CN113456889A - 生物合成角膜 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制造用于提供光学透明的角膜植入物的生物合成角膜，所述角膜植入物用作损伤的，患病的或有缺陷的角膜的再生修复的支架。

Description

生物合成角膜
本申请是申请号为201710620903.3、申请日为2017年7月26日、发明名称为“生物合成角膜”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及合成角膜替代，并且提供一种制造用于提供光学透明角膜植入物的生物合成角膜，所述角膜植入物用作损伤、患病或有缺陷的角膜的再生修复的支架。
背景技术
角膜用作眼睛的保护屏障，并且还将光折射并聚焦到视网膜上。疾病或创伤导致的角膜表面的光学清晰度的损失或失真是失明的主要原因。全世界估计有800万到1000万人准备从角膜移植中受益，但是供体角膜的缺乏和相关成本限制了手术的可用性。例如，在中国大约有 200万人患有角膜性失明。虽然角膜移植在美国和一些欧洲国家是角膜性失明的护理标准，但在中国对于这种手术严重缺乏供体角膜。据世界卫生组织(WHO)和ORBIS国际组织估计，在中国每年只进行 5000-6000例角膜移植手术。换句话说，超过99.5％的患者没有接受治疗。眼科医生和患者正迫切地等待角膜移植的替代方法。
在扩大对角膜移植的尝试中，近期的努力集中在合成替代角膜的发展。在提议用于制造这种合成替代角膜的各种材料中，某些胶原蛋白已经单独或与其它聚合材料组合用于合成角膜镶嵌物和植入物的制造。参见例如国际公开号WO 88/02622，WO 90/05755，WO2006/015490，WO 2006/020859和WO 2007/028258；也参见例如Li 等人的(2003)Proc NatlAcad Sci USA 100(26)：15346-15351，Liu 等人的(2006)Biomacromolecules 7：1819-1828，Liu等人的(2008) Biomaterials 29：1147-1158，Merrett等人的(2008)InvestOphthalmol Vis Sci 49(9)：3887-3894。重组人胶原蛋白(RHC)被认为是用于制造角膜植入物的有前景的材料，因为它是无毒的，非免疫原性的和非炎性的。迄今为止，在使用交联的重组人胶原蛋白制造的角膜植入物的人类患者中已经获得了良好的结果。(参见Fagerholm等人的(2009) Clin Transl Sci 2(2)：162-164，Fagerholm等人的(2010)SciTransl Med.2 (46)：1-8，Fagerholm等人的(2014)Biomaterials 35：2420-2427)。然而，这些现有技术的植入物各有缺陷，包括拉伸强度不足，从而妨碍使用常规缝合。(Fagerholm等人的，同上)。以前对增加由胶原蛋白制成的角膜植入物的拉伸强度付出的努力导致植入物具有降低的光学清晰度。
因此，仍然迫切需要合成角膜替代物，其保留胶原蛋白的优点，但是仍然可以实现改善的可缝合性，甚至可以提供光学高清晰度。本发明通过提供具有更高的光学清晰度的生物合成角膜满足了此需求。
发明内容
本发明提供了一种生物合成角膜，其被设计为产生光学透明的角膜植入物。本发明的生物合成角膜还用作损伤，患病或有缺陷的角膜的再生修复的支架。本发明的生物合成角膜由高度纯化的重组人胶原蛋白制成，重组人胶原蛋白以高度密集有序的小直径微纤维阵列排列。该组合物导致具有改善的可缝合性的生物合成角膜。因为本发明的生物合成角膜具有更高的光学清晰度，所以它是对现有技术中提供的合成替代角膜的改进，包括以前由胶原蛋白制成的合成替代角膜。令人惊奇的是，本发明的生物合成角膜提供了这种优异的光学清晰度，同时其与现有技术的合成替代角膜相比允许更高的胶原蛋白含量和改进的可缝合性。
在优选的实施例中，生物合成角膜包含高度纯化的重组人III型胶原蛋白。在具体实施例中，生物合成角膜基本上由高度纯化的重组人 III型胶原蛋白组成。本发明的生物合成角膜被制造以产生高度密集有序的小直径直接酰胺交联的胶原蛋白微纤维阵列。在一个实施例中，相比于现有技术中提供的合成替代角膜，包括以前由胶原蛋白制成的合成替代角膜，本发明的胶原蛋白微纤维具有更一致和更窄的纤维直径。本发明的微纤维的直径小于25nm，而天然角膜纤维的直径大约为 25nm。生物合成角膜中的最终胶原蛋白浓度约为8-18％(w/w)，特别地约为8-15％，更特别地约为8-11％。在特别的优选实施例中，胶原蛋白含量约为8-9％(w/w)，特别地约为8.36％。在另一个特别的优选实施例中，胶原蛋白含量约为11-15％(w/w)，特别地约为11％，约为12％，约为13％，约为14％或约为15％。
在第一方面，本发明提供了一种生物合成角膜，其基本上由酰胺交联的重组人III型胶原蛋白组成，具有8-18％(w/w)的胶原蛋白含量并且在300nm光波长处其光密度约小于或等于0.09。在具体实施例中，生物合成角膜具有约8％至约15％的胶原蛋白含量。在各种实施例中，生物合成角膜中的胶原蛋白基本上以密集有序的小直径微纤维阵列排列。在各种实施例中，生物合成角膜在380-750nm的光波长处具有≤0.05，特别地≤0.04，甚至更特别地≤0.03的光密度。
