CN113474651A - 单分子蛋白质和肽测序 - Google Patents

Abstract

本说明书提供了可用于对蛋白质进行测序的方法、测定和试剂。广义上的蛋白质测序涉及观察氨基酸的看似合理的身份和顺序，这对于对单个多肽分子或单一多肽的多个分子进行测序是有用的。一方面，该方法可用于对多个多肽进行测序。本文所述的方法和试剂可用于蛋白质组的高分辨率研究，实现对疾病的早期检测至关重要的超灵敏诊断。

Description

单分子蛋白质和肽测序

相关申请

本申请要求于2019年1月8日提交的美国临时申请号62/789,850的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。

背景技术

蛋白质在所有生物体的细胞水平上起着关键的结构和动态功能作用。了解蛋白质对生物功能的贡献至关重要，这取决于拥有适当的定量和鉴定技术。分子生物学的中心法则(即从DNA到RNA再到蛋白质的信息流)已被研究几十年，因为这些分子对细胞功能和多样性至关重要。核酸的聚合酶链反应(PCR)扩增的出现对于在全基因组和转录组水平推进DNA和RNA的高通量分子检测和分析至关重要。相比之下，蛋白质研究在技术上已经落后，因为没有PCR的等效物来扩增和检测低拷贝数蛋白质。相反，蛋白质测序和鉴定方法依赖于许多细胞的集合测量，这些测量掩盖了细胞之间的差异。尽管一些研究人员已将转录组学作为细胞内蛋白质组成的代表，但重要的是要注意到，由于不同mRNA翻译效率的变化性以及mRNA和蛋白质寿命之间的差异，转录组水平的基因表达与蛋白质组表达谱的相关性较弱。此外，翻译后修饰还导致蛋白质丰度及其相对于转录组的一级序列的显著变化。重要的生物过程(例如突触可塑性、代谢信号通路和干细胞分化)均依赖于蛋白质表达。许多疾病也源于基因突变，这些基因突变又被翻译为单个或一组异常蛋白质。疾病(例如癌症和神经退化)往往会引发起源不明且多基因相互作用的突变。它们可在蛋白质组学水平上得到最好的理解和解决，因为它们的病理学与细胞水平上的蛋白质稳态破坏直接相关。

蛋白质组学的进步已经落后，而DNA测序迅速推进了基因组学的研究，这主要是由于允许高通量测序的技术。研究蛋白质的当前方法包括质谱法、埃德曼测序和免疫组织化学(IHC)。

质谱法可根据肽片段的质荷比进行蛋白质识别和定量，这些片段可以生物信息学映射回基因组数据库。尽管这项技术取得了重大进展，但它尚未量化来自生物系统的一套完整的蛋白质。该技术表现出对全蛋白质的阿托摩尔(attomole)检测灵敏度和分馏后的亚阿托摩尔(subattomole)灵敏度。质谱的灵敏度有限，因为占哺乳动物蛋白质表达约10％的低拷贝数蛋白质(尽管丰度低，但在功能上仍很重要)仍未被检测到。

另一种用于蛋白质测序的方法是埃德曼降解(Edman degradation)反应。埃德曼降解允许顺序和选择性地去除单个N-末端氨基酸，随后通过HPLC、高效液相色谱法进行鉴定。埃德曼蛋白质测序是一种经证实的方法，可选择性地去除第一个N-末端氨基酸进行鉴定，其中，异硫氰酸苯酯(PITC)用于缀合至N-末端氨基酸，然后通过酸和热处理，去除PITC标记的N-末端氨基酸。尽管埃德曼测序可具有98％效率，但主要的缺点是它固有的低通量，需要高度纯化的单种蛋白质，不适用于全系统生物学。埃德曼降解和质谱法均可对蛋白质进行测序，但缺乏单分子灵敏度，并且不提供细胞环境中蛋白质的空间信息。

关于空间信息，免疫组织化学是一种蛋白质识别方法，它使我们能够可视化蛋白质的细胞定位，但不提供序列信息。免疫组织化学涉及通过用荧光团缀合抗体进行识别来鉴定蛋白质。此种方法不包括蛋白质序列信息，但可识别蛋白质及它们各自的定位。主要的限制是可扩展性，因为即使是蛋白质组中每种蛋白质的特异性抗体的完美构建也需要约25,000个抗体和约6250轮四色成像。任何一对一的蛋白质标记方案均可能无法扩展到整个蛋白质组。

蛋白质测序的主要障碍是缺乏探测肽上的氨基酸的天然酶和生物分子。例如，不存在类似于用于核酸的PCR的蛋白质扩增过程，因此通过单分子策略进行测序的方法是合适的，需要检测单个氨基酸。

当前提议的单分子蛋白质测序方法依赖于通过肽或蛋白质残基的共价化学修饰进行荧光读出，用N-末端特异性氨基酸结合剂(NAAB)进行探测，或利用跨膜施加的电压通过纳米孔转运肽。由于相邻化学标记引起空间位阻，内部肽链上氨基酸的化学修饰可能容易受到低效率的影响，并且用于标记所有20种氨基酸的可用反应性氨基酸和化学物质的数量也有限。使用纳米孔进行蛋白质测序的主要问题可归因于氨基酸残基的非均匀电荷分布以及反卷积电记录(electric recording)以区分氨基酸的分析挑战。

在N-末端氨基酸结合剂的情况下，肽通过C-末端固定在底物上，因此N-末端可用于结合剂和顺序埃德曼降解。设计不受在不同肽中发现的可变相邻氨基酸影响的高度特异性、强N-末端结合剂具有挑战性。相邻氨基酸可能会通过引入电荷、空间和二级结构的变化来影响N-末端结合。这可称为“局部环境”问题。例如，当试图识别肽的N-末端氨基酸时，肽其余部分上不同氨基酸的组合会导致许多可能的序列，这些序列与N-末端结合剂产生不一致的相互作用。

高分辨率蛋白质水平分析技术的缺乏代表了推进重要生物学研究的重大差距。

发明内容

本发明提供了鉴定肽的末端氨基酸的方法。在实施方式中，该方法包括使肽与ClickP化合物接触，其中，ClickP化合物与肽的末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物，将ClickP-肽复合物拴系(tether)至底物；从肽上切割复合物，从而提供与底物结合的ClickP-氨基酸复合物；以及检测ClickP-氨基酸复合物。

本发明还提供了鉴定样品中两种以上肽的末端氨基酸的方法。在实施方式中，该方法包括将两种以上肽独立地固定在底物的附着点(attachment point)；使肽与ClickP化合物接触，其中，ClickP化合物与末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物，将ClickP-肽复合物拴系至底物；从肽上切割ClickP-肽复合物，从而提供与底物结合的ClickP-氨基酸复合物；以及检测ClickP-氨基酸复合物。

本发明还提供了对肽的至少一部分进行测序的方法。在实施方式中，该方法包括使肽与ClickP化合物接触，其中，ClickP化合物与肽的末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物，将ClickP-肽复合物拴系至底物；从肽上切割ClickP-肽复合物，形成ClickP-氨基酸复合物；检测ClickP-氨基酸复合物；鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸；从底物上释放ClickP-氨基酸复合物；重复这些步骤。

本发明还提供了对样品中的两种以上肽的至少一部分进行测序的方法，所述两种以上肽被独立地固定在底物上的附着点。在实施方式中，该方法包括使两种以上肽与ClickP化合物接触，其中，ClickP化合物与末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物，将ClickP-肽复合物拴系至底物；从肽上切割ClickP-肽复合物，形成ClickP-氨基酸复合物；检测ClickP-氨基酸复合物；鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸；从底物上释放ClickP-氨基酸复合物；重复这些步骤。

本发明还提供了ClickP-氨基酸复合物。在实施方式中，ClickP-氨基酸复合物包含：与20种天然蛋白原氨基酸之一结合的ClickP化合物；与翻译后修饰的氨基酸结合的ClickP化合物；或与(a)或(b)的衍生物结合的ClickP化合物。

本发明还提供了ClickP-氨基酸复合物结合剂。在实施方式中，ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的结合剂；结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的结合剂；或结合(a)或(b)的衍生物的结合剂。

在实施方式中，ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的结合剂；结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的结合剂；或结合(a)或(b)的衍生物的结合剂。

附图说明

本发明的前述和其他目的、特征和优点将通过以下对本发明的优选实施方式的更具体描述而变得明显，如附图所示，不同视图中的相同附图标记表示相同部件。附图不一定按比例绘制，而是重点在于说明本发明的原理。

图1显示了式I的ClickP化合物的一个实例，其包含PITC作为伯胺反应性和切割基团(cleaving group)、炔作为拴系基团(tethering group)、叠氮化物-硫醇接头、硫醇官能化表面。

