CN113499449B - 具协同增效作用的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种具协同增效作用的EGCG+L‑茶氨酸/β‑环糊精包合物，是以β‑环糊精为载体，将EGCG和L‑茶氨酸药物分子包合在β‑环糊精中形成。本发明通过将EGCG和L‑茶氨酸混合以β‑环糊精包合，水溶性和稳定性能更好，不仅提高了EGCG的稳定性和生物利用度，还增强了EGCG与L‑茶氨酸之间的协同增效作用，能显著预防肥胖病及高胆固醇血症的发生，对于茶叶功能成分开发与利用领域具有十分重要的意义。

Description

具协同增效作用的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物及其制备 方法与应用
技术领域
本发明属于农产品领域，具体涉及一种具协同增效作用的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物，同时涉及该包合物的制备方法与应用。
背景技术
表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9％-13％。EGCG由于具有特殊的立体化学结构，而具有非常强的抗氧化活性，其抗氧化活性至少是维生素C的100多倍。然而许多研究表明，由于其结构的特殊性，EGCG在机体内易降解和聚合，导致口服的生物利用度非常低。
为了提高EGCG的生物利用度，研究者们采用了许多封装方法用以提高药物分子在机体内的生物利用度和稳定性。而目前关于EGCG包合物的研究中，以单一药物包埋为主，多药物协同包埋的研究较少。L-茶氨酸(L-theanine)也是茶叶中特有的一类氨基酸，是绿茶滋味的主要呈味物质。现有报道称EGCG与L-茶氨酸存在协同增效的物质基础，因此有助于提高EGCG的生物活性。但未见同时包埋EGCG和L-茶氨酸的包合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中EGCG在机体消化环境中的不稳定而导致的生物利用度低等问题，而提供一种水溶性、稳定性更好，生物利用度更佳的具协同增效作用的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物及其制备方法，通过将L-茶氨酸与EGCG共同封装到β-CD中，可以通过改善EGCG的不稳定性，从而提高EGCG的生物利用度，进一步提高EGCG与L-茶氨酸的协同增效作用，从而得一种更稳定、生物利用度更佳的复合包合物。且制备之后可用于灌胃长期高脂饮食的SD大鼠，起到预防肥胖及高胆固醇血症的作用，在药物输送体系和茶叶功能成分的深层次利用和开发提供了理论和实践依据。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种具协同增效作用的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物，是以β-环糊精为载体，将EGCG和L-茶氨酸包合在β-环糊精中形成；其中，β-环糊精与EGCG+L-茶氨酸的重量比为1:1，EGCG与L-茶氨酸的重量比为(4-5)：1。
较佳的，所述包合物中EGCG与L-茶氨酸的重量比为5:1
本发明的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物的制备方法的步骤如下：
S1：按比例取EGCG和L-茶氨酸、β-环糊精，将EGCG和L-茶氨酸加入到10倍EGCG和L-茶氨酸重量的水中充分溶解，得EGCG和L-茶氨酸的混合水溶液，同时将β-环糊精加入10倍β-环糊精重量的水中充分溶解，得β-环糊精溶液；
S2：将EGCG和L-茶氨酸的混合水溶液逐滴加入到β-环糊精溶液中，搅拌均匀后超声处理，再冷却至室温后摇床震荡，摇床震荡的目的是为了平衡溶液中粒子的形成与分布；
较佳的，上述步骤S2中搅拌时溶液温度为40℃；超声处理的功率为60W，5s/次(每次持续超声4s，间隔停顿1s)，时间为10min。摇床震荡的时间为2h，转速为120rpm/min，温度为28℃；
S3：冷冻，真空冷冻干燥。
