CN113453709A

CN113453709A - 用于引发免疫应答的组合物、方法和用途

Info

Publication number: CN113453709A
Application number: CN201980092579.XA
Authority: CN
Inventors: 弗里达·E-C·简; 凯特·塞布; 叶夫根尼·塞姆琴科; 迈克尔·詹宁斯
Original assignee: Griffith University
Current assignee: Griffith University
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-09-28
Also published as: US20220062402A1; BR112021012250A2; EP3897706A4; EP3897706A1; WO2020124159A1; MX2021007539A; CA3123887A1; AU2019410099A1; KR20210119397A; SG11202106494RA

Abstract

本发明总体上涉及用于引发对奈瑟菌属(Neisseria)的免疫应答的多核苷酸、多肽、组合物、方法和用途，用于针对奈瑟菌属感染对受试者进行免疫接种的方法，以及用于预防和/或治疗受试者中奈瑟菌属感染的方法。更具体地，本发明涉及抗原性奈瑟菌属多肽和编码多核苷酸，以及相关用途和方法，包括用于制备组合物和药物的用途，所述组合物和药物用于引发对奈瑟菌属的免疫应答，用于针对奈瑟菌属感染对受试者进行免疫接种，以及用于预防和/或治疗受试者中奈瑟菌属感染。本发明还涉及用于产生治疗性抗奈瑟菌属抗原结合分子的方法，以及这些抗原结合分子的治疗用途。

Description

用于引发免疫应答的组合物、方法和用途

相关申请

本申请要求于2018年12月21日提交的题为“Compositions,methods and usesfor eliciting an immune response”的澳大利亚临时申请第2018904887号的优先权，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

发明背景

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是革兰氏阴性、专性人类病原体，感染人类粘膜表面并引起性传播感染淋病。据估计，全世界每年存在多于1.06亿淋病病例。症状性淋球菌感染通常表现为男性的尿道炎和女性的宫颈炎，尽管直肠、咽和眼睛的感染也发生在两种性别中。此外，无症状感染是常见的，并且可以发生在多达80％的受感染的女性和40％的受感染的男性中。如果不进行治疗，淋病可以导致严重的后遗症，诸如盆腔炎性疾病、不良妊娠结局、新生儿并发症和不孕，并且还可以增加获得和传播HIV的风险(在Edwards等人，2016,Crit Rev Microbiol 42(6),928-941中综述的)。

最近出现的淋病奈瑟菌多药耐药菌株已经产生了重大的公共健康挑战。阿奇霉素和头孢曲松的联合疗法现在是用于治疗淋病的最后防线，然而，已经在全世界鉴定出对扩展谱头孢菌素类头孢曲松和头孢克肟具有高水平耐受性的分离株，这突出了对新治疗方法或疫苗的需求。已经描述了各种潜在的疫苗靶，但是开发淋球菌疫苗存在若干挑战，包括，例如，感染后缺乏保护性免疫，以及淋病奈瑟菌表面抗原的高水平相变异和抗原性变异(在Edwards等人，2016,Crit Rev Microbiol 42(6),928-941和Rice等人，2017,Annu RevMicrobiol 71,665-686中综述的)。理想地，疫苗抗原应该是保守的、免疫原性的，并且能够诱导功能性抗体，所述功能性抗体能够介导杀细菌的或调理吞噬的杀伤，和/或能够阻断淋病奈瑟菌的重要功能(Edwards等人，2016,Crit Rev Microbiol 42(6),928-941)。但是值得注意的是，有效的疫苗不一定需要完全保护个体免受感染。具有部分或中等效力(例如50％或甚至20％效力)的疫苗有可能降低淋病奈瑟菌的传播，并且对淋球菌流行和疾病后遗症具有实质性影响(Craig等人2015,Vaccine.33(36):4520-4525)。

发明概述

本发明部分地基于以下令人惊讶的发现，即与甲硫氨酸亚砜还原酶位于革兰氏阴性细菌细胞内的普遍持有的观点相反，淋病奈瑟菌的甲硫氨酸亚砜还原酶(MsrA/B)暴露在这些细菌的表面上。此外，来自淋病奈瑟菌的MsrA/B在本研究中研究的所有淋病奈瑟菌菌株中都存在、高度保守并且表达，并且是有免疫原性的。值得注意的是，本发明人发现MsrA/B可以用于引发针对淋病奈瑟菌的抗体，该抗体可以经由血清杀细菌活性和调理吞噬活性二者杀伤淋病奈瑟菌。此外，被引发的抗体可以通过抑制MsrA/B与其底物的结合来抑制MsrA/B的活性。本发明人还确定脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的MsrA/B(其与淋病奈瑟菌的MsrA/B具有98％的序列同一性)也是表面暴露的。因此，如本文首次确定的，MsrA/B是奈瑟菌属疫苗候选物，并且可以用于引发对奈瑟菌属并且特别是淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的免疫应答(包括保护性免疫应答)。因此，MsrA/B也可以用于制备疫苗组合物，以针对奈瑟菌属并且特别是淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种。

因此，在一方面，本公开内容提供了一种组合物，所述组合物包含：a)重组MsrA/B多肽或编码MsrA/B多肽的重组多核苷酸，和佐剂；或者b)病毒载体，所述病毒载体包含编码MsrA/B多肽的多核苷酸；其中MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，抗原性片段包含至少或约30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个或510个氨基酸残基。

在特定实施方案中，抗原性片段缺乏在对应于SEQ ID NO:l的氨基酸1-31的氨基酸中列出的推定信号序列的全部或一部分；与全长MsrA/B多肽相比，在N末端被截短(N-terminally truncated)了至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸；包含MsrA结构域的全部或一部分；包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸181-362或199-354的氨基酸的全部或一部分；包含MsrB结构域的全部或一部分；包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸375-522或383-506的氨基酸的全部或一部分；包含硫氧还蛋白结构域的全部或一部分；和/或包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸17-174的氨基酸的全部或一部分。在另外的实施方案中，MsrA/B多肽与辅助性T细胞表位和/或载体蛋白连接，诸如与破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM-197连接。

组合物中的佐剂可以是，例如，铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂(例如包含角鲨烯的乳剂)、3-<9-脱酰化-4'-单磷酰基脂质A(MPL)、包含MPL的佐剂、toll样受体(TLR)激动剂(例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和/或TLR10激动剂)、基于皂苷的佐剂(例如包含来自皂树(Quillaja saponaria)、人参(Panax ginseng)、三七(Panaxnotoginseng)、西洋参(Panax quinquefolium)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、美远志(Polygala senega)、远志(Polygala tenuifolia)、巴西皂树(Quillaja brasiliensis)、黄芪(Astragalus membranaceus)或牛膝(Achyranthes bidentate)的皂苷或皂苷衍生物的佐剂；和/或是iscom或iscom基质的佐剂)、脂质体、病毒微体、病毒样颗粒(VLP)、外膜囊泡(OMV；例如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大肠杆菌(E.coli)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的OMV)、细胞因子、趋化因子和生长因子。

在一些实例中，组合物还可以包含另外的抗原，诸如淋病奈瑟菌抗原(例如PilC、PilQ、Opa、AniA、TdfJ、PorB、Lst、TbpB、TbpA、OmpA、OpcA、MetQ、MtrE或2C7表位或表位模拟物)，或脑膜炎奈瑟菌抗原(例如NadA、fHbp、NHBA、GNA1030、GNA2091、HmbR、NspA、Nhha、App、Omp85、TbpA、TbpB、Cu,Zn-超氧化物歧化酶，或来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的荚膜多糖或寡糖)。在特定实例中，组合物包含2种、3种、4种、5种或更多种另外的抗原。

在一种实施方案中，组合物中的病毒载体选自逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒(例如，巨细胞病毒(CMV))、甲病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒(papovavirus)、副粘病毒(例如，仙台病毒)、细小病毒、小RNA病毒、痘病毒(例如，牛痘病毒)和披膜病毒载体。

组合物还可以包含药学上可接受的载体。

在另外的方面，本公开内容提供了一种用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用重组MsrA/B多肽或编码MsrA/B多肽的重组多核苷酸；其中MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；并且施用导致对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的保护性免疫应答的产生。

在另一方面，提供了一种用于针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种的方法，该方法包括向受试者施用重组MsrA/B多肽或编码MsrA/B多肽的重组多核苷酸；其中MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；并且施用导致对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的保护性免疫应答的产生。

本公开内容的另外的方面提供了一种用于抑制受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的发展或进展的方法，该方法包括向受试者施用重组MsrA/B多肽或编码MsrA/B多肽的重组多核苷酸；其中MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；并且施用导致对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的保护性免疫应答的产生。

在方法的一些实施方案中，施用引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的保护性体液应答。保护性体液免疫应答可以包括，例如，为杀细菌的、调理吞噬的和/或抑制MsrA/B功能的抗MsrA/B抗体。在特定实例中，保护性体液免疫应答包括抗MsrA/B IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和/或IgA抗体。

在方法的特定实施方案中，抗原性片段包含至少或约30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个或510个氨基酸残基。在一些实例中，抗原性片段缺乏在对应于SEQ ID NO:l的氨基酸1-31的氨基酸中列出的推定信号序列的全部或一部分；与全长MsrA/B多肽相比，在N末端被截短了至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸；包含MsrA结构域的全部或一部分；包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸181-362或199-354的氨基酸的全部或一部分；包含MsrB结构域的全部或一部分；包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸375-522或383-506的氨基酸的全部或一部分；包含硫氧还蛋白结构域的全部或一部分；和/或包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸17-174的氨基酸的全部或一部分。在另外的实施方案中，MsrA/B多肽与辅助性T细胞表位和/或载体蛋白连接，诸如与破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM-197连接。

在一些实施方案中，方法还包括施用佐剂。组合物中的佐剂可以是，例如，铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂(例如包含角鲨烯的乳剂)、3-<9-脱酰化-4'-单磷酰基脂质A(MPL)、包含MPL的佐剂、toll样受体(TLR)激动剂(例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和/或TLR10激动剂)、基于皂苷的佐剂(例如包含来自皂树、人参、三七、西洋参、桔梗、美远志、远志、巴西皂树、黄芪或牛膝的皂苷或皂苷衍生物的佐剂；和/或是iscom或iscom基质的佐剂)、脂质体、病毒微体、病毒样颗粒(VLP)、外膜囊泡(OMV；例如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌的OMV)、细胞因子、趋化因子和生长因子。

在一个实例中，方法还包括施用另外的抗原，诸如淋病奈瑟菌抗原(例如PilC、PilQ、Opa、AniA、TdfJ、PorB、Lst、TbpB、TbpA、OmpA、OpcA、MetQ、MtrE或2C7表位或表位模拟物)，或脑膜炎奈瑟菌抗原(例如NadA、fHbp、NHBA、GNA1030、GNA2091、HmbR、NspA、Nhha、App、Omp85、TbpA、TbpB、Cu,Zn-超氧化物歧化酶或来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的荚膜多糖或寡糖)。在特定实例中，2种、3种、4种、5种或更多种另外的抗原被施用。

在方法的一些实例中，编码MsrA/B多肽的多核苷酸包含在病毒载体中，例如逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒(例如，巨细胞病毒(CMV))、甲病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒(例如，仙台病毒)、细小病毒、小RNA病毒、痘病毒(例如，牛痘病毒)和披膜病毒载体中。

在一个实例中，施用是经由皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮内、鼻内或口服途径。

还提供了一种用于治疗受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的方法，该方法包括向受试者施用对MsrA/B多肽有特异性的抗原结合分子；其中MsrA/B多肽包含SEQID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，抗原结合分子是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgA抗体。在另外的实施方案中，抗原结合分子是单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体(diabody)、Fd或Fd’片段。抗体可以是例如杀细菌的、调理吞噬的和/或抑制MsrA/B功能的。

还提供了以上和本文描述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答、针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种、抑制受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的发展或进展，和/或治疗或预防受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染。

本公开内容的另外的方面提供了重组MsrA/B多肽或编码MsrA/B多肽的重组多核苷酸用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答、针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种、抑制受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的发展或进展，和/或用于治疗或预防受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染；其中MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

附图简述

图1是示出MsrA/B的表面定位的图解和照片表示。(A)淋病奈瑟菌1291和脑膜炎奈瑟菌

的野生型(WT)和msr::kan突变体(Δmsr)菌株的使用抗MsrA/B抗体的全细胞酶联免疫吸附测定(ELISA)。还示出了仅含二级抗体(对照)的阴性对照。该图示出了来自三个独立重复的450nm处的平均吸光度+/-一个标准偏差。(B)经胰蛋白酶处理的(20μg、10μg)和未处理的(0μg)全细胞淋病奈瑟菌1291和脑膜炎奈瑟菌

的用针对MsrA/B、脑膜炎球菌表面蛋白PorA和细胞内蛋白GNA2091的抗体探测的蛋白印迹分析。没有观察到来自在时间0和60min获取的样品的在t0对比60min的CFU/ml的显著差异(双尾非配对学生t检验p>1.5；数据未示出)，表明在测定期间没有发生细胞裂解。

图2是示出MsrA/B的免疫原性的图解表示。来自用MsrA/B-明矾或MsrA/B-弗氏进行免疫接种的每只小鼠的免疫后血清的滴度通过针对(A)纯化的重组MsrA/B或针对(B)全细胞淋病奈瑟菌1291野生型(WT)、msr::kan突变体(Δmsr)和互补的(Δmsr_C)菌株的ELISA确定，其中针对(A)纯化的重组MsrA/B确定IgG1、G2a、G2b、G3、IgM，或针对(B)全细胞淋病奈瑟菌1291野生型(WT)、msr::kan突变体(Δmsr)和互补的(Δmsr_C)菌株确定IgG。10只小鼠中的每一只的滴度用环示出，并且几何平均滴度(GMT)和95％置信区间用条(bars)表示。针对全细胞淋病奈瑟菌1291菌株的免疫前血清的滴度为≤200。用于α-MsrA/B-明矾对比α-MsrA/B-弗氏与WT的结合(p＝0.52)；α-MsrA/B-明矾或α-MsrA/B-弗氏与WT对比Δmsr_C的结合(p＝0.0002)的Mann-Whitney U检验。

图3是示出一组淋球菌菌株中MsrA/B表达的照片表示。在一组淋病奈瑟菌菌株(包括1291野生型和msr::kan突变体(1291Δmsr)以及来自粘膜和播散性淋球菌感染的20种临床分离株(Power等人，2007,Infect Immun,75(6),3202-4))中进行MsrA/B表达的蛋白印迹分析。