图2显示了使用ClickP进行单分子肽测序和N-末端氨基酸鉴定的工作流程。

图3A至图3C显示了与PITC相比的ClickP候选物缀合和切割N-末端伯胺的效率。图3A显示了N-末端缀合效率。图3B显示了N-末端缀合效率的时间进程。图3C显示了N-末端切割效率。

图4显示了ClickP化合物的拴系基团的活性。

图5A和图5B显示了与所有20种天然氨基酸结合的ClickP化合物的实例。

图6A和图6B显示了色氨酸靶向抗体的局部环境问题及其选择性靶向ClickP-色氨酸而非其他ClickP-氨基酸复合物的能力。

图7显示了N-末端氨基酸的ClickP缀合和切割的质谱结果。

具体实施方式

本说明书提供了可用于蛋白质测序的方法、测定和试剂。广义上的蛋白质测序涉及观察氨基酸的合理身份和顺序。

一方面，该方法可用于对单个多肽分子或单一多肽的多个分子进行测序。一方面，该方法可用于对多个多肽进行测序。

一方面，该方法和试剂可用于确定多肽的N-末端氨基酸。一方面，该方法可用于多个单一多肽分子的同时测序，例如用于大规模平行测序技术的基础。因此，包含不同蛋白质混合物的样品可根据本文所述的方法进行测定，产生关于样品中单个蛋白质分子的序列信息。另一方面，该方法可用于复杂样品中的蛋白质表达谱。例如，这些方法可用于生成样品中所含蛋白质的定量(频率)和定性(顺序)数据。

在一个实施方式中，本发明允许蛋白质的单分子鉴定和测序。本文所述的方法和试剂可用于蛋白质组的高分辨率研究，实现对疾病的早期检测至关重要的超灵敏诊断。

一方面，本发明提供了用于鉴定肽的末端氨基酸的化合物、组合物和方法。在一个实施方式中，本发明提供了用于N-末端氨基酸分离和鉴定的试剂，例如N-末端氨基酸分离试剂和N-末端氨基酸分离试剂-氨基酸复合物结合剂。在一个实施方式中，本发明提供了用于C-末端氨基酸分离和鉴定的试剂，例如C-末端氨基酸分离试剂和C-末端氨基酸分离试剂-氨基酸复合物结合剂。在一个实施方式中，鉴定了N-末端氨基酸。在一个实施方式中，鉴定了C-末端氨基酸。

在本文中，N-末端或C-末端氨基酸分离试剂也称为“ClickP”。在一个实施方式中，ClickP化合物具有式I的结构：

式中：

A为末端氨基酸反应性和切割基团；

B为可释放基团；

C为可拴系基团；以及

L1和L2为独立的间隔区(spacer)。

末端氨基酸反应基团与肽的末端氨基酸反应并结合。当用于N-末端氨基酸分离时，ClickP化合物的末端氨基酸反应基团包含伯胺反应基团，该伯胺反应基团与肽的N-末端的游离胺缀合，形成ClickP-肽复合物。

当用于C-末端氨基酸分离时，ClickP化合物的末端氨基酸反应性基团包含C-末端反应性基团，该C-末端反应性基团与肽的C-末端的修饰或未修饰的羧基缀合，形成ClickP-肽复合物。

在实施方式中，末端氨基酸反应性基团为伯胺反应性基团。在一个实施方式中，伯胺反应性基团包括但不限于：异硫氰酸酯、异硫氰酸苯酯(PITC)、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯。在一个实施方式中，试剂为异硫氰酸苯酯(PITC)。

在某些实施方式中，N-末端氨基酸或其衍生物和ClickP化合物可在允许N-末端氨基酸与ClickP的伯胺反应性基团缀合的条件下接触，形成复合物。

在一个实施方式中，末端氨基酸反应性基团为C-末端反应性基团。在一个实施方式中，C-末端反应性基团包括但不限于：异硫氰酸酯、四丁基异硫氰酸铵、二苯基磷酰基异硫氰酸酯、乙酰氯、溴化氰、异硫氰酸酯、硫氰酸钠、硫氰酸铵和羧肽酶。

在某些实施方式中，C-末端氨基酸或其衍生物和ClickP化合物可在允许修饰或未修饰的C-末端氨基酸与ClickP的C-末端反应性基团缀合的条件下接触，形成复合物。

在一些实施方式中，切割基团与末端氨基酸反应基团相同。在一个实施方式中，N-末端切割基团参与从肽中化学去除末端氨基酸。在一个实施方式中，N-末端切割基团参与从肽中化学去除末端氨基酸，形成ClickP-氨基酸复合物。在一个实施方式中，切割基团为PITC或异硫氰酸酯。在一个实施方式中，切割基团由工程化酶或野生型酶如肽酶或蛋白酶辅助。

在一个实施方式中，ClickP氨基酸复合物是与从肽切割后的氨基酸缀合的ClickP化合物。在一个实施方式中，ClickP氨基酸复合物可化学衍生为抗原性的。在一个实施方式中，ClickP-氨基酸复合物可以是但不限于以下衍生形式：噻唑酮、硫代乙内酰脲或硫代氨基甲酰。

在一些实施方式中，与胺反应和从肽切割末端氨基酸的功能可由伯胺反应基团进行。在一些实施方式中，具有这两种功能的伯胺反应性基团包括但不限于：异硫氰酸酯、异硫氰酸苯酯(PITC)。在一个实施方式中，伯胺反应性基团为异硫氰酸苯酯(PITC)。在一个实施方式中，伯胺反应性基团为异硫氰酸酯。

在一些实施方式中，与C-末端反应和切割氨基酸的功能可由相同的化学基团进行。在一个实施方式中，C-末端切割基团参与从肽中化学去除末端氨基酸，形成ClickP-氨基酸复合物。在一个实施方式中，切割基团为异硫氰酸酯、四丁基异硫氰酸铵或二苯基磷酰基异硫氰酸酯。

在一个实施方式中，拴系基团包括但不限于：异硫氰酸酯、四丁基异硫氰酸铵、二苯基磷酰基异硫氰酸酯、叠氮化物、炔烃、二苯并环辛炔(DBCO)、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、硫醇-硫醇二硫键、四嗪、TCO、乙烯基、甲基环丙烯、伯胺、羧酸、炔烃、丙烯酰基、烯丙基和醛。

在允许缀合的条件下，拴系基团可缀合至官能化底物(例如官能化玻璃表面)或整合到聚合物网络中，从而将ClickP-肽复合物固定在底物上。

在实施方式中，可释放基团参与部分或全部ClickP-氨基酸复合物的去除。在一些实施方式中，ClickP-氨基酸复合物可在某些底物释放条件下从底物释放，所述底物释放条件不是结合条件或氨基酸释放条件。在一些实施方式中，可释放基团可以是但不限于二硫化物、肽、寡核苷酸或碳水化合物。

术语“底物释放条件”指ClickP-氨基酸复合物将从底物释放的释放条件。底物释放条件可包括但不限于：酸性条件、碱性条件、存在亲核试剂、存在路易斯碱、存在非亲核碱、存在亲核碱、存在硫醇、氧化条件、还原条件、存在催化剂、存在工程化酶或野生型酶、暴露于可见光、暴露于紫外光，或它们的组合。释放条件可包括但不限于：水性溶剂(例如水)、有机溶剂(例如二恶烷、DMSO、THF、DMF、甲苯、乙腈)或它们的组合。在某些实施方式中，酸性条件可包括使用氢氟酸(HF)或盐酸(HCl)。在某些实施方式中，碱性条件可包括使用吡啶、氨、哌啶、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、哌嗪、吗啉、二环己胺、三乙胺或二乙胺。

作为解释而非限制本发明，ClickP化合物的“切割”基团用于从肽中去除末端氨基酸，而“可释放”基团提供了从底物上释放ClickP-氨基酸复合物的机制。从底物上去除ClickP-氨基酸复合物使得可以识别连续氨基酸。

在一些实施方式中，间隔区用于在ClickP化合物的官能团之间提供足够的空间分离以避免干扰反应动力学。在一些实施方式中，间隔区包括但不限于：聚合物和生物聚合物，例如聚乙二醇(PEG)链、氨基己酸(Ahx)、12-氨基-十二烷酸、O2Oc、O1Pen-O1Pen、Ttd、β-丙氨酸、烃链、氨基酸、肽、肽键和核酸。