较佳的，上述步骤S3中冷冻是于-80℃环境中放置过夜；真空冷冻干燥是指在压强0.8-1.0Mbar下，先于-38℃～-42℃预冻15min，然后主干燥34h，终末干燥2h。
使用时，可进一步将冷冻干燥后得到的固体包合物研磨成粉状后再使用。
本发明还提供具协同增效作用的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物在制备预防肥胖病和高胆固醇血症的药物中的应用。
与现有的技术相比，本发明的优点如下：
(1)由于β-环糊精分子排列特殊，具有疏水的空腔和亲水的外表面，使得β-环糊精的空腔可以同时容纳极性和非极性的客体，无论他们是聚合物还是小分子。因此，β-环糊精疏水空腔可以对EGCG和L-茶氨酸进行包合，从而提高客体分子的水溶性和稳定性，更好地达到缓释效果，从而改善EGCG和L-茶氨酸的生物利用度。与EGCG/β-环糊精包合物相比，本发明所制备的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物的稳定性、水溶性更好。本发明通过将EGCG和L-茶氨酸混合包合，不仅提高了EGCG的稳定性，还增强了EGCG与L-茶氨酸之间的协同增效作用，更好地发挥了其药理作用，且制备成功之后，其在食品、医药等领域有更广的应用。
(2)本发明为提高EGCG的稳定性和生物利用度，采用模拟分子对接，得到包合物的形成理论依据，即可采用固定工艺，得到稳定的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
(3)本发明的包合物制备过程简单，可大规模生产。
(4)本发明的包合物能控制长期高脂饮食大鼠肥胖及高胆固醇血症的发生，从而有效预防肥胖病及高胆固醇血症的发生，在茶叶功能成分开发与利用领域具有十分重要的意义。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
附图说明
图1为本发明实施例3中不同物质的紫外光谱(UV-is)图；
其中，a为β-环糊精(β-CD)、b为EGCG、c为L-茶氨酸、d为EGCG/β-环糊精包合物、e为L-茶氨酸/β-环糊精包合物、f为物理混合物、g为EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
图2为本发明实施例3中不同物质的红外光谱(FTIR)图；
其中，a为β-CD、b为EGCG、c为L-茶氨酸、d为EGCG/β-环糊精包合物、e为L-茶氨酸/β-环糊精包合物、f为物理混合物、g为EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
图3为本发明实施例3中不同物质的X-射线衍射(XRD)图谱；
其中，a为β-CD、b为EGCG、c为L-茶氨酸、d为EGCG/β-环糊精包合物、e为L-茶氨酸/β-环糊精包合物、f为物理混合物、g为EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
图4为本发明实施例3中不同物质的差示热量扫描(DSC)图；
其中，a为β-CD、b为EGCG、c为L-茶氨酸、d为EGCG/β-环糊精包合物、e为L-茶氨酸/β-环糊精包合物、f为物理混合物、g为EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
图5为本发明实施例3中不同物质的热重图；
其中，上图为热重(TGA)图，下图为热重的一阶导数(DTGA)图；a为β-CD、b为EGCG、c为L-茶氨酸、d为EGCG/β-环糊精包合物、e为L-茶氨酸/β-环糊精包合物、f为物理混合物、g为EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
图6为本发明实施例3中EGCG/β-环糊精包合物的模拟分子对接图；
其中，a表示EGCG，b表示β-CD，c-e表示EGCG两端苯环形成稳定的pi-pi堆积结构，f表示EGCG包裹在β-CD内部。
图7为本发明的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物对长期高脂饮食大鼠体重的影响，从体重(上图)和体重增量(下图)二方面进行分析。
