CN113461563A - Nqo1激活型6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸前药及其制备方法和应用 - Google Patents

Nqo1激活型6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸前药及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NQO1激活型6‑重氮基‑5‑氧代‑L‑正亮氨酸前药及其制备方法和应用。由于多数肿瘤细胞中均高表达NQO1，引入NQO1激活的醌酸基团可以实现对肿瘤靶向作用，能够在肿瘤细胞中高效、快速释放DON前药，达到抑制肿瘤增殖的目的。该前药对NQO1显示出高度的亲和性，可以在NQO1高度表达的肿瘤细胞中快速、高效的定向释放出谷氨酰胺代谢拮抗剂DON，进而降低该药物的毒副作用并提高对肿瘤治疗的靶向效率，为抗肿瘤药物的开发提供了新思路。

Description

NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药及其制备方法和应用。
背景技术
前药方法是改善潜在药物分子的物理化学、生物药剂学和药代动力学性质的成熟策略。约5-7％的全球批准的药物是前药。近年来，以苯醌、吲哚醌为载体的NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H:Quinone Oxido reductase,NQO1)激活型前药以其良好的选择性和高效的抗癌活性引起人们的广泛关注，在肿瘤治疗领域显示出广阔的应用前景。NQO1激活型前药由触发基团、中间连接链和药效基团构成。触发基团决定着药物与酶的亲和性，其结构中的醌可被NQO1催化还原成酚的结构，继而引发一系列分解反应，释放出活性药物；中间连接链由可自我分解的结构片段构成，其决定药物的稳定性和释放度；药效基团为活性药物，决定着药物的抗癌活性。由于NQO1在肿瘤细胞的高表达的特性，基于该策略设计的药物被认为是治疗多种肿瘤的潜在分子靶标。靶向NQO1药物有望实现高选择性、特异性杀灭肿瘤细胞。
谷氨酰胺酵解是恶性肿瘤启动代谢重编程过程的重要途径。靶向谷氨酰胺代谢通路的关键限速酶谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS1)进行抗肿瘤研发已成为研究热点。6-重氮基5-氧代-L-正亮氨酸(DON)作为GLS1的底物竞争性抑制剂，在临床上表现出优良的抗肿瘤活性，但由于DON存在严重的胃肠道副作用，限制了其在临床上的进一步应用。临床数据显示：DON在体内的生物分布不均匀，会造成严重的胃肠道毒副作用，从而使临床使用受到限制。为了避免DON的毒性，本发明设计合成了NQO1激活型DON前药以解决DON毒副作用，为其成为高效靶向谷氨酰胺代谢药物提供了可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
如式I所示的NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药、其药学上可接受的盐或酯，
Figure BDA0003181920810000021
其中：R1选自氢、甲基、乙基、异丙基、环己基、环戊基、苯甲基、苯乙基、苯丙基；
R2选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基、卤素；
R3选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基、卤素；
R4选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基、卤素；
R5选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、卤素；
R6选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、卤素。
进一步地，如式I所示的NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药为如下任一化合物：
Figure BDA0003181920810000022
Figure BDA0003181920810000031
Figure BDA0003181920810000041
如式I所示的NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药的合成方法，如下式所示：
Figure BDA0003181920810000051
其中：R1选自氢、甲基、乙基、异丙基、环己基、环戊基、苯甲基、苯乙基或苯丙基；
R2选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R3选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R4选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R5选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃或卤素；
R6选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃或卤素。
具体地：采用对苯二酚和3,3-二甲基丙烯酸甲酯为原料，经过两步反应得到相应的醌丙酸分子，然后经过缩合反应得到相应的前药化合物。
本发明所述的NQO1激活型DON类前药可应用于抑制细胞增殖紊乱和各类抗癌细胞活性，以及免疫代谢相关疾病。癌症主要包括前列腺癌、肝癌、淋巴癌、骨癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、白血病。
附图说明
图1为本发明的NQO1激活前药的释放机制。
图2为前药LJR-205对DU145细胞凋亡结果。
图3为前药LJR-205对前列腺癌细胞DU145的细胞克隆实验结果。
图4为前药LJR-205在DU145细胞内的释放结果。
图5为前药LJR-205对DU145和H596细胞的凋亡结果对比。
图6为前药LJR-205诱导DU145细胞内ROS升高结果。
图7为前药LJR-205对DU145细胞中凋亡蛋白的影响
图8为前药LJR-205在NQO1酶作用下释放随时间变化的液相图(A)、前药LJR-205在NQO1酶作用下随时间变化的DON释放率(B)、前药LJR-205在NQO1酶作用下释放的质谱图(C)。
图9为前药LJR-205在肿瘤细胞DU145中DON的释放随时间变化(A)、前药LJR-205在人血浆中的含量随时间变化(B)、肿瘤细胞和血浆中DON和LJR-205的含量比较(C)。
图10为前药LJR-205对DU145细胞内的氨基酸含量的影响。
图11为前药LJR-205体内抗肿瘤活性实验结果：A)每组裸鼠瘤重的变化；B)每组裸鼠肿瘤体积的变化；C)每组裸鼠体重的变化；D)各组裸鼠肿瘤图像。
具体实施方式
6-重氮基5-氧代-L-正亮氨酸(DON)是1953年从链霉菌中分离出来的一种抗生素。DON是L-谷氨酰胺的重氮类似物，其干扰核酸和蛋白质合成中的多种反应，其中L-谷氨酰胺提供氮，封闭多种识别谷氨酰胺的酶，例如谷氨酰胺酶，调节脑谷氨酸水平，并参与能量代谢等等。改善包括前列腺癌治疗在内的各种治疗方案的DON治疗指数的一种策略将会增加其肿瘤部位暴露，同时限制其全身暴露并因此具有毒性。前药方法是一种改变药物分子的药代动力学和组织分布的成熟策略，然而综合来说，这种方法对DON具有挑战性。鉴于DON的不稳定重氮基团对其谷氨酰胺拮抗活性至关重要，因此NQO1靶向性基团部分的添加必须在温和条件下进行以保护重氮酮基团。
本发明的前药采用下式所示合成路线合成得到：
Figure BDA0003181920810000061
其中：R1选自氢、甲基、乙基、异丙基、环己基、环戊基、苯甲基、苯乙基或苯丙基；
R2选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R3选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R4选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R5选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃或卤素；
R6选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃或卤素。
具体地：采用对苯二酚和3,3-二甲基丙烯酸甲酯为原料，经过两步反应得到相应的醌丙酸分子，然后经过缩合反应得到相应的前药化合物。