在一个实施方式中，ClickP化合物可在拴系基团之前包含可释放基团。

在一个实施方式中，ClickP化合物可在拴系基团之后包含可释放基团。

在一个实施方式中，ClickP化合物可包含可逆的可释放基团，具有根据条件拴系和被切割的能力。

具有拴系基团的可释放基团的实例包括但不限于：

-间隔区-炔-叠氮化物-间隔区-硫醇-硫醇-底物；

-间隔区-硫醇-硫醇-间隔区-炔-叠氮化物-底物；以及

-间隔区-硫醇-硫醇-底物；

其中，下划线部分是拴系ClickP拴系基团的官能化底物。硫醇-硫醇基团为可释放基团，其在一定条件下从底物上释放部分或整个ClickP复合物。可释放基团可在拴系基团之前或之后。在硫醇的情况下，它可充当拴系基团和可释放基团两者。

ClickP化合物包含：反应基团，其缀合至肽的末端氨基酸；拴系基团，其将ClickP-肽复合物固定在物理底物上；切割基团，其允许从肽中去除ClickP化合物和结合的末端氨基酸，产生ClickP-氨基酸复合物；以及可释放基团，其允许复合物从物理底物释放。

在一个实施方式中，ClickP化合物与肽的末端氨基酸缀合，形成ClickP-肽复合物。然后，将ClickP-肽复合物局部拴系到物理底物上。ClickP-肽复合物随后从肽上切割，产生ClickP-氨基酸复合物。在检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸后，ClickP-氨基酸复合物可以可选地从底物上释放以允许随后的连续几轮测序。在一些实施方式中，拴系基团与可释放基团相同。

在一些实施方式中，ClickP-氨基酸复合物是抗原性的。在一些实施方式中，ClickP-氨基酸复合物的一部分是抗原性的。抗原部分将包括连接的氨基酸和来自式I的以下部分——仅A，A和B，A和C，或A、B和C。在实施方式中，抗原部分将包括连接的氨基酸和来自式I的A。在实施方式中，抗原部分将包括连接的氨基酸和来自式I的A和B。在实施方式中，抗原部分将包括连接的氨基酸和来自式I的A和C。在实施方式中，抗原部分将包括连接的氨基酸和来自式I的A、B和C。

在一个实施方式中，式II显示了ClickP的一部分，使得可释放官能团可稍后连接以提供各种可释放接头测试的灵活性。

式中，n为0至500的任意数。在一个实施方式中，n为0至250的任意数。在一个实施方式中，n为0至100的任意数。在一个实施方式中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在一个实施方式中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一个实施方式中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方式中，n为1、2、3、4或5在一个实施方式中，n为1。

在一个实施方式中，ClickP化合物可直接拴系到底物的官能化表面。例如，如果官能化表面是含叠氮化物的表面，则包含缀合至叠氮化物的基团(例如炔烃)的ClickP化合物可直接拴系至表面。炔-叠氮键的条件铜催化(Cu⁺)点击化学是生物正交的，具有高产率和高反应特异性，适用于在复杂生物环境中分离目标分子。

ClickP复合物或ClickP复合物-底物复合物中组分的接触和结合可发生在溶剂中，该溶剂包括但不限于：水性溶剂(例如水)或有机溶剂(例如二恶烷、DMSO、THF、DMF、甲苯、乙腈)。

图1显示了式I的ClickP化合物的一个实例，其包含PITC作为末端胺反应性和切割基团以及炔作为拴系基团、叠氮化物-硫醇接头和硫醇官能化表面。如图1所示，PITC可与肽的末端氨基酸结合，形成ClickP-肽复合物。炔基缀合至叠氮化物-硫醇接头的叠氮化物可拴系基团，后者与硫醇官能化表面形成二硫键。ClickP上的炔基允许添加任何模块化叠氮化物接头(例如但不限于叠氮化物-硫醇)，以与各种类型的官能化表面形成键。二硫键使ClickP可通过切割二硫键的还原剂(例如三(2-羧乙基)膦(TCEP))从表面释放。用于从表面去除ClickP结合氨基酸的可释放基团允许分离和鉴定肽上的下一个末端氨基酸。

在一个实施方式中，本发明提供了分离氨基酸的方法，该方法使用化合物将肽的末端氨基酸拴系在物理底物上并切割末端氨基酸，使其从肽中释放出来，然后鉴定。末端氨基酸与肽的分离允许氨基酸具有更高选择性和/或更高亲和力的结合，不受肽其余部分影响。

在一个实施方式中，鉴定肽的末端氨基酸包括使肽与ClickP化合物接触，其中，ClickP化合物与肽的末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物。肽复合物被拴系至底物。拴系后，ClickP-肽复合物从肽上切割形成ClickP-氨基酸复合物。ClickP-氨基酸复合物然后可用于检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸。

在一个实施方式中，本发明提供了分离和鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸或其衍生物的方法。用ClickP分离N-末端氨基酸将包括：将ClickP化合物与多肽或其衍生物的N-末端氨基酸缀合，形成ClickP肽复合物；有条件地将ClickP-肽复合物拴系至底物，从形成ClickP-氨基酸复合物的肽上切割ClickP-肽复合物；检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物。

在一个实施方式中，本发明提供了分离和鉴定肽的C-末端氨基酸或其衍生物的方法。用ClickP分离C-末端氨基酸将包括：将ClickP化合物与肽或其衍生物的C-末端氨基酸缀合，形成ClickP肽复合物；有条件地将ClickP-肽复合物拴系至底物，从肽上切割ClickP-肽复合物，形成ClickP-氨基酸复合物；检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物。

在一个实施方式中，提供了鉴定样品中多种肽的末端氨基酸的方法。

在一个实施方式中，该方法包括：将样品中的多种肽固定到官能化底物上的多个附着点；使肽与多个ClickP化合物接触，其中，ClickP化合物与末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合形成ClickP-肽复合物，将ClickP-肽复合物拴系至底物；从肽上切割ClickP-肽复合物，形成ClickP-氨基酸复合物；以及检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸。

在本文公开的方法的实施方式中，该方法可选地包括：在从多肽或蛋白质切割ClickP-肽复合物的步骤之前，洗去过量和/或未结合的ClickP化合物。

用ClickP对肽进行测序将包括：将ClickP化合物与肽的末端氨基酸或肽的末端氨基酸的衍生物缀合，形成ClickP-肽复合物；有条件地将ClickP-肽复合物拴系至底物，从肽上切割ClickP-肽，形成ClickP-氨基酸复合物；检测和鉴定ClickP-氨基酸复合物；从底物上释放固定的ClickP-氨基酸复合物，用于下一个循环。

在一个实施方式中，检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸包括：使ClickP-氨基酸复合物与ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，其中，ClickP-氨基酸复合物结合剂与ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组结合；检测与ClickP-氨基酸复合物结合的ClickP-氨基酸复合物结合剂。检测结合剂与ClickP-氨基酸复合物的结合使得可以鉴定肽的末端氨基酸。

在一个实施方式中，检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸包括：使ClickP-氨基酸复合物与多种ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，其中，每种ClickP-氨基酸复合物结合剂优先结合特定的ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组；检测与ClickP-氨基酸复合物结合的ClickP-氨基酸复合物结合剂。通过检测与ClickP-氨基酸复合物结合的ClickP-氨基酸复合物结合剂，使得可以鉴定肽的末端氨基酸或氨基酸的亚组。

已经确定ClickP和ClickP-氨基酸复合物结合剂可用于通过识别肽的末端氨基酸来生成序列信息。本发明人还确定，通过首先将肽分子固定到底物上，可通过反复检测底物上相同位置的ClickP-氨基酸复合物来确定固定肽的序列。

在一个实施方式中，检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸可包括通过光的波长的直接检测。在一个实施方式中，检测来自单个ClickP-氨基酸复合物的拉曼光谱来鉴定该复合物。在一个实施方式中，表面增强拉曼光谱用于检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物。在一个实施方式中，每种ClickP-氨基酸复合物的拉曼光谱是彼此可区分的。在一个实施方式中，每种ClickP-氨基酸复合物的拉曼光谱彼此部分可区分。在一些实施方式中，金或银可沉积到底物上作为拉曼光谱的表面增强形式。在一个实施方式中，拉曼光谱的表面增强是与ClickP-氨基酸复合物相互作用的纳米颗粒。在一个实施方式中，纳米颗粒与ClickP-氨基酸复合物的相互作用是但不限于共价、亲水或疏水相互作用。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用且指通过肽键连接在一起的两个以上氨基酸。术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”包括合成来源或天然存在的肽。如本文所用，“肽的至少一部分”指肽的2个以上氨基酸。可选地，肽的一部分包括肽的完整氨基酸序列的连续或者有间隔的至少5、10、20、30或50个氨基酸或肽的完整氨基酸序列。

短语“N-末端氨基酸”指肽中具有游离胺基且仅通过肽键与一个其他氨基酸连接的氨基酸。短语“N-末端氨基酸衍生物”指已被化学修饰的N-末端氨基酸残基(例如在体外或在细胞内通过埃德曼试剂或其他化学物质通过天然翻译后修饰(例如磷酸化)机制)或合成氨基酸。

