CN113476648B - 一种医用金属植入体表面涂层处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种医用金属植入体表面涂层处理方法,在合成壳聚糖‑β‑环糊精接枝物(Chi‑β‑CD)基础上,利用Chi‑β‑CD的环糊精疏水环加载匹伐他汀药物,并以此为聚阳离子,以明胶(Gel)为聚阴离子,采用自组装技术,在金属植入材料表面构建含匹伐他汀药物的多层膜结构。本发明处理后的匹伐他汀多层膜可以有效促进间充质干细胞的成骨分化和内皮细胞的成血管效应,大大提高金属骨植入材料的骨再生能力,对于加快医用金属骨植入材料在体内植入后与宿主产生有效骨整合具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于新材料技术领域,具体涉及一种医用金属植入体表面涂层处理方法,是一种兼具促成骨与促血管化的表面涂层的生物金属植入体的处理方法。
背景技术
医用金属植入材料,如钛基植入材料等,由于具有良好的生物相容性及机械性能等特点而在骨科、牙科等临床硬组织替代植入领域广泛应用;但是植入材料表面的生物惰性却也阻碍植入体与周围骨组织间的功能性整合,进而影响体内植入后的预后以及使用寿命。在不改变金属植入体整体性能的情况下,通过对材料表面进行改性修饰,增强其表面生物学、化学等性能,制备多功能化的医用金属植入体,加快体内植入后金属植入体与周围骨组织的骨整合,以满足临床需求,是现代医用装置应用中要解决的重要问题。
与常规骨折修复、以及骨骼生长或重塑过程中的骨生长相似,在骨-植入体界面修复过程涉及到一系列复杂动态过程。血管(尤其是血管内皮细胞)在控制器官的生长、平衡和再生过程中发挥重要调控作用。近年来大量研究证实,在骨生长或再生修复过程中,骨组织的血管化与骨形成是一个耦合过程,有效的血管新生是骨再生修复的重要方面。尽管有研究人员试图提高金属植入材料体内植入后的周边血管化水平,但是所用方法普遍过程复杂,需要使用两种或两种以上活性物质对成骨和成血管化进行分别调控。因此,寻求一种简单的兼具促成骨与促血管化的生物医用金属植入体表面修饰手段,是当前医用植入体表面设计的关键性问题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种医用金属植入体表面涂层处理方法,采用自组装技术,在钛及钛合金、钴基合金、不锈钢材料等植入基体材料表面上涂布含匹伐他汀多层膜涂层,以解决现有植入材料快速骨整合问题,该方法所得永久植入材料适合多种植入部位的力学要求,同时具有促进植入体周围骨再生和血管化功能。
本发明提供的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,该方法包括以下步骤:以壳聚糖为原料,利用对硝基苯磺酰氯取代β-环糊精(ASC)中的双键与壳聚糖的氨基反应,制备了壳聚糖-β-环糊精接枝物(Chi-β-CD),利用壳聚糖-β-环糊精接枝物的环糊精疏水环加载匹伐他汀药物,并以此为聚阳离子,以明胶(Gel)为聚阴离子,采用层层自组装技术,在金属植入材料表面构建含匹伐他汀药物的多层膜结构,完成表面涂层处理。
所用植入基体材料为金属件,采用钛及钛合金、钴基合金、不锈钢材料制成。
所用植入基体材料为医用材料及器件。
通过控制匹伐他汀加载浓度,或通过控制多层膜构建过程中的循环次数来控制多层膜结构中匹伐他汀加载量。
具体制备步骤如下:
(1)利用无水丙酮、无水乙醇、去离子水依次将所述植入基体材料进行超声清洗三次,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,干燥备用;
(2)准确称取113.5g的β-环糊精、154.7g对硝基苯磺酰氯,置于2000mL圆底烧瓶中,加入无水二甲亚砜200mL、三乙胺97.4mL,60℃恒温油浴反应1h。准确称取壳聚糖粉末(50,000-190,000Da低分子量,75-85%脱乙酰化)16.1g,置于1000mL烧杯中,加500mL去离子水,在磁力搅拌下缓慢滴加醋酸至壳聚糖刚好溶解,并加入到反应瓶中,继续反应24h,获得壳聚糖-β-环糊精接枝物(Chi-β-CD)初级产物。用截留相对分子质量为1.8万的透析袋对产物Chi-β-CD进行装样透析,每8小时换一次去离子水,共透析3天。将获得产物Chi-β-CD置于冷冻干燥机中干燥备用;