本发明提供的谷氨酰胺拮抗剂的前药是通过掩蔽氨酸酯官能团并在氨基出引入NQO1靶向性醌丙酸基团来改变DON的药代动力学而制备的，其提供了较慢的释放动力学和细胞靶向以增强耐受性。此外，在一些实施方案中，本发明提供的前药选择性地将活性谷氨酰胺拮抗剂靶向特定的细胞或提供DON的较慢释放，从而降低药物分子的毒性。如图1所示。
本发明的内容表明，通过设计NQO1靶向性前药增强了DON分子的稳定性和安全性。本发明提供的前药还呈现出与游离DON相当的稳定性。
在下述实施例中，部分中间体的合成如下：
(R)-5-氧吡咯烷-2-羧酸环己酯(2c)
将1a(1.00g,7.74mmol),环己醇(0.93g,9.29mmol)，DCM(20mL)加入到100mL的单颈瓶中常温(24℃)搅拌10分钟，之后加入EDCI(1.78g,9.29mmol)和DMAP(0.10g,0.77mmol),常温(24℃)搅拌3个小时，减压蒸除溶剂，加入100mL的饱和NaHCO3,用EA萃取三次，合并有机层，有机层再用水洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂得到白色固体2c(1.34g)，收率为82％。无需纯化直接进行下一步。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝6.28(s,1H),4.91-4.85(m,1H),4.30-4.25(m,1H),2.57-2.39(m,3H),2.33-2.23(m,1H),1.91-1.89(m,3H),1.79-1.77(m,2H),1.77-1.31(m,6H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcdfor C11H18NO3 +,212.1281；found.212.1263
(R)-5-氧吡咯烷-2-羧酸3-苯丙酯(2d)
将1a(1g,7.74mmol),苯丙醇(1.26g,9.29mmol)，DCM(20mL)加入到100mL的单颈瓶中常温(26℃)搅拌10分钟，之后加入EDCI(1.78g,9.29mmol)和DMAP(0.1g,0.77mmol),常温(26℃)搅拌4个小时，减压蒸除溶剂，加入100mL的饱和NaHCO3,用EA萃取三次，合并有机层，有机层再用水洗两次，有机层用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂得到白色固体2d(1.39g)，收率为73％。无需纯化直接进行下一步。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd forC14H18NO3 +,248.1281；found.248.1273
1-((9H-芴基-9-基)甲基)-2-环己基(R)-5-氧吡咯烷-1,2-二羧酸酯(3c)
将2c(3.00g,14.21mmol)溶于无水THF(30mL)并冷却至-78℃。缓慢滴加LiHMDS(1MTHF,13.50mmol)，在该温度下搅拌20分钟。之后将Fmoc-Cl(4.77g,18.47mmol)溶解在无水THF(40mL)中，缓慢滴加至反应液中。反应体系在-78℃下搅拌2小时。反应完全之后加入预冷的饱和氯化铵溶液淬灭，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝3:1)分离纯化得到白色的固体3c(5.32g)，收率为82.3％。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+calcd for C26H27NNaO5 +,456.1781；found.456.1772
1-((9H-芴基-9-基)甲基)-2-苯丙基(R)-5-氧吡咯烷-1,2-二羧酸酯(3d)
将2d(3.51g,14.21mmol)溶于无水THF(30mL)并冷却至-78℃。缓慢滴加LiHMDS(1MTHF,13.50mmol)，在该温度下搅拌20分钟。之后将Fmoc-Cl(4.77g,18.47mmol)溶解在无水THF(40mL)中，缓慢滴加至反应液中。反应液在-78℃下搅拌2小时。反应完全之后加入预冷的饱和氯化铵溶液淬灭，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝3:1)分离纯化得到白色的固体3d(5.23g)，收率为78.5％。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+calcd for C29H27NNaO5 +,492.1781；found.492.1773
(S)-2-((((9H-芴基-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-重氮-5-氧代己酸环己酯(4c)
将三甲基甲硅烷基重氮甲烷(2M的乙醚溶液,3.2mL,6.34mmol)加到无水THF(30mL)中,冷却至-110℃,逐滴加入正丁基锂(2.5M的己烷溶液，2.6mL，6.49mmol),并将溶液在-110℃搅拌3分钟。将3c(2.2g，5.28mmol)在无水THF(10mL)中溶解,缓慢滴加至反应液中,温度不超过-110℃，反应完全后用饱和氯化铵溶液(50mL)淬灭，用EA(3×50mL)萃取水相。合并的有机层并用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝7:3)分离纯化得到淡黄色的固体4c(0.48g),收率为21％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ＝7.97-7.95(m,2H),7.83-7.76(m,2H),7.51-7.46(m,2H),7.42-7.37(m,2H),4.74(s,1H),4.39-4.29(m,3H),4.13-4.01(m,1H),2.91(s,1H),2.47(s,1H),2.10-2.01(m,1H),1.91-1.69(m,5H),1.46-1.21(m,7H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+calcd for C27H29N3NaO5 +,475.2107；found.475.2111
(S)-2–((((9H-芴基-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-重氮-5-氧代己酸苯丙酯(4d)
将三甲基甲硅烷基重氮甲烷(2M的乙醚溶液,3.2mL,6.34mmol)溶液加到无水THF(30mL)中,冷却至-110℃,逐滴加入正丁基锂(2.5M的己烷溶液，2.6mL，6.49mmol),并将溶液在-110℃搅拌3分钟。将3c(2.37g，5.28mmol)在无水THF(10mL)中溶解,缓慢滴加至反应液中,温度不超过-110℃，当反应完全后用饱和氯化铵溶液(50mL)淬灭，用EA(3×50mL)萃取水相。合并的有机层并用无水Na2SO4干燥。减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝7:3)分离纯化得到淡黄色的固体4d(0.46g)，收率为18％。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+calcd for C30H29N3NaO5 +,534.1999；found.534.1983
(S)-2-氨基-6-重氮-5-氧代己酸环己酯(5c)
将化合物4c(3.57g，7.9mmol)溶解在无水DCM(25mL)中。加入哌啶(1.67g,19.76mmol)，并将反应液在室温(27℃)下搅拌4个小时。减压蒸除溶剂。柱层析(DCM/MeOH＝30:1)分离纯化得到黄色油状物5c(1.32g)，收率为66％。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd forC13H20N3O3 +,254.1499；found.254.1481
(S)-2-氨基-6-重氮-5-氧代己酸苯丙酯(5d)
将化合物4d(4.04g，7.9mmol)溶解在无水DCM(30mL)中。加入哌啶(1.67g,19.76mmol)，并将反应混合物在室温(25℃)下搅拌4个小时。减压蒸除溶剂。柱层析(DCM/MeOH＝30:1)分离纯化得到黄色油状物5d(1.16g)，收率为51％。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C15H20N3O3 +,290.1499；found.290.1484
6-羟基-4,4,5,7,8-五甲基苯并吡喃-2-酮(2e)