短语“C-末端氨基酸”指肽中具有游离羧基且仅通过肽键与一个其他氨基酸连接的氨基酸。短语“C-末端氨基酸衍生物”指已被化学修饰的C-末端氨基酸残基(例如在体外或在细胞内通过化学试剂通过天然的翻译后修饰(例如磷酸化)机制)或合成氨基酸。

短语“ClickP-氨基酸复合物的亚组”指由相同ClickP-氨基酸复合物结合剂结合的一组氨基酸。在最广泛的意义上，结合剂中编码识别氨基酸或亚组。如果结合剂不对一种氨基酸具有特异性，它可以例如以某种统计规律结合2或3种氨基酸。此种类型的信息仍然与蛋白质鉴定相关，因为缩小氨基酸的可能性仍然与数据库搜索相关。氨基酸身份和结合变化基于极性、结构、官能团和电荷等特征，这些特征会影响结合剂的特异性。总体而言，基团基于结合剂的特异性及它们所代表的内容。结合剂可同等地或以不同程度的置信度结合两个或多个氨基酸，这仍提供了序列信息。

如本文所用，结合剂与ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组的结合指结合剂与ClickP-氨基酸复合物之间的任何共价或非共价相互作用。在一个实施方式中，结合是共价的。在一个实施方式中，结合是非共价的。

如本文所用，“对肽进行测序”指确定肽的氨基酸序列。该术语还指确定肽段的序列或确定肽的部分序列信息。当映射回可用数据库时，肽的部分测序仍然有效且足以区分蛋白质身份。例如，可通过对蛋白质的六(6)个连续末端氨基酸进行测序来独特地识别90％的人类蛋白质组。在ClickP-氨基酸复合物结合剂与ClickP-氨基酸复合物亚组结合的情况下，结合剂可能不提供末端氨基酸的确切身份，而是提供看似合理的亚组身份。当映射回可用数据库时，看似合理的序列身份信息仍然有效且足以区分蛋白质身份。

如本文所用，“固定”指肽和底物之间的连接，使得肽的至少一部分和底物保持物理接近。术语“固定的”或“拴系的”包括间接或直接连接并且可以是可逆或不可逆的，例如连接可选地为共价键或非共价键。

在一个实施方式中，底物是平坦的平面表面。在另一个实施方式中，底物是3维的且具有表面特征。在一个实施方式中，表面是官能化表面。在一些实施方式中，底物是化学衍生的载玻片或二氧化硅晶片。

如本文所用，“切割肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物”指如下的化学反应：从肽中去除N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物而其余部分的肽仍然固定在底物上。

如本文所用，“切割肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物”指如下的化学反应：从肽中去除C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物而其余部分的肽仍然固定在底物上。

如本文所用，术语“样品”包括含有一种以上多肽的任何材料。样品可以是生物样品，例如活组织检查、血液、血浆、器官、细胞器、细胞提取物、分泌物、尿液或粘液、组织提取物和天然或合成来源的流体的其他生物样品。术语样品还包括单个细胞。样品可源自已暴露于分析物(例如药物)或经受环境条件、遗传扰动或它们的组合的细胞、组织、生物体或个体。生物体或个体可包括但不限于：哺乳动物，例如人类或小动物(例如大鼠和小鼠)。

在一个实施方式中，官能化表面上的附着点是空间上可分辨的。如本文所用，术语“空间上可分辨”指两种以上多肽在底物上的排列，其中，在一个多肽上发生的化学或物理事件可与在第二个多肽上发生的那些化学或物理事件区分开来。例如，如果来自与多肽之一结合的可检测标记的信号可明确地分配给底物上特定位置的多肽之一，则固定在底物上的两个多肽是空间上可分辨的。

在一个实施方式中，将待测序的肽固定在底物上。在一些实施方式中，底物由诸如玻璃、石英、二氧化硅、塑料、金属、水凝胶、复合材料或它们的组合的材料制成。在一个实施方式中，底物是平坦的平面表面。在另一个实施方式中，底物是3维的。在一些实施方式中，底物是化学衍生的载玻片或二氧化硅晶片。

在一个实施方式中，底物由基本上不影响本文所述的测序试剂和测定的材料制成。在一个实施方式中，底物耐受用于埃德曼降解的碱性和酸性pH、化学品和缓冲剂。底物也可覆盖有涂层。在一些实施方式中，涂层耐受埃德曼降解中使用的化学反应和条件。在一些实施方式中，涂层提供用于将多肽固定到底物上和/或排斥非特异性探针吸附的附着点。在一些实施方式中，涂层提供用于拴系ClickP-肽复合物的附着点。

在一些实施方式中，底物表面耐受多肽或碎片的非特异性粘附，以便在检测探针时最小化背景信号。

在一个实施方式中，底物由光学透明的材料制成。如本文所用，“光学透明”指允许光穿过材料的材料。在一个实施方式中，底物是最低限度地自发荧光或非自发荧光的。

在一个实施方式中，肽被固定在底物上。在一个实施方式中，肽被固定到底物上，使得肽的N-末端或C-末端游离以允许ClickP化合物的结合。因此，在一些实施方式中，肽通过肽的N-末端或C-末端、肽的N-末端胺或C-末端羧酸基团固定在底物上。在一些实施方式中，底物包含一个以上允许肽固定在底物上的附着点。

在一个实施方式中，肽被固定在底物上，使得肽的C-末端游离以允许ClickP化合物的结合。因此，在一些实施方式中，肽通过肽的N-末端、N-末端胺基团或肽的侧链官能团固定在底物上。在一些实施方式中，底物包含一个以上允许多肽固定在底物上的附着点。

在一些实施方式中，肽通过共价键固定到表面。例如，底物的表面可包含聚乙二醇(PEG)或基于碳水化合物的涂层，肽通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯PEG接头固定到表面。

用于将接头和肽连接至底物的多种不同化学物质是本领域已知的，例如通过使用包括醛硅烷、环氧硅烷或其他受控反应性部分的专用涂层。在一个实施方式中，底物是涂有硅烷或相关试剂的玻璃，多肽通过暴露的赖氨酸残基通过希夫碱键固定在底物上。

在一些实施方式中，肽非共价地固定于底物。例如，在一个实施方式中，肽的C-末端与生物素缀合，底物包含抗生物素蛋白或相关分子。在另一个实施方式中，肽的C-末端与抗原缀合，该抗原结合至底物表面上的抗体。在另一个实施方式中，肽的N-末端与生物素缀合并且底物包含抗生物素蛋白或相关分子。在另一个实施方式中，肽的N-末端与抗原缀合，该抗原结合至底物表面上的抗体。

本领域中已经描述了适用于将多肽固定到底物的其他偶联剂(参见，例如AthenaL.Guo和X.Y.Zhu.，The Critical Role of Surface Chemistry In ProteinMicroarrays，Drug Discovery)。

在一个实施方式中，提供优先结合特定ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组的ClickP-氨基酸复合物结合剂。如本文所用，短语“优先结合特定ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组”指与其他特定或亚组ClickP-氨基酸复合物相比，对特定或亚组的ClickP-氨基酸复合物具有更高亲和力的结合剂。如果结合剂与特定或亚组的ClickP-氨基酸复合物的结合存在可检测的相对增加，则ClickP-氨基酸复合物结合剂优先结合目标ClickP-氨基酸复合物或ClickP氨基酸复合物的亚组。

在一个实施方式中，优先结合特定ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组的结合剂用于鉴定肽的N-末端氨基酸。在一个实施方式中，优先结合特定ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组的结合剂用于对肽进行测序。在一些实施方式中，结合剂可以以单分子灵敏度检测。

在一个实施方式中，优先结合特定ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组的结合剂用于鉴定肽的C-末端氨基酸。在一个实施方式中，优先结合特定ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组的结合剂用于对肽进行测序。在一些实施方式中，结合剂可以以单分子灵敏度检测。

在一个实施方式中，提供了选择性地结合ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸衍生物复合物的结合剂。如本文所用，短语“选择性地结合特定的ClickP-氨基酸复合物”指与其他ClickP-氨基酸复合物相比，对特定ClickP-氨基酸复合物具有更大亲和力的结合剂。如果结合剂与特定ClickP-氨基酸复合物的结合存在可检测的相对增加，则ClickP-氨基酸复合物结合剂选择性地结合目标ClickP-氨基酸复合物。

在一个实施方式中，选择性地结合ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸衍生物复合物的结合剂用于鉴定肽的N-末端氨基酸。在一个实施方式中，选择性地结合ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸衍生物复合物的结合剂用于对多肽进行测序。在一些实施方式中，结合剂可以以单分子灵敏度检测。

