CN113461678B - 微管蛋白降解剂CRSMs及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白降解技术领域，具体涉及一种微管蛋白降解剂CRSMs及其用途。针对现有微管抑制剂要么促进微管蛋白聚合，要么抑制微管蛋白聚合，还没有直接靶向微管蛋白且促使微管蛋白降解的物质，本发明提供了一种微管蛋白降解剂CRSMs及其在降解微管蛋白中的用途，并进一步提供了CRSMs在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。本发明为抗肿瘤的药物开发提供了一种新的选择，并提供了一种新的药物作用途径，即不需要促进或抑制微管蛋白聚合，而是直接降解微管蛋白进而发挥药效，具有很好的应用前景。

Description

微管蛋白降解剂CRSMs及其用途

技术领域

本发明属于蛋白降解技术领域，具体涉及一种微管蛋白降解剂CRSMs及其用途。

背景技术

目前许多癌症靶向小分子药物研发通常专注于抑制靶蛋白功能结构域的生化活性发挥治疗效果，这些小分子药物通常都结合在那些致癌蛋白的活性位点，而这些致癌蛋白中有许多是活性部位结构相似的激酶，导致高剂量的小分子药物很有可能带来非特异性的副作用。诱导蛋白降解是最近兴起的一种新的抗癌机制，旨在降低疾病相关蛋白质的总体水平。理论上，只需要小分子药物短暂地与致癌蛋白结合，给致癌蛋白打上“需要清理”的标签就可以通过泛素-蛋白酶体系统降解了。这些药物不需要很高的浓度，可以循环使用，并且蛋白被降解后需要重新合成才能恢复功能，这就极大地推迟了抗药性的产生。已有多个实例证实促进靶蛋白降解可能是比抑制蛋白功能更有效的治疗策略。实例包括(1)三氧化二砷和全反式维甲酸诱导的白血病相关融合蛋白PML-RARα降解批准上市用于临床治疗早幼粒细胞白血病。(2)氟维司群(Fulvestrant)诱导雌激素受体(ER)降解被批准上市临床用于治疗乳腺癌等。最近开发的用于多发性骨髓瘤的免疫疗法药物lenalidomide，也被发现可以诱导激酶CK1α和两个在多发性骨髓瘤中非常重要的转录因子Ikaros和Aiolos的泛素化和降解。

聚焦于靶蛋白降解策略，最近火热的PROTAC靶蛋白降解策略正是研究热点。PROTAC是PROteolysis TArgeting Chimera的缩写-蛋白降解靶向嵌合体。PROTAC是一种双功能小分子，一端是结合靶蛋白的配体，另一端是结合E3泛素连接酶的配体，通过一段链条连接。在体内可以将靶蛋白和E3酶拉近，使靶蛋白被打上泛素标签，然后通过泛素—蛋白酶体途径降解。PROTAC技术在很大程度上是结合了小分子化合物和小分子核酸的优点。既可以有效地靶向目标蛋白，又可以将之降解清除，想象空间非常丰富。理论上可以降解细胞内几乎所有的蛋白质(包括膜蛋白)，与靶向小分子药物相比具有较高的安全性、能克服耐药性因而具有广阔的应用前景。不过，尽管PROTACs展现出了令人期待的潜力，靶向蛋白降解仍然存在很大的挑战。比如，如何在临床应用中把握适当剂量就是一个问题，因为过多的PROTACs可以分别与靶蛋白和E3形成PROTAC-蛋白二元复合物，从而减少靶蛋白-PROTAC-E3三元复合物的形成，阻断泛素标记，并消除降解。此外，由于PROTAC是双功能小分子，其分子量相对较大(700-1000Da)、且其极性表面积通常大于

其水溶性、口服吸收和透膜性很可能都较差，药代动力学特征仍旧是多数PROTAC分子成药的主要障碍，同时其化学合成成本也相对较高。另外，其脱靶毒性尚需值得关注，因为泛素化标记不仅涉及到蛋白质的降解，还关系到甲基化、乙酰化、磷酸化等过程；不仅涉及蛋白质，还涉及到了DNA。同时还需要指出，ROTACs作为化学生物学工具的发展也充满挑战。目前，尚无指导特定E3连接酶与给定蛋白质靶标配对的理论依据，还属于经验性的摸索，鉴于此，探索更多的靶蛋白以及可用E3泛素连接酶也是未来的重要研究方向。因此，除了PROTAC技术，是否能找到新的蛋白降解策略也是当前一个重要的研究方向。