图8本发明的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物对长期高脂饮食大鼠Lee’s的影响。
图9本发明的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物对长期高脂饮食大鼠血脂的影响(从总胆固醇、磷酯、低密度脂蛋白胆固醇含量、高密度脂蛋白胆固醇含量方面进行分析)。
具体实施方式
以下以具体的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
本文及附图中化合物用字母表示时：BB为β-CD、E为EGCG、L为L-茶氨酸、BE为EGCG/β-环糊精包合物、BL为L-茶氨酸/β-环糊精包合物、PM为物理混合物、BLE为EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
实施例1
取10g EGCG和2g L-茶氨酸充分溶解溶于120g水中得EGCG和L-茶氨酸的混合水溶液，取12gβ-环糊精充分溶解溶于120g水中得β-环糊精溶液；将EGCG和L-茶氨酸的混合水溶液逐滴加入到β-环糊精溶液中，40℃搅拌均匀后超声处理10min(YMN1-1000Y超声装置，功率60W，5s/次(每次持续超声4s，间隔停顿1s))，冷却至室温后摇床震荡2h(转速为120rpm/min，温度为28℃)；然后置于-80℃环境中放置过夜，真空冷冻干燥(压强0.8-1.0Mbar，先于-38℃～-42℃预冻15min，然后主干燥34h，终末干燥2h)，得包合物，将包合物研磨成粉，得到粉末状的本发明EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
对比例1
将10g EGCG和2g L-茶氨酸与12gβ-环糊精研磨混合5min，得到物理混合物。
对比例2
取12g EGCG溶于充分溶解于120g水中得EGCG水溶液，取12gβ-环糊精充分溶解于120g水中得β-环糊精溶液；于β-环糊精溶液中逐滴加入EGCG水溶液，40℃搅拌均匀后超声处理10min(YMN1-1000Y超声装置，功率60W，5s/次(每次持续超声4s，间隔停顿1s))，冷却至室温后摇床震荡2h(转速为120rpm/min，温度为28℃)；然后置于-80℃环境中放置过夜，真空冷冻干燥(压强0.8-1.0Mbar，先于-38℃～-42℃预冻15min，然后主干燥34h，终末干燥2h)，得包合物，将包合物研磨成粉，得到粉末状的EGCG/β-环糊精包合物。
对比例3
取12g L-茶氨酸充分溶解于溶于120g水中得L-茶氨酸水溶液，取12gβ-环糊精充分溶解于120g水得β-环糊精溶液；于β-环糊精溶液中逐滴加入L-茶氨酸水溶液，40℃搅拌均匀后超声处理10min(YMN1-1000Y超声装置，功率60W，5s/次(每次持续超声4s，间隔停顿1s))，冷却至室温后摇床震荡2h(转速为120rpm/min，温度为28℃)；然后置于-80℃环境中放置过夜，真空冷冻干燥(压强0.8-1.0Mbar，先于-38℃～-42℃预冻15min，然后主干燥34h，终末干燥2h)，得包合物，将包合物研磨成粉，得到粉末状的L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
实施例2
取8g EGCG和2g L-茶氨酸充分溶解于100g水中得EGCG和L-茶氨酸的混合水溶液，取10gβ-环糊精充分溶解于100g水中得β-环糊精溶液；将EGCG和L-茶氨酸的混合水溶液逐滴加入到β-环糊精溶液中，40℃搅拌均匀后超声处理10min(YMN1-1000Y超声装置，功率60W，5s/次(每次持续超声4s，间隔停顿1s))，冷却至室温后摇床震荡2h(转速为120rpm/min，温度为28℃)；然后置于-80℃环境中放置过夜，真空冷冻干燥(压强0.8-1.0Mbar，先于-38℃～-42℃预冻15min，然后主干燥34h，终末干燥2h)，得包合物，将包合物研磨成粉，得到粉末状的本发明EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
