CN113474082A - 配体连接体基材 - Google Patents

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CN113474082A CN201980090277.9A CN201980090277A CN113474082A CN 113474082 A CN113474082 A CN 113474082A CN 201980090277 A CN201980090277 A CN 201980090277A CN 113474082 A CN113474082 A CN 113474082A
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Abstract

包含已经被改性成提供经由连接体共价结合的接枝的捕集用配体基团的固体基材的配体官能化基材，制备所述配体官能化基材的方法及其用于例如提升结合速率以及动态结合容量(DBC)的用途。

Description

配体连接体基材
技术领域
本发明涉及感兴趣的受体对官能化基材的受体-配体动力学、增加的结合速率以及增加的动态结合容量。
官能化基材，制备所述配体-连接体官能化基材的方法及其连接体长度优化。更具体地，所述配体连接体官能化基材包含固体基材，该固体基材已经被改性成提供经由一定连接体长度共价结合、用于增加感兴趣的受体化合物对基材的结合速率和动态结合容量的结合用配体基团。
背景技术
目标(靶，target)分子例如生物大分子的分离和纯化对于治疗目的和在生物医学研究中是重要的。一般工业纯化工艺(过程)通常包括众多单元操作例如萃取、过滤、沉淀、以及阴离子和阳离子交换色谱法、和亲和纯化。
大多数目前的捕捉或亲和纯化色谱法通过常规的基于树脂的柱技术进行。多孔的珠粒状色谱树脂具有高的表面积对质量比，带有相互作用性的亲和配体基团，并且因此已被用于蛋白质亲和纯化工艺中。由于结合速率依赖于扩散传质，这些技术耗时并在下游纯化中提供严重的瓶颈问题。这也限制了色谱技术在高通量筛选中和对于快速下游加工的适用性。
基于过滤器、膜、纳米纤维和纳米颗粒的技术，尤其是以一次性用品的形式，在生物制药与疫苗生产工艺中正变得愈发重要。膜已被用于被动的基于分子尺寸的分离中以及主动过滤中。
具有提升的工艺流程性质的官能化膜(包括带有官能化聚合物的膜)由于低的表面积对质量比而典型地存在相对低的生物材料结合容量的问题，这通常限制了其在某些大规模纯化工艺中的使用。
然而，由于可能的高的工艺物流速度与高效的对流传质，膜与过滤器具有高的生产潜能(产物质量/体积/时间)。如今，膜与过滤器被主要用于精加工工艺中以将杂质去除而达到在产物物流中非常低的水平。这些材料、膜、过滤器与多孔珠粒树脂可以被进一步改进。此外，基于珠粒树脂的材料可以通过优化配体与受体之间的动态结合动力学而更加经济适用。所得膜、过滤器或珠粒工艺将甚至更快和更高效，并使得可让下游纯化单元操作具有更小的占地面积、更高容量和让提供更少的废水和工艺缓冲流体消耗。
标准配体官能化基材例如配体官能化膜被广泛用于多种目标分子的分离与亲和纯化。例如，配体官能化膜可被用于基于亲和性相互作用或基于共价键的形成而纯化或分离目标分子。
US 5,451,453公开了具有吖内酯官能表面的基材，加合物基材，以及制备两者的方法。
US 9,616,394 B2公开了胍基配体官能化聚合物，其制造方法，以及带有所述配体官能聚合物的接枝涂层的基材。
US 9,650,470 B2公开了配体官能化基材，制造配体官能化基材的方法，及使用官能化基材的方法。
US 9,958,364 B2公开了具有提升的结合容量的配体官能化基材。
US 9,758,547 B2公开了配体官能化基材，制造配体官能化基材的方法，及使用官能化基材的方法。
EP 2220107 B1公开了一种纯化目标生物分子的工艺，该工艺包含如下步骤：(a)让(i)目标生物分子、(ii)双亲和性多肽(DAP)、和(iii)包含捕集用配体的固体基材接触，以及(b)通过洗脱而收取目标生物分子，其中使目标生物分子与双亲和性多肽在溶液中接触，之后使混合物与固体基材接触。
WO 2010/128033 A2公开了一种纯化目标分子的工艺，该工艺包含如下步骤：(a)让目标分子、和一群靶向(目标，target)结合多肽(TBP)在溶液中接触足以容许形成络合物的时间；以及(b)通过后续的纯化步骤将目标(物)从来自(a)的络合物分离，其中(i)靶向结合多肽具有至少两种结合官能性；第一种结合官能性针对目标分子，第二种结合官能性针对包含在固体基材中的捕集用配体；并且(ii)第一种结合官能性包含至少2个针对目标物的结合位点，并且目标物包含至少2个针对TBP的结合位点。
EP 2220107 B1中所描述的双亲和性多肽(DAP)具有与WO 2010/128033 A2中所描述的靶向结合多肽(TBP)相同的官能性，并且这两个术语DAP与TBP在本文中可互换地用于描述相同化合物。
尽管存在众多配体官能化基材，但是本领域中需要如下的更优的配体-连接体官能化基材：其能够以高的结合速率和以高的动态结合容量操作以提供高的产物通量-和由此高的生产率以降低生产设备投资、操作成本以及环境足迹。
发明目的
本发明的实施方式的目的是提供如下的配体-连接体官能化基材：其允许对受体(感兴趣的化合物)的快速结合速率而不损害高的动态结合容量。
发明内容
本发明人已经发现，通过提供如下的配体官能化基材，可得到配体与感兴趣的受体之间的显著增加的动态结合容量以及结合速率：其中配体通过特定长度的、优选地无法弯折的结构的连接体与基材结合。
因此，在第一方面中，本发明涉及配体官能化基材，其包含：
a.基材，该基材在其表面处具有羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基基团(-NH2)、C-C双键(-烯)或C-C三键(-炔)；
b.连接体，该连接体与所述基材的所述羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基基团(-NH2)、C-C双键(-烯)或C-C三键(-炔)共价结合，该连接体例如半柔性连接体，该连接体具有10-25、例如17-22个键的连接体长度，其中键为C-C、C-N、C-N(H)、C-C(O)和/或C-O；以及
c.配体官能团，其通过所述连接体与基材的表面结合。