新的蛋白降解策略的开发将会一直是制药领域的热点。除了PROTAC策略，还有疏水标签(Hydrophobic tagging)蛋白降解策略以及HaloTag蛋白降解策略等。疏水标签蛋白降解策略的基本原理是在可与靶标结合的小分子上连接一个“大而疏水”基团，这样的双头分子结合到靶标后会引起其错误折叠，从而被相应的蛋白酶降解，已经有科研工作者将这种想法加以利用，制造出可以降解HER3和雄激素受体的小分子药物。最近，美国西奈山研究中心的科研人员在Nature Chemical Biology报道了首个利用疏水标签蛋白降解策略成功开发了EZH2蛋白的特异性降解剂MS1943，其药效评价结果表明MS1943有可能是一种有效治疗TNBC和其他依赖EZH2的癌症的方法。研究者认为疏水标签是一种长期以来被低估的降解剂设计方法，从而很可能又重新掀起疏水标签蛋白降解的研究热点。总之，以上蛋白策略均需要对目标蛋白的已存在的抑制剂进行特异性标记，如通过Linker链接E3泛素连接酶的配体(PROTAC)、链接疏水标签(Hydrophobic tagging)，链接烷基氯化物(HaloTag)等。这些策略通常都会由于增加Linker链接标签以后导致分子量增大，药动学参数变差而导致成药性降低。因此，除了上述PROTAC技术以外，能否开发不利用Linker链接标签的蛋白降解技术具有重大的价值。

此外，目前总共发现了6个微管靶向剂结合位点，即紫杉醇位点、长春新碱位点、秋水仙碱位点、maytansine位点、laulimalide/peloruside A位点和pironetin位点。传统上根据微管靶向剂作用机制的不同将其分为两类：一类是促进微管蛋白聚合的微管蛋白聚合剂或微管稳定剂(microtubule stabilizing agents,MSAs)，另一类是抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂或微管去稳定剂(microtubule destabilizing agents,MDAs)。其中靶向紫杉醇位点的MTAs能够稳定微管，属于MSAs；靶向长春新碱^[22]和秋水仙碱位点的MTAs能够导致微管变得不稳定，属于MDAs。迄今为止，针对目前已经发现的这6个微管抑制剂作用位点，已经报道的微管抑制剂要么促进微管蛋白聚合，要么抑制微管蛋白聚合，而通过直接靶向微管蛋白且促使微管蛋白降解的小分子还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有微管抑制剂要么促进微管蛋白聚合，要么抑制微管蛋白聚合，还没有直接靶向微管蛋白且促使微管蛋白降解的物质。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种微管蛋白降解剂CRSMs。

本发明所述的微管蛋白降解剂CRSMs，为能与微管蛋白中特定的可电离氨基酸残基形成低能垒氢键进而引起蛋白内部电荷重新分布的小分子物质。

进一步的，上述微管蛋白降解剂CRSMs，为(N-(3-苯氧基苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺。

更进一步的，上述微管蛋白降解剂CRSMs，结构为

本发明还提供了一种上述微管蛋白降解剂CRSMs在降解微管蛋白中的用途。

其中，上述用途中，所述的微管蛋白降解剂CRSMs使用剂量为≥1μM。

其中，上述用途中，所述降解微管蛋白通过泛素-蛋白酶体途径进行。

其中，上述用途中，所述的微管蛋白降解剂CRSMs结合位点为秋水仙碱位点。

本发明还提供了一种上述微管蛋白降解剂CRSMs在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

其中，上述用途中，所述的肿瘤包括：胃癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胸腺癌、卵巢癌、前列腺素癌、神经胶质瘤或黑色素瘤中的至少一种。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种化合物的新用途，所述化合物为(N-(3-苯氧基苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺，本发明首次发现其具有降解微管蛋白的作用，进而发现该化合物可用在制备预防或治疗肿瘤的药物中。本发明为抗肿瘤的药物开发提供了一种新的选择，并提供了一种新的药物作用途径，即不需要促进或抑制微管蛋白聚合，而是直接降解微管蛋白进而发挥药效，具有很好的应用前景。

附图说明

图1所示为CRSMs(1μM)在HeLa细胞上与Pironetin(Pir,1μM),Colchicines(Col,1μM),Maytansine(May,1μM)和Vinblastine(Vin,1μM)的竞争性实验。

图2所示为CRSMs与微管蛋白的晶体复合物。A)微管蛋白-CRSMs晶体复合物结构概览。RB3-SLD绿色，TTL黄色，α-微管黑色，β-微管灰色，球状CRSMs蓝绿色；B)CRSMs的化学结构；C)CRSMs与微管蛋白的相互作用。被标记的与CRSMs有相互作用的氨基酸残基用球棍表示，疏水中心用绿色的半透明椭圆表示(小的椭圆：疏水中心I,大的椭圆：疏水中心II)；D)CRSMs与βGlu198和βTyr200之间氢键相互作用的特写视图。