在第二方面，本发明提供了通过包括以下步骤的过程制备的第一方面的生物合成角膜：(a)在约0-3℃将重组人III型胶原蛋白凝胶与碳二亚胺交联剂在缓冲至pH 5.2-5.3的溶液中混合，使得最终胶原蛋白浓度为8-18％(w/w)，特别地为8-15％，更特别地为8-11％，胶原蛋白胺基与碳二亚胺交联剂的摩尔比约为1:0.3，约为1:0.4，约为1:0.5 或约为1:0.6；(b)将所述混合物挤出到具有腔的模具中，该腔具有适合宿主角膜的尺寸，厚度和曲率；和(c)在室温(18-24℃，更优选约21℃)约100％湿度温育过夜，以允许模具内的交联过程的完成。在特别的优选实施例中，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)以0.150-0.340M，更特别地约为0.157-0.277M，甚至更具体地约为0.165M 的交联最终浓度将溶液缓冲至pH 5.2-5.3。在具体实施例中，胶原蛋白胺基与碳二亚胺交联剂的摩尔比约为1:0.4。在具体实施例中，混合在约0℃进行。
在第二方面的具体实施例中，生物合成角膜通过包括以下步骤的过程制备：(a)在约0-3℃将重组人III型胶原蛋白凝胶与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在缓冲至pH 5.2-5.3的溶液中混合，使得最终胶原蛋白浓度为8-18％(w/w)，特别地为8-15％，更特别地为8-11％，胶原蛋白胺基与NHS的摩尔比选自约1:0.3，约1:0.4，约1:0.5或约1:0.6； (b)在约0-3℃向混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，使得EDC与NHS的摩尔比约为1:1；(c)在约0-3℃混合并将混合物挤出到具有腔的模具中，该腔具有适合宿主角膜的尺寸，厚度和曲率；和(d)在约100％湿度在室温温育过夜，以允许模具内的交联过程的完成。在特别的优选实施例中，使用MES以约 0.150-0.350M，更特别地以约0.157-0.277M，甚至更具体地以约0.165M 的最终交联浓度将溶液缓冲至pH 5.2-5.3。在具体实施例中，步骤(a)至(c)在约0℃进行。在优选的方面，胶原蛋白胺基与NHS与EDC 的摩尔比约为1:0.4:0.4。
在另选的实施例中，生物合成角膜的胶原蛋白含量为7-9％，并通过以下步骤的过程制备∶(a)在0-3℃将重组人III型胶原蛋白凝胶与 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在缓冲至pH5.1-5.3的溶液中混合，使得最终胶原蛋白浓度为7-9％，胶原蛋白胺基与NHS的比例为1:0.4；(b) 在0-3℃向混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺 (EDC)，使得EDC与NHS的摩尔比为1:1；(c)在0-3℃进行混合，并且将混合物挤出到具有腔的模具中，所述腔具有适合宿主角膜的尺寸，厚度和曲率；以及(d)在约100％湿度在室温温育过夜，以允许所述模具内的交联过程的完成。在特别的优选实施例中，使用最终交联浓度为约0.150-0.350M，更特别地约0.157-0.277M，甚至更具体地约0.165M的MES将溶液缓冲至pH 5.1-5.3。在具体实施例中，步骤 (a)至(c)在约0℃进行。
本发明的生物合成角膜提供了支架和模板以促进宿主组织向内生长和角膜再生。生物合成角膜旨在在手术切除损伤，患病或有缺陷的角膜的前层之后被固定在接受者的角膜床中。上皮细胞将沿着角膜植入物的表面迁移以形成完整的再上皮化层并恢复眼泪膜。同时，基质细胞和神经纤维迁移到角膜植入物中。角膜植入物通过向内生长的细胞重塑并且最终被天然角膜组织替代。
在一个实施例中，本发明的生物合成角膜具有隐形眼镜的形状并设计成具有与天然人类角膜相同的曲率。
附图说明
图1示出了与使用本领域中公开的方法产生的代表性合成替代角膜(样品B2)相比，本发明的生物合成角膜(样品A2)的光学清晰度的视觉比较。
图2.图2A示出了对于本发明的生物合成角膜(样品A1)，以及对于使用本领域中公开的方法生产的代表性替代合成角膜(样品B1)，穿过300-800nm的波长光谱的光的光密度(吸光度)。
图2B示出了对于本发明的生物合成角膜(样品A2)，以及对于使用本领域中公开的方法生产的代表性替代合成角膜(样品B2)，穿过 300-800nm的波长光谱的光的光密度(吸光度)。
图3示出了(A)本发明的生物合成角膜的透射电子显微照片(样品A)与(B)使用本领域中公开的方法生产的代表性替代合成角膜的透射电子显微照片(样品B)的并排比较；条＝0.5μm。
图4示出了对于本发明的生物合成角膜(样品A1)，以及对于使用本领域中公开的方法生产的代表性替代合成角膜(样品B3，B4和B5)，穿过300-800nm的波长光谱的光的光密度(吸光度)，同时在制造期间将pH保持在5.2。
图5示出了本发明的生物合成角膜的示例性构造。