在本发明的一些具体实施方式中，连接体包含独立地选自C-C、C-N和C-C(O)键的一个(种)或多个(种)的组合，例如当在连接体的合成中使用不同氨基酸，例如甲基丙氨酸或β-丙氨酸时。因此，在一些实施方式中，连接体包含由如下定义的基团的1、2或3个：
Figure BDA0003179554230000031
在其它实施方式中，连接体包含在例如聚乙二醇(PEG)中找到的键的组合：C-O-C-C-O-C-C-O。
Figure BDA0003179554230000032
在其它实施方式中，连接体包含在聚酰胺、聚氨酯、或聚神经酰胺(polycaramide)中找到的键的组合：
Figure BDA0003179554230000041
在还有的其它实施方式中，连接体包含C-C-C-C键与水溶性侧链的组合，例如在如聚二甲基酰氨基丙烯酰胺中找到的一系列键。
在第二方面中，本发明涉及用于制备根据前述权利要求任一项的配体官能化基材的方法，其包含(a)将基材以化学方式或通过引入自由基而活化，以及(b)将配体直接经由连接体或者通过使用两种或更多种丙烯酸类单体的自由基共聚而与基材偶联，所述丙烯酸类单体的至少一种包含配体。
在第三方面中，本发明涉及根据本发明的配体官能化基材用于捕捉或固定感兴趣的受体的用途。
附图说明
图1说明了如下的“较短”、“中等”和“长”连接体生物素亲和配体的结构与命名法：具有末端氨基-NH2者(系列A)，即生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C24-NH2；以及具有末端-烯者(系列B)，即生物素-C10-烯、生物素-C17-烯、生物素-C24-烯。
图2说明了连接体的不同长度的确定。
图3说明了生物素-连接体的组成(乙二胺EDA、α-甲基丙氨酸和β-丙氨酸)
图4说明了生物素-C10-烯的合成
图5说明了生物素-C10-NH2的合成
图6说明了生物素-C10-NH2的替代合成路径
图7说明了生物素-C17-烯的合成。
图8说明了生物素-C17-NH2的合成
图9说明了生物素-C24-烯的合成
图10说明了生物素-C24-NH2的合成
图11.使用Hanes图-朗缪尔(Langmuir)等温线的线性化形式-对于生物素-C17官能化固体基材的动态结合容量的测量结果。趋势线的方程为y＝13.08x+3.2307。趋势线的斜率等于最大结合容量并且为在0.25mL固体基材中13.08mg DAP/TBP。这对应52.3mg/mL的DBC。
具体实施方式
定义
在本上下文中，连接体的长度通过键的数量定义，其中键为C-C、C-N、C-N(H)、C-C(O)和/或C-O键。图2进一步说明了连接体键的数量是如何确定的。注意，生物素天然地包含一个亲脂性的连接体。根据本发明所使用的连接体包含酰胺以及部分地空间受阻的基团，其防止连接体成为完全柔性的。
应理解，本发明含义内的连接体指的是连接本发明的基材和配体官能团的具有至少6个N、C、S或O原子的链。典型地，连接体是至少6个N、O或C原子的线性序列，其中连接体的长度由原子的线性序列中的键的总量定义(见图2)。键可包括C-C、C-N、C-N(H)、C-C(O)和/或C-O。
应理解，连接体的实际长度取决于各个化学键的真实长度、周围的官能性、角度、旋转柔性以及在溶剂中的构象。例如，平均的C-C、C-O和C(O)-N(H)键分别为约1.5、1.4和
Figure BDA0003179554230000051
C-O键可以部分地旋转，而酰胺键不那样自由旋转。
根据本发明，连接体长度定义为连接体中化学键的数量。其是从配体官能团例如生物素到基材。注意，末端的与基材的键也被计入。因此，在对具有末端的-烯的如本文中所示的连接体的长度进行计数时，从末端碳原子到基材的键也应当被计入。若如本文所示的连接体具有末端氨基基团(-NH2)，与该氨基基团的键将被计为最后一个键。人们应当意识到，生物素在环结构(脲基和四氢噻吩基团)和羧基之间天然地具有C5连接体。
亲和素(亲合素、抗生物素蛋白，avidin)/链霉亲和素(streptavidin)分子中的生物素结合区域被包埋在蛋白质表面以下
Figure BDA0003179554230000052
处。因此在生物素结合囊附近大体积基团的存在可能产生空间位阻并降低结合效率。
应理解，根据本发明的连接体的官能性以及长度与DAP/TBP分子对表面的动态结合容量以及结合速率关联。
如本文所使用的，与“靶向结合多肽”或“TBP”可互换使用的“双亲和性多肽”或“DAP”指这样的重组蛋白质：其包含至少一个能够与目标生物分子以如本文所描述的期望的结合特异性结合的结合区域，以及至少一个能够与根据本发明的配体官能化基材结合的结合区域。合适的DAP分子描述于WO2009062942中并且合适的TBP分子描述于WO 2010/128033 A2中，在一种优选实施方式中包括在融合蛋白质中融合至四个蛋白质A结合区域的链霉亲和素单体。
发明的具体实施方式
本发明在宽的方面中涉及配体官能化基材，其包含：(a)基材，该基材在其表面处具有羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基基团(-NH2)、C-C双键(-烯)或C-C三键(-炔)；(b)连接体，该连接体与所述基材的所述羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基基团(-NH2)、C-C双键(-烯)或C-C三键(-炔)共价结合，该连接体具有10-25、例如17-22个键的连接体长度，其中键为C-C、C-N、C-N(H)、C-C(O)和/或C-O；以及(c)配体官能团，其经由所述连接体与基材的表面结合。
在一些实施方式中，连接体具有10-25个键的长度，例如10-24个键的长度，例如10-23个键的长度，例如10-22个键的长度，例如10-21个键的长度，例如10-20个键的长度，例如10-19个键的长度，例如10-18个键的长度，例如10-17个键的长度，例如10-16个键的长度，例如10-15个键的长度，例如10-14个键的长度，例如10-13个键的长度，例如10-12个键的长度，例如10-11个键的长度，例如11-25个键的长度，例如12-25个键的长度，例如13-25个键的长度，例如14-25个键的长度，例如15-25个键的长度，例如16-25个键的长度，例如17-25个键的长度，例如18-25个键的长度，例如19-25个键的长度，例如20-25个键的长度，例如21-25个键的长度，例如22-25个键的长度，例如23-25个键的长度，例如24-25个键的长度。