图3所示为CRSMs对微管形态的影响。

图4所示为CRSMs选择性的下调微管蛋白的表达。

图5所示为CRSMs浓度和时间依赖性的降解微管蛋白。A)CRSMs在四个肿瘤细胞HeLa,HCT-116,H460及SU-DHL-6上浓度依赖促进α-和β-微管蛋白降解。B)CRSMs(1μM)在HeLa和HCT-116细胞上时间依赖促进α-和β-微管蛋白降解。

图6所示为CRSMs促进αβ-微管蛋白泛素化。A)免疫印迹分析CRSMs对α-微管蛋白泛素化的影响；B)免疫印迹分析CRSMs对β-微管蛋白泛素化的影响；C)免疫印迹分析CRSMs对细胞内其他蛋白的泛素化水平的影响。

图7所示为溶酶体抑制剂NH₄Cl，蛋白酶体抑制剂MG132，泛素-激活酶E1抑制剂PYR-41对CRSMs促进αβ-微管蛋白降解的影响。

图8所示为Glu198和Tyr200氨基酸突变考察CRSMs对诱导微管蛋白降解的影响。

图9所示为在秋水仙碱位点与CRSMs具有相同结合模式的Nocodazole和Plinabulin对诱导微管蛋白降解的影响。A)CRSMs，Nocodazole和Plinabulin在秋水仙碱位点的结合模式；B)CRSMs，Nocodazole和Plinabulin对诱导微管蛋白降解的影响。

图10所示为QM/MM计算Glu198-CRSMs,Glu198-Plinabulin和Glu198-Nocodazole的低势垒氢键。

图11所示为CRSMs在H460和HCT116模型上的体内抗肿瘤效果。A)CRSMs在H460模型上的肿瘤生长曲线图；B)CRSMs在H460模型上瘤重统计图；C)CRSMs在HCT116模型上的肿瘤生长曲线图；D)CRSMs在HCT116模型上瘤重统计图。

具体实施方式

本发明提供了一种微管蛋白降解剂CRSMs(促进靶蛋白残基带电或不带电的小分子,Charging/discharging Residue of Target Protein Small Molecule，CRSM)，通过与靶蛋白中特定的可电离氨基酸残基形成低能垒氢键(LBHB,Low Barrier Hydrogen Bond)来改变蛋白内部电荷平衡，从而破坏蛋白稳定性并促进蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解，从而达到降解微管蛋白的目的。本发明提供的CRSMs不需要Linker链接标签，其在具有PROTACs的所有优点时，还拥有分子量相对较小、更容易成药等特点。

特别的，本发明所述的微管蛋白降解剂CRSMs为(N-(3-苯氧基苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺，结构为：

本发明还提供了上述微管蛋白降解剂CRSMs在降解微管蛋白中的用途。

其中，上述用途中，所述的微管蛋白降解剂CRSMs使用剂量为≥1μM。

其中，上述用途中，所述降解微管蛋白通过泛素-蛋白酶体途径进行。

其中，上述用途中，所述的微管蛋白降解剂结合位点为秋水仙碱位点。

本发明还提供了一种上述微管蛋白降解剂CRSMs在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

其中，上述用途中，所述的肿瘤包括：胃癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胸腺癌、卵巢癌、前列腺素癌、神经胶质瘤或黑色素瘤中的至少一种。

本领域的技术人员公知，蛋白质在执行其正常生理功能时必须保存完整的构象。破坏蛋白构象可以破坏蛋白稳定性从而导致目的蛋白变性然后被泛素化-蛋白酶体途经清除。影响蛋白稳定性的因素有多种，包括其构象稳定性，疏水相互作用，氢键相互作用，可离子化残基的影响等。在蛋白中内部可电离氨基酸残基相对较少，但它们在所有生物体的许多基本生物过程中都是必不可少的。在蛋白中有七种可电离的氨基酸侧链，它们分别是：天冬氨酸，谷氨酸，络氨酸，半胱氨酸，组氨酸，赖氨酸和精氨酸。它们可存在于蛋白的表面及内部。存在于表面时它们是带电状态且与水分子或者周围的氨基酸残基形成氢键，维持蛋白稳定性。存在蛋白质内部时这些氨基酸残基通常保持中性，即不带电状态，也具有维持蛋白稳定性的作用。可电离氨基酸介导的电荷平衡对蛋白稳定性具有重要作用。这些氨基酸在pH 1到14之间电离，平均而言，这些残基占蛋白质中29％的氨基酸。蛋白质中的局部环境改变可以影响它们的pKa值，同时反过来这些氨基酸残基通过电荷相互作用也会影响蛋白质的稳定性，既可通过形成离子对增加蛋白稳定性或在蛋白内部疏水区域带电荷降低蛋白的稳定性。