图6示出了本发明的生物合成角膜的三维表示。
具体实施方式
在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所述的具体化合物，组合物，方法，方案，细胞系，化验和试剂，因为它们可以变化。还应当理解，本文使用的术语旨在描述本发明的具体实施例，并且决不意在限制如所附权利要求中阐述的本发明的范围。
必须注意，除非上下文另有明确说明，否则本文和所附权利要求中使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是现在也描述了优选方法，设备和材料。本文引用的所有出版物通过引用整体并入，用于描述和公开在可能与本发明结合使用的出版物中报道的方法，试剂和工具。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术内的化学，生物化学，分子生物学，细胞生物学，遗传学，免疫学和药理学的常规方法。这样的技术在文献中被充分解释。(参见例如Troy，DB和 Beringer,P.,eds.(2006)Remington：药学科学与实践，第21版，Lippincott Williams&Wilkins；Colowick，S.,和Kaplan，N.O.,EDS., 酶学方法，AcademicPress,Inc.；DMWeir和C.C.Blackwell，eds. (1986)Handbook of ExperimentalImmunology，Vols.I-IV，Blackwell Scientific Publications；Green，MR和Sambrook，J.,eds.(2012) Molecular Cloning：实验室手册，第四版，Vols.I-III，Cold Spring HarborLaboratory Press；Ausubel，FM等人，eds。(2002)Short Protocols in MolecularBiology，5th edition，Vols.I-II，John Wiley&Sons。)
本发明提供了一种生物合成角膜，其被设计为产生光学透明的角膜植入物。本植入物还用作损伤的、患病的或有缺陷的角膜的再生修复的支架。生物合成角膜由以高度密集有序的小直径微纤维阵列排列的高纯度人胶原蛋白制成。特别地，胶原蛋白微纤维以高度密集的平行阵列排列。因为本发明的生物合成角膜具有更高的光学清晰度，所以它是对现有技术中提供的合成替代角膜的改进，包括以前由胶原蛋白制成的合成替代角膜。令人惊讶的是，本发明的生物合成角膜提供了这种优异的光学透明度，同时与现有技术的设备相比允许更高的胶原蛋白含量和改进的可缝合性。
生物合成角膜描述
本发明的生物合成角膜是由高纯度I型或III型胶原蛋白，优选地由重组人胶原蛋白I型或III型制成的光学透明的角膜植入物。在具体实施例中，生物合成角膜包含或基本上由高纯度的重组人III型胶原蛋白组成。在优选的实施例中，用于本发明的生物合成角膜的胶原蛋白是由工程化酵母产生的高度纯化的重组人III型胶原蛋白，如美国专利 5,593,859中所述。使用酵母中产生的重组胶原蛋白消除了对来自人或动物来源的组织成分的污染物的安全担忧，包括例如传染性海绵状脑病。生物合成角膜中的最终胶原蛋白浓度为约8-18％(w/w)，特别地约为8-15％，更特别约为8-11％。在特别的优选实施例中，胶原蛋白含量为约8.0-9.0％，特别是约8.36％。在另一个特别的优选实施例中，胶原蛋白含量约为11-15％，特别地约为11％，约为12％，约为13％，约为14％或约为15％。在另选的实施例中，生物合成角膜中的最终胶原蛋白浓度为7-9％。
本发明的生物合成角膜通过目视检查是无色和光学透明的。参见例如图1，样品A2。通常，本发明的生物合成角膜在300nm的光波长的吸光度(光密度)≤0.09。特别地，对于本发明的生物合成角膜，在可见光谱(380-750纳米)上的吸光度(光密度)≤0.05，特别地≤0.04，甚至更特别地≤0.03。在优选实施例中，可见光谱上的吸光度平均约为0.020-0.013(等同于约95-97％透射率)。参见例如图2A，样品 A1，和图2B，样品A2。在所有实施例中，白光透射率>87％，并且反向散射≤3％。
本发明的生物合成角膜中的胶原蛋白在胶原蛋白分子之间含有直接酰胺交联。直接酰胺交联增强了植入物的初始结构完整性，同时仍然允许植入的生物合成角膜随时间被自然再生过程替代。直接酰胺交联的胶原蛋白以高度密集有序的小直径胶原蛋白微纤维阵列排列。特别地，胶原蛋白微纤维以高度密集的平行阵列排列。参见例如图3A。胶原蛋白的这种密集有序的排列在小直径微纤维的平行阵列中为本发明的生物合成角膜提供了光学高清晰度，甚至同时增加了胶原蛋白含量并因此提高结构完整性。通过提供更高的光学清晰度，特别是提供更高的胶原蛋白含量并同时保持光学高清晰度，本发明的生物合成角膜是对现有技术中可用的合成角膜的改进。
在各种实施例中，生物合成角膜被模制成隐形眼镜的形状，其中，基于适于特定宿主受试者的参数确定其直径，厚度和曲率半径。在特定实施例中，生物合成角膜被设计成使得其直径，厚度和曲率半径与人类角膜的自然形状一致。参见例如图5和图6。对于人类受试者，生物合成角膜的直径被制造为通常为≥10mm，特别地为10-12mm，并且厚度约为350-550μm，特别地约为500μm。参见例如图5。生物合成角膜的曲率半径(R)约为6.5-7.8mm，特别地约为7.7mm。