在一个实施方式中，选择性地结合ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸衍生物复合物的结合剂用于鉴定肽的C-末端氨基酸。在一个实施方式中，选择性地结合ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸衍生物复合物的结合剂用于对肽进行测序。在一些实施方式中，结合剂可以以单分子灵敏度检测。

靶向和识别特定ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组的ClickP-氨基酸结合剂可以是蛋白质或肽、核酸、化学品或它们的组合。结合剂还可包括含有非典型氨基酸和合成核苷酸的成分。在一个实施方式中，蛋白质结合剂可以是但不限于抗体或酶，例如肽酶、蛋白酶、氨酰tRNA合成酶、肽或转运蛋白如脂质运载蛋白。在一个实施方式中，抗体是多克隆抗体。在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方式中，核酸结合剂可以是但不限于适体DNA、RNA或合成核苷酸的混合物。适体是具有结合特性的DNA/RNA。在一个实施方式中，化学结合剂可以是但不限于氨基酸反应性化学物质，例如，马来酰亚胺和NHS酯、具有2个以上不同官能团的多官能化学物质，或非共价结合的超分子化学物质。

在一个实施方式中，多种结合剂可包括20种结合剂，其各自选择性地结合20种天然蛋白原氨基酸之一。在另一个实施方式中，结合剂包括20种结合剂，其各自选择性地结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的衍生物。在一个实施方式中，衍生物是苯基硫代氨基甲酰基衍生物。在另一个实施方式中，结合剂包括选择性地结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸或它们的衍生物的结合剂。在一个实施方式中，结合剂包括选择性地结合与ClickP复合的合成氨基酸或它们的衍生物的结合剂。

检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂可通过本领域技术人员已知的任何检测方法来完成。

在一个实施方式中，结合剂包括可检测标记。适用于本发明的可检测标记包括但不限于可作为单个分子检测的标记。

在一个实施方式中，通过将结合剂与结合剂特异性抗体接触来检测结合剂，然后检测结合剂特异性抗体。

在一些实施方式中，使用磁或电脉冲或信号来检测结合剂或标记物。

在一些实施方式中，结合剂上的标记是寡核苷酸。寡核苷酸标记可以通过本领域技术人员已知的任何方法来读出。

在一个实施方式中，通过电脉冲或信号通过生物或合成纳米孔来检测结合剂。

在一个实施方式中，标记是光学可检测的，例如包含荧光部分的标记。光学可检测标记的实例包括但不限于荧光染料，包括：包含芯染料(core dye)的聚苯乙烯壳(例如FluoSpheres^TM)、尼罗红、荧光素、罗丹明、衍生化罗丹明染料(例如TAMRA)、磷光剂、聚美沙定(polymethadine)染料、荧光亚磷酰胺、TEXAS RED、绿色荧光蛋白、吖啶、花青(cyanine)、花青5染料、花青3染料、5-(2'-氨基乙基)-氨基萘-1-磺酸(EDANS)、BODIPY、120ALEXA，或上述任一项的衍生物或修饰物。其他可检测标签包括颜色编码的纳米粒子、量子点或FluoSpheres^TM。在一个实施方式中，可检测标记耐受光漂白，同时以独特且易于检测的波长产生大量信号(例如光子)，具有高信噪比。

可使用本领域技术人员已知的技术，将一种以上可检测标记缀合至本文所述的结合剂试剂。在一个实施方式中，特定的可检测标记(或标记的组合)与相应的结合试剂缀合，从而允许通过检测标记来鉴定结合试剂。例如，一种以上可检测标记可直接或间接与本文所述的结合试剂缀合。

检测与固定在底物上的ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂，从而鉴定多肽或蛋白质的末端氨基酸。在一个实施方式中，通过检测与结合剂缀合的可检测标记(或标记组合)来鉴定结合剂。因此，适用于检测本文所述结合剂的方法取决于该方法中使用的可检测标记的性质。

在一个实施方式中，使用高分辨率光栅激光/扫描仪在底物上的预定网格、独特位置或路径上重复检测该位置的粘合剂或标签。这些方法对于在本文描述的方法的每个测序循环期间在相同坐标处的信号的准确和重复检测是有用的。在一些实施方式中，将多肽随机固定在基底上，通过重复扫描基底以鉴定与固定在基底上的多肽结合的探针的坐标和身份，从而进行探针的检测。

在一个实施方式中，检测结合剂包括超灵敏检测系统，其能够重复检测来自底物上精确相同坐标的信号，从而将检测到的序列信息分配给固定在该坐标上的独特多肽分子。

在一个实施方式中，使用光学检测系统检测结合剂。光学检测系统包括：电荷耦合器件(CCD)、近场扫描显微镜、远场共聚焦显微镜、宽场落射式照明、光散射、暗场显微镜、光转换、单光子和/或多光子激发、光谱波长鉴别、荧光团识别、倏逝波照明、全内反射荧光(TIRF)显微镜、超分辨率荧光显微镜和单分子定位显微镜。通常，方法包括使用配备有相机的显微镜检测激光激活的荧光，有时也称为高效光子检测系统。合适的光子检测系统包括但不限于：光电二极管和增强型CCD相机。

在一个实施方式中，适用于荧光探针单分子检测的技术实例包括：共聚焦激光(扫描)显微镜、宽场显微镜、近场显微镜、荧光寿命成像显微镜、荧光相关光谱、荧光强度分布分析，测量由荧光淬灭/去淬灭(dequench)或荧光能量转移引起的亮度变化。

在一个实施方式中，从肽上切割ClickP复合物。在一个实施方式中，切割使肽上相邻氨基酸的末端暴露，由此相邻氨基酸可用于与ClickP化合物反应。可选地，肽被顺序切割直至肽中的最后一个氨基酸。

在一些实施方式中，C-末端氨基酸共价固定在底物上并且不从底物上切割。在一个实施方式中，切割使肽上相邻氨基酸的N-末端暴露，由此相邻氨基酸可用于与ClickP化合物反应。可选地，肽被顺序切割直至肽中的最后一个氨基酸(C-末端氨基酸)。

在一些实施方式中，N-末端氨基酸共价固定在底物上并且不从底物上切割。在一个实施方式中，切割使肽上相邻氨基酸的C-末端暴露，由此相邻氨基酸可用于与ClickP化合物反应。可选地，肽被顺序切割直至肽中的最后一个氨基酸(N-末端氨基酸)。

在一个实施方式中，使用顺序末端降解来切割肽的N-末端氨基酸。在一个实施方式中，顺序末端降解用于切割肽的C-末端氨基酸。降解通常包括两个步骤：偶联步骤和切割步骤。这些步骤可反复重复，每次去除肽的暴露的末端氨基酸残基。

在一个实施方式中，末端降解通过使肽与合适的试剂(例如PITC或PITC类似物)在升高的pH下接触以形成N-末端苯基硫代氨基甲酰基衍生物的方式进行。降低pH，例如通过添加三氟乙酸导致N-末端氨基酸苯基硫代氨基甲酰基衍生物从多肽上切割，形成游离的苯胺基噻唑啉酮(ATZ，anilinothiozolinone)衍生物。可检测到此种ATZ衍生物。在一个实施方式中，ATZ衍生物可通过暴露于酸而转化为苯硫乙内酰脲(PTH)衍生物。可检测到此种PTH衍生物。在一个实施方式中，ATZ衍生物和PTH衍生物可通过暴露于还原剂而转化为苯基硫代氨基甲酰基(PTC)衍生物。可检测到此种PTC衍生物。在一个实施方式中，控制底物环境的pH以控制反应(控制偶联和切割步骤)。

在实施方式中，通过在用乙酸酐活化后使肽与合适的试剂(例如硫氰酸铵)接触以形成C-末端肽基硫代乙内酰脲衍生物，来进行末端降解。用路易斯酸降低pH值导致C-末端氨基酸肽基硫代乙内酰脲衍生物从多肽上切割，从而产生烷基化的硫代乙内酰脲(ATH)离去基团，形成游离的硫代乙内酰脲衍生物。可检测到此种ATH衍生物。在一个实施方式中，ATH衍生物可通过暴露于酸而转化为硫代乙内酰脲衍生物。可检测到此种硫代乙内酰脲衍生物。在一个实施方式中，控制底物环境的pH以控制反应(控制偶联和切割步骤)。

在一个实施方式中，使肽与ClickP化合物接触的步骤，其中，ClickP化合物与N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物，将ClickP-肽复合物拴系至底物；从肽上切割ClickP-肽复合物，产生ClickP-氨基酸复合物；检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸，从底物中释放ClickP-氨基酸复合物，重复上述步骤以对肽进行测序。可选地，这些步骤重复至少2、5、10、20、30、50或大于50次，以对部分或完整的肽进行测序。可选地，测定肽的氨基酸序列的至少2、5、10、20、30或50个连续或不连续的氨基酸残基或肽的完整氨基酸序列。