图4是示出经汇集的针对淋病奈瑟菌的MsrA/B抗血清的功能活性的图解表示。(A)血清杀细菌活性。示出了淋病奈瑟菌在存在经热灭活的免疫前(浅灰色)或α-MsrA/B(深灰色)血清的2倍稀释物加上作为补体来源的10％正常人类血清的情况下的存活率。(B)调理吞噬活性。示出了淋病奈瑟菌在存在经热灭活的免疫前(浅灰色)或α-MsrA/B(深灰色)血清的2倍稀释物加上原代人类多形核白细胞(PMN)和作为补体来源的10％正常人类血清的情况下的存活率。对于插图A-B，数据表示一式三份样品的平均存活率(±1个标准偏差)，作为在不存在抗体的情况下的细菌的百分比(无抗体对照(白色)设定为100％，表示SBA的2.0×10³CFU和OPA的3.5×10³CFU)。(C)对MsrA/B与其底物甲硫氨酸亚砜(Met(O))的结合的阻断。MsrA/B与Met(O)相互作用的表面等离子共振(SPR)在存在免疫前(浅灰色)或α-MsrA/B(深灰色)血清的情况下进行。数据表示一式三份样品的平均MsrA/B-Met(O)结合(±1个标准偏差)，作为在不存在抗体的情况下的MsrA/B-Met(O)结合的百分比(无抗体对照(白色)设定为100％，表示15.4±3.7nM的K_D)。对于插图A-C，使用双尾学生t检验，相对于无血清对照组的统计学显著差异表示为：*P<0.05；**P≤0.01；***P≤0.001。对于插图A-C，来自免疫接种前对比免疫接种后个体小鼠的血清活性的Wilcoxon符号秩检验(p<0.01；表5)。

图5是示出MsrA和MsrB结构域的免疫原性的图解表示。来自用MsrA和MsrB任一种进行免疫接种的每只小鼠的免疫后血清的滴度通过针对全细胞淋病奈瑟菌1291野生型(WT)、msr::kan突变体(Δmsr)和互补的(Δmsr_C)菌株的ELISA确定，其中针对全细胞淋病奈瑟菌1291野生型(WT)、msr::kan突变体(Δmsr)和互补的(Δmsr_C)菌株确定IgG。示出了5只小鼠中每一只的滴度。几何平均滴度(GMT)和95％置信区间用条表示。针对全细胞淋病奈瑟菌1291菌株的免疫前血清的滴度为≤200。用于α-MsrA与WT对比Δmsr的结合或α-MsrB与WT对比Δmsr的结合(p＝0.012)；α-MsrA对比α-MsrB与WT或Δmsr_C的结合(p＝0.12)的Mann-Whitney U检验。

发明详述

1.定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，在下文中定义了以下术语。

除非上下文另有明确指示，单数术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。还应当理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并且是为了描述而提供的。

如本文使用的，“和/或(and/or)”是指并且涵盖一个或更多个相关的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以可选地(或)解释时缺少组合。

如本文使用的，术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如，MsrA/B)特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(其可以缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区(其可以缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(C_L1)。V_H和V_L区可以被进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布着被称为框架区(FR)的更保守区域。每个V_H和V_L包含3个CDR和4个FR，按以下顺序从氨基末端向羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，本发明的抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人类种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可以基于两个或更多个CDR的并列分析(side-by-side analysis)来定义。

抗体包括任何类别的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其子类别)，并且抗体不需要是任何特定类别。根据免疫球蛋白的重链的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白被指定为不同的类别。免疫球蛋白存在五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以被进一步分为子类别(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。

如本文使用的，术语“抗原”及其语法等同物(例如“抗原性的”)是指可以被特异性体液免疫或细胞免疫的产物(诸如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括，例如，半抗原、简单的中间代谢物、糖(例如，寡糖)、脂质和激素以及大分子，诸如复合糖类(例如，多糖)、磷脂和蛋白，尽管为了本文的目的，对抗原的提及通常是对MsrA/B的提及。

术语“抗原结合片段”是指参与抗原结合的抗原结合分子的一部分。这些术语包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。例如，抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术从完整抗体分子获得，所述标准技术诸如蛋白水解消化或重组基因工程技术，包括操纵和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA。这样的DNA是已知的和/或可容易地从例如，商业来源、DNA文库(包括，例如，噬菌体抗体文库)获得，或者可以被合成。可以对DNA进行测序并且如下进行操纵：化学地或通过使用分子生物学技术，例如，以将一个或更多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或以引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。其他工程化分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、单臂抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体(nanobody)(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(small modularimmunopharmaceuticals，SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本文使用的表述“抗原结合片段”中。

抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以是任何尺寸或氨基酸组成，并且通常将包含与一个或更多个框架序列相邻或符合读框(in frame)的至少一个CDR。在具有与V_L结构域相关的V_H结构域的抗原结合片段中，V_H和V_L结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体，并且包含V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。可选地，抗体的抗原结合片段可以包含单体V_H或V_L结构域。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以包含被共价连接至至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括上文列出的任何示例性构型中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过全部或部分铰链区或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，这些氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含以彼此和/或与一个或更多个单体V_H结构域或V_L结构域(例如，通过一个或更多个二硫键)非共价缔合的上文列出的可变结构域和恒定结构域构型中的任一种的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。多特异性抗原结合分子通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够与单独的抗原或与同一抗原上的不同表位特异性结合。使用本领域可得的常规技术，任何多特异性抗原结合分子形式都可以适于本公开内容的抗体的抗原结合片段的背景中。

“抗原结合分子”意指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语扩展至表现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白来源的蛋白框架。可用于实践本发明的代表性抗原结合分子包括抗体及其抗原结合片段。术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段。

如本文使用的，术语“抗原性片段”是指是抗原性的，即，能够与特异性体液免疫或细胞免疫的产物(诸如抗体分子或T细胞受体)特异性相互作用并被其结合的多肽诸如MsrA/B多肽的片段。如应当理解的是，这样的片段本身不必是有免疫原性的，即，当单独施用至受试者时能够引发免疫应答，但是当与适当的佐剂或载体结合施用时可以是有免疫原性的。抗原性片段通常包含至少或约30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或更多个氨基酸。

术语“杀细菌的”是指诸如抗体的剂杀伤细菌的能力。关于抗体的杀细菌活性，活性可以是补体依赖性的或补体非依赖性的。抗体的杀细菌活性可以使用本领域熟知的方法来评估。例如，可以使用血清杀细菌抗体(SBA)测定评估抗体的杀细菌活性。在SBA测定中，抗体(例如，分离的或在血清中)与靶细菌(例如，淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌)在存在补体(优选地，人类补体，尽管通常使用幼兔补体替代)的情况下孵育，并且细菌的杀伤在血清的各种稀释度进行评估以确定SBA活性。

“编码序列(coding sequence)”意指对基因的多肽产物的编码有贡献的任何核酸序列。相比之下，术语“非编码序列(non-coding sequence)”指对基因的多肽产物或基因的最终mRNA产物的编码无贡献的任何核酸序列。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为隐含包括陈述的步骤或要素，或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素，或步骤或要素的组。因此，使用术语“包含”等指示列出的要素是必需的或要求的，但其他要素是任选的并且可以存在或可以不存在。“由以下组成(consisting of)”意指包括并且限于“由以下组成”一词之后的任何事物。因此，措辞“由以下组成”指示列出的要素是必需的或要求的，并且不可以存在其他要素。“基本上由以下组成(consisting essentially of)”意指包括在该措辞之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于所列要素在本公开内容中指定的活动或动作的其他要素。因此，措辞“基本上由以下组成”指示列出的要素是必需的或要求的，但其他要素是任选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响列出的要素的活性或作用。

“保守氨基酸取代(conservative amino acid substitution)”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义，其通常可以如下进行子分类：

表1

氨基酸子分类

保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸，或用结构相关的氨基酸类似地替换氨基酸，不会对所得变体多肽的性质具有大的影响。氨基酸改变是否产生功能性多肽可以通过测定其活性来容易地确定。保守取代在下表2中在示例性和优选的取代的标题下示出。落入本发明范围内的氨基酸取代通常通过选择在其维持(a)在取代区域中的肽骨架的结构，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的作用中没有显著差异的取代来实现。引入取代后，筛选变体的生物活性。

表2

示例性和优选的氨基酸取代

原始残基	示例性取代	优选的取代
			Ala	Val，Leu，Ile	Val
Arg	Lys，Gln，Asn	Lys
			Asn	Gln，His，Lys，Arg	Gln
Asp	Glu	Glu
			Cys	Ser	Ser
Gln	Asn，His，Lys，	Asn
			Glu	Asp，Lys	Asp
Gly	Pro	Pro
			His	Asn，Gln，Lys，Arg	Arg
Ile	Leu，Val，Met，Ala，Phe，Norleu	Leu
			Leu	Norleu，Ile，Val，Met，Ala，Phe	Ile
Lys	Arg，Gln，Asn	Arg
			Met	Leu，Ile，Phe	Leu
Phe	Leu，Val，Ile，Ala	Leu
			Pro	Gly	Gly
Ser	Thr	Thr
			Thr	Ser	Ser
TrD	Tyr	Tyr
			Tyr	Trp，Phe，Thr，Ser	Phe
Val	Ile，Leu，Met，Phe，Ala，Norleu	Leu

如本文使用的，对应的氨基酸残基(或位置)是指在蛋白质的一级氨基酸序列内对齐的基因座处出现的残基(或位置)。相关或变体多肽通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这样的方法通常使匹配最大化，并且包括方法诸如使用手动比对和通过使用许多可得的比对程序(例如，BLASTP)和本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽序列，本领域技术人员可以使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定对应的残基。例如，通过将SEQ ID NO:1中列出的MsrA/B多肽的序列与另一种MsrA/B多肽，诸如SEQ ID NO:8中列出的序列进行比对，本领域技术人员可以使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定对应的残基，例如，SEQ ID NO:1的Thr31对应于SEQ ID NO:9的Ala31。

术语“减少”、“降低”、或“抑制”以及其语法等同物在本文中全部用于通常意指减少统计学显著的量。然而，为了避免疑问，术语“减少”、“降低”或“抑制”及其语法等同物意指与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％，其中减少小于100％。在一种实施方案中，减少包括100％减少(例如，与参考样品相比不存在的水平)，或者与参考水平相比在10％-100％之间的任何减少。

如本文使用的，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可以被转录和/或翻译以产生多肽，或者如果核酸序列可以被加工成可以被转录和/或翻译以产生多肽的形式，那么核酸序列被称为“编码”多肽。这样的核酸序列可以包括编码序列或者编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等包括因DNA分子的转录而产生的RNA产物、因RNA分子的翻译而产生的蛋白、因DNA分子的转录以形成RNA产物和随后RNA产物的翻译而产生的蛋白，或者因DNA分子的转录以提供RNA产物、RNA产物的加工以提供加工的RNA产物(例如，mRNA)和随后加工的RNA产物的翻译而产生的蛋白。

关于基因序列的术语“表达”是指基因转录以产生RNA转录物(例如，mRNA)，并且适当地，所得mRNA转录物翻译为蛋白。因此，如从上下文将清楚的，编码序列的表达因编码序列的转录和翻译而产生。

措辞关于奈瑟菌属感染“对受试者进行免疫接种”及其语法变化形式意指在该受试者中引发免疫应答，该免疫应答部分或完全保护(即，“保护性免疫应答”)受试者免受由奈瑟菌属引起的感染和/或疾病，和/或抑制由奈瑟菌属(例如，淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌)引起的感染和/或疾病的发展和/或进展。因此，为了本公开内容的目的，针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种意指，通过施用本公开内容的组合物、MsrA/B多肽或MsrA/B多核苷酸，引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的保护性免疫应答。因此，术语“保护性免疫应答”是指部分或完全预防或抑制由奈瑟菌属(例如，淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌)引起的感染和/或疾病的发展和/或进展的免疫应答。保护性免疫应答通常包括保护性体液免疫应答，尽管也可以包括保护性细胞介导的免疫应答。针对奈瑟菌属的保护可以例如在临床试验中通过流行病学来测量，但是方便使用间接测量来确认保护性免疫应答已经产生(诸如通过本公开内容的组合物、MsrA/B多肽或MsrA/B多核苷酸产生)。保护性体液免疫应答可以包括杀细菌抗体和/或调理吞噬抗体。在一些实施方案中，保护性体液免疫应答使用SBA测定来评估。在SBA测定中，来自受试者的血清与靶细菌(例如，淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌)在存在补体(优选地，人类补体，尽管通常使用幼兔补体替代)的情况下孵育，并且细菌的杀伤在血清的各种稀释度进行评估以确定SBA活性。SBA测定中观察到的结果可以通过进行竞争性SBA测定来加强，以提供保护性免疫应答产生的进一步间接证据。在竞争性SBA测定中，血清与抗原(例如，MsrA/B多肽)预孵育，并且随后在存在人类补体的情况下与靶细菌孵育。然后评估细菌的杀伤，并且如果受试者的血清中的杀细菌抗体在预孵育阶段期间与感兴趣的抗原结合并且因此不能够与细菌上的表面抗原结合，则杀伤被降低或消除。保护性体液应答也可以通过进行调理吞噬测定(OPA；也称为调理吞噬杀伤测定或OPK测定)来评估。在这些测定中，来自受试者的血清与靶细菌(例如，淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌)在存在补体(例如，人类补体或幼兔补体)和效应细胞诸如吞噬性HL-60细胞(即，已分化为粒细胞的HL-60细胞；参见例如，Romero-Steiner等人，1997,ClinDiagn Lab Immunol.1997；4:415-422)、新鲜多形核白细胞(PML)或多形核中性粒细胞(PMN)的情况下孵育。在测定前和后进行存活细菌计数，以确定调理吞噬活性。

术语“相互作用”，包括其语法等同物，在提及两个分子之间的相互作用时，是指分子彼此之间的物理接触。通常，这样的相互作用导致一种或两种所述分子的活性(其产生生物学作用)。物理接触通常需要分子彼此结合或缔合，并且可以包括感应磁场或顺磁性场的形成、共价键形成、离子相互作用(诸如，例如，如在离子晶格中发生的)、氢键或可选地范德华相互作用，诸如，例如，偶极-偶极相互作用、偶极-感应偶极相互作用、感应偶极-感应偶极相互作用或排斥相互作用，或以上吸引力的任何组合。