生物合成角膜被设计成在手术切除损伤的、患病的或有缺陷的角膜前层之后被固定在接受者的角膜床中。生物合成角膜可以使用缝线临时固定在适当位置。本发明的生物合成角膜提供了优异的光学清晰度，同时与现有技术的合成替代角膜相比允许更高的胶原蛋白含量和改进的可缝合性。本发明的生物合成角膜支持跨角膜植入物的外表面的上皮细胞迁移，允许完整的上皮层的再形成和恢复眼泪膜。本发明的生物合成角膜还支持基质细胞和神经纤维迁移到角膜植入物中。随着这些细胞的迁移，将逐渐形成新的角膜组织，并且生物合成角膜将随着时间逐渐被降解和替代。
生物合成角膜制造
通过使用本文所述的方法用从任何来源获得的胶原蛋白I型或III 型胶原蛋白，可以制造本发明的生物合成角膜，其对于现有技术中提供的合成替代角膜，包括以前由胶原蛋白制成的合成替代角膜，具有改善的清晰度。起始材料应该具有高纯度并且基本上由I型或III型胶原蛋白的单一种类组成。优选地，本发明的生物合成角膜由人I型胶原蛋白或III型胶原蛋白，特别地由型重组人胶原蛋白I型或III制成。用于生物合成角膜制造的特别的优选起始材料是通过酵母发酵制造的重组人III型胶原蛋白，例如，如美国专利5,593,859中所述。在特别的优选实施例中，生物合成角膜由使用其中插入了III型胶原蛋白和脯氨酰4-羟化酶的人类基因的酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株制备的重组人III型胶原蛋白制成。优选该起始材料以避免使用动物和人来源的组分(以确保安全性)，并且包括产生高纯度胶原蛋白产品的大量下游纯化步骤。纯化的胶原蛋白在生产生物合成角膜之前被无菌冻干。
在具有严格无菌性和颗粒控制(ISO 5级)的环境中进行生物合成角膜制造。在用足够的注射用水(WFI)重构以形成胶原蛋白溶液之前，测试被冻干的胶原蛋白的胶原蛋白含量，无菌性和内毒素。例如通过离心将任何气泡从胶原蛋白溶液中除去。胶原蛋白交联在约 0-3℃，特别地在约0℃的温度，并且在没有气泡被引入反应的条件下进行。例如，在国际公开号WO 2006/015490(参见例如第26页第24 行至第27页第2行，以及图1-图3)中提供了用于混合试剂以避免气泡引入的合适设备。
胶原蛋白溶液首先在pH 5.1-5.3，更特别地为5.2-5.3的缓冲溶液中达到最终起始浓度。优选的缓冲溶液包含在交联最终浓度约为 0.150-0.340M，特别地约为0.157-0.277M，更特别地约为0.165M的2- (N-吗啉代)乙磺酸(MES)。缓冲溶液还可以包含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或者NHS可之后加入到缓冲的胶原蛋白溶液中，在任一情况下，NHS与胶原蛋白胺基的摩尔比约为0.3:1至0.6:1，例如约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1或约0.6:1。特别地，NHS与胶原蛋白胺基的摩尔比为约0.4:1。在所述生物合成角膜的胶原蛋白浓度为7-9％的另选实施例中，pH为5.1-5.3，NHS与胶原蛋白胺基的摩尔比约为0.4:1。
然后，将碳二亚胺交联剂加入到胶原蛋白/NHS缓冲的混合物中，使得碳二亚胺交联剂与NHS的摩尔比约为1:1。水溶性碳二亚胺交联试剂是优选的，因为未反应的试剂和来自交联反应的副产物可以在生物合成角膜形成后更容易和彻底地被除去。在具体的实施例中，碳二亚胺交联试剂选自包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺 (EDC)和N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)的组。在优选的实施例中，碳二亚胺交联剂是EDC。将胶原蛋白/NHS/碳二亚胺交联剂溶液在约0-3℃，特别地在约0℃被彻底地混合不超过约0.25-2分钟，优选地不超过约1分钟。
然后，将充分混合的胶原蛋白溶液立即挤出到具有腔的模具中，该腔具有适合特定宿主角膜的尺寸，厚度和曲率，并且该胶原蛋白溶液在约100％湿度在室温(18-24℃，更优选约21℃)温育过夜以允许模具内的交联过程的完成。模内交联增强了植入物的结构完整性，同时仍保持透明度。
然后，将植入物从铸模中取出并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底洗涤以除去交联反应的所有副产物。然后，可以测试本发明的生物合成角膜的无菌性，内毒素，大小，胶原蛋白含量，熔融温度和光透射率。通过所描述的方法制造的生物合成角膜至少满足表1所列的标准。
表1
测试 接受标准
外观 清晰，无色的植入物。无重大缺陷
通过折射率测定胶原蛋白浓度 8％到18％(w/w)
差示扫描量热法(DSC) 62.9℃到50.6℃
直径 ≥10mm
白光透射率 >87％
后向散射 ≤3％
通过鲎阿米巴细胞溶解物(LAL)的内毒素测试 ≤2.0EU/植入物