在一个实施方式中，使肽与ClickP化合物接触的步骤，其中，ClickP化合物与C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物，将ClickP-肽复合物拴系至底物；从肽上切割ClickP-肽复合物，产生ClickP-氨基酸复合物；检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸，从底物中释放ClickP-氨基酸复合物，重复上述步骤以对肽进行测序。可选地，这些步骤重复至少2、5、10、20、30、50或大于50次，以对部分或完整的肽进行测序。可选地，测定肽的氨基酸序列的至少2、5、10、20、30或50个连续或不连续的氨基酸残基或肽的完整氨基酸序列。

在一个实施方式中，该方法还包括在以下任一步骤之前或之后洗涤或冲洗底物：固定底物、使肽与ClickP化合物接触、将ClickP-肽复合物拴系至底物；从肽上切割ClickP-肽复合物；检测和/或鉴定ClickP-氨基酸复合物的氨基酸；从底物中释放ClickP-氨基酸复合物。清洗或漂洗底物可从底物中去除废弃产物(例如切割的N-末端氨基酸或C-末端氨基酸、碎片或先前未使用的试剂)，这些废弃产物可能会干扰测序分析的下一步骤。

本文所述的方法允许在单个底物或一系列底物上对非常大量的肽分子进行测序。因此，本发明的一个方面提供对最初存在于样品中的多个固定肽进行同时测序。在一个实施方式中，样品包含细胞提取物或组织提取物。在一些实施方式中，本文描述的方法可用于分析包含在单个细胞中的肽。在另一个实施方式中，样品可包括生物流体，例如血液、尿液或粘液。带有混合生物群落的土壤、水或其他环境样品也适用于分析。

在一个实施方式中，样品包含人工合成的合成肽的混合物。

在本说明书的一个实施方式中，该方法包括：将每个肽的序列与参考蛋白质序列数据库进行比较。在一些实施方式中，包含10至20个或更少测序氨基酸残基的小片段可用于检测样品中肽的身份。

在一个实施方式中，该方法包括肽的从头测序以产生关于肽的序列信息。在另一个实施方式中，该方法包括测定部分序列或氨基酸模式，然后将部分序列或氨基酸模式与包含在序列数据库中的参考序列或模式进行匹配。

在一个实施方式中，该方法包括使用由该方法产生的序列数据作为分子指纹或在其他生物信息学程序中来识别样品的特征，例如细胞类型、组织类型或生物体身份。

此外，由于固定在底物上的每个肽被可选地单独监测，因此该方法可用于蛋白质表达的定量分析。例如，在一些实施方式中，该方法包括：比较每个肽的序列、将相似肽序列分组和计算每种相似肽序列的实例数。因此，本文所述的方法可用于分子计数或定量样品中肽的数量或样品中特定种类的肽的数量。

在另一个实施方式中，使用本文所述的方法对交联的肽进行测序。例如，可将交联的蛋白质固定到底物上，然后将两个以上N-末端氨基酸结合并测序。检测到的重叠信号对应于每个结合该位置的两个以上末端氨基酸的结合剂。在一个实施方式中，可通过计算算法和DB搜索来推导出或解卷积两个多路(multiplexed)/混合序列。

在另一个实施方式中，本文所述的方法可用于磷酸肽的分析和测序。例如，包含磷酸肽的样品中的多肽通过金属螯合化学固定到底物上。然后根据本文所述的方法对磷酸多肽进行测序，从而提供关于磷酸蛋白质组的序列和定量信息。

其他多路单分子读出和荧光扩增方案可能涉及：将结合剂与DNA条形码缀合，使用杂交链反应(HCR)进行扩增。HCR涉及包含荧光团的DNA纳米结构的触发自组装，并提供多路、等温、无酶、高信号背景比(signal-to-background)的分子信号放大。HCR和分支DNA扩增可允许以单条码精度靶向大量荧光团。

实施例

实施例1：表征和验证ClickP功能

如图1所示，使用ClickP化合物确定缀合和切割N-末端氨基酸的能力。还测试了ClickP上的可点击炔基，以确保ClickP可与叠氮化物缀合物连接。

ClickP切割涉及将PITC基团与已知分子量的肽缀合，使用质谱法测量切割前后的分子量。由于失去一个氨基酸而预期的分子量降低将意味着成功切割。对不含ClickP的肽(仅肽)、具有与N-末端氨基酸缀合的ClickP的肽和ClickP去除N端氨基酸后的切割肽进行质谱分析。基于质谱结果，与PITC相比的两种候选ClickP化合物对N-末端氨基酸的缀合和切割的效率如图3所示。

图3A比较了PITC、ClickP1、ClickP2和仅肽的N-末端缀合效率。图3B表明ClickP1可在更长的反应时间段内实现PITC N-末端缀合效率。图3C比较了PITC、ClickP1、ClickP2和仅肽的N-末端切割效率。用LCMS收集数据以确定反应物的量和产物的量。基于这些结果，ClickP候选物能够与肽的N-末端缀合并切割N-末端氨基酸，其效率与PITC相当。

确定了炔基的官能度及其与叠氮化物底物缀合的能力。为了证明这一点，在没有肽(对照)或固定肽的情况下对官能化微珠进行包被。包被后，将微珠与ClickP一起孵育以促进与肽的N-末端氨基酸的缀合。接下来，ClickP的可点击基团与连接到荧光团四甲基罗丹明(TMR)的叠氮化物反应，然后进行洗涤步骤。由于反应性叠氮化物荧光团应仅与ClickP的炔基反应，因此当引入叠氮化物荧光团时，与含有微珠的肽缀合的ClickP的荧光强度应该更高。与对照相比，荧光的增加表明ClickP试剂上存在功能性叠氮化物-炔烃点击化学。结果如图4所示。

还将测试ClickP的拴系官能团，以确保它与用于固定ClickP的官能化表面形成键(无论它在高温和低pH的埃德曼条件下是否稳定，以及还原剂是否切割键)。例如，将测试模块化硫醇-叠氮化物接头，以确保它与用于有条件地固定ClickP的硫醇官能化表面形成二硫键。该验证将包括：使用接头在硫醇官能化微珠上形成二硫键，使用接头上的叠氮基团与炔烃-荧光团缀合物缀合。添加还原剂TCEP预计会切割二硫键并释放与荧光团缀合的接头，从而降低荧光强度。对照将测试埃德曼条件下的二硫键是否会切割和释放荧光团，以及当暴露于TCEP和埃德曼条件时荧光团本身是否稳定。荧光团将直接与微珠缀合，预计在高温、低pH值和暴露于还原剂TCEP时保持相同的荧光强度。

实施例2：氨基酸识别试剂(ClickP-氨基酸复合物的“结合剂”)

单分子肽或蛋白质序列固有地涉及阐明氨基酸组成和顺序。所有氨基酸均是含有氨基(-NH₂)和羧基(-COOH)官能团的有机小分子化合物，由它们各自的侧链(R基团)区分。识别所有20种氨基酸的能力需要一套能够高度特异性区分其分子结构的试剂或方法。

基于ClickP的氨基酸分离解决了“局部环境”问题，其被定义为由于相邻氨基酸的变化性而干扰结合剂与特定末端氨基酸结合的能力。图6A证明了靶向色氨酸的抗体在N-末端氨基酸处的结合效率受到相邻氨基酸的干扰。结合量通过生物层干涉法(BioLayerInterferometry)来定量。通过用ClickP消除局部环境问题，结合剂旨在靶向ClickP-氨基酸而不是末端氨基酸。图5显示了与所有20个氨基酸结合的可能ClickP化合物的一部分。在图6B中，色氨酸抗体可将ClickP-色氨酸与其他氨基酸区分开来。这表明结合剂能够靶向特定的ClickP氨基酸。

为了获得更具选择性的结合剂，部分ClickP-氨基酸复合物可用作小分子，用于开发具有高亲和力和特异性的抗体。

在一种方法中，可将ClickP-氨基酸复合物注射到兔子体内以引发针对这些化合物的免疫反应，从而产生结合ClickP-氨基酸复合物的抗体。

在下游，将测试通过兔子杂交瘤技术产生的单克隆抗体的亲和力、特异性和交叉反应性。将使用酶联免疫吸附测定(ELISA)29测定不同克隆分泌的抗体的交叉反应性，使用无标记方法生物层干涉法(BLI)30测定亲和力，以测量蛋白质-配体相互作用的动力学。