在一些实施方式中连接体具有17-21个键的长度，例如17-20个键的长度，例如17-19个键的长度，例如17-18个键的长度，例如18-22个键的长度，例如19-22个键的长度，例如20-22个键的长度，例如21-22个键的长度，例如17、18、19、20、21或22个键的长度。
在根据本发明的配体官能化基材的一种实施方式中，基材是固体基材，其例如为片材、膜、珠粒、鞍形物或颗粒料的形式。具有光滑表面与由多孔性所致的大的内表面两者。
在根据本发明的配体官能化基材的一种实施方式中，基材是可通过自由基引发的乙烯基聚合而被接枝的固体基材。
在根据本发明的配体官能化基材的一种实施方式中，基材选自琼脂糖、硅藻土、硅胶、纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素、退化纤维素、基于琼脂糖或纸的膜、硝化纤维素、硝化纤维素混合酯、二氧化硅、以及可控孔度玻璃、聚酰胺、聚砜醚、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚醚砜、聚砜、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚偏氟乙烯、聚苯乙烯或聚丙烯、聚乙烯及共聚嵌段聚合物(co-block polymer)、它们的共混物及组合。在一种实施方式中，基材为如下形式：颗粒、薄膜、织造或非织造幅材、海绵、纤维、片材、珠粒、过滤器、或膜。根据本发明所使用的基材通常是多孔的以得到增加的表面积以及最佳的液体流动性质并且可以是有机的与无机的两者，包括聚合物型的。
在根据本发明的配体官能化基材的一种实施方式中，连接体选自2-乙烯基-4,4-二甲基-5-
Figure BDA0003179554230000071
唑酮(VDMA)、乙烯基吖内酯衍生物、丙烯酸类衍生物、己烷二异氰酸酯(HDI)衍生物、二异氰酸酯衍生物、或其混合物。
通过将被保护的氨基酸或其它多官能构建模块逐步偶联在一起而逐步延长肽的合成方法从例如经典的Merrifield固相多肽合成或溶液中得到了很好的描述。各种化学选择性的和正交保护基团尤其包括Boc、Fmoc、苄基或叔丁基。酰胺的形成是使用例如碳二亚胺、高效活性酯、HATU/HOAt或相似反应进行的。SPPS试剂与方法的概述可以参见例如Merrifield,R.B.，Peptides:“Synthesis,Structures and Applications”；(Gutte,B.,Ed.)；Academic Press:San Diego,CA,1995；第93–168页，或Fernando Albericio(ed.):“Solid-Phase Synthesis:A Practical Guide”,CRC Press(2000)，以及更一般地，对于共轭与交联，参见Shan S.Wong，“Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking”,CRC Press,(1991)。
此外，使用2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯(VDMA)及衍生物来延长和接枝连接体是众所周知的。例如描述于如下中：Jamie M.Messman等，Macromolecules 2009,42,3933–3941；US2016231208；以及本文引用的其它参考文献。
在根据本发明的配体官能化基材的一种实施方式中，配体官能团选自生物素、或生物素类似物。生物素类似物是本领域技术人员所知晓的，且指能够与亲和素、中性亲和素(中性抗生物素蛋白，neutravidin)或链霉亲和素结合的生物素衍生物，例如任意由与四氢噻吩环稠合的脲基环组成的化合物，例如亚氨基生物素或脱硫生物素。
本发明人已经惊奇地发现，连接体的长度与性质对于其因而发生的如下用途的动态结合容量(DBC)和结合速率两者具有显著影响：结合受体分子像例如双亲和性多肽(DAP)或靶向结合蛋白(TBP)以及将它从溶液高效去除(其是对于目标生物分子的纯化的要求)。连接体应当优选为在水中于pH 4时半柔性的，以容许舒展的构型并且因此更高的结合效率。在基材与配体官能团例如生物素之间的连接体应当在水中伸展，但不应当是完全柔性的或自由旋转、或在所有方向上弯折。
进一步地，发明人已经发现，对于延伸到作为生物素结合囊的配体官能团中而言最优长度要求对最优动态结合容量的指导。现有技术中描述的各种连接体优化典型地基于稳态平衡、静态结合条件，或来自使用小分子的实验或来自阴离子和阳离子交换色谱法。
在根据本发明的用途的一种实施方式中，所述用途为用于纯化目标生物分子，其包含如下步骤：
a)让(i)目标生物分子、(ii)双亲和性多肽(DAP)、和(iii)根据本发明的配体官能化基材接触，以及(b)通过洗脱收取目标生物分子，其中使目标生物分子与双亲和性多肽在溶液中接触，之后混合物接触配体官能化基材。
在根据本发明的用途的一种实施方式中，所述用途为用于纯化目标生物分子，其包含如下步骤：
a)让目标分子、和一群靶向结合多肽(TBP)或双亲和性多肽(DAP)在溶液中接触足以容许形成络合物的时间；以及(b)通过后续的纯化步骤将目标物从来自(a)的络合物分离，其中(i)靶向结合多肽具有至少两种结合官能性；第一种结合官能性针对目标物，并且第二种结合官能性针对包含在固体基材中的捕集用配体；并且(ii)第一种结合官能性包含至少2个针对目标物的结合位点，以及目标物包含至少2个针对TBP/DAP的结合位点。
在一些实施方式中，所述方法包含如下步骤：洗去杂质例如宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、病毒，选择性地固定或者从目标产物溶液去除双亲和性多肽。
在其一种实施方式中，目标生物分子是抗体。
将理解，如本文所使用的术语“抗体”可以指任何免疫球蛋白分子，例如与蛋白质A具有结合亲和性的免疫球蛋白分子，例如任何包含Fc区域或Fab区域的免疫球蛋白分子，其例如来自人类VH3基因基因家族的IgG。
实施例
以下实施例说明了本发明。总而言之，制备了众多根据本发明的连接体并测量了动态结合容量与结合速率。