无菌性 无菌的
将生物合成角膜储存在无菌溶液中，例如无菌PBS。
在所述生物合成角膜的胶原蛋白浓度为7-9％的另选实施例中，所述生物合成角膜通过上述包括以下具体步骤的模内交联过程制备∶ (a)在0-3℃将重组人III型胶原蛋白凝胶与NHS在缓冲至pH 5.1-5.3 的溶液中混合，以得到7-9％的最终胶原蛋白浓度，胶原蛋白胺基与 NHS的比例为1:0.4；(b)在0-3℃向混合物中加入EDC，使得EDC 与NHS的摩尔比为1:1，使得交联发生；(c)在0-3℃进行混合，并且将混合物挤出到具有腔的模具中，所述腔具有适合宿主角膜的尺寸，厚度和曲率；以及(d)在约100％湿度在室温温育过夜，以允许所述模具内的交联过程的完成。
生物合成角膜用途
本发明的生物合成角膜用于部分厚度角膜植入，用于治疗由于角膜功能障碍引起的视力损伤。生物合成角膜提供光学透明的植入物并且用作损伤，患病或有缺陷的角膜的再生修复的支架。在具体实施例中，生物合成角膜用于前板层角膜移植术。在手术切除损伤的，患病的或有缺陷的角膜前层之后，将无菌植入物例如通过缝合固定在接受者的角膜床中。关键的外科手术步骤如下：(1)使用前板层角膜移植术(ALK)或深层前板层角膜移植术(DALK)技术移除病理角膜组织；(2)将生物合成角膜切割成直径比接受者的角膜床大0.25mm的层状植入物；(3)用缝线将植入物置于角膜床和锚上；(4)将惰性绷带隐形眼镜置于眼睛上，并施用局部类固醇/抗生素滴剂，直到移除隐形眼镜和缝线。
设备性能
本发明的生物合成角膜的非永久性质通过使植入物基质内的宿主角膜细胞迁移来促进组织再生，其中，宿主角膜细胞增殖，缓慢降解植入物，并合成富含I型胶原蛋白的新角膜组织。另外，在植入本发明的生物合成角膜后，观察到神经再生和泪膜功能的恢复。本发明的生物合成角膜也是有利的基底，其允许宿主上皮细胞在植入物的外表面上迁移，再生类似于天然存在的角膜中的新的上皮细胞层。
示例
通过参考以下示例进一步理解本发明，这些示例仅仅是本发明的示例。本发明的范围不限于示例性实施例，其仅意在说明本发明的单一方面。
示例1.生物合成角膜和眼科设备的生产。
本发明的生物合成角膜由以高度密集有序阵列，特别是以高度密集的平行阵列排列的小直径胶原蛋白微纤维组成。相比较于现有技术的合成替代角膜，本发明的生物合成角膜在提供更高程度的光学清晰度方面上是个进步。令人惊奇的是，本发明的生物合成角膜提供了这种优异的光学清晰度，同时与现有技术的合成替代角膜相比提供了更高的胶原蛋白含量和改进的可缝合性。提供了本发明的生物合成角膜与本领域公开的合成替代角膜镶嵌或植入物(所谓的“眼科设备”)的比较，以证明了这些改进的特性。
使用本文所述的方法制备本发明的生物合成角膜，并使用国际公开号WO 2006/015490中公开的方法制备“眼科设备”。相同的重组人III型胶原蛋白(rhc-III)凝胶被用作生物合成角膜和眼科设备的起始材料。虽然可以使用本文所述的方法从任何高度纯化的胶原蛋白I型或III型起始材料制备改进的生物合成角膜，但是rhc-III是用于产生本发明的最佳生物合成角膜的优选起始材料。
通过使用人III型胶原蛋白基因和人脯氨酰4-羟化酶基因转染的巴斯德毕赤酵母的酵母发酵制造高纯度rhc-III(FibroGen，San Francisco CA)。参见例如美国专利5,593,859。为了安全性的保证，在重组人胶原蛋白的生产过程中不使用动物或人类成分。为了制备20％(w/w) 的rhc-III凝胶，将700mg冷冻干燥的rhc-III溶解并在2.8mL注射用水 (WFI)中匀化。如果需要，离心最终的凝胶以除去任何气泡。还制备了18％和15％的凝胶。
A.生物合成角膜
通过在约0℃将400μl 15％(w/w)的rhc-III凝胶与285μl， pH5.2，0.625M的2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)缓冲液混合，制造本发明的第一生物合成角膜。分别在pH5.2，0.625M的MES缓冲液中中制备7.5％(w/w)的NHS溶液，并且在pH5.2，0.625M的MES缓冲液中制备10％(w/w)的EDC溶液。在约0℃将14.5μl等分的NHS 溶液与胶原蛋白溶液混合，然后加入18.2μl EDC溶液。然后将胶原蛋白/NHS/EDC溶液在约0℃剧烈混合约25秒。最终混合物的EDC:NHS:胶原蛋白-NH2摩尔比为0.4:0.4:1。然后，将混合物浇注到塑料模具中，并在室温(约21℃)在100％湿度温育过夜。然后，将生物合成角膜从模具中取出并用PBS洗涤以除去残余的交联剂。所得生物合成角膜含有约8.36％(w/w)的rhc-III，并且在此被标为样品A1。
通过在约0℃将520μl 20％(w/w)的rhc-III凝胶与150μl，pH5.2， 0.625M的MES缓冲液混合来制造本发明的第二生物合成角膜。分别在0.625M的MES缓冲液(pH5.2)中制备20％(w/w)的NHS溶液，并且在pH5.2，0.625M的MES缓冲液中制备20％(w/w)的EDC溶液。在约0℃将9.5μl等分的NHS溶液与胶原蛋白溶液混合，然后加入16.0μl EDC溶液。然后在约0℃将胶原蛋白/NHS/EDC溶液剧烈混合25秒。最终混合物的EDC:NHS:胶原蛋白-NH2摩尔比为0.4:0.4:1。然后将混合物浇注到塑料模具中，并在室温(约21℃)在100％湿度温育过夜。然后，将生物合成角膜从模具中取出并用PBS洗涤以除去残余的交联剂。所得生物合成角膜含有约15％(w/w)的rhc-III，并且在本文中被标为样品A2。
