯酶和葡萄糖醛酸酯酶；乙酰酯酶的酶活为36U/mg，添加量为20U/g木聚糖；葡萄糖醛酸酯酶的酶活为27U/mg，添加量为20U/g木聚糖。
整个定向酶解体系在pH 4.8，50℃条件下酶解4h，低聚木糖得率以及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例最高。
低聚木糖仅指聚合度为2～6。
木糖得率(％)＝水解液中木糖质量g÷(原始木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。
低聚木糖得率(％)＝水解液中低聚木糖质量g÷(原始木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。
低聚合度木聚糖得率(％)＝(水解液酸解前后木糖的增量×0.88g-水解液中低聚木糖质量g)÷(原始杨木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。
木二糖和木三糖占低聚木糖的比例(％)＝(水解液中木二糖和木三糖质量g÷水解液中低聚木糖质量g)×100％。
进一步的，由木本原料制备低聚合度低聚木糖工艺，具体步骤如下：
(1)取木本木屑，按固液比1∶10g/mL加入蒸馏水，于170℃下处理50min；结束后，收集固液混合物；
(2)取步骤(1)的固液混合物，加入醋酸钠缓冲液、内切木聚糖酶和支链酶，于pH4.8，50℃的恒温摇床中摇动酶解4h；酶解结束后，分离获得富含低聚木糖的上清液。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明的由木本原料制备低聚合度低聚木糖工艺，利用水热和酶定向降解组合方法，有效促进聚合度较高的低聚木糖(聚合度高于3)的进一步降解，显著提高低聚木糖混合物中木二糖和木三糖的含量。试验结果表明，与水热预处理结果相比，本专利的水热耦合酶法所得杨木和桦木低聚木糖(聚合度2～6)得率分别提高了44.9％和87.3％，达到51.3％和65％；木二糖和木三糖的比例提高了81.2％和157.9％，达到85.0％和90％。同时本方法预处理工艺绿色简单，无毒无污染，产品得率高，更具有实际操作价值，具有很好的实用性。
附图说明
图1为水热预处理液、水热耦合酶法处理杨木的酶解液中低聚木糖的离子色谱分析图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。实施例是为说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例，不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。
以下实施例中，单糖的浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下：色谱仪：Agillent1200高效液相色谱仪；色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H；流动相：0.005mol/L硫酸；流速：0.6mL/min；柱温：55℃；检测器：示差折光检测器；进样量：10μL。外标法测定。低聚木糖(木二糖～木六糖)的浓度采用高效阴离子交换色谱法(HPAEC)测定。色谱条件如下：色谱仪Dionex ICS-3000；色谱柱：CarboPac PA-200；流动相：100mmol/L氢氧化钠，500mmol/L醋酸钠；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；内标法测定。
以下实施例中，水热预处理液酸解的具体测定方法为：取2mL水热处理液，用氢氧化钠将pH调节至7.0左右，并定容至10mL；取5mL处理后的样品溶液于酸解瓶中，并加入5mL8％(w/v)硫酸，于121℃下处理60min。取1mL酸解液加入40μL 50％氢氧化钠，所得样品进行HPLC分析。采用HPLC测定酸解前后样品中的木糖浓度。
实施例1
由木本原料制备低聚合度低聚木糖工艺，步骤如下：
(1)称取绝干杨木屑(木聚糖含量18.6％)2.4g，按照固液比1∶10(g/mL，下同)加入蒸馏水，在170℃下预处理50min。
(2)预处理结束后，收集所得预处理固液混合物。
(3)将该固液混合物放于50mL水解瓶中，用醋酸钠缓冲液调节体系pH至4.8，内切木聚糖酶用量为300U/g木聚糖，乙酰酯酶用量为20U/g木聚糖，葡萄糖醛酸酯酶的用量为20U/g木聚糖，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解4h。
酶解结束后，将酶解混合物用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的木糖和低聚木糖(木二糖～木六糖)浓度，并计算木糖得率、低聚木糖(木二糖～木六糖)得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。