实施例3
将实施例1的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物，对比例1的物理混合物，对比例2的EGCG/β-环糊精包合物和对比例3的L-茶氨酸/β-环糊精包合物的进行表征，以进一步明确本包合物的物理和化学特征。
如图1所示，EGCG在280nm附近有一个很强的紫外吸收峰。而EGCG/β-环糊精包合物(BE)、EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物(BLE，又称EGCG+L-茶氨酸包合物)以及物理混合物(PM)在同一波长也有很强的吸收峰，但与混合物PM相比，纳米包合物BE、BLE的最大紫外吸收峰发生红移且变宽，这是由于EGCG被装载到β-CD的空腔中之后，分子内的芳香部分由自由态变为共轭态，这与现有文献报道一致。而β-CD在整个波段内没有特征吸收峰。此外，还发现L-茶氨酸在200nm附近出现了较强的吸收峰，而L-茶氨酸/β-环糊精包合物(BL)中在同一波长下也表现出相同的吸收峰，而在BLE以及PM中L-茶氨酸的吸收峰则显著降低，这可能与BLE以及PM中含有少量L-茶氨酸有关(mLTA＝1/5mEGCG)。
参见图2，傅立叶变换红外光谱(FT-IR)在500-4000cm-1范围内记录了β-CD、EGCG、L-茶氨酸、物理混合物和包合物的红外光谱。β-CD、L-茶氨酸、EGCG的红外光谱的一般特征几乎是相似的，所以根据以前对β环糊精、EGCG、L-茶氨酸的研究，我们能够指定它们最重要的红外光谱带，结合图2，我们很容易就能知道EGCG在3356cm-1处有特征峰，在3570～3200cm-1之间有较宽的伸展。在3360cm-1处的O-H伸缩震动证实了苯酚基团的存在，其他特征峰位于1690cm-1(对于C＝O基的伸缩震动)、1620、1540、1450cm-1(三处峰是对于芳香环的骨架震动)、1350cm-1(对于羧酸盐COOR的伸缩震动)、1220cm-1(对于酚醛C＝O伸缩震动)、1150-956cm-1(对于芳香族化合物的C-H弯曲振动)。对于L-茶氨酸，显示了1150–1650cm-1范围内的强吸收峰。1650cm-1处的峰属于COOH拉伸振动，而1150cm-1和1240cm-1处的两个峰归因于C-H面外弯曲振动。N-H(N3)伸缩振动带来了3330cm-1的吸收峰。N-H外弯曲和C＝O拉伸振动分别带来1540cm-1和1580cm-1的吸收峰。β-环糊精特征红外光谱为O-H伸缩振动带来的3390cm-1吸收峰，脂肪族C-H伸缩振动在2920cm-1，1030cm-1处的吸收峰属于C-O伸缩振动产生，C-H的吸收峰在1160、946cm-1处。图2的FT-IR图谱中显示物理混合物的曲线与β-CD、EGCG、L-茶氨酸三种物质的特征曲线相比，基本都保留了三种物质的特征峰，总体曲线不同于β-CD的特征曲线。反观EGCG包合物、L-茶氨酸包合物和EGCG+L茶氨酸包合物与β-CD、EGCG、L-茶氨酸三种物质的特征曲线相比，EGCG的几大特征基本消失，L-茶氨酸的特征峰完全消失，且三种包合物的吸收峰形曲线与β-CD的吸收峰形曲线在形状上保持一致。以上结果说明EGCG和L-茶氨酸已经被深深的嵌入β环糊精的疏水空腔中，由于β环糊精外腔体的屏蔽作用，使得EGCG和茶氨酸中的特征基团被覆盖，所以整个包合物的傅立叶红外变换光谱(FT-IR)显示的特征吸收峰形与β环糊精基本一致。此外，我们还在物理混合物中观察到少数特征吸收峰减弱或消失的情况，特征峰减弱可能是由于混合物中三种物质的含量与单一物质检测时的含量不一样，所以吸收峰出现减弱情况，而物理混合物中少数吸收峰消失的情况也说明，β-CD即使在物理混合物条件下依旧显示出其包埋特性。