氢原子与电负性大的原子X以共价键结合，若与电负性大、半径小的原子Y(O F N等)接近，在X与Y之间以氢为媒介，生成X-H…Y形式的一种特殊的分子间或分子内相互作用，称为氢键。氢键是一种重要的相互作用，在化学、物理和生物化学过程中发挥着关键作用。当氢原子只位于电负性最强的原子之间，它与其中一个原子的相互作用通常要强烈得多，这类氢键是普通氢键。低能垒氢键-LBHB是一种特殊类型的氢键：当两个杂原子的pKa紧密匹配，且距离低于

时LBHB可以发生。这允许氢原子在它们之间更均等地共享。在两个杂原子的距离更近(一般低于

)的情况下两个能量最小值之间的势垒足够低，使得形成低势垒或单阱LBHB。LBHB可以发生在蛋白的内部疏水区域和蛋白质表面，其中多个空间相邻的残基共同作用以调节两个LBHB的两个杂原子的pKa值。LBHB在蛋白质结构和酶活性催化中起重要作用，在蛋白质中具有特殊的结构作用。LBHB导致的氢原子共享机制使得两个杂原子之间更容易发生质子转移，从而改变两个杂原子的带电情况。因此，LBHB是重要的蛋白内部电荷调节工具。

本发明创新性的发现了CRSMs可通过泛素-蛋白酶体途径进微管蛋白降解，本发明通过构效关系分析及β-微管蛋白的定点突变，鉴定了CRSMs的吡啶氮与微管蛋白的βGlu198(β-微管蛋白的内部疏水区)之间的单一氢键相互作用是降解作用的关键因素，QM/MM计算显示该氢键是LBHB。而通过在秋水仙碱位点的结合模式与CRSMs相似的两个已知的微管抑制剂Nocdazole和Plinabulin作为比较，发现该两个抑制剂不能促进微管白降解。通过QM/MM计算，我们发现这种氢键仅仅是普通的氢键，而不是LBHB，所以不能引起微管蛋白的电荷分布，不能影响微管蛋白的稳定性，所以不会被降解。而CRSMs与微管蛋白形成LBHB后，会导致CRSMs与βGlu198形成共享质子，从而改变βGlu198的电荷分布，使βGlu198更倾向于带负电而导致蛋白不稳定后降解。因此，本发明验证了CRSMs通过与微管蛋白形成LBHB来促进微管蛋白的降解。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例所用的微管蛋白降解剂CRSMs为(N-(3-苯氧基苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺，其余试剂和设备均为普通市售产品。

实施例1微管蛋白降解剂CRSMs结合到秋水仙碱位点促进微管蛋白降解

采用竞争结合实验的方法。选用对数期生长的Hela铺到已经铺好爬片(盖玻片)的96孔板上，继续培养24小时，待细胞完全贴壁。后加入1μM的秋水仙碱(col)，Pironetin(Pir)，长春碱(Vin)以及美登木素(May)与细胞孵育1个小时后，在加入微管蛋白降解剂继续孵育16个小时后，提取总蛋白，western检测微管蛋白降解情况。结果如图1所示，只观察到秋水仙碱位点的α/β-微管蛋白条带，说明微管蛋白降解剂作用与秋水仙碱位点。Pir、Vin和May作用过的细胞α/β-微管蛋白条带消失，说明微管蛋白降解剂CRSMs能够促进α/β-微管蛋白降解。

实施例2结构生物学实验考察微管蛋白降解剂在秋水仙碱位点的结合模式

蛋白的表达和纯化参照已经报道的文献步骤，RB3-SLD(RB3蛋白质stathmin样结构域)在大肠杆菌中表达，并通过阴离子交换层析纯化，随后在10mM HEPES-NaOH(150mMNaCl,2mM DTT,pH＝7.2)中通过凝胶过滤。纯化后的RB3-SLD蛋白被浓缩至10mg/mL并储存于-80℃冰箱中。His标记的TTL(重组蛋白)也在大肠杆菌中表达后通过Ni²⁺亲和层析柱进行纯化，接着在20mM Bis丙烷缓冲液(200mM NaCl,2.5mM MgCl₂,5mMβ-巯基乙醇，1％甘油，pH＝6.5)中用凝胶进行过滤。最后浓缩至20mg/mL并储存在-80℃冰箱中。RB3和TTL的纯度通过SDS-PAGE检测。购买的猪脑微管蛋白浓度为10mg/mL溶解在GTB缓冲液中，并在-80℃下保存。将微管蛋白(10mg/mL)，TTL(20mg/mL)和RB3(10mg/mL)按2:1.2:1.3(微管蛋白：RB3:TTL)的比列混合在一起。向其中加入1mM AMPPCP(腺苷一磷酸-人前胶原C端肽酶),5mM酪氨酸和10mM DTT,并将所得混合物在4℃浓缩至20mg/mL。后通过坐滴结晶法进行结晶。将1μL蛋白质溶液和1μL含有6％PEG(聚乙二醇)4000,5％甘油，0.1M MES(2-(N-吗啉)乙烷磺酸缓冲液),30mM CaCl₂和30mM MgCl₂,pH＝6.7的溶液混匀于20℃下进行培养。晶体的生长过程通过seeding方法加速。在20℃下温育后出现晶体，3-5天内长度达到200-300mm。取0.1μL体积10mM微管蛋白降解剂CRSMs(溶解在DMSO中)溶液在20℃环境条件下滴入含有晶体的液滴中。浸泡时间在1到24小时之间变化，用可见的方式检查晶体。用冷冻保护剂(8％PEG 4000,30mM MgCl₂,30mM)中的环上CaCl₂.0.1M MES,pH＝6.7和20％甘油)浸过的loop环捞出晶体。然后快速将晶体放入液氮中保存。晶体数据在上海同步辐射中心进行收集，光速线：BL19U1。使用MX225 CCD(电荷耦合器件)检测器，波长为