如本文使用的术语“MsrA/B多肽”是指包含对应于天然存在的淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的MsrA/B多肽及其变体的氨基酸序列的多肽。该术语涵盖，但不限于，全长MsrA/B多肽，诸如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9-12中列出的那些多肽，及其抗原性片段，包括包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的片段：MsrA区域(例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中列出的)、MsrB区域(例如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中列出的)和/或硫氧还蛋白结构域(例如SEQ ID NO:6中列出的)。在特定实施方案中，本公开内容的MsrA/B多肽是缺乏N-末端信号肽的全部或一部分的抗原性片段，诸如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中列出的MsrA/B多肽。术语“MsrA/B多肽”还涵盖，但不限于，具有与SEQ ID NO:1-12中任一项中列出的序列共同具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽或其抗原性片段。术语“MsrA/B多肽”也意图涵盖相对于天然存在的MsrA/B多肽已经被化学修饰的MsrA/B多肽。如本文使用的，“MsrA/B多核苷酸”是指编码MrsA/B多肽的多核苷酸。在特定实施方案中，MsrA/B多核苷酸和多肽是重组或合成的多核苷酸和多肽，即已经通过重组技术或通过体外化学合成产生。

“获得”及其语法等同物意指变得拥有。如此获得的样品包括，例如，从特定来源分离或衍生的核酸提取物或多肽提取物。例如，提取物可以直接从受试者的生物流体或组织中分离。

如本文使用的，术语“可操作地连接(operably connected)”或“可操作地连接(operably linked)”指其中如此描述的组分处于允许它们以它们预期的方式发挥功能的关系中的并置。例如，调控序列(例如，启动子)“可操作地连接”至感兴趣的核苷酸序列(例如，编码序列和/或非编码序列)是指控制序列相对于感兴趣的核苷酸序列的定位和/或取向，以允许该序列在与控制序列相容的条件下表达。只要控制序列发挥指导感兴趣的核苷酸序列表达的功能，控制序列不必与感兴趣的核苷酸序列连续。因此，例如，间插非编码序列(例如，不翻译但转录的序列)可以存在于启动子和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。

术语“调理吞噬的”是指抗体或其他抗原结合分子与抗原(包括细菌上的抗原(例如，淋病奈瑟菌上或脑膜炎奈瑟菌上的MsrA/B))结合并诱导或促进由效应细胞(例如，巨噬细胞)对抗原(或细菌)的吞噬的能力。抗体的调理吞噬活性可以使用例如如上文描述的OPA测定来评估。

如本文使用的，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、剂、材料、组合物和/或剂型。

如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”意指涉及将主题剂从一个器官或身体的一部分运送或转运至另一个器官或身体的一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)或溶剂包封材料。每种载体必须是“可接受的”，其意义在于与制剂的其他成分相容并且对患者不是有害的。

术语“多核苷酸”在本文可与“核酸”互换使用，以表示核苷的聚合物。通常，本发明的多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的天然存在于DNA或RNA中的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)构成。然而，术语涵盖包含核苷或核苷类似物(所述核苷或核苷类似物包含化学或生物修饰的碱基、修饰的骨架等，无论是否存在于天然存在的核酸中)的分子，并且这样的分子对于某些应用可能是优选的。在本申请涉及多核苷酸的情况下，应当理解，提供了DNA、RNA二者，以及在每种情况下的单链和双链形式二者(以及每种单链分子的互补物)。如本文使用的“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或生物化学地表征特定核酸的序列信息(例如，用作碱基缩写的连续的字母)。除非另有指示，本文呈现的多核苷酸序列以5’至3’方向呈现。

如本文使用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白”和“多肽”在本文可互换使用。肽是通常长度在约2个与60个氨基酸之间的相对短的多肽。本文使用的多肽通常包含氨基酸，诸如最通常在蛋白质中发现的20种L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或更多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体，诸如糖类基团、磷酸基团、脂肪酸基团、用于缀合的接头、官能化等来修饰。具有与其共价或非共价缀合的非多肽部分的多肽仍然被认为是“多肽”。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生，通过化学手段诸如常规固相肽合成等合成。如本文使用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料本身和/或生物化学地表征多肽的序列信息(例如，用作氨基酸名称缩写的连续的字母或三个字母代码)。除非另有指示，本文呈现的多肽序列以N-末端至C-末端的方向呈现。

术语“启动子”在本文以其一般意义使用，以指包含能够启动下游(3’-方向)基因转录的序列的核苷酸区域。“增强子”在本文以其一般意义使用，以指包含以下序列的核苷酸区域：与不存在增强子时从启动子的基因表达相比，所述序列能够增加从启动子的基因转录水平。

“调控序列”、“调控元件”等是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)并且直接或间接影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控元件包括增强子、启动子、翻译前导序列、Rep识别元件、基因间区域和多腺苷酸化信号序列。它们包括天然和合成的序列，以及可以是合成序列和天然序列的组合的序列。

如本文使用的术语“重组多核苷酸”指通过将核酸操纵为通常未在自然界中发现的形式而在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以呈表达载体的形式。通常，这样的表达载体包括可操作地连接至核苷酸序列的转录和翻译调控核酸。

“重组多肽”意指使用重组技术，即通过重组多核苷酸的表达制备的多肽。

如本文使用的术语“样品”包括可以从受试者提取的、未处理的、处理的、稀释的或浓缩的任何生物样本。样品可以包括，但不限于，生物流体，诸如全血、血清、红细胞、白细胞、血浆、唾液、尿液、粪便(stool)(即，粪便(feces))、眼泪、汗液、皮脂、乳头抽出物、导管灌洗液(ductal lavage)、肿瘤渗出物(tumor exudates)、滑液、腹水、腹膜液、羊水、脑脊液、淋巴液、细针抽出物、羊水、任何其他体液、细胞裂解物、细胞分泌产物、炎症液(inflammation fluid)、精液和阴道分泌物。样品可以包括组织样品和活组织检查、组织匀浆等。样品可以包括石蜡包埋的组织和冷冻的组织。术语“样品”还包括未处理或预处理(或预加工)的样品。在一些实施方案中，样品是未处理的生物样品。在另外的实施方案中，术语“样品”涵盖已经被处理或加工的样本，诸如通过随后培养来使细菌生长。

如本文使用的术语“序列同一性”是指诸如30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或更多个核苷酸或氨基酸在比较窗上基于一个核苷酸接着一个核苷酸或基于一个氨基酸接着一个氨基酸的序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”如下计算：通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中出现相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗尺寸)，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

“相似性”是指如上文表1和表2中定义的相同或构成保守取代的氨基酸的百分比。相似性可以使用序列比较程序诸如GAP(Deveraux等人1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)来确定。以这种方式，可通过将空位插入到比对中来比较与本文提及的那些序列长度相似或基本不同的序列，这样的空位例如通过GAP使用的比较算法来确定。

用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“实质同一性(substantial identity)”。“参考序列”的长度为至少12个但经常为15个至18个并且通常至少25个单体单元，所述单体单元包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以各自包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗”上比较两个多核苷酸的序列来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。“比较窗”是指至少6个连续位置，通常约50个至约100个，更通常约100个至约150个的概念区段，其中在两个序列被最佳比对后，序列与具有相同数量的连续位置的参考序列进行比较。为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗可以包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。用于对齐比较窗的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实现(Wisconsin GeneticsSoftware Package发布7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检查来进行并选择各种方法中的任一种所产生的最佳比对(即，产生比较窗上的最高同源性百分比)。还可以参考如例如由Altschul等人，1997,Nucl.Acids Res.25:3389公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等人，“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章的19.3单元中找到。

如本文使用的，关于抗体或其抗原结合片段，“特异性结合”或“对…有特异性”是指抗体或抗原结合片段与关联抗原通过抗体的一个或更多个抗体结合位点和抗原(例如，MsrA/B多肽)之间的非共价相互作用形成一个或更多个非共价键的能力。抗原可以是分离的抗原，诸如分离的蛋白，或者呈现在细胞诸如细菌的表面上的蛋白。通常，与本文的多肽或细胞特异性结合的抗体是以约或至少10⁷-10⁸M^-1的结合亲和力常数(K_a)(或是以下或约以下的解离常数(K_d)：约10^-7M(100nM)或10^-8M(10nM)或更少)结合的抗体。亲和力常数可以通过用于抗体反应的标准动力学方法，例如免疫测定(例如，ELISA)或表面等离子共振(SPR)来确定。用于实时检测和监测结合率的仪器和方法是已知的，并且是商购可得的(例如，Biacore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare Life Sciences)。

如本文定义的“严格条件”或“高严格条件”可以通过以下这些条件来鉴定：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液在pH 6.5与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠在42℃；或者(3)在采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、经声处理的(sonicated)鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸右旋糖酐的溶液中过夜杂交，在42℃在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，随后是10分钟的在55℃的由包含EDTA的0.1×SSC组成的高严格洗涤。

如本文使用的术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，并且更特别是灵长类动物，包括低等灵长类动物，并且甚至更特别是可以受益于本公开内容的人类。受试者，无论是人类或非人类动物或胚胎，都可以被称为个体、受试者、动物、患者、宿主或接受者。为了方便起见，“动物”具体包括家畜动物，诸如牛、马、绵羊、猪、骆驼、山羊和驴，以及家养动物，诸如犬和猫。关于马，这些包括用于赛马业的马以及用于娱乐或畜牧业的那些马。实验室测试动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿动物，诸如大鼠和小鼠，提供了方便的测试系统或动物模型，灵长类动物和低等灵长类动物也是如此。在一些实施方案中，受试者是人类。

如本文使用的术语“合成的多核苷酸”是指通过化学合成在体外形成的多核苷酸。在一些情况下，多核苷酸通过以下产生：首先诸如用固相亚磷酰胺化学产生跨越期望序列的寡核苷酸，然后“组装”寡核苷酸，诸如使用DNA连接酶或聚合酶循环组装(PCA)来产生合成的多核苷酸。

“合成的多肽”意指使用体外化学合成，诸如固相肽合成(SPPS)制备的多肽。

如本文使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。为了本公开内容的目的，在治疗是关于由淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌引起的感染和/或疾病的情况下，效果可以在完全或部分预防由淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌引起的感染和/或疾病方面是预防性的，和/或可以在部分或完全治愈已确定的由淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌引起的感染或疾病方面是治疗性的。

“载体(vector)”意指来源于例如多核苷酸可被插入或克隆到其中的质粒、噬菌体、酵母或病毒的多核苷酸分子，合适地DNA分子。载体可以包含一个或更多个独特的限制性位点，并且可以能够在包括靶细胞或组织或者其祖细胞或组织的已定义的宿主细胞中自主复制，或者是可与已定义的宿主的基因组整合的，使得克隆的序列可繁殖。因此，载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，线性质粒或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体(mini-chromosome)或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何工具(means)。可选地，载体可以是当被引入宿主细胞时被整合进基因组中并且与其整合的一条或更多条染色体一起复制的载体。

术语“野生型”、“天然的”和“天然存在的”在本文可互换使用，以指当从天然存在的来源分离时具有该基因或基因产物的特征(例如序列)的基因或基因产物。

表3

序列简述

除非另有特别陈述，本文描述的每种实施方案加以必要修改被用于每一种和每种实施方案。

2.MsrA/B

淋球菌甲硫氨酸亚砜还原酶MsrA/B通过催化甲硫氨酸亚砜残基Met(O)还原为甲硫氨酸(Met)(Lowther等人，2002,Nat Struct Biol 9(5),348-352；和Brot等人，2006,JBiol Chem 281(43),32668-32675)而在保护淋病奈瑟菌免受氧化损伤方面发挥重要作用(Skaar等人，2002,Proc Natl Acad Sci U S A 99(15),10108-10113)。应对氧化应激的机制对于人类病原体(诸如淋病奈瑟菌)的存活至关重要，淋病奈瑟菌例常地暴露于宿主的氧化杀伤并且通常分离于多形核白细胞(PMN)中。蛋白质中的甲硫氨酸残基可以容易地被存在的活性氧物质氧化，影响蛋白的结构和功能。酶甲硫氨酸亚砜还原酶(Msr)可以通过催化甲硫氨酸亚砜残基(Met(O))在细胞质甲硫氨酸池中和在受损的蛋白质中还原为甲硫氨酸(Met)来修复氧化的甲硫氨酸(Weissbach等人2005,Biochim Biophys Acta 1703(2),203-212)。如大肠杆菌(Escherichia coli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)这样的致病细菌全部包含保护免受氧化损伤的Msr酶。

大多数细菌甲硫氨酸亚砜还原酶系统由单独的细胞质MsrA和MsrB蛋白组成，它们分别对Met-S(O)和Met-R(O)差向异构体有特异性。在催化过程期间，首先产生次磺酸(sulfenic)中间体，同时释放修复的Met，并且其次，发生再循环步骤，其中氧化的MsrA和/或MsrB经由硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶系统还原成它们的活性形式(Ezraty等人，2005,Biochim Biophys Acta 1703(2),221-229)。然而，在淋病奈瑟菌和有密切亲缘性的脑膜炎奈瑟菌中，MsrA、MsrB和硫氧还蛋白酶促功能存在于位于外膜的单个蛋白质MsrA/B中(Skaar等人，2002,Proc Natl Acad Sci U S A 99(15),10108-10113)。

淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的MsrA/B被假设面向周质间隙。然而，如本发明人首次确定的，淋球菌和脑膜炎球菌MsrA/B蛋白是表面暴露的。这与其他革兰氏阴性甲硫氨酸亚砜还原酶的实例形成鲜明对比，在这些实例中，酶存在于细胞质中并且利用由硫氧还蛋白还原酶再生的细胞质巯基池。