更详细地，将生物素用胺官能化。通过使用VDMA的逐步合成，构建了具有丙烯酸类或胺末端基团的连接体。同样的方法被用以合成更长版本的连接体。在一种替代合成路径中，类似于SPPS方法，使用逐步酰胺偶联而合成了多种长度的连接体。
将各种连接体偶联或接枝至基材并测试动态结合容量与结合速率。测得的动态结合容量与结合速率依赖于连接体长度。
分析方法
在Teledyne ISCO,Combi Flash Rf+Lumen上，使用RediSepRf碱性氧化铝或SiliCycle SiliaSep二氧化硅柱进行快速柱色谱法。
使用装备有电喷雾接口以及UV二极管阵列检测器的Agilent 1100系列液相色谱/质量选择检测器(MSD)(单四极杆)进行分析型HPLC-MS。使用如下方法进行分析：其使用ACE3C8(3.0x 50mm)柱以及在0.1％TFA水溶液中的乙腈梯度进行3分钟，流速1mL/min；或使用Xbridge C18(3.0x 50mm)柱以及在10mM碳酸氢铵中的乙腈梯度进行3分钟，流速1mL/min。
中间NMR谱图于25℃在Nanalysis NMReady 60e上记录。最终NMR谱图于25℃在Bruker 400MHz仪器上使用D6-DMSO作为溶剂以及TMS作为参考物记录。对于市售材料与试剂，使用商业名称或俗名。
实施例1
生物素-C10-烯的合成
A：胺化生物素的合成：N-(2-氨基乙基)-5-(2-氧代-1,3,3a,4,6,6a-六氢噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺的合成
将生物素(5克，Aldrich)在甲醇(100ml)和TsOH(5mg，Aldrich)中回流过夜，随后通过在旋转蒸发器中在真空中温和蒸馏而减小反应体积，以产生生物素甲酯的清亮油。随后，加入在乙醇(25ml)中的5ml的1,2-二氨基乙烷(Aldrich)，并且将混合物搅拌过夜，随后通过在旋转蒸发器中在真空中温和蒸馏而浓缩，以得到浅黄色的半结晶油。该胺化生物素根据H-NMR、LC-MS与薄层色谱法(TLC)是纯的，并且在未进一步纯化的情况下用于在下一步骤中在水中加成VDMA(2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯，CAS号29513-26-6)。
见图3，其说明了生物素-连接体的位置(乙二胺EDA、α-甲基丙氨酸和β-丙氨酸)。
B：向在水(20mL)中的N-(2-氨基乙基)-5-(2-氧代-1,3,3a,4,6,6a-六氢噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(1.0g，3.5mmol)的溶液加入VDMA(534mg，3.8mmol)。将反应搅拌5min，随后冷冻干燥。将粗制物(1.56g)通过二氧化硅色谱柱(80g二氧化硅，液体注入甲醇中，DCM/MeOH，5％2CV，在4CV中5至20％，在2CV中20至60％，对于8CV而言60％)纯化。浓缩合并的级分。将残留物溶于水中并冷冻干燥以得到作为白色固体的生物素-C10-烯(1.2g，2.8mmol，产率80％)。质谱[M+H]+426Da。
见图4，其说明了生物素-C10-烯的合成。
生物素-C10-烯用于通过与丙烯酰胺共聚的在固体载体例如膜上的自由基引发的共接枝实验并且可用于通过对末端乙烯基键的迈克尔加成而将生物素-C10-烯偶联至胺化基材。
实施例2
生物素-C10-NH2的合成
向生物素-C10-烯(1.0g，2.3mmol)加入在水中的氨的12N溶液(12M，23mL，282mmol)。将反应混合物在封闭的耐压容器中于80℃搅拌3h。将溶液冷冻干燥以得到1.0g的生物素-C10-NH2。将该化合物通过H-NMR、C-NMR与LCMS全面表征。
见图5，其说明了生物素-C10-NH2的合成。
实施例3
生物素-C17-烯的合成
将415mg(3.0mmol)VMDA加入至在水(20mL)中的如在实施例2中合成的生物素-C10-NH2(1.3g，2.9mmol)的溶液。反应搅拌5min，随后冷冻干燥。将粗制溶液(1.61g)通过二氧化硅色谱柱(80g二氧化硅柱，液体注入甲醇中，DCM/MeOH 5％2CV，在3CV中5至20％，在3CV中20至60％，60％8CV)纯化。将含有产物及水解的VDMA的级分合并和通过在旋转蒸发器中在真空中温和蒸馏而浓缩。将材料通过碱性氧化铝色谱柱(8g碱性氧化铝柱，液体注入甲醇中，DCM/MeOH在8CV中0至5％)进一步纯化。将合并的级分通过在旋转蒸发器中在真空中温和蒸馏而浓缩。将残留物溶于水中并冷冻干燥，以得到作为白色固体的生物素-C17-烯(425mg，0.73mmol，产率：32％)。质谱[M+H]+582Da。
见图7，其说明了生物素-C17-烯的合成。
生物素-C17-烯用于通过与丙烯酰胺共聚的在膜上的自由基引发的共接枝实验，以及用于通过对生物素-C17-烯的末端乙烯基双键的迈克尔加成而将生物素-C17-烯偶联至胺化基材。
还将该连接体在单独的实例中用于用另外的VDMA单元进一步延长，从而产生甚至更长的连接体衍生物。
实施例4
本实施例说明了生物素-不同长度(C-10、C-17和C-24)的连接体的合成路径。使用通过HATU/DIPEA的肽偶联反应、以及通过哌啶和2M HCl的正交的N-端Fmoc与Boc脱保护，合成了2种类型的具有不同连接体长度(C-10、C-17和C-24)的亲和配体(系列A：末端NH2氨基，与系列B：末端乙烯基-烯)。最终步骤是将作为活性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的生物素与肽连接体分子进行N-端偶联和最后N-Boc脱保护以合成N-端氨基生物素连接体分子生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C-24-NH2(系列A)。
已通过如下而合成了具有末端的-烯基团的生物素-连接体分子生物素-C10-烯、生物素-C17-烯、生物素-C24-烯(系列B)：在水中将2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯VDMA偶联在生物素-EDA-NH2、生物素-C10-NH2和生物素-C17-NH2的末端氨基基团上，以实现延长了C7的连接体分子。