其中，木糖得率(％)＝水解液中木糖质量g÷(原始杨木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。低聚木糖得率(％)＝水解液中低聚木糖质量g÷(原始杨木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。低聚合度木聚糖得率(％)＝(水解液酸解前后木糖的增量×0.88g-水解液中低聚木糖质量g)÷(原始杨木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。木二糖和木三糖占低聚木糖的比例(％)＝(水解液中木二糖和木三糖质量g÷水解液中低聚木糖质量g)×100％。式中：0.88为木糖与木聚糖的转换系数。
杨木水热固液混合物酶解上清液中木糖得率、低聚木糖得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例见表1。
表1杨木水热固液混合物的酶解液组分得率
由表1结果表明，利用复合酶酶解水热预处理杨木固液混合物，酶解4h时，木糖得率为25.0％，低聚木糖得率为51.3％，低聚合度木聚糖得率为3.8％，木二糖和木三糖占低聚木糖的比例为85.0％。
实施例2
由木本原料制备低聚合度低聚木糖工艺，步骤如下：
(1)称取绝干桦木屑(木聚糖含量22.7％)2.4g，按照固液比1∶10加入蒸馏水，在170℃下预处理50min。
(2)预处理结束后，收集所得预处理固液混合物。
(3)将该固液混合物放于50mL水解瓶中，用醋酸钠缓冲液调节体系pH至4.8，内切木聚糖酶用量为300U/g木聚糖，乙酰酯酶用量为20U/g木聚糖，葡萄糖醛酸酯酶的用量为20U/g木聚糖，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解48h。
酶解结束后，将酶解混合物用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的木糖和低聚木糖(木二糖～木六糖)浓度，并计算木糖得率、低聚木糖(木二糖～木六糖)得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。其中，木糖得率(％)＝水解液中木糖质量g÷(原始桦木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。低聚木糖得率(％)＝水解液中低聚木糖质量g÷(原始桦木屑绝干重g×木聚糖含量)×100％。木二糖和木三糖占低聚木糖的比例(％)＝(水解液中木二糖和木三糖质量g÷水解液中低聚木糖质量g)×100％。
桦木水热固液混合物酶解上清液中木糖得率、低聚木糖得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例见表2。
表2桦木水热预处理固液混合物的酶解液组分得率
由表2结果表明，利用复合酶酶解桦木的水热预处理固液混合物，酶解48h时，木糖得率为9.0％，低聚木糖得率为65.0％，低聚合度木聚糖得率为1.0％，木二糖和木三糖占低聚木糖的比例为90％。本例中低聚木糖得率及木二糖和木三糖的占比高于实施例1的低聚木糖得率(51.3％)及木二糖和木三糖占比(85.0％)。
对比例1
(1)称取绝干杨木2.4g，按照固液比1∶10加入蒸馏水，分别在150℃、160℃、170℃、180℃和190℃下预处理50min。然后在优选条件170℃下，分别预处理5min，10min，30min，50min和70min。
(2)水热预处理结束后，将预处理液用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的木糖浓度和低聚木糖浓度，并计算木糖得率、低聚木糖(木二糖～木六糖)得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。预处理强度因子＝Log t×exp[(T-100)÷14.75]，式中t为预处理时间，min；T为预处理温度，℃。
水热预处理杨木的主要成分分析以及预处理液中相关糖类组分得率见表3。
表3水热预处理杨木的主要成分分析及相关糖类组分得率
由表3结果表明，随着水热预处理强度因子的增加，预处理液中木糖的得率逐渐增加，低聚木糖和低聚合度木聚糖的得率均呈现先增加后减少趋势。当预处理强度因子为3.76，即预处理温度为170℃，时间为50min，此时低聚木糖得率最高，可以达到35.4％，木二糖和木三糖的占比为46.9％，木糖得率为23.0％，低聚合度木聚糖得率为17.6％，本例中低聚木糖得率及木二糖和木三糖的占比均低于实施例1中低聚木糖得率(51.3％)及木二糖和木三糖的占比(85.0％)。
对比例2
由木本原料制备低聚合度低聚木糖工艺，步骤如下：
(1)称取绝干杨木2.4g，按照固液比1∶10加入蒸馏水，在170℃下预处理50min。
(2)预处理结束后，固液分离，收集所得预处理液。
(3)对上述预处理液进行离心分离获得上清液。取30mL上清液于50mL水解瓶中，用醋酸钠缓冲液调节体系pH至4.8，内切木聚糖酶用量为300U/g木聚糖，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解4h。