(3)优选的,将步骤(2)制备的Chi-β-CD溶解于双蒸水,制备Chi-β-CD溶液,浓度为0.1mg/mL-10mg/mL,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,得到壳聚糖-β-环糊精接枝物(Chi-β-CD)聚电解质溶液,备用;
(4)优选的,将匹伐他汀加入到Chi-β-CD溶液,匹伐他汀加载浓度为1.0nM-1.0μM,颠倒混匀处理24小时,将匹伐他汀加载在壳聚糖-β-环糊精接枝物(Chi-β-CD)聚电解质的环糊精疏水环中,记为Chi-β-CD@pc;
(5)优选的,将明胶溶解于双蒸水中,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,制备浓度为0.1mg/mL-10mg/mL的明胶聚电解质溶液备用;
(6)优选的,将步骤(1)处理后的植入基体材料,利用旋涂仪旋涂Chi-β-CD@pc聚电解质,旋涂条件为起始旋涂转速为100-500转/秒,时间为1-10秒钟,之后旋涂转速为2500-4500转/秒,时间为10-60秒钟。或者静置吸附法包被Chi-β-CD@pc聚电解质:将金属植入基体材料浸没在Chi-β-CD@pc聚电解质溶液中,静置吸附,吸附时间为1-60分钟,之后取出,利用生理缓冲液清洗,浸没在生理缓冲液中,清洗去除未包被在植入基体材料表面的Chi-β-CD@pc聚电解质;
(7)优选的,利用旋涂仪旋涂明胶聚电解质,旋涂条件为起始旋涂转速为100-500转/秒,旋涂时间为1-10秒钟,之后旋涂转速为2500-4500转/秒,旋涂时间为10-60秒钟;或者静置吸附法包被明胶聚电解质:将植入材料浸没在明胶聚电解质溶液中,静置吸附,吸附时间为1-60分钟,之后取出,利用生理缓冲液清洗,浸没在生理缓冲液中,清洗去除未包被在植入基体材料表面的明胶聚电解质。
(8)优选的,多次重复步骤(6)和步骤(7),在医用金属植入材料表面构建装载匹伐他汀多层膜结构,记为Ti-LBL@pc或LBL@pc,循环重复次数为5-100次。
生理缓溶液为磷酸缓冲溶液或平衡盐溶液。
本发明方法解决了植入材料周围成骨化与成血管化共调控问题,本发明具有以下优点:
(1)本发明构建的匹伐他汀涂层,可以实现骨植入体周围进行促骨再生与血管化共调控。
(2)制备方法不需要特殊设备,操作简单、可控性强。
(3)通过在植入体表面构建匹伐他汀多层分子库,可以在有效控制匹伐他汀局部释放,在发挥匹伐他汀调控作用的同时,极大减少匹伐他汀的全身用药的副作用,在骨替代植入材料的应用中有重要的研究价值和临床意义。
附图说明
图1是壳聚糖-β-环糊精接枝物(Chi-β-CD)的红外表征图。
图2是不同基底表面扫描电子显微镜观察。
图3是不同基底表面原子力显微镜观察。
图4构建的含匹伐他汀多层膜结构中匹伐他汀的药物释放曲线。
图5为不同修饰样品表面间充质干细胞(MSCs)培养4天和7天后的细胞活性图。
图6为不同修饰样品表面间充质干细胞(MSCs)培养4天和7天后的碱性磷酸酶活性。
图7为不同修饰样品表面人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞活性图。
图8为不同修饰样品表面人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞划痕实验结果图。
图9为不同修饰样品表面人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的微管形成能力图。
具体实施方式
以下结合附图和通过实施对本发明进行清楚和完整的描述。显而易见地,下面所描述的实施例只用于本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限定。本发明中的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不做出创造性劳动成果的前提下,还可以根据这些实施例获得其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
基体材料(简称基材)表面预处理:将各基体材料(钛及钛合金、钴基合金、不锈钢等金属材料)制备成直径15mm,厚度2mm的金属圆片,然后依次经丙酮、乙醇和去离子水分别超声15分钟清洗,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,干燥备用。
下面所用的基体材料均为通过上述表面处理过后的基材。