图3的X射线衍射图谱(XRD)在2θ(0-50°)范围内记录了β-CD、EGCG、L-茶氨酸、物理混合物和包合物的XRD图谱。我们用主客体物质及其物理混合物和包埋混合物的X射线衍射(XRD)进一步证实了包埋物的形成。所制备的包埋混合物具有显著的非晶态特征衍射图(图3)。β-CD在12°处有尖锐的强峰，在15°～27°处有中等强度的锐峰。EGCG的X衍射图显示其在衍射角15°、24°、26°出现了尖锐的特征峰。L-茶氨酸的X衍射图也同样显示其在13°～27°出现了非常尖锐且高强度的特征峰。以上三种物质的XRD图谱都表明它们都具有典型的结晶特性，同时三种物质的X射线衍射图谱表明β-CD、EGCG、L-茶氨酸三种物质特征峰的出现角度和强弱是不同的，因此可作为判别混合物中有无该物质的证据。因此，我们从普通物理混合物的谱带中很容易就发现，物理混合物显示出明显而强烈的峰，而所出现的峰基本上就是三种物质特征峰的叠加，而在EGCG包合物、L-茶氨酸包合物和EGCG+L-茶氨酸包合物的图谱中与三种物质有关的特征峰全部或基本消失。因此从EGCG包合物、L-茶氨酸包合物和EGCG+L-茶氨酸包合物的X衍射图可以推断包合物的形成。至于混合物图谱中表现出峰强度的变化则是与混合物中各物质的含量有关，但并不影响各物质特征峰出现的角度。
采用差式扫描量热法(DSC)研究EGCG+L-茶氨酸/β-CD纳米包合物，当客体分子进入β-CD空腔时，通常热峰会发生位移或消失。如图4所示β-CD的DSC曲线在109.12℃(337.5J/g)有较宽的吸热峰，这是由于与β-CD结合的水分子脱水引起的。EGCG在107.99℃(114.9J/g)和220.24℃(122.1J/g)有两个吸热峰这与现有文献报道的结果相似。107.99℃的峰是吸热融化所致，220.24℃与EGCG的熔点有关。L-茶氨酸在200.12℃(182.4J/g)有一个较大的吸热峰，与L-茶氨酸的熔点有关。物理混合物的DSC曲线在110.57℃仍然存在与β-CD相关的吸热峰，且在96.92℃和203.66℃也发现了与EGCG和L-茶氨酸相关的吸热峰，表明EGCG和L-茶氨酸仍然处于游离状态，这里的EGCG和L-茶氨酸的吸热发生了部分位移也说明了即使在物理混合物中β-CD也显示出了部分包合能力，但与β-CD相关的吸热峰则依然存在且未发生明显位移，显然物理混合物得到的仅仅只是物理覆盖的混合物。然而EGCG+L茶氨酸包合物得到了不同的DSC结果，与β-CD相比，EGCG+L-茶氨酸包合物的吸热峰向低温方向移动，吸热峰变宽、ΔH减小都是无序现象发生的证据，这可能是EGCG-L茶氨酸包合物形成所引起。这些结果表明，一些与β-CD结合的水分子被EGCG和L-茶氨酸所取代；换言之，EGCG和L茶氨酸被成功嵌入β-CD的空腔中。除此之外，在EGCG+L-茶氨酸包合物的DSC曲线中属于EGCG和L-茶氨酸的三个相关吸热峰消失，表明EGCG和L-茶氨酸被包封到β-CD的空腔中，而不是物理混合。这一点在EGCG包合物和L-茶氨酸包合物的DSC结果中也得到了印证，在EGCG包合物的DSC结果中，与EGCG和β-CD相关的吸热峰基本消失，在L-茶氨酸包合物的DSC结果中与β-CD有关的吸热峰基本消失，与L-茶氨酸相关的吸热峰则位移至212.98℃，表明包合下的L-茶氨酸熔点升高了，这表明在β-CD的作用下，L-茶氨酸的热稳定性得到提高。以上结果均表明L-茶氨酸和EGCG都已嵌入β-CD的空腔中，并起到了保护药物分子的作用。
对EGCG、β-CD、L-茶氨酸、物理混合物(PM)、EGCG/β-环糊精包合物(BE)、L-茶氨酸/β-环糊精包合物(BL)、EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物(BLE)进行了热稳定性测试，如图5所示，所有样品的质量损失都经历了两个阶段，第一阶段的质量损失在50℃-148℃之间，这主要是由于物理吸附的水分以及残留的溶剂蒸发所致。第二阶段的质量损失在189℃-415℃之间，这主要归因于样品的脱水和分解。EGCG、L-茶氨酸、β-CD、PM、包合物BL、包合物BE及包合物BLE在第二阶段的质量损失分别为36.98％、75.15％、70％、51.9％、52.58％、34.4％和39.1％。由此可以看出，包合物BL、BE、BLE分别与未包合的L-茶氨酸、EGCG、PM相比失重更少(即L-茶氨酸、EGCG、PM分别包合后损失更少)，可能是因为EGCG和/或L-茶氨酸被β-CD深深包裹使得药物分子的热稳定性得到提高。同时，包合物BL、包合物BE、包合物BLE在第二阶段失重均比β-CD少，可能是因为EGCG或L-茶氨酸对β-CD的填充，从而抑制了β-CD的热降解，这结果与现有文献报道一致。一阶导数(DTG)是TGA的一次微分曲线，更直观地显示7个样品在第2阶段的失重情况。由图5中DTG曲线可知，第二阶段样品L-茶氨酸、EGCG和其纳米包合物BE、BLE的峰值温度分别为TL-茶氨酸＝246.83℃、TEGCG＝246.83℃、TBE＝298.33℃、TBLE＝295.40℃，这进一步证明了EGCG或L-茶氨酸经过与β-CD形成包合物后热稳定性均得到提高。