来自淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的MsrA/B是高度保守的，并且长度通常是522个氨基酸，在N末端有推定信号肽。来自淋病奈瑟菌菌株1291的示例性全长MsrA/B多肽在SEQID NO:1中列出。构成多肽中每个区域或结构域的精确氨基酸残基尚未确定，但据报道，推定信号序列或肽被包含在对应于SEQ ID NO:1的残基1-31的氨基酸残基中或跨越对应于SEQ ID NO:1的残基1-31的氨基酸残基；硫氧还蛋白结构域被包含在对应于SEQ ID NO:1的残基17-174的氨基酸残基中或包含对应于SEQ ID NO:1的残基17-174的氨基酸残基；MsrA结构域被包含在对应于SEQ ID NO:1的残基181-362或199-354的氨基酸残基中或包含对应于SEQ ID NO:1的残基181-362或199-354的氨基酸残基；并且MsrB结构域被包含在对应于SEQ ID NO:1的残基375-522或383-506的氨基酸残基中或包含对应于SEQ ID NO:1的残基375-522或383-506的氨基酸残基(Lowther等人，2002,Nat Struct Biol 9(5),348-352；和Uniprot登录号P14930)。通过与脑膜炎奈瑟菌MsrA/B多肽比对，催化残基包括对应于位置64、67、68、71、238、250、285、290、348、349、440、442、477、480、493、495和497的位置处的那些残基。

来自淋病奈瑟菌菌株1291的全长MsrA/B多肽(推定信号序列呈粗体)：

3.MsrA/B多肽和多核苷酸

如本文首次展示的，MsrA/B在淋病奈瑟菌和有亲缘性的脑膜炎奈瑟菌中是高度保守且表面暴露的。此外，对MsrA/B有特异性的抗体介导对淋病奈瑟菌的杀细菌的和调理吞噬的杀伤，并且能够抑制MsrA/B与其底物甲硫氨酸亚砜(Met(O))的结合。因此，提供了MsrA/B多肽和多核苷酸，其可以如本文描述用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的免疫应答、用于针对淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种以及用于预防和治疗由淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌引起的感染和/或疾病的组合物、方法和用途中。

3.1示例性MsrA/B多肽

本公开内容的MsrA/B多肽包括全长MsrA/B多肽(例如，SEQ ID NO:1中列出的来自淋病奈瑟菌1291的全长MsrA/B，或者来自其他淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌菌株的全长MsrA/B多肽，诸如来自淋病奈瑟菌PID322(SEQ ID NO:9)、来自淋病奈瑟菌WHO_K(SEQ IDNO:10)、来自淋病奈瑟菌MS-11(SEQ ID NO:11)和来自脑膜炎奈瑟菌MC58(SEQ ID NO:12)的MsrA/B多肽)，其抗原性片段及其变体，诸如包含与其至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的变体。

抗原性片段包括，例如，具有全长MsrA/B多肽的至少或约30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个或510个氨基酸残基的那些。如应当理解的是，抗原性片段必须包括至少一个B细胞表位和/或T细胞表位。通常，抗原性片段包括至少一个B细胞表位，并且优选地2个或更多个B细胞表位，诸如2个、3个、4个、5个或更多个B细胞表位，任选地具有至少一个辅助性T细胞表位，诸如1个、2个、3个、4个或更多个辅助性T细胞表位。

与全长MsrA/B多肽相比，抗原性片段可以在N末端和/或C末端被截短，诸如在N末端和/或C末端被截短了至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个或更多个氨基酸。可选地，或此外，与全长MsrA/B多肽相比，抗原性片段可能缺乏一个或更多个不在N-末或C-末端的(即是“内部的”)氨基酸残基，诸如至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个或更多个氨基酸残基。这些可以是连续的或非连续的。

为全长MsrA/B多肽的抗原性片段的示例性MsrA/B多肽包括缺乏信号序列的全部或一部分的那些多肽，即在N末端被截短的那些多肽。在特定实例中，MsrA/B多肽从全长MsrA/B的N末端缺乏至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。因此，例如，本公开内容的MsrA/B多肽可以包含对应于SEQ ID NO：1的氨基酸5-522、6-522、7-522、8-522、9-522、10-522、11-522、12-522、13-522、14-522、15-522、16-522、17-522、18-522、19-522、20-522、21-522、22-522、23-522、24-522、25-522、26-522、27-522、28-522、29-522、30-522、31-522、32-522、33-522、34-522、35-522、36-522、37-522、38-522、39-522、40-522、41-522、42-522、43-522、44-522、45-522、46-522、47-522、48-522、49-522或50-522的氨基酸。一种这样的示例性MsrA/B多肽是包含对应于SEQ ID NO：1的氨基酸32-522的氨基酸的多肽，即缺乏跨越氨基酸1-31的所有推定信号肽的多肽。这样的多肽的实例是在SEQ ID NO：7中列出的多肽。在另一个非限制性实例中，MsrA/B多肽缺乏信号序列的一部分，并且包含对应于SEQ ID NO：1的氨基酸30-522的氨基酸。这样的多肽的实例是在SEQ ID NO：8中列出的多肽。

N末端截短的MsrA/B多肽(对应于SEQ ID NO：1的aa 32-522)：

ATVPHTLSTLKTADNRPASVYLKKDKPTLIKFWASWCPLCLSELGQAEKWAQDAKFSSANLITVASPGFLHEKKDGEFQKWYAGLNYPKLPVVTDNGGTIAQNLNISVYPSWALIGKDGDVQRIVKGSINEAQALALIRNPNADLGSLKHSFYKPDTQKKDSAIMNTRTIYLAGGCFWGLEAYFQRIDGVVDAVSGYANGNTENPSYEDVSYRHTGHAETVKVTYDADKLSLDDILQYYFRVVDPTSLNKQGNDTGTQYRSGVYYTDPAEKAVIAAALKREQQKYQLPLVVENEPLKNFYDAEEYHQDYLIKNPNGYCHIDIRKADEPLPGKTKAAPQGKGFDAATYKKPSDAELKRTLTEEQYQVTQNSATEYAFSHEYDHLFKPGIYVDVVSGEPLFSSADKYDSGCGWPSFTRPIDAKSVTEHDDFSFNMRRTEVRSRAADSHLGHVFPDGPRDKGGLRYCINGASLKFIPLEQMDAAGYGALKGKVK(SEQ ID NO：7)

N末端截短的MsrA/B多肽(对应于SEQ ID NO：1的aa 30-522)：

GTATVPHTLSTLKTADNKPASVYLKKDKPTLIKFWASWCPLCLSELGQAEKWAQDAKFSSANLITVASPGFLHEKKDGEFQKWYAGLNYPKLPVVTDNGGTIAQNLNISVYPSWALIGKDGDVQRIVKGSINEAQALALIRNPNADLGSLKHSFYKPDTQKKDSAIMNTRTIYLAGGCFWGLEAYFQRIDGVVDAVSGYANGNTENPSYEDVSYRHTGHAETVKVTYDADKLSLDDILQYYFRVVDPTSLNKQGNDTGTQYRSGVYYTDPAEKAVIAAALKREQQKYQLPLVVENEPLKNFYDAEEYHQDYLIKNPNGYCHIDIRKADEPLPGKTKAAPQGKGFDAATYKKPSDAELKRTLTEEQYQVTQNSATEYAFSHEYDHLFKPGIYVDVVSGEPLFSSADKYDSGCGWPSFTRPIDAKSVTEHDDFSFNMRRTEVRSRAADSHLGHVFPDGPRDKGGLRYCINGASLKFIPLEQMDAAGYGALKGKVK(SEQ ID NO：8)

为全长MsrA/B多肽的抗原性片段的示例性MsrA/B多肽还包括包含MsrA结构域的全部或一部分，例如，对应于SEQ ID NO：1的残基181-362或199-354的氨基酸残基的全部或一部分的那些多肽。这样的多肽的非限制性实例是包含对应于SEQ ID NO：1的大致氨基酸225-325、224-326、223-327、222-328、221-329、220-330、219-331、218-332、217-333、216-334、215-335、214-336、213-337、212-338、211-339、210-340、209-341、208-342、207-343、206-344、205-345、204-346、203-347、202-348、201-349、200-350、199-351、198-352、197-353、196-354、195-355、194-356、193-357、192-358、191-359、190-360、189-361、188-362、187-363、186-364、185-365、184-366、183-367、182-368、181-369、180-370、179-381、178-372、177-373、176-374或175-375的氨基酸的那些多肽。这样的多肽的实例是包含SEQ IDNO：2中列出的序列(其对应于SEQ ID NO：1的氨基酸181-362)的那些多肽和SEQ ID NO：3中列出的序列(其对应于SEQ ID NO：1的氨基酸199-354)的那些多肽。

包含MsrA结构域(对应于SEQ ID NO：1的aa 181-362)的MsrA/B多肽：

HSFYKPDTQKKDSAIMNTRTIYLAGGCFWGLEAYFQRIDGVVDAVSGYANGNTENPSYEDVSYRHTGHAETVKVTYDADKLSLDDILQYYFRVVDPTSLNKQGNDTGTQYRSGVYYTDPAEKAVIAAALKREQQKYQLPLVVENEPLKNFYDAEEYHQDYLIKNPNGYCHIDIRKADEPLPG(SEQ ID NO：2)

包含MsrA结构域(对应于SEQ ID NO：1的aa 199-354)的MsrA/B多肽：

RTIYLAGGCFWGLEAYFQRIDGVVDAVSGYANGNTENPSYEDVSYRHTGHAETVKVTYDADKLSLDDILQYYFRVVDPTSLNKQGNDTGTQYRSGVYYTDPAEKAVIAAALKREQQKYQLPLVVENEPLKNFYDAEEYHQDYLIKNPNGYCHIDIR(SEQ ID NO：3)

为全长MsrA/B多肽的抗原性片段的示例性MsrA/B多肽还包括包含MsrB结构域的全部或一部分，例如，对应于SEQ ID NO：1的残基375-522或383-506的氨基酸残基的全部或一部分的那些多肽。这样的多肽的非限制性实例是包含对应于SEQ ID NO：1的大致氨基酸395-495、394-496、393-497、392-498、391-499、390-500、389-501、388-502、387-503、386-504、385-505、384-506、383-507、382-508、381-509、380-510、379-511、378-512、377-513、376-514、375-515、374-516、373-517、372-518、371-519、370-520、369-521或368-522的氨基酸的那些多肽。这样的多肽的实例是包含SEQ ID NO：4中列出的序列(其对应于SEQ IDNO：1的氨基酸375-522)的那些多肽；和SEQ ID NO：5中列出的序列(其对应于SEQ ID NO：1的氨基酸383-506)的那些多肽。

包含MsrB结构域(对应于SEQ ID NO：1的aa 375-522)的MsrA/B多肽：

AATYKKPSDAELKRTLTEEQYQVTQNSATEYAFSHEYDHLFKPGIYVDVVSGEPLFSSADKYDSGCGWPSFTRPIDAKSVTEHDDFSFNMRRTEVRSRAADSHLGHVFPDGPRDKGGLRYCINGASLKFIPLEQMDAAGYGALKGKVK(SEQ ID NO：4)

包含MsrB结构域(对应于SEQ ID NO：1的aa 383-506)的MsrA/B多肽：

DAELKRTLTEEQYQVTQNSATEYAFSHEYDHLFKPGIYVDVVSGEPLFSSADKYDSGCGWPSFTRPIDAKSVTEHDDFSFNMRRTEVRSRAADSHLGHVFPDGPRDKGGLRYCINGASLKFIPL(SEQ ID NO：5)

另外的示例性多肽包括包含硫氧还蛋白结构域的全部或一部分，例如，对应于SEQID NO：1的残基17-174的氨基酸残基的全部或一部分的那些多肽。这样的多肽的非限制性实例是包含对应于SEQ ID NO：1的大致氨基酸40-150、39-151、38-152、37-153、36-154、35-155、34-156、33-157、32-158、31-159、30-160、29-161、28-162、27-163、26-164、25-165、24-166、23-167、22-168、21-169、20-170、19-171、18-172、17-173、16-174、15-175、14-176、13-177、12-178、11-179或10-180的氨基酸的那些多肽。这样的多肽的实例是包含SEQ ID NO：6中列出的序列(对应于SEQ ID NO：1的氨基酸17-174)的多肽。

包含硫氧还蛋白结构域(对应于SEQ ID NO：1的aa17-174)的MsrA/B多肽：

ALGACSPKIVDAGTATVPHTLSTLKTADNRPASVYLKKDKPTLIKFWASWCPLCLSELGQAEKWAQDAKFSSANLITVASPGFLHEKKDGEFQKWYAGLNYPKLPVVTDNGGTIAQNLNISVYPSWALIGKDGDVQRIVKGSINEAQALALIRNPNA(SEQ ID NO：6)

3.2另外的部分

以上和本文描述的MsrA/B多肽也可以包含或被连接至一种或更多种部分，诸如一种或更多种其他抗原性多肽、一种或更多种辅助性T细胞表位、一种或更多种其他免疫刺激分子、一种或更多种靶向剂、一种或更多种聚合物、一种或更多种蛋白、一种或更多种多聚化结构域、一种或更多种可检测标签(labels)、一种或更多种亲和标记(tags)，或它们的任何组合。多肽可以通过本领域已知的任何方法被连接至一种或更多种其他部分，所述方法包括导致多肽和一种或更多种其他部分之间形成共价键和/或非共价键的任何化学或重组方法。

当向受试者施用MsrA/B多肽时，为了有助于引发对MsrA/B多肽的体液免疫应答，该多肽可以与一种或更多种辅助性T细胞表位或包含一种或更多种辅助性T细胞表位的多肽连接。在MsrA/B多肽是全长MsrA/B多肽的抗原性片段并且包含一种或更多种B细胞表位且没有或相对较弱的辅助性T细胞表位的情况下，这可能是特别期望的。任何辅助性T细胞表位都可以与MsrA/B多肽连接，条件是辅助性T细胞表位被该多肽所施用的受试者中的辅助性T细胞识别。在不同MHC背景(即，在遗传多样性群体中)的上下文中被识别的混杂或通用的辅助性T细胞表位是本领域熟知的，并且可以与本文提供的肽连接(参见，例如，Diethelm-Okita等人，2000,J.Inf.Dis.181:1001-1009；Greenstein等人，J Immunol 148(12):3970-3977)。已知的辅助性T细胞表位可以使用公共可访问的数据库诸如免疫表位数据库和分析资源(iedb.org)来鉴定，并且新的辅助性T细胞表位可以使用本领域熟知的方法来鉴定(参见例如，Pira等人，2010,J Biomed Biotechnol)。为期望的目的，鉴定和选择适当的辅助性T细胞表位完全在技术人员的能力范围内。