参考已有文献，使用Xia2软件对数据进行处理。通过分子置换法解析结构，用现有的载脂蛋白结构T2R-TTL(无浸泡配体)(PDB代码：4I55)通过Phaser搜索模型。手动建模后通过使用Coot和Refmac5进行精修。实验结果如图2所示，CRSMs(图2B)在β1和β2两个亚基上都有结合，虽然分子中的咔啉环(图2中的a环)小部分位于α亚基但是却不与其发生相互作用(图2A)。CRSMs更主要是嵌入β亚基深处。咔啉环2位的氮原子与Glu198和Tyr200之间有氢键相互作用，Linker部分的-NH基团与Glu198和Tyr200有氢键相互作用(图2C、D)。b环与Tyr200有较弱的面对面的π-π相互作用，c环与Phe20、Phe167、Met233、Val236形成的疏水中心I有疏水相互作用(图2C)。a环与Leu240、Leu246、Leu250、Leu253、Met257形成的疏水中心II有疏水相互作用(图2C)。结构生物学实验证明，CRSMs靶向微管蛋白的秋水仙碱位点，且更多地是作用于β微管部位。

实施例3免疫荧光实验考察微管蛋白降解剂对微管形态的影响

微管在细胞有丝分裂过程中发挥着重要作用，微管靶向剂能够干扰细胞有丝分裂活动，使有丝分裂被阻滞在某一个特定的时期诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。而诸如紫杉醇这类微管稳定剂会促使微管在有丝分裂过程中聚合，长春新碱和秋水仙碱这类微管去稳定剂会促使微管在有丝分裂过程中解聚，微管在这些微管靶向剂的干扰下产生的形态变化可以通过免疫荧光实验清晰直观的观察到。因此我们考察了微管蛋白降解剂在HeLa细胞上对微管形态变化的影响。

选用对数期生长的HeLa铺到已经铺好爬片(盖玻片)的6孔板上，继续培养24小时，待细胞完全贴壁。后加入不同浓度的微管蛋白降解剂CRSMs继续孵育16h，轻轻去除上清，用37℃预热的PBS洗一次。然后用50％甲醇/50％丙酮溶液固定破膜2min，后PBS洗一次，加入α-tubulin的抗体(溶于3％的BSA溶液)孵育4h，。后用PBS洗三次，每次5min，用荧光二抗和稀释10倍的DAPI共同孵育40min后。PBS洗三次，每次5min。封片。免疫荧光显微镜下观察。

实验结果如图3所示。结果表明，微管蛋白降解剂对微管形态的影响与传统上的微管聚合剂(Taxol)和微管解聚剂(Colchicine)完全不同。10μM的微管蛋白降解剂处理过HeLa细胞16h以后，微管蛋白(绿色)完全消失，在免疫荧光显微镜下只能看到细胞核(蓝色)。通过免疫荧光实验，我们可以直观的看到微管蛋白降解剂既不是促使微管聚合，也不是促使微管解聚，而是直接将微管清除掉了，这说明微管蛋白降解剂能够促进微管蛋白降解。

实施例4蛋白组学实验考察微管蛋白降解剂选择性的下调微管蛋白的表达

选用对数期生长的Hela铺到已经铺好爬片(盖玻片)的6孔板上，继续培养24小时，待细胞完全贴壁。后加入1μM微管蛋白降解剂继续孵育6个小时。提取总蛋白，进行TMT定量标记蛋白组学分析。蛋白组学分析由北京白泰派克生物科技有限公司完成。整理结果如图4所示。蛋白组学分析结果显示微管蛋白降解剂能明显促进Tubulinα1B,α1C,α4A,β,β4B各亚型的降解。且该5个蛋白是下调最为明显的5个蛋白。说明微管蛋白降解剂促进微管蛋白下调具有很高的特异性。