EGCG/β-环糊精包合物的分子对接如图6所示，EGCG(图6a)与β-CD(图6b)对接打分为-6.8kcal/mol。其两端苯环可以形成稳定的pi-pi堆积结构(图6c)，这与紫外光谱中的结果是相一致的，并统一朝向β-CD开口较大一端。而中间苯环则朝向β-CD开口较小一端。从该结构可知，β-CD可以较好的将EGCG包裹在内部(图6f)。EGCG与β-CD主要通过EGCG羟基氧与β-CD羟基氧之间氢键相互作用(静电作用)稳定结合，二者可以形成至少8个氢键作用，具体氢键分布、键长(两个氧原子间距离)，见图6e。由于EGCG的A环、B环和Bˊ环的空间位阻较小，因此EGCG的三个环都容易与β-CD形成包合物。
实施例4
为实施例1的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物在提高EGCG稳定性方面的应用。将EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物进行初步的模拟体外静态消化实验，测定消化过程中EGCG及其包合物的抗氧化活性变化及生物利用度，其应用方法为：
以空白为对照，EGCG、EGCG+L-茶氨酸、EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物、对比例2的EGCG/β-环糊精包合物、对比例3的L-茶氨酸/β-环糊精包合物为对比，采用模拟体外静态消化对EGCG、EGCG+L-茶氨酸及EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物、EGCG/β-环糊精包合物、L-茶氨酸/β-环糊精包合物进行的相对生物利用度的评价。
参考体外静态模拟消化的国际共识建立起体外消化模型(Minekus M,AlmingerM,Alvito P,Ballance S,Bohn T,Bourlieu C,Carrière F,Boutrou R,Corredig M,Dupont D,Dufour C,Egger L,Golding M,Karakaya S,Kirkhus B,Le Feunteun S,LesmesU,Macierzanka A,Mackie A,Marze S,McClements DJ,Ménard O,Recio I,Santos CN,Singh RP,Vegarud GE,Wickham MS,Weitschies W,Brodkorb A.A standardised staticin vitro digestion method suitable for food-an international consensus.FoodFunct.2014Jun；5(6):1113-24.doi:10.1039/c3fo60702j.Epub 2014May 7.PMID:24803111.)，消化过程如下：
模拟口腔消化阶段：将5mL样品溶液与3.5mL的SSF电解质原液混合，加入25μL的CaCl2(0.3M)，再加入唾液淀粉酶0.5mL(1500U/mL),最后用1M碳酸氢钠调节pH至7.0，用超纯水将最终体积调整到10mL，混合均匀，将混合物在37摄氏度的水浴摇床上摇动2min，进行模拟口腔消化。
模拟胃液消化阶段：将上述模拟口腔消化完成的10mL混合液体与7.5mL的SGF电解质原液混合，依次加入5μL CaCl2(0.3M)，1.6mL的胃蛋白酶溶液(25000U/mL)，用6M盐酸调节pH值至3.0。用超纯水将混合物的体积调节到20mL，并将其置于37℃的恒温浴中搅拌2h，进行模拟胃液消化。胃液消化结束后将消化液经超声2min，而后在4℃，14000rpm/min的条件下高速离心10min，取上清液进行HPLC分析。