将1e(2.00g，13.1mmol)与3-甲基丁酯-2-烯酸(1.5g，15.0mmol)加入到甲磺酸(20mL)中。在氮气保护下，将反应液升温至85℃搅拌3个小时，然后冷却至室温(25℃)。向反应液中加入100mL冰水。EA(3×100mL)萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3(3×40mL)和水(3×40mL)依次进行洗涤，并用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，得到黄色固体。己烷和乙酸乙酯(2:1,v/v)重结晶得到白色固体2e(2.55g)，收率为83％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝4.71(s,1H),2.60(s,2H),2.41(s,3H),2.27(s,3H),2.23(s,3H),1.50(s,6H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C14H19O3 +,235.1329；found.235.1317
6-羟基-4,4,7,8-四甲基苯并吡喃-2-酮(2f)
将2e(1.81g，13.1mmol)与3-甲基丁酯-2-烯酸(1.5g，15.0mmol)加入到甲磺酸(30mL)中。在氮气保护下，将反应液升温至95℃搅拌4个小时，然后冷却至室温。向反应液中加入100mL冰水。EA(3×100mL)萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3(3×50mL)和水(3×50mL)依次进行洗涤，并用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂得到的棕色油状物。正庚烷和乙酸乙酯(3:1,v/v)重结晶得到棕色固体2f(2.08g)，收率为72％。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcdfor C13H17O3 +,221.1172；found.221.1165
6-羟基-4,4,5,7-四甲基苯并吡喃-2-酮(2g)
将2e(1.81g，13.1mmol)与3-甲基丁酯-2-烯酸(1.5g，15.0mmol)加入到甲磺酸(30mL)中。在氮气保护下，将反应物升温至90℃搅拌5个小时，然后冷却至室温。向反应液中加入100mL冰水。EA(3×100mL)萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3(3×50mL)和水(3×50mL)依次进行洗涤，并用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂得到的棕色油状物。用正庚烷和乙酸乙酯(3:1,v/v)进行重结晶，得到淡粉色固体2g(1.67g)，收率为58％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ＝8.13(s,1H),6.66(s,1H),2.60(s,2H),2.28(s,3H),2.13(s,3H),1.34(s,6H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C13H17O3 +,221.1172；found.221.1162
3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)丁酸(3e)
将2e(2.5g，10.9mmol)溶解在乙腈(25mL)和水(5mL)的混合物中，之后添加N-溴琥珀酰亚胺(2.0g，11.5mmol)。常温(26℃)反应1个小时后，将有机溶剂减压蒸除，并将剩余溶液用DCM(3×30mL)萃取。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂得到黄色固体产物3e(1.54g)。收率为58％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝3.07(s,2H),2.19(s,3H),2.00(s,3H),1.97(s,3H),1.48(s,6H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]-calcd for C14H18O4 +,250.1205；found.250.1198
3-(4,5-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)-3-甲基丁酸(3f)
将2e(2.39g，10.9mmol)溶解在乙腈(25mL)和水(10mL)的混合物中，之后添加N-溴琥珀酰亚胺(2.0g，11.5mmol)。常温(27℃)反应2个小时后，将有机溶剂减压蒸除，并将剩余溶液用DCM(3×30mL)萃取。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂得到棕色固体3f(1.07g)，收率为42％。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C13H16O4 +,236.1049；found.236.1033
3-(2,4-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)-3-甲基丁酸(3g)
将2e(2.39g，10.9mmol)溶解在乙腈(25mL)和水(10mL)的混合物中，之后添加N-溴琥珀酰亚胺(2.0g，11.5mmol)。常温(28℃)反应2个小时后，将有机溶剂减压蒸除，并将剩余溶液用DCM(3×30mL)萃取。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，抽滤，减压蒸除溶剂得到金黄色固体3g(1.17g)，收率为46％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝6.50(s,1H),3.09(s,2H),2.22(s,3H),2.04(s,3H),1.48(s,6H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C13H16O4 +,236.1049；found.236.1037
3-(4-溴-2,5-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)-3-甲基丁酸(3h)
将2g(2.5g，10.9mmol)溶解在乙腈(25mL)和水(5mL)的混合物中，之后添加液溴(1.8g，11.5mmol)。常温(26℃)反应4个小时后，将有机溶剂减压蒸除，并将剩余溶液用DCM(3×30mL)萃取。合并的有机层用无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离纯化(PE:EA＝3:1)得到棕色固体产物3h(0.82g)。收率为23％。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd forC13H15BrO4 +,314.0154；found.314.0138
实施例1
化合物(S)-6-重氮-2-(3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)丁酰胺基)-5-氧代己酸乙酯(LJR-201)的合成
将化合物3e(1g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入HATU(1.78g,4.69mmol)，DIPEA(1.83g，14.08mmol)，常温(26℃)搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5a(0.80g,4.0mmol)，常温搅拌4小时之后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝3:1)分离纯化得到淡黄色固体LRJ-201(1.07g)。收率62％。mp＝107-109℃.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝6.28(d,1H,J＝6.0Hz),5.30-5.26(m,1H),4.47-4.40(m,1H),4.18-4.11(m,2H),2.83(s,2H),2.36-2.33(m,2H),2.11(s,3H),1.95(d,6H,J＝6.0Hz),1.42(s,6H),1.26(t,3H,J＝6.0Hz)ppm.13C NMR(75MHz,CDCl3):δ＝193.74,191.11,187.56,171.90,171.68,153.05,143.42,137.99,137.88,125.23,69.2,66.2,61.62,51.59,48.96,38.28,36.49,28.92,28.80,14.11,12.70,12.13ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C22H30N3O6 +,432.2129；found.432.2177.