如果抗体对ClickP结合的氨基酸没有表现出强大的亲和力或特异性，可使用定向进化方法来提高抗体的亲和力和特异性。抗体结合剂可被设计为使用酵母展示(yeastdisplay)靶向每个用ClickP分离的氨基酸，酵母展示是一种蛋白质工程技术，它使用并入酵母细胞壁的重组蛋白的表达来筛选和进化高亲和力配体。酵母展示已被用于成功设计以高亲和力靶向小分子的抗体。从兔杂交瘤产生的克隆可用于在酵母中构建抗体库。该文库已经偏向于ClickP目标，因此通过诱变进行定向进化可引入具有改进特性的新型抗体变体。酵母展示还能够进行负选择，这有助于去除与其他目标发生交叉反应的抗体。负选择将包括：用与非目标抗原缀合的磁珠孵育表达抗体库的酵母，将它们从溶液中拉出。例如，当靶向与一种特定氨基酸结合的ClickP时，可对其他19个氨基酸进行负选择，以提高高度特异性结合剂的几率。

同时，如果杂交瘤技术不产生任何靶向ClickP结合氨基酸的抗体，则可探索其他结合剂(例如酶或核酸适体)。有20种氨酰-tRNA合成酶可识别它们各自的氨基酸。氨酰-tRNA合成酶或自然界中的任何其他氨基酸结合蛋白可用作酵母展示上的支架蛋白，进行定向进化以针对相应ClickP结合氨基酸的特异性和亲和力进行选择。DNA/RNA适体是单链寡核苷酸，能够以高特异性和亲和力结合各种分子。已确定RNA能够形成游离氨基酸的特异性结合位点，RNA适体已经发展到通过重复多轮随机RNA库的体外选择扩增技术来改变其结合特异性。

抗体结合剂可简单地具有偶联的荧光团或缀合至荧光团的二抗，这些荧光团与一抗缀合，从而放大荧光强度。

生成用于靶向ClickP结合氨基酸的结合剂后，将在肽、蛋白质和细胞裂解物上实施测序方案和成像平台。

实施例3：蛋白质组的成像和缩放

可通过整合N-末端氨基酸的ClickP分离物的所有成分，用ClickP氨基酸特异性结合剂进行标记、成像和释放ClickP以进行氨基酸鉴定的后续循环来鉴定氨基酸。氨基酸鉴定的足够循环将提供蛋白质测序信息。

首先，肽将通过羧基交联化学通过C-末端固定。接下来，ClickP与肽的N-末端氨基酸结合，并通过添加可移除基团拴系至官能化底物。在N-末端切割后，分离出的ClickP结合氨基酸用结合剂进行标记、成像和去除。

在下文，优先权申请的79项权利要求作为条款而列出。这些条款定义了本发明的实施方式。无论是在本申请中还是在从本申请分案的进一步申请中，申请人保留要求保护这些条款中列出的特征组合和/或在提交的优先权申请中包含的任何其他主题的权利。

1.鉴定肽的末端氨基酸的方法，其中，所述方法包括：

(a)使所述肽与ClickP化合物接触，所述ClickP化合物与所述肽的末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物；

(b)将所述ClickP-氨基酸复合物拴系至底物；

(c)从所述肽上切割所述ClickP-氨基酸复合物；

(d)使所述ClickP-氨基酸复合物与多种ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，所述ClickP-氨基酸复合物结合剂与ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组结合；以及

(e)检测与ClickP-氨基酸复合物结合的ClickP-氨基酸复合物结合剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：(f)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，重复步骤(a)至(f)。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)或(c)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述肽固定在所述底物上。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述肽通过所述肽的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述肽通过所述肽的N’-末端氨基或侧链官能团固定在所述底物上。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述肽共价固定在所述底物上。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述底物具有多个附着点。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述肽固定在附着点上。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

21.鉴定样品中多种肽的末端氨基酸的方法，其中，所述方法包括：

(a)将样品中的多种肽固定在底物上的多个附着点；

(b)使所述肽与多种ClickP化合物接触，所述ClickP化合物与末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物；

(c)将所述ClickP-氨基酸复合物拴系至所述底物；

(d)从所述肽上切割所述ClickP-氨基酸复合物；

(e)使所述ClickP-氨基酸复合物与多种ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，每种ClickP-氨基酸复合物结合剂结合特定的ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组；以及

(f)检测与ClickP-氨基酸复合物结合的ClickP-氨基酸复合物结合剂。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：(g)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，重复步骤(b)至(g)。

26.根据权利要求21所述的方法，其中，在步骤(c)或(d)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

27.根据权利要求21所述的方法，其中，所述多种肽通过多肽或蛋白质的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

28.根据权利要求21所述的方法，其中，所述多种肽通过所述肽的N’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

29.根据权利要求21所述的方法，其中，所述多种多肽或蛋白质共价固定在所述底物上。

30.根据权利要求21所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

31.根据权利要求21所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

33.根据权利要求21所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

34.根据权利要求21所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

37.根据权利要求21所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

38.根据权利要求21所述的方法，其中，所述样品包括生物流体、细胞提取物或组织提取物。

39.对肽的至少一部分进行测序的方法，其中，所述方法包括：

(a)使多肽或蛋白质与ClickP化合物接触，ClickP化合物与肽的末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物；

(b)将所述ClickP-氨基酸复合物拴系至底物；

(c)从所述肽上切割所述ClickP-氨基酸复合物；

(d)使所述ClickP-氨基酸复合物与多种ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，每种ClickP-氨基酸复合物结合剂结合特定的ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组；

(e)检测与ClickP-氨基酸复合物结合的ClickP-氨基酸复合物结合剂；

(f)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物；以及

(g)重复步骤(a)至(f)。

40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

41.根据权利要求39所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

42.根据权利要求39所述的方法，其中，在步骤(b)或(c)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

43.根据权利要求39所述的方法，其中，将所述肽固定在所述底物上。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述肽通过多肽或蛋白质的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

45.根据权利要求43所述的方法，其中，所述肽通过多肽或蛋白质的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

46.根据权利要求39所述的方法，其中，所述肽共价固定在所述底物上。

47.根据权利要求39所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

48.根据权利要求39所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

50.根据权利要求39所述的方法，其中，所述底物具有多个附着点。

51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述肽固定在附着点上。

52.根据权利要求39所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

53.根据权利要求39所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

54.根据权利要求52或53的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

55.根据权利要求54所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

56.根据权利要求39所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

57.根据权利要求39所述的方法，其中，所述方法还包括：将步骤(g)中确定的肽的序列与参考蛋白质序列数据库进行比较。

58.对样品中多种肽的至少一部分进行测序的方法，其中，所述方法包括：

(a)将样品中的多种肽固定在底物上的多个附着点；

(b)使所述肽与多种ClickP化合物接触，所述ClickP化合物与末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物；

(c)将所述ClickP-氨基酸复合物拴系至所述底物；

(d)从所述肽上切割所述ClickP-氨基酸复合物；

(e)使所述ClickP-氨基酸复合物与多种ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，每种ClickP-氨基酸复合物结合剂结合特定的ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物亚组；

(f)检测与ClickP-氨基酸复合物结合的ClickP-氨基酸复合物结合剂；

(g)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物；以及

(h)重复步骤(b)至(g)。

59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

60.根据权利要求58所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

61.根据权利要求58所述的方法，其中，在步骤(c)或(d)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

62.根据权利要求58所述的方法，其中，所述多种肽通过所述肽的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

63.根据权利要求58所述的方法，其中，所述多种肽通过多肽的N’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

64.根据权利要求58所述的方法，其中，所述多种肽共价固定在所述底物上。

65.根据权利要求58所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

66.根据权利要求58所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

68.根据权利要求58所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

69.根据权利要求58所述的方法，其中，所述多种ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

70.根据权利要求68或69所述的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

71.根据权利要求70所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

72.根据权利要求58所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

73.根据权利要求58所述的方法，其中，所述样品包括生物流体、细胞提取物、组织提取物或人工合成肽的混合物。

74.根据权利要求58所述的方法，其中，所述方法还包括：将步骤(h)中确定的至少一种肽的序列与参考蛋白质序列数据库进行比较。

75.根据权利要求58所述的方法，其中，所述方法还包括：将步骤(h)中确定的每个肽的序列进行比较，将相似肽序列进行分组，以及计算每种相似肽序列的实例数。

76.ClickP-氨基酸复合物，其包括：

(a)与20种天然蛋白原氨基酸之一结合的ClickP化合物；

(b)与翻译后修饰的氨基酸结合的ClickP化合物；或者

(c)与(a)或(b)的衍生物结合的ClickP化合物。

77.ClickP-氨基酸复合物结合剂，其包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的结合剂；或者

(c)结合(a)或(b)的衍生物的结合剂。

78.ClickP-氨基酸复合物结合剂，其包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的结合剂；或者