命名为生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2、生物素-C24-NH2的第一种类型具有末端氨基基团(系列A)。命名为生物素-C10-烯、生物素-C17-烯、生物素-C24-烯的第二种类型具有末端乙烯基-烯(系列B)。
对以下各类型，需要分别地n＝1、2和3的3种化合物。
Figure BDA0003179554230000121
生物素-C10-烯、生物素-C17-烯、生物素-C24-烯。
Figure BDA0003179554230000122
生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C24-NH2。
该方法使用肽偶联反应。连接体的链由三种不同的组分组成：乙二胺EDA以及两种氨基酸：α-甲基丙氨酸以及β-丙氨酸。
Figure BDA0003179554230000123
连接体链由乙二胺EDA、α-甲基丙氨酸α-MeAla以及β-丙氨酸β-Ala组成。
作为一个实例，对于系列B合成，图7显示了将2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯VDMA加成至生物素-C10-NH2将得到延长了C7的生物素-C17-烯亲和配体。
具有末端NH2的系列A(生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C24-NH2)的合成
在系列A与系列B连接体的合成中所使用的不同构建模块的合成
Fmoc-EDA-HCl
向用冰浴冷却的在二氯甲烷(300mL)中的Fmoc-Cl(16.1g，62.4mmol)的溶液逐滴加入在20mL DCM中的N-(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(Boc-EDA)(10.0g，62.4mmol)的溶液。反应在室温下搅拌。30min后，形成白色沉淀。加入10mL的MeOH并且溶液变成均相。将混合物用水(2×100mL)洗涤。将有机相在硫酸镁上面干燥，过滤并浓缩。将固体用二乙基醚洗涤并在真空下干燥以得到Fmoc-EDA-Boc(16.9g，44.2mmol，产率：70.8％)。向在1,4-二氧六环(50.0mL)中的Fmoc-EDA-Boc(4.00g，10.5mmol)的溶液加入在1,4-二氧六环中的HCl的4M溶液(4.00M，55mL，220mmol)。将反应混合物搅拌1小时。将固体过滤并用二乙基醚洗涤以得到作为白色固体的Fmoc-EDA-HCl(3.5g，11.0mmol，产率：定量的)。
生物素-NHS
Figure BDA0003179554230000131
向在N,N-二甲基甲酰胺(50.0mL)中的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(12.7g，49.5mmol)及生物素(11.0g，45.0mmol)的溶液加入三乙胺TEA(31.4mL，0.225mol)。将反应混合物搅拌16小时。将固体过滤，用二乙基醚洗涤并在真空下干燥以得到生物素-NHS(11.2g，0.0328mol，产率：72.9％)，其为白色固体并且在未进一步纯化的情况下使用。
Fmoc-EDA-MeAla-NH2-HCl与Fmoc-EDA-NH2-HCl
向在1,4-二氧六环中的Fmoc-EDA-MeAla-NHBoc或Fmoc-EDA-NHBoc加入在1,4-二氧六环中的HCl的4M溶液(20当量)。将反应混合物搅拌1小时，并随后浓缩。将粗制材料在未进一步纯化的情况下使用。
用于Boc-α-甲基丙氨酸偶联的程序
向Boc-α-甲基丙氨酸(1.2当量)与HATU(1.1当量)在乙腈中的溶液(浓度约0.15M)加入DIPEA(5当量)。将混合物搅拌10min。向该混合物加入N-端氨基化合物(1当量)并且将所得溶液搅拌30min。当产物沉淀时，将固体过滤，用二乙基醚洗涤并在真空下干燥。否则，将溶液用乙酸乙酯稀释，用在水中的HCl的0.5M溶液洗涤2次，用水洗涤2次并用盐水洗涤1次。随后，将有机相在硫酸镁上面干燥，过滤并浓缩。
用于Boc-β-丙氨酸偶联的程序
向Boc-β-丙氨酸(1.2当量)与HATU(1.1当量)在乙腈中的溶液(浓度约0.15M)加入DIPEA(5当量)。将混合物搅拌10min。向该混合物加入N-端氨基化合物(1当量)并且将所得溶液搅拌30min。当产物沉淀时，将固体过滤，用二乙基醚洗涤并在真空下干燥。否则，将溶液用乙酸乙酯稀释，用在水中的HCl的0.5M溶液洗涤2次，用水洗涤2次并用盐水洗涤1次。随后，将有机相在硫酸镁上面干燥，过滤并浓缩。在两种情况下，粗制材料均在未进一步纯化的情况下使用。
NH2-EDA-NHBoc
向Fmoc-乙二胺-NHBoc加入在乙腈中的哌啶的20％溶液。将反应混合物搅拌30分钟，随后浓缩。将溶液浓缩，并且将粗制物在真空下干燥24小时。将固体用二乙基醚研制三次。将固体过滤，用二乙基醚洗涤并在真空下干燥。将粗制材料在未进一步纯化的情况下使用。
生物素-EDA-NHBoc
向NH2-乙二胺-NHBoc在乙腈和水中的溶液(浓度约0.1M)加入生物素-NHS(2当量)。将反应混合物搅拌30min并通过LCMS检查。若需要，加入另外的0.5当量的生物素-NHS并且将混合物搅拌1小时。将混合物在旋转蒸发器中浓缩并通过二氧化硅色谱法(液体注入甲醇中，DCM 2CV，DCM/MeOH在14CV中0至60％)纯化。
生物素-EDA-NH2-HCl
向生物素-乙二胺-NHBoc加入在水中的HCl的2M溶液。将反应混合物搅拌过夜，并浓缩。将粗制材料在甲醇中再溶解并浓缩。将固体在真空下干燥。
具有末端NH2的系列A(生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C24-NH2)的合成
生物素-C10-NH2