可以与本文提供的多肽连接的辅助性T细胞表位包括，但不限于，来源于微生物蛋白诸如病毒蛋白和细菌蛋白的那些表位，以及人工或合成的辅助性T细胞表位(参见例如，美国专利第6,713,301号)。在一些实例中，辅助性T细胞表位来自有效的免疫原，诸如破伤风毒素、白喉毒素、脊髓灰质炎病毒、百日咳毒素、麻疹病毒F蛋白、HIV gp120和HIV Gag蛋白以及乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)。在一些情况下，辅助性T细胞表位是在较大蛋白的背景下提供的。因此，本公开内容的MsrA/B多肽可以与包含辅助性T细胞表位的蛋白或多肽连接。示例性蛋白是载体蛋白，诸如破伤风类毒素、白喉类毒素、交叉反应物质197(cross-reacting material 197,CRM-197)。

本发明的MsrA/B多肽也可以亲和标记连接或融合，以例如促进纯化。示例性亲和标记包括，但不限于，几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、FLAG、His、c-myc和HA标记。例如，MsrA/B多肽可以包含His标记，诸如6-His标记，其可以使用金属离子亲和柱或树脂促进多肽的纯化。在另外的实例中，构成裂解位点的氨基酸，诸如构成凝血酶、肠激酶或Xa因子裂解位点的氨基酸，存在于亲和标记和MsrA/B多肽之间，以便能够在纯化后将亲和标记从MsrA/B多肽裂解。可检测分子，包括，但不限于，荧光或化学发光分子，或生物素或链霉抗生物素蛋白，也可以与多肽连接。

与所提供的MsrA/B多肽连接的一种或更多种其他部分可以通过本领域已知的任何方法连接，包括化学方法和重组方法。蛋白(例如，载体蛋白诸如破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM-197)可以使用标准化学偶联技术诸如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或双偶氮联苯胺(bisdiazobenzidine,BDB)偶联被缀合至多肽。在其他实例中，多肽通过肽合成方法或重组方法与其他肽(诸如包括T细胞表位的肽)或蛋白连接。例如，多肽可以通过以下与T细胞表位连接：使用标准方法(例如，Fmoc固相合成)顺序合成多肽，然后将T细胞表位作为单个多肽。在其他实例中，编码MsrA/B多肽的核酸可以与编码T细胞表位(或任何其他蛋白)的核酸和诸如使用细菌表达系统表达的整个核酸分子可操作地连接，以产生包含多肽和T细胞表位的单个多肽。因此，根据所采用的连接方法，连接可以通过共价键和/或非共价键。

在一些实例中，肽接头或间隔物用于连接或融合MsrA/B多肽和一种或更多种其他部分。肽接头通常是约1个氨基酸的长度至约10个氨基酸的长度，尽管可以更长。可以在本文使用的肽接头的非限制性实例包括具有序列K、KK、KKK、GPGPG、G、GG、GGG、GGGG、GGA、GA、GD、GSGGGG、GSGGGGS、GSHMK、GS、RS、RR、KKK、KKAA、VE和AAY的接头。因此，示例性MsrA/B多肽还包括在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQID NO:39中列出的那些，其包括His标记、凝血酶裂解位点和/或接头。

3.3示例性MsrA/B多核苷酸

还提供了编码以下的多核苷酸：以上和本文描述的MsrA/B多肽，诸如SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中列出的多肽中的任一种、其抗原性片段或与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。这样的多核苷酸的非限制性实例包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28中列出的那些，以及与其具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸。例如，编码SEQ ID NO:1的全长MsrA/B多肽的示例性多核苷酸的核酸序列在SEQID NO:13中列出，并且编码缺乏推定信号序列的N末端截短的MsrA/B多肽的示例性多核苷酸(即，包括SEQ ID NO:13的核苷酸94-1569)的核酸序列在SEQ ID NO:14中列出。本公开内容的MsrA/B多核苷酸还包括在高严格性条件下与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的多核苷酸杂交的那些多核苷酸。

编码SEQ ID NO:1的全长MsrA/B多肽的示例性多核苷酸，其中呈粗体的核苷酸(核苷酸1-93)编码推定信号序列：

编码SEQ ID NO：7的N末端截短(即，缺乏推定信号序列)的MsrA/B多肽的示例性多核苷酸：

GCGACCGTGCCGCACACTTTATCCACGTTAAAAACCGCGGACAACCGCCCCGCCAGTGTTTATTTGAAAAAAGACAAACCGACGCTGATTAAATTTTGGGCGAGCTGGTGTCCTTTATGTTTGTCCGAATTGGGACAGGCCGAGAAATGGGCGCAAGATGCAAAATTCAGCTCCGCCAACCTGATTACCGTCGCCTCCCCCGGCTTTTTGCACGAGAAAAAAGACGGCGAGTTTCAAAAATGGTATGCCGGTTTGAACTACCCCAAGCTGCCCGTCGTTACCGACAACGGCGGCACGATCGCCCAAAACCTGAATATCAGCGTTTATCCTTCTTGGGCGTTAATCGGTAAAGACGGCGACGTGCAGCGCATCGTCAAAGGCAGCATCAACGAAGCGCAGGCATTGGCGTTAATCCGCAACCCGAATGCCGATTTGGGCAGTTTGAAACATTCGTTCTACAAACCCGACACTCAGAAAAAGGATTCAGCAATCATGAACACGCGCACCATCTACCTCGCCGGCGGCTGCTTCTGGGGCTTGGAAGCCTATTTCCAACGCATCGACGGCGTGGTTGACGCGGTATCCGGCTACGCCAACGGCAACACGGAAAACCCGAGCTACGAAGACGTGTCCTACCGCCATACGGGCCATGCCGAGACCGTCAAAGTGACCTACGATGCCGACAAACTCAGCCTGGACGACATCCTGCAATATTATTTCCGCGTCGTTGATCCGACCAGCCTCAACAAACAGGGTAACGACACCGGCACGCAATACCGCAGCGGCGTGTACTACACCGACCCCGCCGAAAAAGCCGTCATCGCCGCCGCCCTCAAACGCGAGCAGCAAAAATACCAACTGCCCCTCGTTGTTGAAAACGAACCGCTGAAAAACTTCTACGACGCCGAGGAATACCATCAGGACTACCTGATTAAAAACCCCAACGGCTACTGCCACATCGACATCCGCAAAGCCGACGAACCGCTGCCGGGCAAAACCAAAGCCGCACCGCAAGGCAAAGGCTTCGACGCGGCAACGTATAAAAAACCGAGTGACGCCGAACTCAAACGCACCCTGACCGAAGAGCAATACCAAGTGACCCAAAACAGCGCGACCGAATACGCCTTCAGCCACGAATACGACCATTTGTTCAAACCCGGCATTTATGTGGACGTTGTCAGCGGCGAACCCCTGTTCAGCTCCGCCGACAAATATGATTCCGGCTGCGGCTGGCCGAGCTTCACGCGCCCGATTGATGCAAAATCCGTTACCGAACACGATGATTTCAGCTTCAATATGCGCCGCACCGAAGTCAGAAGCCGCGCCGCCGATTCGCACTTGGGACACGTCTTCCCCGACGGCCCCCGCGACAAAGGCGGACTGCGCTACTGCATCAACGGCGCGAGCTTGAAATTCATCCCGCTGGAACAAATGGACGCGGCAGGCTACGGCGCGTTGAAGGGCAAAGTGAAATAA(SEQ ID NO：14)

3.4用于产生和评估MsrA/B多肽的方法

本文提供的MsrA/B多肽可以使用本领域已知的任何方法产生，包括肽合成技术和重组技术，其中编码MsrA/B多肽的核酸分子用于表达MsrA/B多肽。因此，本文提供了重组和/或合成的MsrA/B多肽和MsrA/B多核苷酸。

在特定实例中，多肽使用本领域熟知的重组方法产生。编码多肽的核酸可以通过任何合适的方法获得，所述方法包括但不限于，对淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌基因组DNA的PCR或编码本公开内容的多肽的多核苷酸的化学合成。设计和/或产生编码本文描述的多肽的核酸分子完全在技术人员的技术范围内。

编码MsrA/B多肽的多核苷酸可以在各种不同的表达系统中表达，诸如，例如，与细菌、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞和植物一起使用的表达系统，其中每一种都是本领域熟知的。编码MsrA/B多肽的多核苷酸可以被克隆到适于所选表达系统的表达载体中，与促进异源核酸分子表达的调控序列可操作地连接。对于多肽的表达，许多表达载体是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。表达载体的选择受宿主表达系统的选择影响。这样的选择完全在本领域技术人员的技术水平范围之内。通常，表达载体可以包括与MsrA/B多核苷酸可操作地连接的转录启动子和任选地增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有允许转化的细胞的选择和维持的选择性标志物。

在一些实例中，使用本领域熟知的细菌表达技术表达MsrA/B多肽。用于各种系统中的细菌表达载体，并且特别是利用大肠杆菌的那些细菌表达载体，是熟知的并且商购可得，并且应当理解，本领域技术人员可以容易地选择和使用适当的细菌表达系统用于产生MsrA/B多肽。简言之，可用于表达异源序列诸如MsrA/B多核苷酸的细菌启动子包括诱导型启动子和组成型启动子。与编码代谢途径酶的细菌基因相关的启动子可能是特别有用的。实例包括来源于糖代谢酶，诸如用于半乳糖、乳糖(lac)和麦芽糖的糖代谢酶的启动子序列。另外的实例包括来源于生物合成酶诸如用于色氨酸(trp)的生物合成酶的启动子序列。合成启动子也广泛用于细菌表达系统，并且包括例如由trp启动子和由lac阻遏物调控的lac操纵子序列二者构成的杂交trp-lac启动子。细菌启动子还可以包括具有结合细菌RNA聚合酶和启动转录的能力的非细菌来源的天然存在的启动子。非细菌来源的天然存在的启动子也可以与相容的RNA聚合酶偶联，以在原核生物中产生一些基因的高水平表达。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的实例。除了发挥功能的启动子序列外，有效的核糖体结合位点(例如，大肠杆菌中的Shine-Dalgarno(SD)序列)也可用于原核生物中的外源基因表达。用于表达MsrA/B多肽的细菌表达载体通常也包含转录终止序列。

MsrA/B分子可以在细胞内表达和保留，或者可以从细胞分泌。例如，MsrA/B多核苷酸可以被表达为嵌合或融合蛋白，所述嵌合或融合蛋白包含被提供用于蛋白在细菌中的分泌的外源信号肽。信号序列通常编码由疏水性氨基酸组成的信号肽，该信号肽指导蛋白从细胞的分泌。蛋白被分泌到生长培养基中(革兰氏阳性细菌)，或者分泌到位于细胞内外膜之间的周质间隙中(革兰氏阴性细菌)。优选地，信号肽片段和外来基因之间编码可以被体内或体外裂解的加工位点。合适的信号序列包括来源于分泌型细菌蛋白的基因的那些，诸如大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)、大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列(phoA)和来自各种芽孢杆菌属(Bacillus)菌株的α-淀粉酶基因的那些。

酵母诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)也可用作MsrA/B多肽的表达宿主。酵母可以用附加型复制载体进行转化或通过以同源重组的稳定染色体整合进行转化。通常，诱导型启动子，诸如包括GAL1、GAL7和GAL5，用于调控基因表达。酵母表达载体通常包括选择性标志物，诸如LEU2、TRPl、HIS3和URA3，用于选择和维持转化的DNA。

在另一个实例中，昆虫和昆虫细胞用于表达MsrA/B多肽。例如，杆状病毒表达系统可以与昆虫细胞结合使用。杆状病毒具有限制性宿主范围，这改进了安全性并且减少了真核表达的调控问题。通常，表达载体使用启动子，诸如用于高水平表达的杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒，诸如苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)。示例性昆虫细胞系包括这样的来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9细胞系、来源于Pseudaletia unipuncta的A7S细胞系和来源于黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)的DpN1细胞系。为了高水平表达，待表达的分子的核苷酸序列紧接地在病毒多角体蛋白起始密码子的下游融合。

哺乳动物表达系统也可以用于表达本文描述的MsrA/B多肽。表达构建体可以通过病毒感染(诸如使用腺病毒)或通过直接DNA转移(诸如使用脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖)和通过物理手段(诸如电穿孔和显微注射)转移到哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多聚腺苷酸化元件。这样的载体通常包括用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV40启动子-增强子、人类巨细胞病毒(CMV)启动子，以及劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)的长末端重复序列。可用于哺乳动物表达的示例性细胞系包括但不限于，小鼠、大鼠、人类、猴、以及鸡和仓鼠的细胞，诸如BHK、293-F、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NSO(非分泌的)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤(heterohybridoma)细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8和HKB细胞。

MsrA/B多肽的抗原性质可以使用本领域技术人员已知的各种方法来评估。例如，多肽诱导抗体应答的能力可以通过向受试者(例如，非人类受试者)一次或更多次施用(诸如通过静脉内、腹膜内或肌肉内注射)多肽来评估。通常，多肽与合适的佐剂(诸如下文描述的佐剂)一起配制或共施用。引发的免疫应答，并且特别是抗体应答，可以在免疫接种后的各个时间点通过对受试者的血液取样并且使用适当的测定诸如ELISA或蛋白印迹对血清进行分析来评估。例如，多孔板可以用MsrA/B多肽或淋病奈瑟菌制剂或脑膜炎奈瑟菌制剂包被。这样的方法可以用于确定通过施用所提供的多肽而引发的抗体应答的量级和特异性。多肽被抗体(包括针对淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的多克隆抗体或单克隆抗体)识别的能力可以通过标准方法进行评估，标准方法包括但不限于ELISA、蛋白印迹、斑点印迹、表面等离子共振和快速流动测试(例如，横向或垂直流动测试)。

4.核酸递送媒介物

编码本文描述的MsrA/B多肽的多核苷酸可以在核酸递送媒介物中提供。这样的媒介物可以递送至受试者，用于在受试者中表达MsrA/B多肽。这些媒介物可以包括病毒或非病毒载体，以及机械和颗粒递送平台。

用于疫苗应用的病毒载体是本领域熟知的(关于综述，参见，例如，Ura等人，2014Vaccines 2(3):624-641；Choi和Chang,2013,Clin Exp Vaccine Res.2(2):97-105；Humphreys和Sebastian,2018,Immunology 153:1-9)。可以用于向受试者递送编码MsrA/B多肽的多核苷酸的病毒载体的非限制性实例包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒(例如，巨细胞病毒(CMV))、甲病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒(例如，仙台病毒)、细小病毒、小RNA病毒、痘病毒(例如，牛痘病毒)和披膜病毒载体。