实施例5微管蛋白降解剂降解微管蛋白的浓度时间效应

选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用完全培养基配成浓度为5×10⁵个/mL的细胞悬液接种到96孔板中，每孔2mL，培养过夜后加入不同浓度梯度的候选化合物，处理不同时间。收集细胞，提取总蛋白后进行Western实验考察化合物对α-微管蛋白和β-微管蛋白表达水平的影响。蛋白的降解一般来说与诱导剂的浓度和处理时间呈正相关关系。本实施例继续考察不同浓度(0,0.1,1,10μM)的微管蛋白降解剂处理HeLa,HCT-116,H460和SU-DHL-6细胞24h及相同浓度(1μM)的微管蛋白降解剂处理HeLa和HCT-116细胞不同时间(1,2,4,8,16h)后对微管蛋白降解的影响。

实验结果如图5所示(β-Actin作为内参)。实验结果表明，不同浓度的微管蛋白降解剂处理HeLa,HCT-116,H460和SU-DHL-6细胞24h后，0.1μM的微管蛋白降解剂由于浓度太低，促进微管蛋白降解的效果并不明显，当浓度增加到1μM时，在HeLa和SU-DHL-6细胞上可以非常明显地看到αβ-微管蛋白降解效果。在HCT-116和H460细胞上也可以看到不同程度的微管蛋白降解。且随着浓度的增加，微管蛋白降解的效果更加明显。当用1μM的微管蛋白降解剂处理HeLa和HCT-116细胞后，在4h以后就能观察到微管蛋白有被降解掉的现象，但不是十分明显，8h以后效果就十分明显了，16h以后，微管蛋白几乎被完全降解掉了。综上所述，微管蛋白降解剂可以浓度和时间依赖性地促进微管蛋白降解。

实施例6微管蛋白降解剂通过泛素-蛋白酶体途径促进微管蛋白降解

用泛素抗体对免疫沉淀的α-和β-微管蛋白进行免疫印迹分析表明，α-和β-微管蛋白的泛素化水平明显升高。微管蛋白降解剂可以在细胞内促进α-微管蛋白(图6A)和β-微管蛋白(图6B)的泛素化，且不会影响细胞内泛素蛋白本身的水平(图6C)。因为促进泛素化或蛋白质变性/错误折叠都会导致目标蛋白的降解，此实验证明了微管蛋白降解剂不是通过影响泛素蛋白本身来诱导微管蛋白降解的，但确实是通过泛素化途径来实现的。

自噬-溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径某些情况下存在交联，自噬-溶酶体途径也可能会导致目标蛋白的泛素化。为了进一步验证微管蛋白降解剂是通过哪种途径促进微管蛋白降解的，我们选取泛素-激活酶E1抑制剂PYR-41，溶酶体抑制剂NH₄Cl，蛋白酶体抑制剂MG132作为交叉相互对照，进行免疫印迹分析和免疫荧光实验。实验结果如图7所示。

在不加入任何抑制剂，仅有微管蛋白降解剂(10μM)存在的情况下，微管蛋白降解剂明显下调αβ-微管蛋白的水平。NH₄Cl是一个溶酶体抑制剂，如果加入NH₄Cl以后，微管蛋白降解剂不能促进αβ-微管蛋白降解了，说明αβ-微管蛋白的降解需要溶酶体的参与。但是结果表明，只有在加入蛋白酶体抑制剂MG132和泛素-激活酶E1抑制剂PYR-41以后αβ-微管蛋白才不再降解(图7A)，说明微管蛋白降解剂诱导的微管蛋白降解依赖泛素激活酶和蛋白酶体，不依赖溶酶体，进一步证明了微管蛋白降解剂是通过泛素-蛋白酶体途径诱导微管蛋白降解的。从免疫荧光实验中我们可以更加直观的看到，在不加任何抑制剂的情况下，微管蛋白降解剂能够彻底的清除微管蛋白(图7B)，当加入蛋白酶体抑制剂MG132和泛素-激活酶E1抑制剂PYR-41以后，微管蛋白向细胞核聚集使微管蛋白降解剂不能清除掉微管蛋白(图7B)。综上，微管蛋白降解剂能够通过泛素-蛋白酶体途径诱导微管蛋白降解。