模拟十二指肠消化阶段：将上述模拟胃液消化完成的20mL混合液体与11mL的SIF原液混合，再依次加入40μLCaCl2(0.3M)，5ml的胰蛋白酶(800U/mL)，用1M氢氧化钠调节pH至7.0，用超纯水将最终体积调整到40mL，然后放入37℃的恒温浴中搅拌2h，进行模拟十二指肠消化。十二指肠消化后将消化液经超声2min，而后在4℃，14000rpm/min的条件下高速离心10min，取上清液进行相对生物利用度计算(HPLC分析)及可抗氧化性检测。
生物利用度的测定
收集前述模拟消化阶段的混合物，利用高效液相色谱对残留EGCG进行检测分析，生物利用度的计算按参考文献：Seraglio SKT,Valese AC,Daguer H,Bergamo G,AzevedoMS,Nehring P,Gonzaga LV,Fett R,Costa ACO.Effect of in vitro gastrointestinaldigestion on the bioaccessibility of phenolic compounds,minerals,andantioxidant capacity of Mimosa scabrella Bentham honeydew honeys.Food ResInt.2017Sep；99(Pt 1):670-678.doi:10.1016/j.foodres.2017.06.024.Epub 2017Jun13.PMID:28784530.进行，计算公式见下，检测结果列于表1中。
Figure BDA0003226259470000141
根据表1可以看出：EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物在经过完整的体外模拟消化后，相对生物利用度显著高于EGCG/β-环糊精包合物及未包合的EGCG、EGCG+L-茶氨酸。
表1EGCG及纳米包合物在模拟体外消化前、消化中及消化后EGCG的保留情况
Figure BDA0003226259470000142
注：表中字母a-c表示具有相同字母的组之间无显著差异，无相同字母的组之间差异显著(P<0.05)。
抗氧化检测
采用FRAR法和DPPH法对前述收集的模拟消化阶段的混合物包括：消化前、消化中(模拟胃消化阶段结束)、消化后(模拟肠消化阶段结束)进行抗氧化活性的检测。检测结果列于表2中。
根据表2可以看出：EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物、EGCG/β-环糊精包合物在经过完整的体外模拟消化后抗氧化活性要显著优于未包合的EGCG、EGCG+L-茶氨酸；且消化完成后的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物的抗氧化效果要优于EGCG/β-环糊精包合物，EGCG+L-茶氨酸要优于单独的EGCG。
表2EGCG及纳米包合物在模拟体外消化前、消化中及消化后抗氧化能力的变化情况
Figure BDA0003226259470000151
注：表中字母a-d表示具有相同字母的组之间无显著差异，无相同字母的组之间差异显著(P<0.05)。
实施例5
以实施例1的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物验证在预防长期高脂饮食大鼠肥胖及高胆固醇血症方面的应用。将实施例1制备的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物进行初步的动物实验，测定本实施例中制备的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物对长期高脂饮食大鼠体重、血脂的影响，其应用方法为：