已经通过一系列肽偶联反应合成了生物素-C10-NH2(图5)，所述肽偶联反应为始于在乙腈中将Boc-MeAla和N-Fmoc保护的乙二胺Fmoc-EDA进行HATU偶联以形成FmocNH-EDA-MeAla-NHBoc的偶联反应。将末端的N-Boc保护基团通过2M HCl溶液去除，以形成N-端氨基基团Fmoc-EDA-MeAla-NH2。将Fmoc-EDA-MeAla-NH2偶联至BocNH-β-丙氨酸以形成Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-NHBoc。将末端的Fmoc基团通过在乙腈中的20％哌啶去除以形成末端氨基基团。随后将生物素-NHS在室温下在乙腈-水中偶联至NH2-EDA-MeAla-β-Ala-NHBoc上并且最后在室温下将NHBoc基团用2M HCl去除以合成具有末端氨基基团的生物素-C10-NH2。图7中描述了合成路径。将该化合物生物素-C10-NH2通过H-NMR、C-NMR和LC-MS全面表征。式量为479.04，发现测得的质量为478.21。
生物素-C17-NH2
生物素-C17-NH2的合成(图8)遵循和对于生物素-C10-NH2描述的相同的通过HATU/DIPEA的肽偶联反应、用2M HCl进行Boc脱保护、用哌啶进行Fmoc脱保护以及用生物素-NHS进行生物素化。
将Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-NHBoc(C-10连接体)的Boc保护基团通过2M HCl处理而去除以形成Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-NH2。随后，在乙腈中通过HATU/DIPEA将末端氨基偶联至Boc-MeAla。将末端的Boc保护基通过2M HCl去除，随后通过HATU/DIPEA偶联而偶联至β-Ala-NHBoc。随后，将Fmoc基团用在乙腈中的20％哌啶去除。将生物素作为NHS活性酯偶联至末端的NH2基团并且最后，将末端的Boc基团用2M HCl去除以形成生物素-C17-NH2亲和连接体分子。最后，在生物素-C17-NHBoc的脱保护后，得到了1.5g产物，总产率31％(10个步骤)。将该化合物通过H-NMR、C-NMR和LC-MS全面表征。式量为635.22，发现测得的质量为634.31。
生物素-C24-NH2
生物素-C24-NH2的合成(图10)遵循和对于生物素-C10-NH2以及生物素-C17-NH2描述的相同的通过HATU/DIPEA的肽偶联反应、用2M HCl进行Boc脱保护、用哌啶进行Fmoc脱保护以及用生物素-NHS进行生物素化。
首先，将Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-MeAla-β-Ala-NHBoc(C-17连接体)的Boc保护基团通过2M HCl处理而去除以形成Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-NH2。随后，将末端氨基基团再次在乙腈中通过HATU/DIPEA偶联至Boc-MeAla。将末端的Boc保护基再次通过2M HCl去除，随后通过HATU/DIPEA偶联而偶联至β-Ala-NHBoc。随后，将Fmoc基团用在乙腈中的20％哌啶去除，将生物素作为NHS活性酯偶联至末端的NH2基团并且最后，将末端的Boc基团用2M HCl去除以形成生物素-C24-NH2亲和连接体分子。借助来自合成生物素-C10-NH2和生物素-C17-NH2的经验，生物素-C24-NH2的该合成导致得到2g材料，总产率30％(14个步骤)。将该化合物通过H-NMR、C-NMR和LC-MS全面表征。式量为791.40，发现测得的质量为790.39。
具有末端乙烯基-烯的系列B(生物素-C10-烯、生物素-C17-烯和生物素-C24-烯)的合成
向生物素-EDA-NH2、生物素-C10-NH2或生物素-C17-NH2在水中的溶液加入在水中的碳酸氢钠的1M溶液，直至pH 8。向该溶液加入VDMA。将混合物浓缩并且进行二氧化硅色谱法(液体注入甲醇中，DCM 2CV，DCM/MeOH在5CV中0至20％，在3CV中20至40％，在1CV中40-60％，以及对于3CV而言60％)。浓缩合并的级分。将产物在甲醇中溶解，浓缩并且在真空下干燥以分别得到生物素-C10-烯、生物素-C17-烯和生物素-C24-烯。
生物素-C10-烯
通过在水中将2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯VDMA加成到生物素-EDA-NH2的末端氨基基团而合成具有末端乙烯基基团的生物素-C10-烯(图4)。最后，将生物素-C10-烯通过二氧化硅色谱法纯化并且通过H-NMR、C-NMR和LC-MS全面表征。式量为425.55，发现测得的质量为425.21。
生物素-C17-烯
相应地，通过在水中将2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯VDMA加成到生物素-C10-NH2的末端氨基基团而合成具有末端乙烯基基团的生物素-C17-烯(图7)。最后，将生物素-C17-烯通过二氧化硅色谱法纯化并且通过H-NMR、C-NMR和LC-MS全面表征。式量为581.73，发现测得的质量为581.31。
生物素-C24-烯
具有末端乙烯基基团的生物素-C24-烯(图9)可以遵循相同的策略合成：在水中将2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯VDMA加成到生物素-C17-NH2的末端氨基基团导致几乎定量地形成延长了C7的生物素-C24-烯亲和配体。最后，将生物素-C24-烯通过二氧化硅色谱法纯化并且通过H-NMR、C-NMR和LC-MS全面表征。式量为737.91，发现测得的质量为737.39。
实施例5
珠粒基材的胺化
将含有反应性溴醇(bromohydrin)基团的WorkBeads 40/10 000ACT(Bio-WorksAB)用1,2-二氨基乙烷(在水中5％)在室温下处理过夜。将所述珠粒用水以及三乙胺缓冲液(50mM)洗涤。所得伯胺官能化珠粒被用于中等的以及长的长度的连接体与生物素的偶联。
实施例6
将生物素-C10-烯或生物素-C17-烯偶联至胺化基材
将胺化基材(实施例5)与分别如在实施例1和3中所描述那样合成的生物素-C10-烯或生物素-C17-烯(50nmol/ml胺化载体)在50mM三乙胺(2ml/ml胺化载体)中混合6小时。反应通过用水大量洗涤而终止，以避免任何泄漏。
所得两种类型的具有生物素-C10或生物素-C17的珠粒可通过根据此前描述的抗体纯化方法，例如在EP 2220107 B1中或在WO 2010/128033 A2中公开的纯化工艺捕捉双亲和性多肽(DAP)或靶向结合多肽(TBP)而被用于例如抗体的纯化。