实施例7氨基酸点突变实验考察促进微管蛋白降解的关键基团

CRSMs与微管蛋白的晶体复合物表明咔啉环2位上的氮原子与Glu198之间形成的H键非常重要，是导致微管蛋白降解的关键因素。为了进一步证实这个观点，我们将Glu198和Tyr200进行了突变，分别将198位的谷氨酸突变成甘氨酸(E198G)、天冬酰胺(E198N)、天冬氨酸(E198D)，将200位的酪氨酸突变成苯丙氨酸(Y200F)，并对CRSMs诱导的微管蛋白降解进行了考察。实验方法如下：将Flag标签融合到TUBB(β-tubulin)、TUBB(Y200F)和TUBB(E198G)基因的C端，并在末端添加PacI和BamHI限制性位点。全序列由Genwie(苏州，中国)合成，并克隆到MSCV-IRES-GFP表达的载体中。利用Q5位点突变试剂盒(NEB#E0554S)对TUBB(E198N和E198D)进行点突变。用于点突变的特异引物如下所示：

SEQ ID NO:1突变引物的核苷酸序列TUBB(E198N)：

agagaatactgatcagacctattgcattg。

SEQ ID NO:2反向引物的核苷酸序列TUBB(E198N)：

accaactgatggacggagagg。

SEQ ID NO:3突变引物的核苷酸序列TUBB(E198D)：

agagaatactgatgacacctattgcattg。

SEQ ID NO:4反向引物的核苷酸序列TUBB(E198D)：

accaactgatggacggagagg。

在用脂质体2000试剂转染HeLa细胞之前，先将HeLa细胞接种于96孔板上，培养24h。将含2.0μg质粒DNA的约250μL OptiMEM培养基和含7.5μL脂质体2000试剂的250μLOptiMEM制备好，分别孵育5min，混合后再孵育20min。然后将该混合物加入HeLa细胞，培养24h后加入药物16h。用标志抗体和GFP抗体提取总蛋白，Westernblot分析，以GAPDH作为负载对照。

实验结果如图8所示，将200位的酪氨酸突变成苯丙氨酸以后，CRSMs仍然能够促进微管蛋白降解，但是将198位的谷氨酸突变成甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸以后，CRSMs就不能导致微管蛋白降解了，说明咔啉环2位上的N原子与Glu198之间形成的H键是促进微管蛋白降解的关键因素。

实施例8与CRSMs具有相同结合模式的小分子不能促进微管白降解

目前秋水仙碱位点的抑制剂已有大量报道，例如CA-4、CA-4P、ABT-751、MPC-6827等，但和CRSMs具有相近的结合模式且同样与Glu198形成了H键的小分子并不多，仅有Nocodazole和Plinabulin这两个小分子(图9A)。然而截至目前，并没有Nocodazole和Plinabulin能够诱导微管蛋白降解的报道。于是，我们考察了Nocodazole和Plinabulin对促进微管蛋白降解的影响，并与CRSMs进行了竞争性实验考察。实验结果如图9所示，Nocodazole和Plinabulin不能诱导微管蛋白降解，且高浓度下(3μM)能够抑制CRSMs诱导的微管蛋白降解(图9B)，说明并不是只要能与微管蛋白Glu198形成氢键的小分子都能够促进微管蛋白降解。

实施例9 QM/MM计算CRSMs与微管蛋白之间的氢键是低势垒氢键

Nocodazole、Plinabulin和本申请中的CRSMs结构差异非常大，在秋水仙碱位点具有极其相似的结合模式，且都与微管蛋白Glu198形成了氢键，但只有CRSMs能够促进微管蛋白降解。结合量子力学和分子力学(QM/MM)方法，解决蛋白质活性中心发生的键形成和过程，是解释小分子与蛋白相互作用的有力工具之一。我们采用如下方法对以上三者与微管蛋白Glu198之间的氢键进行计算。

首先，用n-层集成分子轨道分子力学方法对所有配合物进行几何优化。在程序集中实现了一种二层法，用于几何优化和随后的电子势能扫描计算。详情可在其他地方查阅。基本上，该系统的总能量可描述为以下三个项：

E^ONIOM＝E^High，model+E^Low，real-E^Low，model， (I)

其中High和Low表示计算方法的级别。real指整个系统是采用低水平的方法计算的。model包含需要使用高和低水平处理的部分。为了包括溶剂效应，整个系统随后被放入一个预平衡过的矩形水箱中进行溶剂化，计算出最终系统的原子总数约为26000个。采用带交换相关函数的密度泛函理论进行几何优化。在几何优化过程中，采用了6-311G(d,p)的标准基集，一个普适力场(UFF)被应用于所有属于低层的原子，包括蛋白质、环境和水分子。对于CRSMs-tubulin(PDB:6IKQ),Plinabulin-tubulin(PDB:5C8Y)和Nocodazole-tubulin(PDB:5CA1)晶体复合物，其模型包括Glu198在内的质子化的中性电荷侧链和Tyr200。LBHB相互作用反应坐标可定义为氢键给体原子与氢原子之间的距离，范围为