逆转录病毒载体是本领域熟知的，并且MsrA/B多核苷酸可以被引入任何逆转录病毒载体中，包括B型、C型和D型逆转录病毒、异嗜性逆转录病毒(xenotropic retroviruses)(例如，NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1)、多嗜性逆转录病毒(polytropic retroviruses)，例如，MCF和MCF-MLV、泡沫病毒属(spumavirus)和慢病毒中。用于构建包含MsrA/B多核苷酸的逆转录病毒载体的示例性逆转录病毒包括禽白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、水貂细胞病灶诱导病毒(Mink-Cell Focus-Inducing Virus)、鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis)病毒和劳氏肉瘤病毒。在一些实例中，逆转录病毒载体的部分来源于不同的逆转录病毒。例如，逆转录载体长末端重复序列(LTR)可以来源于鼠肉瘤病毒，tRNA结合位点来自劳氏肉瘤病毒，包装信号来自鼠白血病病毒，并且第二链合成起点来自禽白血病病毒。

重组逆转录病毒载体可以用于通过将它们引入适当的包装细胞系来产生有转导能力(transduction competent)的逆转录病毒载体颗粒。可以通过将嵌合的整合酶掺入逆转录病毒颗粒中来构建用于位点特异性整合到宿主细胞DNA中的逆转录病毒载体(参见WO1996/37626)。优选地，重组病毒载体是复制缺陷型重组病毒。适合用于与上文描述的逆转录病毒载体一起使用的包装细胞系是本领域熟知的，易于制备(参见例如，WO1995/30763和WO1992/05266)，并且可以用于产生用于产生重组载体颗粒的生产者细胞系(producercell lines)(也称为载体细胞系或“VCL”)。优选地，包装细胞系由人类亲代细胞(例如，HT1080细胞)或水貂亲代细胞系制成，这消除了人类血清中的灭活。

人类腺病毒(例如，Ad5)和腺病毒相关病毒(AAV)载体也是已知的，并且可用于递送MsrA/B多核苷酸以在受试者中表达。腺病毒载体通常是无复制能力的，并且已被广泛用于许多感染性疾病的疫苗接种策略，诸如疟疾、狂犬病、HIV、结核病和流感的疫苗接种策略(关于综述，参见，例如，Zhang和Zhou,2016,Hum Vaccin Immunother.2016Aug；12(8):2064-2074)。AAV载体，并且特别是具有不同衣壳多肽的基于AAV-2的载体，已经广泛用于人类中的基因疗法和疫苗应用，并且可以在本公开内容中应用(关于综述，参见，例如，Naso等人，2017,BioDrugs 31(4):317-334)。AAV载体通常包含与启动子可操作地连接的位于感兴趣基因(在这种情况下，是MsrA/B多核苷酸)侧翼的两个AAV反向末端重复序列(ITR)。这种重组AAV基因组被包装在AAV衣壳中，其可以具有有限的(特异性)或广泛的细胞嗜性。

合适的病毒载体还包括，例如，疱疹载体(例如，CMV载体)、甲病毒载体(例如，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、辛德比斯病毒(SIN)、Semliki forest病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合体；关于综述，参见，例如，Lundstrom 2012,JVacc Vaccination,3:139)，鼻病毒(参见，例如，Tomusange等人，2015,Virus Res 203:72-6)、牛痘病毒(参见，例如，Gilbert 2013,Vaccine 31(39):4241-4246)、麻疹病毒(参见，例如，Cantarella等人，2009.Vaccine 27:3385-3390)和基孔肯亚病毒(参见，例如，Brandler等人，2013,Vaccine 31:3718-3725)。

将MsrA/B多核苷酸递送到细胞不限于上文提及的病毒载体。可以采用的其他递送方法和介质，诸如，例如微米颗粒和纳米颗粒，包括基于聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)的颗粒、基于聚(乙烯亚胺)(PEI)的颗粒、基于壳聚糖的纳米颗粒、阳离子脂质和无机颗粒(关于综述，参见，例如，Farris等人，2016,241:919-929)。也可以采用脂质体、病毒样颗粒等(在下文更详细地讨论的)。适合使用的另外的非病毒递送包括机械递送系统，诸如基因枪系统。

5.治疗性抗原结合分子

本公开内容还提供了与淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌MsrA/B多肽特异性结合的抗原结合分子，包括多克隆抗体和单克隆(mAb)抗体及其抗原结合片段。通常，抗原结合分子表现出体外和/或体内的杀细菌和/或调理吞噬活性。在一些情况下，抗原结合分子也可以抑制MsrA/B多肽的活性，诸如与Met(O)的结合，这可以抑制MsrA/B多肽催化Met(O)还原为甲硫氨酸的能力。因此，本公开内容的抗体可以被治疗性使用，以便治疗受试者中的淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌感染。

因此，本文提供了与本文描述的MsrA/B多肽(包括SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中列出的MsrA/B多肽，其抗原性片段及其包括至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的变体)特异性结合的分离的抗体，诸如分离的多克隆抗体和单克隆抗体(包括其抗原结合片段，诸如单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段)。抗体可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE，并且可以是多克隆或单克隆的、非人类的(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或人类的，或者嵌合的或人源化的。优选地，抗体是人类的或人源化的。在特定实施方案中，抗体是IgG抗体，包括例如IgG1、IgG2a和/或IgG3抗体。在另外的实施方案中，抗体是IgA抗体。

用于制备针对多肽的抗原结合分子的技术是本领域熟知的。例如，针对本文描述的MsrA/B多肽的多克隆抗体可以通过向受试者(诸如非人类受试者，例如，小鼠、大鼠或兔)施用多肽(任选地与佐剂组合)来产生。然后，施用后产生的多克隆抗体可以从受试者的血清中分离。在其他实例中，对MsrA/B多肽有特异性的单克隆抗体可以通过向受试者(例如，非人类受试者)注射多肽(任选地与佐剂组合)，然后取出脾以获得B淋巴细胞来获得。可选地，B淋巴细胞可以从外周血淋巴细胞(PBL)中分离。然后来自免疫接种的受试者的B淋巴细胞可以与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，所述杂交瘤被克隆。产生针对MsrA/B多肽的抗体的阳性克隆使用标准技术(例如，ELISpot)来选择，培养产生针对抗原的抗体的克隆，并且从杂交瘤培养物中分离抗体。

单克隆抗体可以通过各种良好建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化，技术包括但不限于，用蛋白-A

的亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析。在最初产生针对MsrA/B多肽的抗体后，可以对抗体进行测序，并且随后通过重组技术进行制备。抗体的人源化形式可以使用标准和熟知的技术制备。

单克隆抗体及其抗原结合片段也可以从抗体文库中产生。例如，总RNA可以从受试者(诸如健康受试者或已经感染了或正在感染淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的受试者)的外周血B淋巴细胞中提取，并且cDNA文库通过扩增μ、γ和κ链抗体储库(repertoires)来构建。然后，cDNA文库可以用于制备展示文库，诸如噬菌体展示文库，其中抗体的抗原结合片段，诸如单链Fv(scFv)片段，在噬菌体的表面上被表达为与噬菌体外壳蛋白(coat protein)融合的融合蛋白。通常，文库是组合的。然后，可以对识别和结合MsrA/B多肽的抗体或其片段进行筛选和选择。可选地，先前制备的抗体文库，包括先前制备的免疫文库、初始文库(

libraries)、半合成文库和合成文库，可以用于筛选和选择与MsrA/B多肽特异性结合的抗体。用于产生和筛选抗体文库以便鉴定具有期望特异性的抗体的方法是本领域熟知的，并且任何这样的方法都可以与本公开内容结合使用(关于综述，参见，例如，Lerner,2016,Nat Rev Immunol,16(8):498-508；Lim和Chan,2016,Curr Pharm Des.,22(43):6480-6489；以及Chen和Sidhu,2014,Methods Mol Biol.1131:113-31)。

本公开内容的抗原结合分子可以与一种或更多种部分连接，诸如以便于检测，诸如在临床前研究中的检测。例如，抗原结合分子可以与可检测的标签，诸如荧光、化学发光、酶、生物素/链霉抗生物素蛋白或代谢标签连接。可以与抗体和抗原结合片段连接的标签的非限制性实例包括生物素、链霉抗生物素蛋白、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(四甲基异硫氰酸罗丹明，TRITC)、绿色荧光蛋白(GFP)、别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻红蓝蛋白。抗原结合分子可以使用本领域已知的任何方法与一个或更多个部分连接。例如，连接可以通过使用各种熟知的技术之一的化学缀合，包括但不限于使用NHS酯、异双功能试剂(heterobifunctional reagents)、碳二亚胺或高碘酸钠。

本公开内容的抗原结合分子的结合性质，诸如与本文提供的MsrA/B多肽或淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌结合的能力，可以通过已建立的方法(例如ELISA和蛋白印迹)来表征。本领域技术人员已知的任何方法都可以用于测量抗原结合分子的结合性质。在一些实例中，结合性质通过进行饱和结合测定，例如饱和ELISA来评估，其中抗体与多肽的结合通过递增量的抗体来评估。在这样的实验中，可能评估结合是否是剂量依赖性的和/或可饱和的。此外，结合亲和力可以从50％的结合信号进行外推。通常，表观结合亲和力根据其结合常数(K_a)或解离常数(K_d)来测量，并且使用Scatchard分析来确定。例如，与靶多肽的结合亲和力可以在竞争结合测定(其中添加递增浓度的未标记蛋白)中评估，诸如通过放射免疫测定(RIA)或ELISA。抗体与淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌结合的能力也可以使用本领域熟知的方法来评估。例如，抗原结合分子与淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的结合可以通过ELISA或蛋白印迹来评估，或者通过使用直接或间接荧光的显微术来可视化。

抗原结合分子的杀细菌和/或调理吞噬活性也可以使用熟知的测定在体外和/或体内进行评估。例如，抗原结合分子可以在体外评估，诸如下文实施例中描述的。简言之，评估了淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌在存在本公开内容的抗原结合分子和人类补体来源(例如，人类血清)的情况下的存活率。在另一个实例中，评估了淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌在存在本公开内容的抗原结合分子、多形核中性粒细胞(PMN)和人类补体来源(例如，人类血清)的情况下的存活率。淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌感染的非人类动物模型也可以用于评估抗原结合分子的活性。这样的小鼠模型包括，例如，用于淋病奈瑟菌的经雌二醇处理的雌性小鼠模型和各种转基因模型(例如，CAECAM1)(参见，例如，Jerse,1999,Infect.Immun.67,5699-570；Packlam等人，2010,Infect Immun.,78(1):433-440；和Rice等人，2017,Annu Rev Microbiol.,71:665-686)，以及用于脑膜炎奈瑟菌的右旋糖酐铁模型和各种转基因模型(例如，CD46、CAECAM1和人类运铁蛋白)(参见，例如Yi等人，2003,Infect Immun.71(4):1849-1855；Weyand,2017,Pathogens Dis,75(3),ftx031)。

6.组合物

还提供了组合物，所述组合物包含以上和本文描述的MsrA/B多肽、MsrA/B多核苷酸(任选地在核酸递送媒介物内)和/或抗MsrA/B抗原结合分子。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。

在组合物包含MsrA/B多肽或MsrA/B多核苷酸的情况下，组合物通常是免疫原性组合物(或疫苗组合物)。这样的免疫原性组合物在向受试者施用时引发对存在于组合物中或由组合物中的多核苷酸编码的MsrA/B多肽的免疫应答。最通常，免疫应答是预防、抑制或改善由淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌引起的感染和/或疾病的保护性免疫应答。用于本公开内容的组合物优选地具有至少10％，例如，>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>85％、>90％或更多的针对淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的疫苗效力。保护性免疫应答通常包含抗MsrA/B抗体，其可以是杀菌的、调理吞噬的和/或功能性阻断的(即抑制MsrA/B多肽的功能，诸如抑制MsrA/B多肽催化Met(O)还原为甲硫氨酸的能力)。抗体可以包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和/或IgA抗体。在特定实施方案中，本公开内容的免疫原性组合物引发抗MsrA/B的IgG1、IgG2a、IgG3和/或IgA抗体。

通常，本公开内容的免疫原性(或疫苗)组合物包含佐剂，并且合适的佐剂对于本领域技术人员是已知的。合适的佐剂的非限制性实例包括铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾(也称为明矾))、油包水乳剂或水包油乳剂(例如，

(包含角鲨烯的水包油乳剂)和AS03(包含角鲨烯的水包油乳剂)、3-<9-脱酰化-4'-单磷酰基脂质A(MPL)和包含MPL的佐剂(例如，AS01、AS02、AS04和AS15；关于综述，参见，Garcon和DiPasquale,2017,Hum Vaccin Immunother.2017,13(1):19-33)，toll样受体(TLR)激动剂(包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10激动剂，包括CpG；关于综述，参见Steinhagen等人，2011,29(17):3341-3355)，基于皂苷的佐剂、脂质体、病毒微体、病毒样颗粒(VLP)、外膜囊泡(OMV)、细胞因子、趋化因子和生长因子，诸如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如，INF-γ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。本文还考虑了在同一组合物中两种或更多种佐剂的组合。

基于皂苷的佐剂包括来源于例如皂树、人参、三七、西洋参、桔梗、美远志、远志、巴西皂树、黄芪和牛膝的皂苷或皂苷衍生物。示例性的基于皂苷的佐剂包括iscom、iscom基质、ISCOMATRIX^TM佐剂、Matrix M^TM佐剂、Matrix C^TM佐剂、Matrix Q^TM佐剂、

-100佐剂、

-300佐剂、ISCOPREP^TM、ISCOPREP^TM衍生物、包含ISCOPREP^TM或ISCOPREP^TM衍生物的佐剂，QS-21、QS-21衍生物，以及包含QS-21或QS21衍生物的佐剂。