B.现有技术的眼科设备
国际公开号WO 2006/015490('490公开)和国际公开号WO 2006/020859('859公开)公开并要求保护包含胶原蛋白的眼科设备。两个申请具有相同的申请日期并要求相同优先权文件的利益。两个出版物的公开内容基本相同。因此，在本文中提到的'490公开中公开的方法也可以在'859公开中找到，并且对'490公开的参考仅仅是为了方便，并不意味着传达任何其他意义。
尽管'490公开提供了具有来自包括猪和牛的各种来源的胶原蛋白的眼科设备的若干示例，但仅示例18和21使用了重组人胶原蛋白，并且仅示例21使用了rhc-III。在示例21中，使用0.625M的2-(N- 吗啉代)-乙磺酸(MES)，而不用NaOH调节pH。没有调节，0.625M的MES溶液的pH为
Figure BDA0003161800680000141
并且EDC/NHS溶液非常不稳定(不断产生气泡)，并且不能制备用于交联的稳定的EDC/NHS溶液。因此，在本示例中用WFI
Figure BDA0003161800680000142
代替0.625M的MES以制备用于交联的稳定的EDC/NHS溶液。这种调整与'490和'859的部分作者撰写的科技出版物吻合，其中胶原蛋白在“水溶液”中使用EDC/NHS交联。(参见例如Merrett等人(2008)InvestOphthalmol Vis Sci 49:3887-3894)。示例21还使用三种不同摩尔比的EDC/NHS与胶原蛋白-NH2——1:1:1， 2:2:1和3:3:1，但没有报道差异。
通过在0-5℃将300μl的18％(w/w)的rhc-III凝胶与300μl 0.625M的MES混合来制造8.36％(w/w)的胶原蛋白眼科设备。通过在0-5℃将33.5mg的EDC和20.1mg的NHS溶解在125μl WFI中制备交联溶液，然后将57μl EDC/NHS溶液与胶原蛋白溶液在0-5℃剧烈混合25秒。最终混合物的EDC:NHS:胶原蛋白-NH2比为3.6:3.6:1。然后将混合物浇铸到塑料模具中，在100％湿度在室温温育16小时，随后在37℃再温育5小时。然后将眼科设备从模具中取出并用PBS洗涤以除去残余的交联剂。所得眼科设备含有约8.36％(w/w)的rhc-III，并且在本文中被标为样品B1。
使用'490公开中的示例21的方法尝试14％的胶原蛋白含量设备。通过在0-5℃将490μl的20％(w/w)的rhc-III凝胶与150μl WFI 混合来制造眼科设备。通过在0-5℃将98.6mg的EDC和59.2mg的NHS 溶解在375μl WFI中制备交联溶液，然后将57μl EDC/NHS溶液与胶原蛋白溶液在0-5℃剧烈混合25秒。最终混合物的EDC:NHS:胶原蛋白-NH2比为2:2:1。然后，将混合物浇铸到塑料模具中，在100％湿度在室温温育16小时，随后在37℃再温育5小时。然后，将眼科设备从模具中取出并用PBS洗涤以除去残余的交联剂。所得眼科设备含有约14％(w/w)的rhc-III，并且在本文中被标为样品B2。
为了与本发明的生物合成角膜直接比较，也使用上述方法制备具有8.36％(w/w)的最终胶原蛋白含量的眼科设备，溶液保持在pH 5.2， NHS/EDC/胶原蛋白-NH2摩尔比基于'490公开中的示例21。尽管'490 公开报道了3:3:1，2:2:1和1:1:1的比例，但是基于'490公开的实际计算得出的比率分别为3.6:3.6:1，2.4:2.4:1，和1.2:1.2:1。样品B3，B4 和B5是分别使用3.6:3.6:1，2.4:2.4:1和1.2:1.2:1的比例在pH 5.2处制造的眼科设备。
示例2.生物合成角膜和眼科设备之间的比较。
通过视觉检查和跨可见光谱的光吸收度来检查生物合成角膜和眼科设备的透明度和清晰度。如图1所示，通过目视检查，样品A2更透明，并且表现出比样品B2更高的清晰度。
对于吸光度测试，在室温用PBS缓冲液平衡样品A1，A2，B1和 B2。然后将平衡的样品置于1.5ml半微量一次性比色皿(Brand GMBH &Co.KG，Germany)中，并用Beckman DU530光谱仪(Beckman Coulter，Inc.，Brea CA)以10nm/sec的速率从300nm扫描至800nm。将吸光度(光密度)对波长作图，并用作样品清晰度的指标。通常，样品的吸收率越低，光学清晰度越大。如图2A所示，样品A1具有比样品B1更低的吸光度曲线，表明本发明的生物合成角膜在光学清晰度上相比根据现有技术方法制造的眼科设备得到了改善。特别地，样品 A1在可见光谱(380-750nm)上的吸光度范围为0.024至0.009(平均值0.013±0.004)，而样品B1的吸光度范围为0.057至0.018(平均值 0.031±0.011)。如图2B所示，样品A2具有比样品B2更低的吸光度曲线，表明本发明的生物合成角膜在光学清晰度上相比根据现有技术方法制造的眼科设备得到了改善。特别地，样品A2在可见光谱上的吸光度范围为0.029至0.006(平均值0.013±0.006)，而样品B2的吸光度范围为0.423至0.127(平均值为0.225±0.085)。样品A1和A2 的吸光度等于约97％的白光透射率。此外，本发明的生物合成角膜在 8.36-15％(w/w)的最终胶原蛋白浓度范围内保持高水平的清晰度。制备高清晰度的生物合成角膜且样品之间的差异被减少的能力对于商业制造方案的开发是重要的。