酶解结束后，将酶解液用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的木糖浓度和低聚木糖浓度，并计算木糖得率、低聚木糖(木二糖～木六糖)得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。
酶解后木糖得率、低聚木糖得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例见表4。
表4杨木水热预处理液的酶解液组分得率
由表4结果表明，利用内切木聚糖酶酶解水热预处理液，酶解时间为4h时，低聚木糖得率由35.4％显著增加至44.6％，木糖得率由23.0％增加至24.7％，而低聚合度木聚糖显著下降至8.6％，表明内切木聚糖酶对聚合度较高的低聚木糖(聚合度高于3)具有降解作用。此外，低聚木糖中木二糖和木三糖的比例由46.9％显著增加至78.7％，提高了67.8％。图1是水热预处理液和水热耦合酶法处理杨木固液混合物的酶解液中低聚木糖的离子色谱分析对比图，发现经过酶定向降解后，酶解液中可检测到的低聚木糖主要以木二糖、木三糖和木四糖为主，木五糖和木六糖均不存在。本对比例的木聚糖酶定向降解水热预处理液的低聚木糖得率及木二糖和木三糖的占比低于实施例1的低聚木糖得率(51.3％)以及木二糖和木三糖的占比(85.0％)。
对比例3
由木本原料制备低聚合度低聚木糖工艺，步骤如下：
(1)称取绝干杨木2.4g，按照固液比1∶10加入蒸馏水，在170℃下预处理50min。
(2)预处理结束后，固液分离，收集所得预处理液。
(3)对上述预处理液进行离心分离获得上清液。取30mL上清液于50mL水解瓶中，用醋酸钠缓冲液调节体系pH至4.8，内切木聚糖酶用量为300U/g木聚糖，乙酰酯酶的用量为20U/g木聚糖，葡萄糖醛酸酯酶的用量为20U/g木聚糖，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解4h。
酶解结束后，将酶解液用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的木糖浓度和低聚木糖浓度，并计算木糖得率、低聚木糖(木二糖～木六糖)得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。
酶解后木糖得率、低聚木糖得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例见表5。
表5杨木水热预处理液的酶解液组分得率
由表5结果表明，利用复合酶酶解水热预处理液，酶解时间为4h时，木糖得率由23.0％增加至25.7％，低聚木糖得率由35.4％显著增加至46.5％，低聚合度木聚糖得率由17.6％减少至5.0％，表明复合酶可以降解较高聚合度低聚木糖(聚合度高于3)，提高低聚木糖得率。此外，低聚木糖中木二糖和木三糖的比例由46.9％显著增加至84.1％，提高了79.3％。本例中低聚木糖得率及木二糖和木三糖的占比低于实施例1的低聚木糖得率(51.3％)及木二糖和木三糖占比(85.0％)。
对比例4
由木本原料制备低聚合度低聚木糖工艺，步骤如下：
(1)称取绝干桦木屑2.4g，按照固液比1∶10加入蒸馏水，在170℃下预处理50min。
(2)预处理结束后，固液分离，收集所得上清液。
(3)对上述预处理液进行离心分离获得上清液。取20mL于50mL水解瓶中，用醋酸钠缓冲液调节体系pH至4.8，内切木聚糖酶用量为300U/g木聚糖，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解48h。
酶解结束后，将酶解液用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的木糖和低聚木糖(木二糖～木六糖)浓度，并计算木糖得率、低聚木糖(木二糖～木六糖)得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。
桦木水热预处理液的酶解上清液中木糖得率、低聚木糖得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例见表6。
表6桦木水热预处理液的酶解液组分得率
由表6结果表明，桦木原料含有22.7％木聚糖。原料经过水热预处理后，木糖得率为8.5％，低聚木糖得率为34.7％，低聚合度木聚糖得率为23.9％，木二糖和木三糖占比为34.9％，当利用内切木聚糖酶酶解桦木水热预处理液时，当酶解时间为48h，木糖得率增加至8.8％，低聚木糖得率由34.7％显著增加至62.2％，低聚合度木聚糖得率为0，木二糖和木三糖占比为100％，表明内切木聚糖酶可以将桦木水热预处理液中聚合度较高的低聚木糖(聚合度大于3)均降解为木二糖和木三糖。本例中低聚木糖得率低于实施例2的低聚木糖得率(65.0％)，而及木二糖和木三糖的占比高于实施例2中木二糖和木三糖占比(90.0％)。