氢核沿反应坐标的迁移，得到一系列弛豫一维势能曲线。所有的非标准计算采用B3LYP/6-31+G(d,p)水平的原理。为了更准确地描述氢键，在所有计算中都采用了带有原近似阻尼函数的近似色散的色散校正策略。计算结果如图10所示，Nocodazole和Plinabulin与微管蛋白Glu198之间的氢键是常规的氢键，不影响微管蛋白的电荷分布，不能促进微管蛋白降解。CRSMs与微管蛋白Glu198之间的氢键是典型的均衡/双极小/无势垒特征的LBHB，CRSMs会带上部分正电荷，Glu198会带上部分负电荷，带上部分负电荷的微管蛋白会破坏微管蛋白原有折叠状态的稳定性，不稳定的微管蛋白被细胞内的泛素蛋白标记，进而被降解。

实施例10微管蛋白降解剂具有较好的抗体外抗肿瘤活性

选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用完全培养基配成浓度为5×10³个/mL的细胞悬液接种到96孔板中，每孔200μL，培养过夜后加入不同浓度梯度的候选化合物，处理72h，小心其取上清，每孔加入200μL新鲜配置的含有0.2mg/mL的MTT无血清培养基继续培养4h，小心弃去上清，并加入200mL DMSO，待完全溶解后酶标仪检测570nm处的吸光度值。重复三次取平均值。并用软件计算IC₅₀值。如表1所示，微管蛋白降解剂在20多种人源肿瘤细胞中IC₅₀在0.032-0.13μM之间，其活性优于紫杉醇和秋水仙碱。表明微管蛋白降解剂具有很好的体外抗肿瘤活性。

表1微管蛋白降解剂的体外肿瘤活性

实施例11微管蛋白降解剂在耐药细胞株上具有较好的抗肿瘤活性

采用MTT法比较了微管蛋白降解剂对敏感株和4种耐药细胞株在不同时间点(24、48、72h)的生长抑制活性，其中在48小时的结果如表2所示，微管蛋白降解剂对卵巢癌A2780S、A2780/T细胞的IC₅₀值分别为0.045±0.006、0.36±0.009，其耐药因子仅为8.0，而三种常用的抗肿瘤药物紫杉醇、长春新碱和秋水仙碱的耐药因子分别为102、147和71，同样微管蛋白降解剂对HCT-8/T的耐药因子为1.45，而紫杉醇、长春新碱和秋水仙碱的耐药因子分别为110、140和147。同样的的结果在HCT-8/V耐紫杉醇的结肠癌细胞株，A549耐顺铂的乳腺癌细胞株上观察到，显示微管蛋白降解剂具有良好的抗耐药作用。

表2微管蛋白降解剂在耐药肿瘤细胞株上的抗肿瘤活性

实施例12微管蛋白降解剂在H460和HCT116模型上具有较好的体内抗肿瘤活性

SPF级Balbc雌性裸鼠，鼠龄6-8周，体重20g，建立肺癌H460，结肠癌HCT116细胞株荷瘤小鼠模型考察其抗肿瘤效果，以上肿瘤细胞系经传代培养后，收集生长状态良好的细胞，无血清培养基洗涤1次，计数，无血清培养基调整细胞浓度，将计数的肿瘤细胞接种于裸鼠右侧后肢皮下，当肿瘤体积达到一定体积时，随机分组。经尾静脉给予不同剂量优化新化合物，每两天一次并测量肿瘤体积，制作肿瘤生长曲线，连续给药后处死小鼠，肿瘤称重，统计，抑瘤率＝(未治疗组小鼠肿瘤体积-治疗组小鼠肿瘤体积)/未治疗组小鼠肿瘤体积×100％。实验结果见图11。结果表明CRSMs具有较好的体内抗肿瘤活性。

综上可知，本发明提供了一种可以直接作用于微管蛋白并将其降解的化合物，能够通过结合到秋水仙碱位点，启动泛素-蛋白酶体途径进而对微管蛋白进行降解，从而能够用于制备预防或治疗肿瘤的药物。本发明为肿瘤药物提供了一种新的选择，具有很好的应用前景。

序列表

<110> 四川大学

<120> 微管蛋白降解剂CRSMs及其用途

<130> A200164K（序）

<141> 2020-03-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagaatact gatcagacct attgcattg 29

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accaactgat ggacggagag g 21

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagaatact gatgacacct attgcattg 29

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Claims (5)

1.微管蛋白降解剂CRSMs在制备降解微管蛋白药物中的用途，其特征在于：所述微管蛋白降解剂CRSMs分子结构为

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述微管蛋白降解剂CRSMs为能与微管蛋白中特定的可电离氨基酸残基形成低能垒氢键进而引起蛋白内部电荷重新分布的小分子物质。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的微管蛋白降解剂CRSMs使用剂量为≥1μM。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述降解微管蛋白通过泛素-蛋白酶体途径进行。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的微管蛋白降解剂CRSMs结合位点为秋水仙碱位点。

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