(1)利用无水丙酮、无水乙醇、去离子水依次将所述金属植入材料进行超声清洗三次,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,干燥备用。
(2)准确称取113.5g的β-环糊精、154.7g对硝基苯磺酰氯,置于2000mL圆底烧瓶中,加入无水二甲亚砜200mL、三乙胺97.4mL,60℃恒温油浴反应1h。准确称取壳聚糖粉末16.1g,置于1000mL烧杯中,加500mL去离子水,在磁力搅拌下缓慢滴加醋酸至壳聚糖刚好溶解,并加入到反应瓶中,继续反应24h。用截留相对分子质量为1.8万的透析袋对产物进行装样透析,每8小时换一次去离子水,共透析3天。将获得产物样品置于冷冻干燥机中干燥备用。
将Chi-β-CD溶解于双蒸水,制备Chi-β-CD溶液,浓度为2mg/mL,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟。
将匹伐他汀加入到Chi-β-CD溶液,使匹伐他汀终浓度为100.0nM,颠倒混匀处理24小时,将匹伐他汀加载在壳聚糖-β-环糊精接枝物的环糊精疏水环中,记为Chi-β-CD@pc。
将明胶溶解于双蒸水中,制备浓度为2mg/mL的明胶溶液,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟。
利用旋涂仪旋涂Chi-β-CD@pc聚电解质,旋涂条件为起始旋涂转速为500转/秒,旋涂时间为5秒钟,之后旋涂转速为3500转/秒,旋涂时间为30秒钟。
利用旋涂仪旋涂明胶聚电解质,旋涂条件为起始旋涂转速为旋涂条件为起始旋涂转速为500转/秒,时间为5秒钟,之后旋涂转速为3500转/秒,时间为30秒钟。
重复(5)和步骤(6)10次,在医用金属植入材料表面构建装载匹伐他汀(Chi-β-CD@pc/Gel)10多层膜结构,记为LBL@pc。
利用未加载匹伐他汀的Chi-β-CD替代Chi-β-CD@pc,重复以上过程,制备(Chi-β-CD/Gel)10多层膜结构,记为LBL。
图1为壳聚糖,β-环糊精,壳聚糖-β-环糊精接枝物的红外图谱,有图1可见本实施例中,β-环糊精通过自身-OH键与壳聚糖的-NH2结合,成功构建了壳聚糖-β-环糊精接枝物。
图2是不同修饰组Ti表面的扫描电镜图(scale bar=200nm);从图2中可以看到,与未经修饰的Ti表面相比,多层膜修饰的Ti表面多层膜会在干燥过程中发生龟裂;而与未加载匹伐他汀的LBL组相比,加载匹伐他汀的LBL@pc未对其表面结构产生显著改变。
图3是不同修饰组Ti表面的原子力显微镜观察图;从图3可以看出,多层膜包被后的Ti组表面粗糙度会有所降低。
图4是构建的含匹伐他汀多层膜结构中匹伐他汀的药物释放曲线;从图4可以看出,多层膜结构可以实现匹伐他汀药物的长期药物缓慢释放。
实施例2:
基材表面预处理:将各基材(钛及钛合金、钴基合金、不锈钢材料)制备成直径15mm,厚度2mm的金属圆片,然后依次经丙酮、乙醇和去离子水分别超声15分钟清洗,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,干燥备用。
下面所用的基材均为通过上述表面与处理过后的基材。
(1)利用无水丙酮、无水乙醇、去离子水依次将所述金属植入材料进行超声清洗三次,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,干燥备用;
(2)准确称取113.5g的β-环糊精、154.7g对硝基苯磺酰氯,置于2000mL圆底烧瓶中,加入无水二甲亚砜200mL、三乙胺97.4mL,60℃恒温油浴反应1h。准确称取壳聚糖粉末16.1g,置于1000mL烧杯中,加500mL去离子水,在磁力搅拌下缓慢滴加醋酸至壳聚糖刚好溶解,并加入到反应瓶中,继续反应24h。用截留相对分子质量为1.8万的透析袋对产物进行装样透析,每8小时换一次去离子水,共透析3天。将获得产物样品置于冷冻干燥机中干燥备用。
将Chi-β-CD溶解于双蒸水,制备Chi-β-CD溶液,浓度为2mg/mL,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟。
将匹伐他汀加入到Chi-β-CD溶液,使匹伐他汀终浓度为100.0nM,颠倒混匀处理24小时,将匹伐他汀加载在壳聚糖-β-环糊精接枝物的环糊精疏水环中,记为Chi-β-CD@pc;
将明胶溶解于双蒸水中,制备浓度为2mg/mL的明胶溶液,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟。