将80只SPF级SD大鼠在上述条件下适应性饲养一周后，称取体重，随机分为10组(n＝8)：正常饮食组(ND)、高脂饮食组(HFD)、辛伐他汀阳性对照组(Sim)、L-茶氨酸干预组(L)、EGCG干预组(E)、L-茶氨酸+EGCG联合干预组(LE)、L-茶氨酸/β-CD包合物干预组组(BL)、EGCG/β-CD包合物干预组组(BE)、EGCG+L-theanine/β-CD包合物干预组组(BLE)、β-CD组(BB)。正常饮食组(ND)及高脂饮食组(HFD)灌胃等量超纯水，辛伐他汀阳性对照组(Sim)灌胃5mg·kg-1·d-1辛伐他汀，L-茶氨酸干预组(L)灌胃100mg·kg-1·d-1L-茶氨酸，EGCG干预组(E)灌胃100mg·kg-1·d-1EGCG，L-茶氨酸+EGCG干预组(LE)灌胃83.3mg·kg-1·d-1EGCG+16.7mg·kg-1·d-1L-茶氨酸，BL组灌胃含有100mg·kg-1·d-1L-茶氨酸的L-茶氨酸/β-环糊精包合物，BE组灌胃含有100mg·kg-1·d-1EGCG的EGCG/β-环糊精包合物，BLE组灌胃含有(16.7mgL-茶氨酸和83.3mgEGCG)·kg-1·d-1的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物。BB组灌胃100mg·kg-1·d-1β-CD。灌胃体积根据每日体重变化而变化，灌胃浓度固定。
体重结果如图7所示：可以看出EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物、EGCG/β-环糊精包合物在预防长期高脂饮食大鼠体重增长的效果要优于未包合的EGCG、L-茶氨酸、EGCG+L-茶氨酸及β-CD；且EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物在预防长期高脂饮食大鼠体重增长的效果要优于EGCG/β-环糊精包合物或L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
Lee’s指数结果如图8所示：可以看出EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物、EGCG/β-环糊精包合物、L-茶氨酸/β-环糊精包合物在降低长期高脂饮食大鼠Lee’s指数的效果上分别优于未包合的EGCG+L-茶氨酸、EGCG、L-茶氨酸；且EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物的效果要优于EGCG/β-环糊精包合物或L-茶氨酸/β-环糊精包合物。
血脂结果如图9所示：从血清总胆固醇、磷脂含量中可以看出EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物、EGCG/β-环糊精包合物、L-茶氨酸/β-环糊精包合物在降低长期高脂饮食大鼠血脂的效果显著优于未包合的EGCG、L-茶氨酸、EGCG+L-茶氨酸、β-CD；且EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物的效果要优于EGCG/β-环糊精包合物或L-茶氨酸/β-环糊精包合物。在血清低密度脂蛋白胆固醇图中，除L-茶氨酸干预组外各干预组的血清低密度脂蛋白胆固醇含量均显著降低。此外，在血清高密度脂蛋白胆固醇含量图中发现，只有BE和BLE组显著提高了高密度脂蛋白胆固醇含量，且BLE的效果优于BE。
由以上分析可知，EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物在预防长期高脂饮食大鼠体重增长方面、降低长期高脂饮食大鼠Lee’s指数方面以及降低长期高脂饮食大鼠血脂方面均优于EGCG/β-环糊精包合物、L-茶氨酸/β-环糊精包合物及EGCG+L-茶氨酸，表明β-环糊精包合EGCG和L-茶氨酸后，增强了EGCG与L-茶氨酸之间的协同增效作用，更好地发挥了其药理作用，能用于预防肥胖及高胆固醇血症的发生。

Claims (1)

1.具协同增效作用的EGCG+L-茶氨酸/β-环糊精包合物在制备预防高胆固醇血症的药物中的应用，其特征在于，该包合物是以β-环糊精为载体，将EGCG和L-茶氨酸包合在β-环糊精中形成；其中，β-环糊精与EGCG+L-茶氨酸的重量比为1:1，EGCG与L-茶氨酸的重量比为4-5:1。
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