TLR激动剂包括天然激动剂和合成激动剂二者，所述天然激动剂诸如PAMP(病原体相关分子模式)或DAMP(损伤相关分子模式)配体。用于本公开内容的目的的TLR激动剂是本领域已知的，并且包括TLR1/2激动剂(例如，三酰化脂肽，Pam3Cys)、TLR2激动剂(例如，来自革兰氏阳性细菌的肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、脂多糖(LPS)、GPI锚蛋白、奈瑟孔蛋白(Neisserial porin)、磷酸脂甘露聚糖(phospholipomannan)、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1和Hib-OMPC)、TLR3激动剂(例如，单链和双链病毒RNA、多I:C、多A:U)、TLR4激动剂(例如，GLA-SE(在稳定的水包油纳米乳剂(SE)中配制的吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)；Coler等人，PLoS ONE 6,e16333)、LPS、RSV F-蛋白；甘露聚糖、糖基磷脂酰肌醇、RSV和MMTV包膜蛋白、Hsp60、Hsp70、纤连蛋白结构域A、表面活性型蛋白A、透明质酸、HMGB-1、AGP、MPLA、RC-529、MDF2β和CFA)、TLR2/6激动剂(例如，酚溶调控蛋白(phenol-soluble modulin)、二酰化脂肽、LTA、酵母聚糖、MALP-2、Pam2Cys和FSL-1)、TLR7激动剂(例如，病毒单链RNA、人类RNA、鸟苷类似物和咪唑并喹啉(例如，咪喹莫特、

R848、

)和洛索立宾)、TLR8激动剂(例如，病毒单链RNA、人类RNA、咪唑并喹啉、洛索立宾(loxoribine)和ssPolyU)、TLR9激动剂(dsDNA病毒、疟原虫色素、未甲基化的CpG DNA、人类DNA/染色质、LL37-DNA和CpG-寡核苷酸)和TLR10激动剂。在特定实例中，纳米颗粒载体包括Pam2Cys。

可以被抗原呈递细胞(APC)并且特别是树突细胞(DC)内化的颗粒载体，也被考虑作为用于本公开内容的佐剂。示例性颗粒载体包括，但不限于，脂质体(包括中性脂质体、阴离子脂质体或阳离子脂质体；和醇质体(ethosomes))、病毒微体、VLP、OMV、古细菌脂质体(archaeosomes)、质膜囊泡(PMV)、niosomes、脂质核心肽(LCP)、免疫刺激复合物(ISCOM)、基于聚合物的纳米颗粒(例如，可生物降解的纳米颗粒，诸如聚(D,L-乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)纳米颗粒、聚丙烯硫化物纳米颗粒和多羟基化纳米颗粒)。各种各样的颗粒载体是本领域熟知的，并且已经在其他地方进行了广泛的研究和描述(关于综述，参见，例如，Joshi等人，2012,J Cont Release 161:25-37；Altin 2012,Liposomes and othernanoparticles as cancer vaccines and immunotherapeutics.Chapter 8In:Innovations in Vaccinology:from design,through to delivery andtesting.S.Baschieri编著,Springer；Gregory等人，2013,Front Cell InfectMicrobiol.3:13；以及Zhao等人，2014,32(3):327-337)。因此，本公开内容还提供了颗粒载体，诸如上文描述的任一种，其包含MsrA/B多肽或MsrA/B多核苷酸。

在特定实例中，颗粒载体(即，佐剂)是OMV。OMV天然存在于革兰氏阴性细菌中，并且是由蛋白、脂质(主要是LPS)和周质内容物组成的非复制球形纳米颗粒。由于OMV的颗粒性质和组成，包括各种病原体相关分子模式(PAMP)，OMV是高度免疫刺激性的，能够与先天性免疫系统和适应性免疫系统二者接合。OMV本身已被用作独立疫苗(例如，脑膜炎奈瑟菌OMV在有或没有另外的脑膜炎奈瑟菌抗原的情况下作为用于脑膜炎奈瑟菌的疫苗)。然而，它们也是与外源抗原一起使用的有效佐剂(关于综述，参见，例如，Gerritzen等人2017,Biotech Adv.35:565-574；和Tan等人，2018,Front Microbiol,9:783)。用选择的抗原制备OMV的方法是本领域熟知的，并且在其他地方进行了描述(关于综述，参见，例如，Gerritzen等人，上文)。简言之，抗原，诸如本公开内容的MsrA/B多肽，可以与OMV一起配制用于表面暴露、非表面暴露、附接至OMV或不附接(即，单纯的混合物)。抗原和OMV可以由革兰氏阴性细菌同时产生，使得OMV在抗原装载到OMV的表面或腔的情况下产生。可选地，抗原可以在OMV产生后附接至OMV，诸如通过在抗原上使用亲和标记的共价附接来附接至OMV，所述亲和标记与OMV中的融合蛋白结合(参见，例如，Alves等人，2015,ACS Appl.Mater.Interfaces,7(44):24963-24972)。仍此外，抗原可以在OMV已经产生后装载到OMV腔中，或者可以在OMV已经产生后与OMV单纯地混合。用作本公开内容的MsrA/B多肽的佐剂的示例性OMV包括由任何革兰氏阴性细菌(包括但不限于脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌)产生的OMV。

在其他实例中，佐剂包括脂质体，脂质体是基于脂质的双层囊泡。脂质的粒度和物理参数的多功能性导致脂质体被广泛用作用于制药、化妆品和生物化学目的的药物、肽、蛋白和核酸分子的载体。脂质体主要由形成囊泡的脂质组成，其可以是天然的、半合成的或完全合成的，并且是中性的、带负电荷的或带正电荷的。示例性的形成囊泡的脂质包括鞘脂、醚脂质(ether lipids)、甾醇、磷脂，特别是磷酸甘油酯，以及糖脂，诸如脑苷脂和神经节苷脂。适合用于脂质体的脂质是本领域技术人员已知的，并且在各种来源中陈述，诸如1998年McCutcheon的Detergents and Emulsifiers、1998年McCutcheon的FunctionalMaterials，二者均由McCutcheon Publishing Co.,New Jersey以及Avanti PolarLipids,Inc.Catalog出版。在特定实例中，脂质体包括以下中的任一种或更多种：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(l’-外消旋-甘油)(钠盐)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(DOPS)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐)(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750](铵盐)(DSPE-PEG750)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或2-(4,4-二氟-5-甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-Indacene-3-十二酰基)-1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Bodipy)。产生脂质体的方法是本领域技术人员熟知的，并且已经在其他地方进行了广泛描述(关于综述，参见，例如，Wagner和Vorauer-Uhl(2011)J DrugDelivery,文章ID 591325；Yu等人，(2009)Methods Enzymol.465:129-141，和Laouini等人，(2012)J Colloid Sci Biotech 1:147-168),2012.)。这些方法包括，例如，薄膜水合、去垢剂透析、逆相蒸发、乙醇注射、单相溶液的冷冻干燥、微流体水动力学聚焦(microfluidic hydrodynamic focusing)和超临界流体方法。

在特定实施方案中，佐剂是促进对MsrA/B多肽的体液应答或促进对MsrA/B多肽的主要体液应答的佐剂。

本公开内容的免疫原性组合物还可以包含一种或更多种另外的抗原(例如，1种、2种、3种、4种、5种或更多种另外的抗原)，包括一种或更多种淋病奈瑟菌抗原、一种或更多种脑膜炎奈瑟菌抗原或者来自另一种病原体(包括细菌、真菌或病毒病原体)的一种或更多种抗原。抗原可以是，例如，蛋白、编码蛋白的多核苷酸、多糖或寡糖。在特定实例中，免疫原性组合物包含一种或更多种淋病奈瑟菌抗原，诸如，例如，PilC、PilQ、Opa、AniA、TdfJ、PorB、Lst、TbpB、TbpA、OmpA、OpcA、MetQ、MtrE和/或2C7表位或表位模拟物(关于综述，参见，例如，Jerse,2014,Vaccine 32(14):1579-1587；Vincent和Jerse,2018,Vaccine 18April)。免疫原性组合物也可以或可选地包含一种或更多种脑膜炎奈瑟菌抗原，包括但不限于来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135和/或Y中的一种或更多种荚膜多糖或寡糖、NadA、fHbp、NHBA、GNA1030、GNA2091、HmbR、NspA、NhA、App、Omp85、TbpA、TbpB和/或Cu,Zn-超氧化物歧化酶。

本公开内容还考虑了药物组合物，所述药物组合物包含与一种或更多种药学上可接受的载体一起配制的MsrA/B多肽、MsrA/B多核苷酸和/或抗MsrA/B抗原结合分子。药物组合物可以任选地包含一种或更多种其他抗原或抗体、化合物、药物、成分和/或材料。无论所选择的施用途径如何，本公开内容的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型(参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21版，Lippincott Williams和Wilkins,Philadelphia,Pa.))。

本公开内容的药物组合物可以以任何期望和有效的方式向受试者施用。例如，药物组合物可以被配制用于口服摄入，或作为软膏剂或滴剂用于向眼睛局部施用，或用于肠胃外施用或以任何适当的方式(诸如腹膜内、皮下、局部、皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌肉内、静脉内、心房内、鞘内或淋巴管内)进行的其他施用。此外，本公开内容的药物组合物可以与一种或更多种辅助治疗组合施用，如下文详细描述的。如果需要，本公开内容的药物组合物可以被包封或以其他方式保护抵抗胃分泌物或其他分泌物。

本公开内容的药物组合物可以包含与一种或更多种药学上可接受的载体以及任选地一种或更多种其他化合物、药物、成分和/或材料进行混合的一种或更多种活性成分。无论所选择的施用途径如何，本公开内容的双特异性抗体通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型(参见，例如，Remington,The Science and Practice ofPharmacy(第21版，Lippincott Williams和Wilkins,Philadelphia,Pa.))。

药学上可接受的载体是本领域熟知的(参见，例如，Remington,The Science andPractice of Pharmacy(第21版，Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,Pa.)和美国国家药品处方集(National Formulary)(美国药学会(American PharmaceuticalAssociation),Washington,D.C.))并且包括糖类(例如，乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇)、淀粉、纤维素制剂、磷酸钙(例如，磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水性溶液(例如，盐水、氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液)、醇类(例如，乙醇、丙醇和苯甲醇)、多元醇类(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)、有机酯类(例如，油酸乙酯和甘油三酯)、可生物降解的聚合物(例如，聚乳酸-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))、弹性体基质(elastomeric matrices)、脂质体、微球、油类(例如，玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油和花生油)、可可脂、蜡(例如，栓剂蜡(suppository wax))、石蜡、硅酮、滑石、水杨酸盐等。在本公开内容的药物组合物中使用的每种药学上可接受的载体必须是“可接受的”，其意义在于与制剂的其他成分相容并且对受试者不是有害的。适于选择的剂型和预期施用途径的载体是本领域熟知的，并且用于选择的剂型和施用方法的可接受的载体可以使用本领域普通技术来确定。

本公开内容的药物组合物任选地包含药物组合物中常用的另外的成分和/或材料，包括治疗性抗原结合分子制品。这些成分和材料是本领域熟知的，并且包括(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂(agar-agar)、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂(solution retardingagents)，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和月桂基硫酸钠；(10)悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶；(11)缓冲剂；(12)赋形剂，诸如乳糖(lactose)、乳糖(milk sugar)、聚乙二醇、动物和植物脂肪、油类、蜡、石蜡、可可脂、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末；(13)惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；(14)防腐剂；(15)表面活性剂；(16)分散剂；(17)控释剂或吸收延迟剂，诸如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、可生物降解聚合物、脂质体、微球、单硬脂酸铝、明胶和蜡；(18)乳浊剂；(19)佐剂；(20)乳化剂和悬浮剂；(21)增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯；(22)推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代的烃，诸如丁烷和丙烷；(23)抗氧化剂；(24)使制剂与预期接受者的血液等渗的剂，诸如糖和氯化钠；(25)增稠剂；(26)包衣材料，诸如卵磷脂；和(27)甜味剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。每种这样的成分或材料必须是“可接受的”，其意义在于与制剂的其他成分相容并且对受试者不是有害的。适于选择的剂型和预期施用途径的成分和材料是本领域熟知的，并且用于选择的剂型和施用方法的可接受的成分和材料可以使用本领域普通技术来确定。

适于口服施用的本公开内容的药物组合物可以呈以下的形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、颗粒剂、水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水液体乳剂、酏剂或糖浆、锭剂、大丸剂(bolus)、舐剂(electuary)或糊剂。这些制剂可以通过本领域已知的方法制备，例如通过常规的锅包衣(pan-coating)、混合、制粒或冻干方法制备。

用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒剂等)可以通过将一种或更多种活性成分与一种或更多种药学上可接受的载体以及任选地一种或更多种填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂和/或着色剂混合来制备。类似类型的固体组合物可以用作使用合适的赋形剂的软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂可通过任选地与一种或更多种辅助成分一起压制或模制来制备。压制片剂可以使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制而成。片剂和其他固体剂型，诸如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂，可以任选地用包衣和壳，诸如肠溶衣和药物配制领域中熟知的其他包衣进行刻痕(scored)或制备。它们也可以被配制以便提供其中的活性成分的缓慢或控制释放。它们可以通过例如截留细菌的过滤器进行过滤来灭菌。这些组合物也可以任选地包含乳浊剂并且可以属于这样的组合物：它们仅或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分。活性成分也可以呈微包封的形式。

用于直肠或阴道施用的本公开内容的药物组合物可以以栓剂的形式呈现，所述栓剂可以通过将一种或更多种活性成分与一种或更多种合适的非刺激性载体混合来制备，所述载体在室温是固体，但在体温是液体，并且因此会在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。适于阴道施用的本公开内容的药物组合物还包括包含本领域已知适当的这样的药学上可接受的载体的阴道栓剂、卫生棉条、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。

用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。液体剂型可以包含本领域常用的合适的惰性稀释剂。除了惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。悬浮液可以包含悬浮剂。

适于肠胃外施用的本公开内容的药物组合物包含与一种或更多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮剂或乳剂或者无菌粉末的组合的一种或更多种剂/化合物/抗原结合分子，所述无菌粉末可以就在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体，所述组合物可以包含合适的抗氧化剂、缓冲剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。适当的流动性可以例如通过使用包衣材料、在分散体的情况下通过维持期望的粒度，以及通过使用表面活性剂来维持。这些组合物还可以包含合适的佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和分散剂。包括等渗剂也可能是期望的。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的剂来实现。

用于局部或经皮施用的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂(包括微针贴剂)、滴剂和吸入剂。活性剂(例如，治疗性组合)可以在无菌条件下与合适的药学上可接受的载体混合。软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶可以包含赋形剂。粉末和喷雾剂可以包含赋形剂和推进剂。