实施例7
通过溴-醇(bromo-hydrine)活化将生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C24-NH2偶联到琼脂糖树脂上
·将BioWorks Work Beads 40/10.000ACT(4ml，经150μmol/ml溴-醇活化，在20％乙醇/水中的50％淤浆)转移至玻璃过滤器，排干20％的乙醇/水并且用水洗涤数次并通过抽吸而干燥5min。
·将生物素-C10(8.8mg，20μmol)、生物素-C17(12.0mg，20μmol)和生物素-C24(15.1mg，20μmol)各自溶于4ml 0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝9.3)中。随后，分别将所述生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C24-NH2溶液(4ml)添加至在10mL塑料小瓶中的Work Beads树脂(4ml)。
·随后，将溶液置于旋转式混合器中并且于室温下搅拌16h。
·随后，将树脂转移至玻璃过滤器，排干生物素-C10-NH2、生物素-C17-NH2和生物素-C24-NH2溶液。随后，将排干的经生物素化的WorkBeads用水(10×)洗涤并用5ml的1M乙醇胺溶液温育以将琼脂糖上的剩余溴-醇活化用基团失活。将树脂随后在旋转式混合器中搅拌8小时。
·最后，将树脂转移至玻璃过滤器，排干封端剂1M乙醇胺，用水(10×)、用1M HCl(5×)、以及用水(10×)、20％乙醇(5×)洗涤，通过抽吸而干燥。
·将生物素化的树脂制品在20％乙醇中作为50％淤浆储存。
用DAP测试这些具有生物素-C10-NH-、生物素-C17-NH-和生物素-C24-NH连接体的经生物素化的琼脂糖树脂的动态结合容量与结合速率研究。
实施例8
测量动态结合容量(DBC)
为了测定DAP或TBP对偶联至固体载体表面的生物素连接体的DBC，应用了朗缪尔吸附等温线。这基于在以下列举的假设：
·表面是均匀的。
·超过单层覆盖，吸附无法发生。
·所有吸附位点是等价的且结合是彼此独立的。
·被吸附的分子与溶液中的分子之间无相互作用且溶剂与表面之间无相互作用。
朗缪尔吸附等温线基于在DAP与连接至固体载体的生物素之间的平衡。因此，为了让各个分析能够达到平衡，DAP超过最大结合容量是强制性的。
使用朗缪尔吸附等温线，DAP对生物素表面的结合可描述为：
Figure BDA0003179554230000191
其可以重新排列成
C*＝DBC C*/q*-1/k
其中q*是被结合的DAP的质量，其表示为每mL生物素树脂珠粒或膜结合的mg DAP，c*是溶液中DAP的平衡浓度，DBC是最大结合容量以及k是吸附平衡常数。(参考文献：Beier等，Adsorption of Amylase Enzyme on Ultrafiltration Membranes，Langmuir(2007)，第23卷，第9341-51页)
DBC可以通过将C*对C*/q*作图确定。斜率等于DBC。通过如下分析如在以上实施例中描述的那样制备的官能化固体基材的动态结合容量：将已知量的固体基材在溶液中用4种不同量的DAP温育。
将固体基材(0.25mL)置于Omnifit柱(6.6mm/100mm)(Diba Industries Inc.,Danbury,CT,USA)中并用0.3M柠檬酸盐pH 3.5，0.1％吐温20平衡。使用
Figure BDA0003179554230000192
Pure(GEHealthcare,Chicago,IL,USA)向含有该官能化固体基材的Omnifit柱载入10mL浓度分别为1.8、1.4、1.1和0.9mg/mL的DAP溶液。将泵流速设置在每分钟1.0mL，其对应于在柱中15秒的停留时间。在洗出未结合的DAP，并收集穿透级分后，使用Nanodrop光谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA,USA)分析其DAP含量。DAP的消光系数：εDAP＝1.12cm2/mg，以及MW＝42,758kDa。
通过确定在用固体基材温育后溶液中的总DAP含量，计算散装液体中的平衡浓度(C*，mg/mL)。通过从溶液中的起始DAP含量中减去穿透溶液中的DAP含量，计算固体基材上的平衡浓度(q*，mg/mL)。将从实验所收集的数据通过如下而使用：如图11中所示那样将C*(y)绘制为C*/q*(x)的线性函数。线性趋势线的斜率给出了对于结合实验中所用的固体基材的量而言的最大结合容量。在本分析中测试了0.25mL固体基材，通过将斜率乘以4得到以mg/mL计的动态结合容量(DBC)。
表1中是从分析生物素-C10、生物素-C17和生物素-C24官能化固体基材而汇总的DBC结果。从该表清楚的是，生物素-C17官能化固体基材导致最高的DBC。
Figure BDA0003179554230000193
Figure BDA0003179554230000201
表1.在1.0mL/分钟的流速(对应15秒的停留时间)下生物素-C10、生物素-C17和生物素-C24官能化固体基材的所测定动态结合容量(“DBC”，mg/mL)的汇总。包括了未官能化的固体基材作为对照。
实施例9
结合速率(停留时间)
为明白停留时间是否会影响DBC，进一步分析如在以上实施例中所描述的那样制备的官能化固体基材。对于每一个泵速，如以上在实施例8中那样测定DBC。变动泵流速以实现与固体基材接触的DAP的不同停留时间，即每分钟0.5、1.0和2.0mL，其分别对应30、15和7.5秒的停留时间。对于生物素-C10、生物素-C17和生物素-C24官能化固体基材，如以上在实施例9中所描述的那样测定动态结合容量并且结果汇总于表2中。
和其它生物素连接体相比，生物素-C17官能化固体基材提供了DBC最大值。还观察到，生物素-C17的DBC几乎恒定(小于4％的减少)，这意味着相比于其它被测试的连接体，对于生物素-C17而言结合速率快得多。在测量的停留时间范围内，生物素-C10和生物素-C24的DBC分别减少了20％和10％。
Figure BDA0003179554230000202