实施例2
化合物(S)-6-重氮-2-(3-(4,5-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)-3-甲基丁酰胺基)-5-氧代己酸乙酯(LJR-202)的合成
将化合物3f(0.94g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入HATU(1.78g,4.69mmol)，DIPEA(1.83g，14.08mmol)，常温(26℃)搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5a(0.80g,4.0mmol)，常温(26℃)搅拌4小时后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝1:1)分离纯化得到黄色固体LJR-202(0.85g)，收率51％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ＝6.48(s,1H),6.23(d,1H,J＝9.0Hz),5.24(s,1H),4.44-4.37(m,1H),4.17-4.10(m,2H),2.86-2.73(m,2H),2.36-2.31(m,2H),2.13(s,1H),2.04-1.98(m,7H),1.61(s,6H),1.32-1.24(m,3H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcdfor C21H28N3O6 +,418.1973；found.418.1965.
实施例3
化合物(S)-2-(3-(5-溴-2,4-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)-3-甲基丁酰胺基)-6-重氮-5-氧代己酸乙酯(LJR-203)的合成
将化合物3g(1.25g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入EDCI(0.89g,4.69mmol)，HOBT(0.62g，4.69mmol)，常温(26℃)搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5a(0.80g,4.0mmol)，常温(26℃)搅拌3小时后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝3:1)分离纯化得到棕色固体LJR-203(0.66g)，收率为33％。mp＝115-117℃.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝6.27(d,1H,J＝9.0Hz),5.31(d,1H,J＝6.0Hz),4.49-4.42(m,1H),4.19-4.12(m,2H),3.14-3.09(m,1H),2.80(s,1H),2.70-2.65(m,1H),2.37-2.34(m,2H),2.16(s,6H),2.04-1.94(m,2H),1.44(d,6H,J＝9.0Hz),1.27-1.25(m,3H)ppm.13C NMR(75MHz,CDCl3):δ＝193.95,184.70,182.46,171.72,171.68,153.86,143.74,138.09,137.03,136.52,61.66,55.18,51.66,49.01,38.82,36.6,28.90,27.10,16.68,14.44,14.11ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd forC21H27BrN3O6 +,496.1078；found.496.1077.
实施例4
化合物(S)-6-重氮-2-(3-(2,4-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)-3-甲基丁酰胺基)-5-氧代己酸乙酯(LJR-204)的合成
将化合物3g(0.94g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入EDCI(0.89g,4.69mmol)，DMAP(0.05g，0.4mmol)，常温(26℃)搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5a(0.80g,4.0mmol)，常温搅拌3小时之后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝1:1)分离纯化得到黄色固体LJR-204(0.64g)，收率为38％。mp＝108-109℃.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝6.31(d,1H,J＝9.0Hz),5.36(s,1H),4.54-4.47(m,1H),4.24-4.17(m,2H),3.19-3.14(m,1H),2.85(s,2H),2.75-2.70(m,1H),2.45-2.39(m,2H),2.21-2.15(m,7H),2.09-2.02(m,1H),1.49(d,6H,J＝9.0Hz),1.33-1.27(m,3H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C21H28N3O6 +,418.1973；found.418.1965.
实施例5
化合物(S)-6-重氮-2-(3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)丁酰胺基)-5-氧代己酸异丙酯(LJR-205)的合成
将化合物3e(1g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入HATU(1.78g,4.69mmol)，DIPEA(1.83g，14.08mmol)，常温搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5b(0.85g,4.0mmol)，常温(26℃)搅拌4小时之后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝1:1)分离纯化得到淡黄色固体LRJ-205(1.01g)，收率57％。mp＝110-112℃.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝6.23(d,1H,J＝6.0Hz),5.25(s,1H),5.05-4.93(m,1H),4.44-4.37(m,1H),2.96-2.78(m,2H),2.35-2.31(m,2H),2.11(s,3H),1.95(d,7H,J＝6.0Hz),1.43(d,6H,J＝3.0Hz),1.22(d,3H,J＝6.0Hz),1.22(d,3H,J＝6.0Hz)ppm.13C NMR(75MHz,CDCl3):δ＝194.37,190.63,187.22,172.00,171.59,154.82,144.26,136.66,136.16,68.35,54.42,51.80,47.60,38.13,31.42,28.54,28.47,26.21,22.52,21.84,14.13,13.06,12.11ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+calcd forC23H31N3NaO6 +,468.2111；found.468.2174.