为了进一步理解在本发明的生物合成角膜中提供改善的清晰度的物理特性，通过透射电子显微镜进一步分析样品A2和样品B2。如图 3A所示，样品A2显示了高度密集有序的小直径胶原蛋白微纤维阵列，特别地显示了小直径微纤维的高度密集的平行阵列。相反，如图3B所示，样品B2显示了在方向和直径上具有更大变化性的胶原蛋白微纤维的更随机的排列。因为正常角膜基质的特征在于具有规则地包装在薄片内的小直径微纤维的均匀分布(参见例如Hassell和Birk(2010)Exp Eye Res 91(3)：326-335)，样品A2更接近地反映了正常角膜的结构属性。
示例3.用于生产生物合成角膜的交联参数。
在开发本发明的生物合成角膜时，进行实验以鉴定可重复地制造具有光学高清晰度的生物合成角膜，包括具有光学高清晰度的高胶原蛋白含量生物合成角膜，所需的参数。调查的一个特定参数是用于制造生物合成角膜的程序的pH敏感性。'490公开一般地指出“在制造这种设备中使用的pH通常小于约6.0，例如，pH可以在约5.0和约5.5 之间”(例如，参见'490公开第19页，第3行到第5行)。在'490公开中提供的大多数示例在pH 5.5处进行，而一些示例简单地指出将pH 调节至约为5。没有公开优选。
为了研究交联反应的pH对生物合成角膜的光学清晰度的影响，使用上述示例1A中公开的一般程序执行一系列交联反应，交联反应的pH被控制在pH 5.5，pH 5.4，pH 5.3或pH5.2。使用起始浓度0.625M 的MES(交联反应中MES的最终浓度为约0.165M)进行实验，但范围为0.157-0.277M的最终浓度产生相似的结果。如表I所示，在不同 pH水平处观察到显著的效果，在较低pH进行交联时清晰度(通过平均吸光度测量)和再现性(通过样品之间的标准偏差测量，N＝4)都得到了改善。pH 5.2和pH 5.3都产生明显更高的清晰度生物合成角膜，以及比在pH5.4或pH5.5处进行的反应更高的实验之间的再现性。
表1.在指定pH处交联的生物合成角膜的吸光度。
波长(nm) pH 5.2 pH 5.3 pH 5.4 pH 5.5
800 0.011±0.0015 0.014±0.0017 0.023±0.0085 0.047±0.0235
700 0.014±0.0020 0.018±0.0014 0.028±0.0072 0.052±0.0218
600 0.018±0.0014 0.025±0.0017 0.036±0.0079 0.062±0.0201
500 0.025±0.0017 0.035±0.0017 0.049±0.0061 0.080±0.0192
400 0.042±0.0019 0.056±0.0021 0.075±0.0057 0.115±0.0197
300 0.116±0.0061 0.141±0.0046 0.176±0.0109 0.245±0.0210
产生高清晰度的生物合成角膜且样品之间具有降低的差异性的能力对于商业制造方案的开发是重要的。本发明的生物合成角膜在包括在5.2-5.3的pH处交联胶原蛋白的过程中制造。
基于用pH 5.2观察到的改善的清晰度，将本发明的生物合成角膜与如上制造的眼科设备进行比较，除了pH保持在5.2。样品A1与样品B3，B4和B5的清晰度比较在图4中示出。从图中可以看出，样品 A1具有比样品B3，B4和B5更低的吸光度曲线，证明了本发明的生物合成角膜相比根据现有技术的方法制造的眼科设备(除了在制造期间将pH控制在5.2之外)有改善的光学清晰度。特别地，如示例2中，样品A1在可见光谱(380-750nm)上的吸光度范围为0.024至0.009 (平均值0.013±0.004)，而样品B3的吸光度范围为0.068至0.016(平均值0.027±0.011)；样品B4的吸光度范围为0.061至0.015(平均值 0.026±0.009)；样品B5的吸光度为0.049至0.013(平均值0.096± 0.007)。因此，尽管pH是改善本发明的生物合成角膜的因素，但是该过程中另外的因素导致生物合成角膜相对于现有技术的眼科设备具有改善的清晰度。
区分用于制造本发明的生物合成角膜的过程与如'490公开中公开的眼科设备的一般参数在表2中示出。
表2.生物合成角膜和眼科设备过程的比较
Figure BDA0003161800680000181
示例4.生物合成角膜特征
本发明的生物合成角膜具有以下特征：