(c)结合(a)或(b)的衍生物的结合剂。

79.根据权利要求77或78所述的结合剂，其中，所述结合剂还包含可检测标记。

尽管已参考优选实施方式对本发明进行了具体显示和描述，但本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明范围的情况下，可在形式和细节上进行各种改变。

Claims (89)

1.鉴定肽的末端氨基酸的方法，其中，所述方法包括：

(a)使所述肽与ClickP化合物接触，所述ClickP化合物与所述肽的末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物；

(b)将所述ClickP-肽复合物拴系至底物；

(c)从所述肽上切割所述复合物，从而提供ClickP-氨基酸复合物；以及

(d)检测所述ClickP-氨基酸复合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括使所述ClickP-氨基酸复合物与一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，所述ClickP-氨基酸复合物结合剂与ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组结合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括通过光的波长的直接检测。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：鉴定所述ClickP-氨基酸复合物的氨基酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：

(e)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，重复步骤(a)至(e)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)或(c)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述肽固定在所述底物上。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述肽通过所述肽的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述肽通过多肽的N’-末端氨基或侧链官能团固定在所述底物上。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述肽共价固定在所述底物上。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物具有多个附着点。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述肽固定在附着点上。

19.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

20.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

24.鉴定样品中两种以上肽的末端氨基酸的方法，其中，所述方法包括：

(a)将两种以上肽独立地固定在底物上的附着点；

(b)使所述肽与ClickP化合物接触，所述ClickP化合物与末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物；

(c)将所述ClickP-肽复合物拴系至底物；

(d)从所述肽上切割所述ClickP-肽复合物，从而提供ClickP-氨基酸复合物；以及

(e)检测所述ClickP-氨基酸复合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括使所述ClickP-氨基酸复合物与一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，所述ClickP-氨基酸复合物结合剂与ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组结合。

26.根据权利要求24所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括通过光的波长的直接检测。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：鉴定所述ClickP-氨基酸复合物的氨基酸。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

29.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：

(f)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中，重复步骤(b)至(f)。

32.根据权利要求24至31中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)或(d)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

33.根据权利要求24所述的方法，其中，所述一种以上肽通过多肽或蛋白质的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

34.根据权利要求24所述的方法，其中，所述一种以上肽通过所述肽的N’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

35.根据权利要求24至34中任一项所述的方法，其中，所述一种以上肽共价固定在所述底物上。

36.根据权利要求24至35中任一项所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

37.根据权利要求24至36中任一项所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

39.根据权利要求25所述的方法，其中，所述一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

40.根据权利要求25所述的方法，其中，所述一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

43.根据权利要求24所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

44.根据权利要求24至43中任一项所述的方法，其中，所述样品包括生物流体、细胞提取物或组织提取物。

45.对肽的至少一部分进行测序的方法，其中，所述方法包括：

(a)使所述肽与ClickP化合物接触，所述ClickP化合物与所述肽的末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物；

(b)将所述ClickP-肽复合物拴系至底物；

(c)从所述肽上切割所述ClickP-肽复合物，形成ClickP-氨基酸复合物；

(d)检测所述ClickP-氨基酸复合物；

(e)鉴定所述ClickP-氨基酸复合物的氨基酸；

(f)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物；以及

(g)重复步骤(a)至(f)。

46.根据权利要求45所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括使所述ClickP-氨基酸复合物与一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，所述ClickP-氨基酸复合物结合剂与ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组结合。

47.根据权利要求45所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括通过光的波长的直接检测。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

49.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)或(c)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

51.根据权利要求45至50中任一项所述的方法，其中，所述肽固定在所述底物上。

52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述肽通过所述肽的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

53.根据权利要求51所述的方法，其中，所述肽通过所述肽的N’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

54.根据权利要求45至53中任一项所述的方法，其中，所述肽共价固定在所述底物上。

55.根据权利要求45至54中任一项所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

56.根据权利要求45至55中任一项所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

58.根据权利要求45至57中任一项所述的方法，其中，所述底物具有一个以上附着点。

59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述肽固定在所述附着点上。

60.根据权利要求46所述的方法，其中，所述一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

61.根据权利要求46所述的方法，其中，所述一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

62.根据权利要求60或61所述的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

63.根据权利要求62所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

64.根据权利要求45所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

65.根据权利要求45所述的方法，其中，所述方法还包括：将步骤(g)中确定的肽的序列与参考蛋白质序列数据库进行比较。

66.对样品中两种以上肽的至少一部分进行测序的方法，其中，所述方法包括：

(a)将所述两种以上肽独立地固定在底物上的附着点；

(b)使所述两种以上肽与ClickP化合物接触，所述ClickP化合物与末端氨基酸或末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-肽复合物；

(c)将所述ClickP-肽复合物拴系至底物；

(d)从所述肽上切割所述ClickP-肽复合物，形成ClickP-氨基酸复合物；

(e)检测所述ClickP-氨基酸复合物；

(f)鉴定所述ClickP-氨基酸复合物的氨基酸；

(g)从所述底物上释放所述ClickP-氨基酸复合物；以及

(h)重复步骤(b)至(g)。

67.根据权利要求66所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括使所述ClickP-氨基酸复合物与一种以上ClickP-氨基酸复合物结合剂接触，所述ClickP-氨基酸复合物结合剂与ClickP-氨基酸复合物或ClickP-氨基酸复合物的亚组结合。

68.根据权利要求66所述的方法，其中，检测所述ClickP-氨基酸复合物包括通过光的波长的直接检测。

69.根据权利要求66至68中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的N-末端氨基酸或N-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

70.根据权利要求66至68中任一项所述的方法，其中，所述ClickP化合物与所述肽的C-末端氨基酸或C-末端氨基酸衍生物结合，形成ClickP-氨基酸复合物。

71.根据权利要求66至70中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)或(d)之前，洗掉过量和/或未结合的ClickP化合物。

72.根据权利要求66所述的方法，其中，所述多种肽通过所述肽的C’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

73.根据权利要求66所述的方法，其中，所述多种肽通过多肽的N’-末端羧基或侧链官能团固定在所述底物上。

74.根据权利要求66至73中任一项所述的方法，其中，所述两种以上肽共价固定在所述底物上。

75.根据权利要求66至74中任一项所述的方法，其中，所述底物是光学透明的。

76.根据权利要求66至74中任一项所述的方法，其中，所述底物包括官能化表面。

77.根据权利要求76所述的方法，其中，所述官能化表面选自：叠氮化物官能化表面、硫醇官能化表面、炔烃表面、DBCO表面、马来酰亚胺表面、琥珀酰亚胺表面、四嗪表面、TCO表面、乙烯基表面、甲基环丙烯表面、伯胺表面、羧基表面、DBCO表面、炔烃表面和醛表面。

78.根据权利要求67所述的方法，其中，所述ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

79.根据权利要求67所述的方法，其中，所述ClickP-氨基酸复合物结合剂包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的一种以上结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的一种以上结合剂；

(c)结合(a)或(b)的衍生物的一种以上结合剂；或者

(d)(a)、(b)或(c)的结合剂的组合。

80.根据权利要求78或79所述的方法，其中，至少一种结合剂包含可检测标记。

81.根据权利要求80所述的方法，其中，检测与ClickP-氨基酸复合物结合的结合剂的步骤包括检测所述可检测标记。

82.根据权利要求66所述的方法，其中，所述ClickP化合物还包含可检测标记。

83.根据权利要求66至82中任一项所述的方法，其中，所述样品包括生物流体、细胞提取物、组织提取物或人工合成肽的混合物。

84.根据权利要求66至83中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：将步骤(h)中确定的至少一种肽的序列与参考蛋白质序列数据库进行比较。

85.根据权利要求66至83中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：将步骤(h)中确定的每个肽的序列进行比较，将相似肽序列进行分组，以及计算每种相似肽序列的实例数。

86.ClickP-氨基酸复合物，其包括：

(a)与20种天然蛋白原氨基酸之一结合的ClickP化合物；

(b)与翻译后修饰的氨基酸结合的ClickP化合物；或者

(c)与(a)或(b)的衍生物结合的ClickP化合物。

87.ClickP-氨基酸复合物结合剂，其包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸亚组的结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸亚组的结合剂；或者

(c)结合(a)或(b)的衍生物的结合剂。

88.ClickP-氨基酸复合物结合剂，其包括：

(a)结合与ClickP复合的20种天然蛋白原氨基酸之一的结合剂；

(b)结合与ClickP复合的翻译后修饰的氨基酸的结合剂；或者

(c)结合(a)或(b)的衍生物的结合剂。

89.根据权利要求87或88所述的结合剂，其中，所述结合剂还包含可检测标记。

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