实施例6
化合物(S)-6-重氮-2-(3-(2,4-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)-3-甲基丁酰胺基)-5-氧代己酸异丙酯(LJR-206)的合成
将化合物3g(0.95g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入HATU(1.78g,4.69mmol)，DIPEA(1.83g，14.08mmol)，常温(26℃)搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5b(0.85g,4.0mmol)，常温(26℃)搅拌4小时后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝1:1)分离纯化得到黄色固体LJR-206(0.91g)，收率为53％。mp＝111-112℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ＝8.17(d,1H,J＝9.0Hz),6.55(s,1H),6.01(s,1H),4.80-4.76(m,1H),4.04-3.96(m,1H),2.66-2.62(m,2H),2.29(s,2H),1.98(s,4H),1.85(s,4H),1.29(d,6H,J＝6.0Hz),1.08(d,3H,J＝6.0Hz),1.08(d,3H,J＝6.0Hz)ppm.13C NMR(75MHz,CDCl3):δ＝194.43,189.96,188.27,171.81,171.21,152.05,143.47,139.16,135.19,128.18,125.23,69.44,66.28,51.66,49.19,38.65,29.30,29.04,21.69,15.62,14.37,12.11ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcd for C22H30N3O6 +,432.2129；found.432.2214.
实施例7
化合物(S)-6-重氮-2-(3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)丁酰胺基)-5-氧代己酸环己酯(LJR-207)的合成
将化合物3e(1g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入EDCI(0.89g,4.69mmol)，DMAP(0.05g，0.4mmol)，常温(26℃)搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5c(1.01g,4.0mmol)，常温(26℃)搅拌4小时后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝1:1)分离纯化得到淡黄色固体LJR-207(0.89g)，收率为46％。mp＝122-124℃.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝4.83-4.75(m,1H),4.51-4.45(m,1H),2.85(s,6H),2.48-2.31(m,2H),2.16(s,3H),2.01-2.00(m,6H),1.87-1.84(m,2H),1.75-1.70(m,5H),1.48(s,3H),1.47(s,3H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+H]+calcdfor C26H35N3O6 +,486.2599；found.486.2694.
实施例8
化合物(S)-6-重氮-2-(3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)丁酰胺基)-5-氧己酸苯丙酯(LJR-208)的合成
将化合物3e(1g，3.99mmol)溶解在DCM中，加入EDCI(0.89g,4.69mmol)，HOBT(0.62g，4.69mmol)，常温(26℃)搅拌0.5小时，之后缓慢加入化合物5d(1.16g,4.0mmol)，常温搅拌4小时之后，减压蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝1:1)分离纯化得到淡黄色固体LJR-208(0.73g)，收率为35％。mp＝125-127℃.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ＝7.24-7.19(m,5H),4.53-4.50(m,1H),4.07-4.03(m,2H)，3.77-3.73(m,2H),2.40-2.38(m,2H),2.34(s,9H),2.23-2.10(m,4H),1.95-1.91(m,2H),1.24(s,6H)ppm.HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+calcd forC29H35N3NaO6 +,544.2524；found.544.2500.
试验例1
体外增殖抑制实验：
MTT实验原理：MTT是一种黄色的噻唑兰，可以穿透细胞膜，与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作用生成紫色的针状Formazan沉积在细胞中，紫色的结晶可以被二甲亚砜(DMSO)溶解，而死细胞则没有此功能，用酶标仪在570nm波长处测其吸光值(OD)。可间接的反映活细胞数，OD值越大说明活细胞数越多。
MTT实验步骤：
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将LNCaP、22RV1、DU145细胞培养至对数生长期，用含10％FBS的F12K培养基将PC3细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种3000个细胞到96孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将药物用DMSO配成104母液，再用相应的培养基进行稀释成一系列浓度，100μM，33.33μM，11.11μM，3.70μM，1.23μM，0.41μM。并设置阴性孔和空白孔。在37℃，5％CO2环境下培养72小时。
(3)显色：每个孔加20μL的MTT(0.5mg/mL)在37℃下孵育4个小时，有蓝紫色甲瓒形成，之后将培养基弃去，每个孔加150μL的DMSO溶解甲瓒，之后用酶标仪在570nm处检测每个孔的OD值，用根据公式计算得到每个孔的抑制率，用grahpad8.0处理得到每个化合物的IC50(抑制率％＝1-(样品孔OD-空白孔OD)/(阴性孔OD-空白孔OD))
化合物的IC50:1-10μM＝***；10-50μM＝**；50-100μM＝*；JHU083为文献中报道的氨基酸酯类前药。
表1 NQO1激活的谷氨酰胺酶抑制剂前药的细胞增殖抑制活性
Figure BDA0003181920810000141
Figure BDA0003181920810000151
a：指三次平行重复实验