利用旋涂仪旋涂Chi-β-CD@pc聚电解质,旋涂条件为起始旋涂转速为500转/秒,旋涂时间为5秒钟,之后旋涂转速为3500转/秒,旋涂时间为30秒钟。
利用旋涂仪旋涂明胶聚电解质,旋涂条件为起始旋涂转速为旋涂条件为起始旋涂转速为500转/秒,旋涂时间为5秒钟,之后旋涂转速为3500转/秒,旋涂时间为30秒钟。
重复(5)和步骤(6)10次,在医用金属植入材料表面构建装载匹伐他汀(Chi-β-CD@pc/Gel)10多层膜结构,记为LBL@pc。
利用未加载匹伐他汀的Chi-β-CD替代Chi-β-CD@pc,重复以上过程,制备(Chi-β-CD/Gel)10多层膜结构,记为LBL。
实施例3
针对实施例1所得到的材料表面间充质干细胞(MSCs)活性检测和碱性磷酸酶检测
将生长到第三代的细胞,分别种植在不同钛材表面(Ti,LBL,LBL@pc),接种密度为1×104个/cm2,37℃、5%CO2条件下培养不同时间,每两天换液一次;
利用MTT技术检测培养4天和7天不同材料表面的MSCs细胞活性,不同时间点,为了检测不同材料表面的细胞活性,吸弃旧培养液后各孔中加入含有0.5mg/mL的新鲜培养基,继续培养4h后,弃去培养基,添加500μL的DMSO充分溶解甲瓒,在490nm处测量各组吸光值;
另外利用BCA试剂盒和碱性磷酸酶试剂盒检测了培养7天后不同材料表面的MSCs细胞的碱性磷酸酶水平,在不同时间点,利用BCA试剂盒确定不同组的细胞的总蛋白量,然后用ALP试剂盒确定不同组在520nm处的吸光值,根据公式计算出每组的ALP活性;
细胞AKP活性(U/g prot)=(测量OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(0.1mg/mL)÷待测样品蛋白浓度(gprot/mL);
图5为样品表面间充质干细胞培养4天和7天后的细胞活性;从图5中的结果中可以看出,在培养4天和7天后,Ti组和Ti-LBL组细胞活性均显著低于Ti-LBL@pc组;
图6为不同钛材表面间充质干细胞(MSCs)培养7天后的碱性磷酸酶活性;从图6中可以看出,在培养7天后,Ti-LBL@pc组表面细胞的碱性磷酸酶活性均显著地高于Ti和Ti-LBL组。
实施例4
针对实施2所得到的材表面HUVECs细胞活性、微管形成能力和细胞划痕迁移率。
利用MTT技术检测细胞活性,具体的,将HUVECs分别种植在不同钛材表面(Ti,LBL,LBL@pc),接种密度为2×104个/cm2,37℃、5%CO2条件下培养不同时间,每两天换液一次,培养1天和3天不同材料表面的MSCs细胞活性,不同时间点,为了检测不同材料表面的细胞活性,吸弃旧培养液后各孔中加入含有0.5mg/mL的新鲜培养基,继续培养4h后,弃去培养基,添加500μL的DMSO充分溶解甲瓒,在490nm处测量各组吸光值。
利用划痕实验检测HUVECs的迁移能力,具体的,将HUVECs分别种植在不同钛材表面(Ti,LBL,LBL@pc),接种密度为4×104个/cm2,37℃、5%CO2条件下培养过夜,之后利用枪头划细胞单层,制备细胞划痕模型,在培养6小时和12小时候,5μg/mL FDA染色并观察细胞迁移状况。
利用微管形成实验评价HUVECs的体外成血管能力,具体的,首先利用200μLMatrigel加载在不同钛材表面,37℃,5%CO2条件下孵育30分钟,将HUVEC利用培养基重悬,以5×104个/孔的数量种植在钛材料表面,培养12小时后,利用5μg/mL FDA染色并观察。
图7为样品表面HUVECs培养4天和7天后的细胞活性;从图7中的结果中可以看出,在培养4天和7天后,Ti组和Ti-LBL组细胞活性均显著低于Ti-LBL@pc组。
图8为不同钛材表面HUVECs的微管形成能力;从图8可以看出,Ti-LBL@pc组的HUVECs微管形成数量明显高于Ti组和Ti-LBL组。
图9为不同钛材表面HUVECs的划痕迁移能力;从图9可以看出,Ti-LBL@pc组的HUVECs细胞迁移能力明显高于Ti组和Ti-LBL组。
综上所述,本发明中的制备方法不需要特殊设备,操作简单、可控性强;并且本发明构建的匹伐他汀涂层,可以实现骨植入体周围进行促骨再生与血管化共调控;通过在植入体表面构建匹伐他汀多层分子库,可以在有效控制匹伐他汀局部释放,在发挥匹伐他汀调控作用的同时,极大减少匹伐他汀的全身用药的副作用,在骨替代植入材料的应用中有重要的研究价值和临床意义。