材料来源：高纯度胶原蛋白可以从任何合适的来源获得，并且优选地是单一胶原蛋白类型，特别是I型或III型，最特别地是I型或III 型重组人胶原蛋白。在优选的实施例中，胶原蛋白是重组人III型胶原蛋白。在最优选的实施例中，用于生物合成角膜的重组人III型胶原蛋白通过酵母发酵制造，特别是使用用编码人III型胶原蛋白的基因和编码人脯氨酰4-羟化酶的基因转染的巴斯德毕赤酵母菌株。出于安全性保证的目的，优选在重组人胶原蛋白的生产过程中不使用动物或人类成分。
组合物：生物合成角膜包含或基本上由8-18％(w/w)的酰胺交联的I型或III型胶原蛋白，特别地由重组人胶原蛋白I型或III型，优选地由重组人III型胶原蛋白构成，其中交联反应在固定的pH5.2-5.3 和0-3℃的温度进行。将生物合成角膜储存在保持无菌的溶液中，例如储存在无菌磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4，0.144g/l的磷酸二氢钾，9.0g/l 的氯化钠，和0.795g/l的磷酸氢二钠)中。
外观：无色和透明，没有明显缺陷。
直径：≥10mm
厚度：350-550μm；另选为468-609μm。
热稳定性：使用差示扫描量热法测量，熔融温度Tm为62.9-50.6℃。
白光传导性：>87％
后向散射率：≤3％
胶原蛋白含量：8-18％(w/w)，更特别地为8-15％；另选为7-9％。
生物学性质：生物合成角膜是无菌的和无致热性的。产品中的内毒素不超过2.0EU/单位。没有迟发型超敏反应，急性全身毒性反应或亚慢性毒性反应。
植入：在皮下植入产品1周，4周和12周后，以及产品的相应观察，植入后12周的炎症细胞响应的反应程度不超过1级。
示例5.生物合成角膜
本发明的生物合成角膜通过以下步骤制造。将rhc-III凝胶 (10.5％-13.5％胶原)的等份与0.625M的MES缓冲液(pH 5.2)混合，目标胶原浓度为8.0％。按重量计，将1份的NHS溶液与9份0.625M 的MES缓冲液(pH 5.2)混合以制备10％的NHS溶液。将所述10％的NHS溶液的等份与胶原溶液混合，比例为0.4:1(0.4摩尔的NHS比1摩尔的胶原蛋白胺基)。将所述NHS-rhc-III混合物冷却至0.0℃至少45 分钟。按重量计，将1份的EDC溶液与9份0.625M的MES缓冲液(pH 5.2) 混合以制备10％的EDC溶液。为每个rhc-III凝胶的等份制备新鲜的10％的EDC溶液，并在由制备起10分钟内使用。将10％的EDC溶液的等份加入所述冷却了的NHS-rhc-III混合物，比例为0.4:1(0.4摩尔的EDC比1摩尔的胶原蛋白胺基)。最终混合物的EDC:NHS:胶原蛋白 -NH2比为0.4:0.4:1。然后将胶原/NHS/EDC溶液在0.0℃下剧烈混合 30秒，然后立即浇注到塑料模具中，并转移到以注射用水(WFI)加湿至饱和的无菌环境中，并在环境温度下温育过夜。然后，将生物合成角膜从模具中取出并用7.5mL的PBS洗涤三次以除去任何残余的交联剂。将生物合成角膜储存在PBS中。所述生物合成角膜的目标胶原蛋白浓度为8.0％。
所得到的生物合成角膜具有以下特征：
表3.生物合成角膜特征
Figure BDA0003161800680000201
Figure BDA0003161800680000211
1通过折射率测量
2通过差示扫描量热法测量。

Claims (10)

1.一种生物合成角膜，所述生物合成角膜基本上由酰胺交联的重组人III型胶原蛋白组成，具有约8％至约18％(w/w)的胶原蛋白含量并且在300nm的光波长处具有≤0.09的光密度。
2.根据权利要求1所述的生物合成角膜，其中，所述胶原蛋白含量约为8％至约15％(w/w)。
3.根据权利要求1所述的生物合成角膜，其中，所述重组人III型胶原蛋白以密集有序的小直径微纤维阵列排列。
4.根据权利要求1所述的生物合成角膜，其中，在380-750nm的光波长处所述光密度≤0.05。
5.根据权利要求1所述的生物合成角膜，所述生物合成角膜通过包括以下步骤的过程制备：
(a)在约0-3℃将重组人III型胶原蛋白凝胶与碳二亚胺交联剂在缓冲至pH 5.2-5.3的溶液中混合，以获得约8-18％(w/w)的最终胶原蛋白浓度，使得交联发生，胶原蛋白胺基与碳二亚胺交联剂的摩尔比选自约1:0.3，约1:0.4，约1:0.5，或约1:0.6；
(b)将混合物挤出到具有腔的模具中，所述腔具有适合宿主角膜的尺寸，厚度和曲率；和
(c)在约100％湿度在室温温育过夜，以允许所述模具内的交联过程的完成。
6.根据权利要求5所述的生物合成角膜，其中，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)以约0.150-0.350M的交联最终浓度将所述溶液缓冲至pH 5.2-5.3。
7.根据权利要求6所述的生物合成角膜，其中，MES的交联最终浓度约为0.157-0.277M。
8.根据权利要求5所述的生物合成角膜，其中，所述最终胶原蛋白浓度约为8-15％(w/w)。
9.根据权利要求5所述的生物合成角膜，其中，所述胶原蛋白胺基与碳二亚胺交联剂的摩尔比约为1:0.4。
10.根据权利要求5所述的生物合成角膜，其中，所述混合在约0℃发生。
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