从MTT的测试结果可以看出，NQO1激活的前药化合物对四种前列腺细胞均有抑制活性。其中LJR-205对四种前列腺癌细胞的抑制活性最好。
进一步挑选人源支气管上皮细胞16HBE考察化合物LJR201～LJR208的体外安全性。测试结果如下表2所示：化合物的IC50:1-10μM＝***；10-50μM＝**；50-100μM＝*；JHU083为文献中报道的氨基酸酯类前药。
表2 NQO1激活的谷氨酰胺酶抑制剂前药对正常细胞的毒性
Figure BDA0003181920810000161
a：指三次平行重复实验
从测定的结果可以看出NQO1激活的前药化合物对正常细胞的毒性都明显低于母体化合物DON。其中优势化合物LJR-205对正常细胞16HBE的毒性明显低于对四种前列腺癌细胞的毒性，另外跟DON对16HBE的毒性相比，毒性要低近8倍，说明了通过对DON的羧基和氨基上的修饰，可以降低DON的毒性。
试验例2
凋亡蛋白的降解实验
1.实验原理：
用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳将不同分子量的蛋白分开并通过湿转将目的蛋白转移到固相载体PVDF膜上，再用5％的脱脂奶粉封闭PVDF膜上的疏水位点，用稀释好的一抗与PVDF膜上的抗原结合，再与被荧光标记的二抗相互作用，并用ECL发光液曝光得到相应的目的蛋白，通过灰度分析得到蛋白的相对含量。因此本发明通过WB实验来分析化合物对凋亡蛋白含量的影响。
2.实验过程
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种3×106个细胞到6孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将LJR-205用DMSO配成104母液，再用相应的培养基进行稀释成相应的浓度，并空白孔。在37℃，5％CO2环境下培养48小时。
(3)蛋白样品的制备：将每个孔的细胞用含0.5％的EDTA的胰酶消化收集，用0.01mM的PBS洗涤两次，离心1500rpm收集细胞，每个细胞样品加100μL的RIPA裂解液(含1mM的PMSF)，在冰上裂解1个小时，12500rpm离心20分钟，取80μL的上清并加入20μL的5×loading buffer，之后沸水浴加热10分钟。制好的蛋白样品放在-20℃待用。将剩下的20μL的蛋白上清液取出6μL进行蛋白定量，并计算出每个样品的蛋白浓度。
(4)电泳及转膜：根据制胶说明书制得10％的凝胶。10％的胶制好之后每个孔加30μg的蛋白样品，恒压65v跑浓缩胶45分钟，之后用恒压130v跑分离胶2个小时。将分离胶根据蛋白分子量进行切割，得到所需要的蛋白凝胶，之后将胶上的蛋白转移至PVDF膜上，横流200mA转膜2个小时。
(5)蛋白封闭：将PVDF膜取出，用5％的脱脂牛奶(用TBST配制)进行封闭2个小时。
(6)洗膜：用PBS洗膜三次，每次5分钟。
(7)一抗孵育：将相应的一抗用PBST稀释，并4℃孵育过夜
(8)洗膜：用1×的TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟。
(9)二抗孵育：二抗用5％的脱脂牛奶(用PBST配制)稀释，并常温孵育2个小时。
(10)洗膜：用1×的TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟。
(11)用ECL发光液(VA液：VB液＝1：1，现配现用)将PVDF膜进行发光显色并用灰度分析软件分析每个蛋白样品的相对含量。
实验所用到的抗体：Cleaved PARP-1(Asp214)(1:1000,Cell Signalingtechnology,5625S)；Caspase-3(1:200,Santa Cruz,sc-7272)；Caspase-8(1:200,SantaCruz,sc-56070)；β-actin(1:5000,Santa Cruz,sc-47778)；Goat anti Rabbit-HRP(1:3000,Santa Cruz,sc-2357)；Goat anti Mouse-HRP(1:5000,Santa Cruz,sc-2005).
如图7所示，LJR-205在能够促进parp1的剪切体Cleaved parp1上调，促凋亡蛋白Caspase3被激活，这说明了化合物能够激活Caspase3从而使Cleaved parp1增多。同时促凋亡蛋白Caspase8和Caspase9也相应的剂量依赖性增加，从凋亡蛋白的角度进一步证明了化合物确实能够促进肿瘤细胞的凋亡。
试验例3
细胞的凋亡实验
1.实验原理：
Annexin是一类广泛分布在真核细胞内的钙离子依赖的磷脂结合蛋白，Annexin可以选择性的结合磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)，在细胞正常生长时PS一般分布在细胞膜内侧，而当细胞发生早期凋亡时，细胞膜会发生外翻，将细胞膜内侧的PS裸露出来，从而Annexin会与裸露出来的PS发生结合从而阻断PS的促炎症反应。将Annexin用FITC荧光标记可以检测细胞早期凋亡这一特征。碘化丙啶(propidium iodide,PI)可以染色凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。因此，本发明用Annexin-FITC和PI双染料对细胞凋亡进行分析，用BD流式细胞仪对细胞形态进行分组，Annexin-FITC阳性，PI阴性为早期凋亡细胞，而Annexin-FITC阳性，PI阳性为晚期凋亡细胞。
2.实验过程：
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞或者H596细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种3×105个细胞到6孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将药物用DMSO配成104母液，再用相应的培养基进行稀释成所需要的浓度，并设置空白孔。在37℃，5％CO2环境下培养48小时。
(3)细胞收集和染色：将每个孔的细胞用不含EDTA和不含酚红的胰酶消化收集，离心1500rpm收集细胞，用0.01mM的PBS洗涤两次，离心1500rpm收集细胞，将PBS弃去，每个样品加入500μL的Annexin结合液，10μL的FITC，10μL的PI，并设置空白样品和单染样品。37℃染色30分钟。
(4)用BD流式细胞仪分析细胞形态，并用flow jo对结果进行分析处理。
在DU145细胞上用不同浓度的代表性前药处理12h，浓度分别为0.5，1，5，10μM用DON作为阳性对照，浓度为5μM。用FITC和PI进行双重染色，随后用BD FASC流式细胞仪进行分析。其结果如图2和图5可以看出化合物能够以剂量依赖性的促进细胞的凋亡，在10μM下其凋亡率能够达到43.7％
试验例4
ROS调控影响实验
1.实验原理
本实验采用DCFH-DA探针进行活性氧检测，DCFH-DA本身没有荧光，当DCFH-DA进入细胞后，被水解成DCFH，DCFH可以与细胞中的ROS发生作用，生成有荧光的DCF，通过检测DCF就可以得知细胞中的ROS水平。
2.实验过程