表2.在0.5、1.0和2.0mL/分钟的流速(分别对应30、15和7.5秒的停留时间)下生物素-C10、生物素-C7和生物素-C24官能化固体基材的所测得动态结合容量(“DBC”，mg/mL)的汇总。生物素-C17官能化固体基材在所有测量的停留时间下导致更高的DBC且仅在较小程度上受到停留时间减少的影响。
实施例10
在膜上接枝生物素-C10-烯、生物素-C17-烯或生物素-C24-烯
分别地，将三种不同长度的连接体：生物素-C10-烯、生物素-C17-烯或生物素-C24-烯，与N,N-二甲基丙烯酰胺一起自由基引发共接枝到聚砜醚膜片材(3M)。
将膜切割成圆块(直径10cm)并用水洗涤，随后用二氧六环洗涤。将膜于在干燥且无氧的二氧六环中的10％的N,N-二甲基丙烯酰胺(Fluka)以及分别地0.1％的生物素-C10-烯、生物素-C17-烯和生物素-C24-烯以及作为自由基引发剂的苯醌(benzoequinone)(Fluka，25ppm)中浸泡。将膜用UV灯在中性气氛(干燥氮气)下辐照10分钟。将膜用二氧六环洗涤。
将被洗出的均聚物收集并且用于通过SEC近似所接枝聚合物的长度。与MW标准物相比，该均聚物的分子量分布是宽的，为大约500至25000Da。
将所得的具有接枝的聚丙烯酰胺以及生物素-C10、生物素-C17和生物素-C24的三种不同膜用热水(60℃)大量洗涤以去除任何均聚物以及避免此后的泄漏。
所得的膜是物理完整的，尽管略微发黄，并且具有由聚丙烯酰胺骨架和不同长度半刚性支链构成的接枝共聚物。所述支链(梳)不同于所述骨架。
将具有拥有从分支点起的不同长度连接体(梳)的聚丙烯酰胺接枝物的不同膜以与实施例8相似的设置测试。将膜切割成小块(约2x2 mm)并填充在Omnifit柱中。
由于柱中膜折叠的问题，将实验重复了数次。对于C17(10-25mg/mg膜)，结合容量最佳，比C10和C24制品(其具有几乎相同的容量)优约+15-25％。

Claims (12)

1.配体官能化基材，其包含：
a.基材，该基材在其表面处具有羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基基团(-NH2)、C-C双键(-烯)或C-C三键(-炔)；
b.连接体，该连接体与所述基材的所述羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基基团(-NH2)、C-C双键(-烯)或C-C三键(-炔)共价结合，该连接体具有10-25、例如17-22个键的连接体长度，其中键为C-C、C-N、C-N(H)、C-C(O)和/或C-O；以及
c.配体官能团，其通过所述连接体与基材的表面结合。
2.如根据权利要求1所述的配体官能化基材，其中基材是固体基材。
3.如根据权利要求1所述的配体官能化基材，其中基材是能够通过自由基引发的乙烯基聚合而被接枝的固体基材。
4.如根据权利要求1-3任一项所述的配体官能化基材，其中基材选自：琼脂糖，其例如为树脂或珠粒的形式，硅藻土，硅胶，纤维素，纤维素醚，羧甲基纤维素，退化纤维素，基于琼脂糖或纸的膜，硝化纤维素，硝化纤维素混合酯，二氧化硅，以及可控孔度玻璃，聚酰胺，聚砜醚，聚乙烯醇，聚碳酸酯，聚氨酯，聚醚砜，聚砜，聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚偏氟乙烯，聚苯乙烯或聚丙烯，聚乙烯及共聚嵌段聚合物，它们的共混物及组合。
5.如根据前述权利要求任一项所述的配体官能化基材，其中连接体选自2-乙烯基-4,4-二甲基-5-
Figure FDA0003179554220000011
唑酮(VDMA)、乙烯基吖内酯衍生物、丙烯酸类衍生物、己烷二异氰酸酯(HDI)衍生物、二异氰酸酯衍生物、或它们的混合物。
6.如根据前述权利要求任一项所述的配体官能化基材，其中配体官能团选自生物素、或生物素类似物。
7.如根据前述权利要求任一项所述的配体官能化基材，其中连接体具有10-25个键的长度，例如10-24个键的长度，例如10-23个键的长度，例如10-22个键的长度，例如10-21个键的长度，例如10-20个键的长度，例如10-19个键的长度，例如10-18个键的长度，例如10-17个键的长度，例如10-16个键的长度，例如10-15个键的长度，例如10-14个键的长度，例如10-13个键的长度，例如10-12个键的长度，例如10-11个键的长度，例如11-25个键的长度，例如12-25个键的长度，例如13-25个键的长度，例如14-25个键的长度，例如15-25个键的长度，例如16-25个键的长度，例如17-25个键的长度，例如18-25个键的长度，例如19-25个键的长度，例如20-25个键的长度，例如21-25个键的长度，例如22-25个键的长度，例如23-25个键的长度，例如24-25个键的长度。
8.用于制备如根据前述权利要求任一项所述的配体官能化基材的方法，其包含(a)将基材以化学方式或通过引入自由基而活化，以及(b)将配体直接经由连接体或通过使用两种或更多种丙烯酸类单体的自由基共聚而与基材偶联，所述丙烯酸类单体的至少一种包含配体。
9.如根据权利要求1-7任一项所述的配体官能化基体用于捕捉或固定感兴趣的化合物的用途。
10.如根据权利要求9所述的用途，其用于纯化目标生物分子，所述纯化包含如下步骤：
(a)将(i)目标生物分子、(ii)双亲和性多肽、和(iii)如根据权利要求1-7任一项所述的配体官能化基材接触，以及(b)通过洗脱收取目标生物分子，其中使目标生物分子与双亲和性多肽在溶液中接触，之后混合物与配体官能化基材接触，以及任选地c)洗去杂质和/或去除双亲和性多肽。
11.如根据权利要求9所述的用途，其用于纯化目标生物分子，所述纯化包含如下步骤：
(a)让目标分子、和一群靶向结合多肽在溶液中接触足以容许形成络合物的时间；以及(b)通过后续的纯化步骤将目标从来自(a)的络合物分离，其中(i)靶向结合多肽具有至少两种结合官能性；第一种结合官能性针对目标，第二种结合官能性针对包含在固体基材中的捕集用配体；以及(ii)第一种结合官能性包含至少2个针对目标的结合位点，以及目标包含至少2个针对TBP的结合位点。
12.如根据权利要求11或12任一项所述的用途，其中目标生物分子是抗体。
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