Claims (10)
1.一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,通过以下步骤实现:以壳聚糖为原料,利用对硝基苯磺酰氯取代β-环糊精中的双键与壳聚糖的氨基反应,制备壳聚糖-β-环糊精接枝物,利用壳聚糖-β-环糊精接枝物的环糊精疏水环加载匹伐他汀药物,并以此为聚阳离子,以明胶为聚阴离子,采用层层自组装技术,在植入基体材料表面构建含匹伐他汀药物的多层膜结构,完成植入体表明涂层处理。
2.如权利要求1所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于:所用基体材料为金属件,选用钛及钛合金、钴基合金、不锈钢材料。
3.如权利要求1或2所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,通过以下步骤实现:
(1)利用无水丙酮、无水乙醇、去离子水依次将所述植入基体材料进行超声清洗三次,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,干燥备用;
(2)以壳聚糖为原料,利用对硝基苯磺酰氯取代β-环糊精中的双键与壳聚糖的氨基反应,制备壳聚糖-β-环糊精接枝物,简称Chi-β-CD,将Chi-β-CD溶解于双蒸水,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,得到Chi-β-CD聚电解质溶液,备用;
(3)将匹伐他汀钙加入到步骤(2)得到的Chi-β-CD聚电解质溶液中,颠倒混匀处理24小时,将匹伐他汀加载在壳聚糖-β-环糊精接枝物的环糊精疏水环中,记为Chi-β-CD@pc溶液;
(4)将明胶溶解于双蒸水中,高压蒸汽灭菌,灭菌条件为121度,时间30分钟,得到明胶(Gel)聚电解质溶液备用;
(5)将步骤(1)处理后的植入基体材料利用旋涂仪包被Chi-β-CD@pc聚电解质;或者静置吸附法包被Chi-β-CD@pc聚电解质:将植入基体材料浸没在Chi-β-CD@pc聚电解质溶液中,并静置吸附,之后取出,浸没在生理缓冲液中,清洗去除未包被在植入基体材料表面的Chi-β-CD@pc聚电解质;
(6)在步骤(5)处理的基础上,利用旋涂仪包被步骤(4)得到的明胶(Gel)聚电解质溶 液;或者利用步骤(4)得到的明胶(Gel)聚电解质溶液进行浸没处理,静置吸附,之后取出,浸没在生理缓冲液中,清洗去除未包被在植入基体材料表面的明胶(Gel)聚电解质;
(7)多次重复(5)和步骤(6),在植入基体材料表面构建装载匹伐他汀多层膜结构。
4.根据权利要求3所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,所述的植入基体材料为金属件,选用钛及钛合金、钴基合金、不锈钢材料制成。
5.根据权利要求3所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,所述的步骤(2)中Chi-β-CD聚电解质溶液浓度为0.1mg/mL-10mg/mL。
6.根据权利要求3所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,所述的步骤(3)中匹伐他汀加载浓度为1.0nM-1.0μM。
7.根据权利要求3所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,所述的步骤(4)中明胶聚电解质溶液为0.1mg/mL-10mg/mL。
8.根据权利要求3所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,所述的步骤(5)和步骤(6)中,旋涂条件为起始旋涂转速为100-500转/秒,时间为1-10秒钟,之后旋涂转速为2500-4500转/秒,时间为10-60秒钟;静置吸附法吸附时间为1-60分钟。
9.根据权利要求3所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,所述的步骤(5)和步骤(6)中的生理缓溶液为磷酸缓冲溶液或平衡盐溶液。
10.根据权利要求3所述的一种医用金属植入体表面涂层处理方法,其特征在于,所述的步骤(7)中的循环次数为5-100次。
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