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种3×105个细胞到6孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将药物用DMSO配成104母液，再用相应的培养基进行稀释成所需要的浓度，并设置空白孔。在37℃，5％CO2环境下培养48小时。
(3)细胞收集和染色：将每个孔的细胞用不含EDTA和不含酚红的胰酶消化收集，离心1500rpm收集细胞，用0.01mM的PBS洗涤两次，离心1500rpm收集细胞，弃去PBS，用不含血清的1640培养基按照1:1000比例稀释DCFH-DA探针，将探针与细胞37℃孵育1个小时，每10分钟颠倒混匀一次，之后用无血清的1640培养基洗涤细胞样品两次，洗去未装载到细胞内部的探针。
(4)上机检测：将制好的细胞样品用BD流式细胞仪进行检测，用flow jo软件进行结果分析处理。
用不同浓度的LRJ-205和DON处理细胞12h后进行ROS检测，用BD FACS流式细胞仪进行分析后发现化合物能够剂量依赖性的促进DU145细胞内的ROS水平升高(图6所示)。证明了前药化合物能够刺激肿瘤细胞产生ROS，从而促进细胞凋亡。
试验例5
体外释放实验：
1.实验原理：
LJR-205化合物的苯甲醌结构能够在NQO1酶的作用下发生氧化还原成氢醌，三甲基氢醌由于具有严重的空间排斥作用，限制了构象的运动，随后通过电子转移释放出相应的醇或者胺。
2.实验过程：
将NQO1酶用0.01mM的PBS进行稀释成14μg/mL，用0.01mM的PBS稀释NADPH到200μM，化合物LJR-205用DMSO配成104的母液，接着用0.01mM的PBS将化合物稀释到200μM，在96孔板中加入配制好的NQO1酶(2μL)，NADPH(100μL)，化合物(2μL)，0.01mM PBS(96μL)。37℃条件下孵育不同的时间，用HPLC(有机相：甲醇；水相：纯水)去监测化合物释放情况，选取半个小时的时间点，用质谱来判断释放的化合物结构。
试验例6
稳定性实验
为了获得DON前药的代谢稳定性，本发明使用了人血浆，大鼠血浆，小鼠血浆和人工肠液。将DON前药化合物用DMSO配成104的母液，用相应的基质稀释前药化合物至20μM，并于37℃孵育1个小时，之后加入三倍体积的预冷乙腈，12500rpm 4℃离心25分钟，取上100μL上清液，使用HPLC(有机相：甲醇；水相：纯水)来监测前药化合物的保留率。
表3 NQO1激活的谷氨酰胺酶抑制剂前药的稳定性考察
Figure BDA0003181920810000201
从测定结果可以看出，8个前药化合物在大鼠、小鼠血浆中均不稳定，37℃孵育一个小时之后，其保留率为零，易被水解代谢。在人血浆中，除了LJR-203，LJR-204和LJR-206以外，其他的前药化合物均稳定存在。在人工肠液中，除了LJR-203，LJR-206以外，其他前药化合物均稳定存在，不易被胰蛋白酶水解。LJR-207和LJR-208在人血浆和人工肠液中均稳定存在，说明在羧基上引入位阻较大的基团可以提高化合物代谢稳定性。
试验例7
前药化合物的细胞激活机制实验：
1.实验原理：
LJR-205化合物能够在NQO1酶的作用下发生氧化还原反应释放出相应的DON分子，为了验证其在细胞内的释放机制，本发明采用两种方案进行验证。方案一：用NQO1酶抑制剂DIC抑制NQO1的活性，看LJR-205对前列腺癌细胞的活性是否受到影响；方案二：通过LCMS来检测细胞内的DON水平。
2.方案一的实验过程：
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将LNCaP、22RV1、DU145细胞培养至对数生长期，用含10％FBS的F12K培养基将PC3细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种3000个细胞到96孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：用50μM的DIC预处理细胞三个小时，之后将化合物用相应的培养基稀释成所需要的浓度，并空白孔和阴性孔。在37℃，5％CO2环境下培养72小时。
(3)显色：每个孔加20μL的MTT(0.5mg/mL)在37℃下孵育4个小时，有蓝紫色甲瓒形成，之后将培养基弃去，每个孔加150μL的DMSO溶解甲瓒，用酶标仪在570nm处检测每个孔的OD值，用根据公式计算得到每个孔的抑制率，用grahpad8.0处理得到每个化合物的IC50＝(抑制率％＝1-(样品孔OD-空白孔OD)/(阴性孔OD-空白孔OD))
3.方案二的实验过程：
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种3×105个细胞到6孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将LJR-205用DMSO配制成104的母液，用培养基稀释化合物到50μM，并处理不同的时间。
(3)细胞收集和样品制备：将每个孔的细胞用含0.5％EDTA的胰酶消化收集，离心1500rpm收集细胞，用0.01mM的PBS洗涤两次，离心1500rpm收集细胞，弃去上清，加入300μL的纯水，并在液氮中反复冻融3次，4℃离心12500rpm 10分钟，取200μL上清，在烘箱中烘干，再加入100μL甲醇复溶。
(4)上机检测：将复溶好的样品加入100μL内标(100ng),8000rpm 4℃离心10分钟，取100μL上清进样，用LCMS/MS进行定量检测。
结果如图8所示。从质谱结果可以看出化合物LRJ-205能够在NQO1酶和NADH条件下迅速释放，且质谱结果均有相应化合物的分子量。
随后，通过孵育不同的时间来看化合物LRJ-205的释放程度，用Agilent1260infinity高效液相色谱仪进行检测，从图中可以看出化合物LRJ-205释放具有时间依赖性，一个小时的时候释放效率达到98％以上。
试验例8
细胞克隆实验
实验过程：
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种1×104个细胞到6孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将LJR-205用DMSO配制成104的母液，用培养基稀释化合物到指定的浓度，并在37℃，5％CO2环境下处理10天。
(3)后处理：将培养基弃去，用0.01mM的PBS清洗两次，接着用4％的多聚甲醛在37℃条件下固定半个小时，弃去4％的多聚甲醛并在每个孔加入1mL的稀释好的结晶紫溶液在37℃条件下染色1个小时，之后用PBS洗去残余的结晶紫溶液。最后用相机进行拍照观察细胞群落形成情况。
如图3所示，LJR-205在10μM的浓度下能明显的抑制DU145细胞群落的生成，同时以浓度依赖性的方式抑制DU145细胞群落的生成。从克隆形成实验也进一步证实了LJR-205对雄激素非依赖的前列腺癌细胞DU145的抗增殖活性。
试验例9
细胞内氨基酸定量质谱分析实验
实验过程：
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种2×105个细胞到6孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将LJR-205用DMSO配制成104的母液，用培养基稀释化合物到指定的浓度，并在37℃，5％CO2环境下处理48小时。