对比例5
由禾草原料制备低聚合度低聚木糖工艺，步骤如下：
(1)称取绝干水洗麦糠50g，按照固液比1∶10加入蒸馏水，在180℃下预处理40min。
(2)预处理结束后，固液分离，收集所得预处理液。
(3)对上述预处理液进行离心分离获得上清液。取20mL上清液于50mL水解瓶中，用醋酸钠缓冲液调节体系pH至4.8，内切木聚糖酶用量为300U/g木聚糖，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解48h。
酶解结束后，将酶解液用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的木糖浓度和低聚木糖浓度，并计算木糖得率、低聚木糖(木二糖～木六糖)得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例。
木糖得率、低聚木糖得率、低聚合度木聚糖得率及木二糖和木三糖占低聚木糖的比例见表7。
表7水洗麦糠水热预处理液的酶解液组分得率
由表7结果表明，水洗麦糠的木聚糖含量为25.0％。利用内切木聚糖酶酶解水洗麦糠的水热预处理液，酶解48h时，木糖得率为9.0％，低聚木糖得率为33.2％，低聚合度木聚糖得率为4.0％，木二糖和木三糖占低聚木糖的比例为79.2％。本例中低聚木糖得率及木二糖和木三糖的占比低于实施例1和实施例2的低聚木糖得率(51.3％、65.0％)及木二糖和木三糖占比(85.0％、90.0％)。
可见，与禾草原料相比，利用本发明提出的水热耦合酶法组合工艺对木本原料低聚木糖生产具有优势，可以显著提高木本原料低聚木糖得率以及木二糖和木三糖的比例，组合工艺条件简单，操作简便，更具有实际应用价值。
Claims (5)
1.一种利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法，其特征在于，采用水热耦合复配酶法处理木本原料，实现含量不低于85%木二糖和木三糖的低聚合度低聚木糖的制备；所述复配酶由内切木聚糖酶和半纤维素支链酶组成，所述内切木聚糖酶酶活为30IU/mL，酶添加量为300U/g木聚糖；所述木本原料为杨木锯木屑和/或桦木锯木屑；所述半纤维素支链酶为乙酰酯酶和葡萄糖醛酸酯酶，所述乙酰酯酶的酶活为36U/mg，添加量为20U/g木聚糖；葡萄糖醛酸酯酶的酶活为27U/mg，添加量为20U/g木聚糖；
具体包括以下步骤：采用水热法预处理木本原料，获得含低聚木糖的水溶液和滤渣即水热预处理固液混合物，水热预处理温度为150-190℃，水热预处理时间为5-70min；接着加入由内切木聚糖酶和半纤维素支链酶组成的复配酶对水热预处理固液混合物进行一锅法定向酶解，实现高含量木二糖和木三糖的低聚合度低聚木糖的制备。
2.根据权利要求1所述的利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法，其特征在于，水热预处理温度为170℃，水热预处理时间5-70min。
3.根据权利要求2所述的利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法，其特征在于，水热预处理温度为170℃，水热预处理时间50min。
4.根据权利要求1所述的利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法，其特征在于，采用水热法预处理木本原料时，在木本原料中加入固液比为1:10的水，单位为g/mL；所述木屑的质量按木屑绝干重计。
5.根据权利要求1所述的利用木本原料制备低聚合度低聚木糖的方法，其特征在于，定向酶解体系在pH 4.8，50℃条件下酶解4h。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN106987610A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-07-28 | 南京林业大学 | 一种木二糖和木三糖含量高的低聚木糖制备方法 |
| CN108004284A (zh) * | 2018-01-30 | 2018-05-08 | 南京林业大学 | 一种聚合度2～6的低聚木糖的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Deacetylation of xylans by acetyl esterases of Trichoderma reesei;K. Poutanen等;Applied Microbiology and Biotechnology;第33卷;506-510 * |
| 低聚木糖生产用里氏木霉木聚糖酶选择性合成的研究现状;毛连山等;现代化工;第27卷(第02期);17-21 * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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