(3)细胞收集和样品制备：将每个孔的细胞用含0.5％EDTA的胰酶消化收集，离心1500rpm收集细胞，用0.01mM的PBS洗涤两次，离心1500rpm收集细胞，弃去上清，加入300μL的纯水，并在液氮中反复冻融3次，4℃离心12500rpm 10分钟，取200μL上清，在烘箱中烘干，再加入100μL甲醇复溶。
(4)上机检测：将复溶好的样品中加入100μL内标(100ng),8000rpm 4℃离心10分钟，取100μL上清进样，用LCMS/MS做定量检测。
通过给药处理48小时后，测定了DU145细胞内的谷氨酰胺，谷氨酸，谷胱甘肽，富马酸，苹果酸的含量变化。如图10可知，谷氨酰胺的含量随着给药浓度的增加而升高，而谷氨酸和谷氨酰胺下游的氨基酸例如：谷胱甘肽，富马酸，苹果酸的含量随着给药浓度的增加而下降。说明LJR-205能够显著的切断谷氨酰胺代谢，影响细胞内其他的氨基酸水平。肿瘤细胞中的TCA循环通路受到抑制，进而抑制了肿瘤细胞的生长。
试验例10
细胞荧光染色实验
实验过程：
(1)细胞铺板：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞培养至对数生长期，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞，每孔接种2×104个细胞到6孔板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜至细胞贴壁长出形态。
(2)细胞给药：将LJR-205用DMSO配制成104的母液，用培养基稀释化合物到指定的浓度，并在37℃，5％CO2环境下处理48小时。
(3)后处理：将培养基弃去，用PBS清洗细胞两遍，每个孔加入1mL 4％的多聚甲醛固定半个小时，弃去多聚甲醛，用PBS清洗多余的多聚甲醛，之后向每个孔加入2mL的0.3％的Triton-X100溶液透化半个小时，弃去0.3％的Triton-X 100溶液，用PBS清洗多余的0.3％的Triton-X 100溶液。接着每个孔加入1mL的Hoechst 33342，避光37℃孵育1个小时，用PBS清洗未被染色的背景。
(4)上机检测：选取DAPI通道进行荧光显微镜观察拍照。
从实验结果可以看出，相比于DMSO组来看，LJR-205给药处理48小时之后可以改变细胞形状，染色体呈现致密梭形，而DON组的致密梭形染色体要明显少于LJR-205给药组，说明NQO1激活醌释放可以诱发染色体交联，从而进一步促进细胞的凋亡。
试验例11
DU145细胞异种移植瘤体内抗肿瘤实验
(1)细胞培养：用含10％FBS的1640培养基将DU145细胞培养至对数生长期，在10cm3大皿中培养，当细胞密度为90％时，用含0.5％的EDTA的胰酶消化细胞并进行收集，细胞密度为6×107。
(2)移植瘤模型的建立：选取健康的BALB/c雄性裸鼠，体重约为16-20g，在每只小鼠左侧腋窝皮下注射0.1mL的细胞悬液。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至80mm3左右后将动物随机分组并记为第0天，然后开始腹腔给药。
(3)使用测量瘤径的方法，动态观察药物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天一次。给药22天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重并拍照。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：TV＝1/2×m×n2，其中m、n分别表示长宽。
如图11所示。从测定结果可以看出，化合物LJR-205在1.5mg/kg的药物浓度下对人前列腺癌细胞DU145移植瘤有非常明显的抑制作用，肿瘤的体积和重量都明显下降，其抑瘤率与阳性药DON(1.5mg/kg)和CB839(30mg/kg)相当。此外，LJR-205给药组裸鼠的体重相比较空白组呈现上升的趋势，而CB839对于裸鼠体重影响较大。通过初步的体内活性数据可以看出，前药化合物LJR-205对于人前列腺癌细胞DU145移植瘤有很好的抑瘤率，并且前药化合物LJR-205与CB839相比有剂量上的优势。

Claims (8)

1.如式I所示的NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药、其药学上可接受的盐或酯，
Figure FDA0003181920800000011
其中：R1选自氢、甲基、乙基、异丙基、环己基、环戊基、苯甲基、苯乙基或苯丙基；
R2选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R3选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R4选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃、甲氧基或卤素；
R5选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃或卤素；
R6选自氢、甲基、乙基、C1-C6烷烃或卤素。
2.如式I所示的NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药、其药学上可接受的盐或酯，其特征在于：R1为异丙基或乙基。
3.如式I所示的NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药、其药学上可接受的盐或酯，其特征在于：其中所示前药为下列化合物之一：
Figure FDA0003181920800000012
Figure FDA0003181920800000021
Figure FDA0003181920800000031
4.权利要求1-3任一项所述NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
Figure FDA0003181920800000032
5.权利要求1-3任一项所述NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药在制备抑制细胞增殖紊乱药物中的应用。
6.权利要求1-3任一项所述NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药在制备癌症治疗药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述癌症为前列腺癌、肝癌、淋巴癌、骨癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌或白血病。
8.权利要求1-3任一项所述NQO1激活型6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸前药在制备免疫代谢相关疾病治疗药物中的应用。
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