在一些情况下，为了延长药物组合物的效果，减缓其对来自皮下或肌肉内注射的吸收是期望的。这可以通过包含具有差水溶性的结晶或无定形物质的液体悬浮剂来实现。

然后组合物的单独组分的吸收速率取决于其溶出速率，其继而可能取决于晶体尺寸和结晶形式。可选地，肠胃外施用的组合物的活性组分的延迟吸收可以通过将组分溶解或悬浮在油媒介物中来实现。可注射的贮库(depot)形式可以通过在可生物降解聚合物中形成活性成分的微包封的基质来制备。根据活性成分与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质，可以控制活性成分的释放速率。贮库可注射制剂还通过将活性组分包封在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。可注射物质可以通过例如截留细菌的过滤器进行过滤来灭菌。

制剂可以呈现于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在冻干条件中，仅需要在临使用之前添加无菌液体载体例如注射用水。即时注射液和悬浮液可以由上文描述的类型的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。

7.预防性和治疗性方法

本文还公开了一种用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答(诸如保护性免疫应答)的方法，该方法包括向受试者施用包含MsrA/B多肽和/或MsrA/B多核苷酸的组合物。因此，本公开内容扩展至本文描述的MsrA/B多肽和/或MsrA/B多核苷酸用于制备疫苗(或免疫原性)组合物的用途，所述疫苗(或免疫原性)组合物用于引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答(诸如保护性免疫应答)、用于针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种和/或预防或治疗受试者中由淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌引起的感染和/或疾病。此外，本公开内容涵盖用于通过施用包含本文描述的抗MsrA/B抗原结合分子的组合物来治疗受试者中由淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌引起的感染和/或疾病的方法。

如应当理解的是，鉴于来自淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的MsrA/B多肽之间的高水平序列同一性，当向受试者施用本公开内容的组合物时，可以引发交叉反应性和交叉保护性免疫应答。因此，例如，施用包含来自淋病奈瑟菌的MsrA/B多肽或多核苷酸的组合物可以导致产生针对淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌二者的免疫应答，以及针对淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌二者感染的保护。类似地，施用包含来自脑膜炎奈瑟菌的MsrA/B多肽或多核苷酸的组合物可以导致产生针对脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌二者的免疫应答，以及针对脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌二者感染和/或疾病的保护。这样的交叉反应性和交叉保护先前已经被建议用于奈瑟菌属疫苗(参见，例如，Petousis-Harris等人，2017,Lancet 390:1603-1610)。

在一些实施方案中，被施用组合物的受试者为淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌血清阴性的。在其他情况下，受试者为淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌血清阳性的。此外，受试者可能未感染淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌。在这样的情况下，组合物诸如疫苗组合物作为预防性组合物施用。在其他实施方案中，受试者感染了淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌。在这样的情况下，组合物，诸如疫苗组合物或包含抗MsrA/B抗体的组合物，作为治疗性组合物施用。

如本文描述的组合物通常以“有效量”施用；即有效引发免疫应答或治疗性作用或预防性作用的量。本领域技术人员能够通过常规实验来确定包含在药物组合物中或为了期望的结果而施用的有效、无毒的量。通常，如本文公开的组合物可以以与施用途径和接受者的身体特征(包括健康状态)相容的方式并且以其引发期望的一种或更多种作用(即，治疗有效的、免疫原性的和/或保护性的)的这样的方式施用。例如，组合物的适当剂量可以取决于各种因素，包括但不限于受试者的身体特征(例如，年龄、体重、性别)、组合物是用作单一剂还是作为辅助疗法的一部分、任何潜在感染的进展(即，病理状态)以及本领域技术人员可认识到的其他因素。在确定例如组合物的适当剂量时可以被考虑的一般因素的其他说明性实例被以下讨论：Gennaro(2000,"Remington:The Science and Practice ofPharmacy",第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；和Gilman等人，(编著),(1990),"Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics",PergamonPress)。

预期有效量会落在相对宽的范围内，该范围可以通过本领域技术人员已知的方法、考虑到上文概述的一些因素来确定。有效量可以由本领域技术人员凭经验确定。

对于本领域技术人员将明显的是，如果需要诱导期望的免疫应答，个体剂量的最佳数量和间隔可以通过例如施用的形式、途径和部位以及待治疗的特定受试者的性质来确定，如本文其他地方描述的。最佳条件可以使用本领域技术人员已知的常规技术来确定。

本发明的组合物通常向受试者直接施用，诸如经由肠胃外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或皮内)，或通过任何其他合适的途径，包括鼻内、口服或经由阴道栓剂。在一些实施方案中，组合物以肌肉内施用。注射可以经由针(例如，皮下针)进行，但是也可以使用无针注射。用于人类受试者的典型肌肉内剂量体积为0.5ml，但可以是0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL或更大，并且可以取决于受试者的体重和/或年龄以及其他因素。剂量的体积还可以根据组合物中MsrA/B多肽、MsrA/B多核苷酸或抗MsrA/B抗体的浓度而变化。

在一些情况下，具有数次或多次组合物施用可能是期望的。例如，组合物可以被施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。施用可以是约一天间隔至约52周间隔，并且在某些实施方案中，可以是约一周至约四周、一周至八周、一周至十二周、一周至二十四周或一周至三十六周间隔。可能需要定期再施用以达到可期望的结果，诸如期望的免疫应答水平。

给出以下实施例仅仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1

材料和方法

细菌菌株和生长条件

淋病奈瑟菌1291、来自粘膜和播散性淋球菌感染的20种临床分离株(Power等人，2007Infect Immun 75(6),3202-3204)和脑膜炎奈瑟菌

(Virji等人1995MolMicrobiol 18(4),741-754)菌株在37℃在5％CO₂分别生长在具有1％IsoVitaleX(BectonDickinson)的GC琼脂(Oxoid)或具有10％Levinthal基础培养基的脑心浸液(BHI,Oxoid)1％琼脂上，根据需要使用卡那霉素(kan)(100μg/ml)或四环素(5μg/ml)。

序列生物信息学分析

MsrA/B在可于GenBank和脑膜炎球菌研究基金会(Meningitidis ResearchFoundation,MRF)脑膜炎球菌基因组文库(PubMLST)数据库获得的淋球菌基因组中的分布，使用BLAST搜索来自淋病奈瑟菌1291的MsrA/B进行了研究(GenBank登录：蛋白-EEH61172.1；核苷酸-DS999919.1，基因座标记NGAG_00088)。

突变体菌株的产生

来自淋病奈瑟菌1291的1569bp msr基因用引物1291msrFor(5'-GCCGTCTGAAATGAAACACCGTACTTTCTTTTCCC-3'；SEQ ID NO:17)和1291msrRev(5'-TTCAGACGGCTTATTTCACTTTGCCCTTCAACGCG-3'；SEQ ID NO:18)(包含奈瑟菌属摄取序列5’-GCCGTCTGAA-3’(SEQ IDNO:19))来扩增，并且将所得的PCR产物克隆到p

-T Easy(Promega)中以产生pGemTmsr。Mutation Generation System^TM(MGS)试剂盒(Thermo Fisher)用于根据制造商的说明将包含kanR3基因的转座子插入pGemTmsr中。kanR3在msr中的位置和取向通过测序确定。将msr::kan构建体线性化并且通过同源重组转化到淋病奈瑟菌1291和脑膜炎奈瑟菌

中，以产生1291msr::kan和

msr::kan突变体菌株。为了产生互补菌株，将完整的msr基因使用互补质粒pCTS32(Steichen等人，2008J Inf Dis 198(12),1856-1861)引入1291msr::kan突变体，或者使用pComPind(Ieva等人，2005,J Bacteriol 187(10),3421-3430)引入

msr::kan突变体。

MsrA/B蛋白表达

msr基因使用引物msrexp_NdeIF(5'-AAAATCCATATGAAAGGGACCGCGACCGTGCCGCA-3'；SEQ ID NO:20)和msrexp_XhoIR(5'-CCCTGACTCGAGTTATTTCACTTTGCCCTTC-3'；SEQ IDNO:21)从淋病奈瑟菌1291中扩增，并且将所得的PCR产物克隆到pET15b中以获得Msr表达构建体pET15bmsr。将构建体pET15bmsr转化到大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS宿主菌株(Novagen)中，并且将MsrA/B过表达并纯化。简言之，表达通过0.1mM IPTG在室温诱导24小时，达到0.4的在600nm的光密度(OD₆₀₀)。收获细胞培养物，并且将细胞沉淀物重悬在缓冲液A中。细胞通过声处理进行裂解、离心并且将上清液施加到装有TALON^TM金属亲和树脂的柱(Clontech laboratories,Inc)上。未结合的蛋白用20柱体积的缓冲液A洗掉，随后用10柱体积的缓冲液A与20mM咪唑洗掉。MsrA/B蛋白在1ml的200mM咪唑的级分中洗脱。将级分收集，并且通过用考马斯蓝染色的4-12％Nu

Novex Bis-Tris凝胶(Invitrogen)并且通过抗His多克隆抗血清的蛋白印迹进行分析。

重组表达的MsrA/B缺乏全长MsrA/B多肽的氨基酸1-29，即，推定信号序列中的大部分。因此，重组表达的MsrA/B包含SEQ ID NO:1的氨基酸30-522。与多肽的N末端融合的是6-His标记和凝血酶裂解位点，序列由pET15载体提供。重组表达的MsrA/B的氨基酸序列和编码核酸序列在下文示出。

重组表达的MsrA/B的氨基酸序列(包含6-His标记和凝血酶裂解位点的N末端区域呈粗体)：

通过凝血酶裂解去除6-His标记的重组表达的MsrA/B的氨基酸序列，(剩余裂解位点和接头氨基酸呈粗体)：

编码重组表达的MsrA/B的核酸序列(包含6-His标记和凝血酶裂解位点的N末端区域呈粗体)：

MsrA/B小鼠抗血清产生(抗MsrA/B)

10只雌性BALB/c小鼠(6周龄)的组用5μg重组MsrA/B与

(氢氧化铝，InvivoGen)或弗氏(FCA/FIA,Sigma-Aldrich)佐剂在第0天、第21天和第28天进行皮下免疫接种。在第42天收集终末出血(Terminal bleeds)。对于弗氏佐剂，在第0天使用弗氏完全佐剂(FCA)，并且在第21天和第28天的加强中使用弗氏不完全佐剂(FIA)。免疫接种前4天收集每只小鼠的前-出血(pre-bleed)。本研究根据格里菲斯大学动物伦理委员会(theGriffith University Animal Ethics Committee，AEC)的澳大利亚科学目的动物护理和使用规范(the Australian Code for the Care and Use of Animals for scientificPurposes)的建议来进行。方案经格里菲斯大学AEC批准。

细胞表面胰蛋白酶消化

将1291和

的过夜培养物以0.05的OD₆₀₀接种到适当的培养基中。在37℃生长2小时后，将细胞收获，洗涤一次并且重悬在PBS中至2的OD₆₀₀。细胞悬浮液(200μl)用胰蛋白酶(trypsin gold，Promega)在37℃处理60min。细胞悬浮液在时间0和在60min以一式三份获取，用于确定菌落形成单位(CFU)/ml，以确认细胞生存力，并且通过使用抗MsrA/B的蛋白印迹分析进行分析。使用的对照抗体是表面暴露的PorA(NIBSC-UK-EN63QFG)和细胞质GNA2091(Seib等人，2010,Vaccine 28(12),2416-2427；Bos等人，2014,J Biol Chem 289(22),15602-15610)。

ELISA

对于全细胞ELISA，使细菌在BHI或GC板上生长16小时。将细胞收获并且以0.2的OD₆₀₀重悬在PBS中。微量滴定板孔用50μl细菌悬浮液填充，并且在超净工作台中在室温干燥过夜。然后将经干燥的孔中的细菌在56℃热杀伤1小时。对于重组蛋白ELISA，将板的孔在室温用100μl包被缓冲液(0.5M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)中的100ng纯化的重组MsrA/B蛋白包被1小时。所有ELISA都用小鼠免疫前或经MsrA/B免疫接种的血清以及如结果中规定的二级抗体(多克隆抗小鼠Ig HRP(Dako)或者IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgM HRP(Thermofisher Scientific))进行。底物TMB(3,3',5,5-四甲基联苯胺)溶液(Thermofisher Scientific)按照制造商的说明使用。添加等量的1N盐酸以使反应停止。在TECAN Model Infinite 200Pro读板器中在450nm处读取吸光度。

血清杀细菌测定

将淋病奈瑟菌1291(～1x10³ CFU)在热灭活(56℃，60min)的抗MsrA/B血清或免疫前血清的系列稀释物中在37℃孵育15min，之后将正常人类血清(如先前描述的(McQuillen等人1994,Methods Enzymol 236,137-147)，用淋病奈瑟菌预吸收(pre-absorbed))添加至10％(v/v)的最终浓度，作为补体来源。然后将悬浮液在37℃、5％CO₂孵育30min，并且细菌CFU通过铺板连续稀释物来确定。杀细菌滴度是30min后诱导多于50％杀伤的最低抗体稀释度的倒数。统计显著性使用单因素方差分析(ANOVA)、学生t检验和Wilcoxon符号秩检验来计算。

来自健康志愿者的全血通过静脉穿刺收集。对于血清，将血液收集在Vacuette Z血清分离管(Greiner Bio-One)中，允许在室温凝结15min，然后以2,000×g离心10min。本研究根据格里菲斯大学人类研究伦理委员会的关于人类研究中伦理行为国家声明的建议进行，具有来自所有受试者的书面知情同意。所有受试者都根据Helsinki宣言给予书面知情同意。方案经格里菲斯大学人类研究伦理委员会批准。

调理吞噬杀伤测定

多形核白细胞(PMN)使用Polymorphprep^TM(Axis-Shield)按照制造商的说明从供体血液中分离(收集在K3 EDTA管(Greiner Bio-One)中)，并且重悬在测定缓冲液(补充有0.15mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂和0.5％(v/v)人类血清白蛋白的RPMI(Gibco))中。淋病奈瑟菌1291(～1×10³CFU)在热灭活的抗MsrA/B血清或免疫前小鼠血清的系列稀释物中在37℃孵育15min。然后添加PMN(～1×10⁵个细胞)和补体来源(用淋病奈瑟菌预吸收的10％v/v正常人类血清)，并且在37℃孵育90min。淋球菌存活率在将系列稀释物铺板在GC琼脂上后进行确定，并且存活率计算为相对于无抗体对照的百分比。调理吞噬滴度是90min后诱导多于50％杀伤的最低抗体稀释度的倒数。统计显著性使用单因素方差(ANOVA)、学生t检验和Wilcoxon符号秩检验来计算。

表面等离子共振(SPR)

进行SPR测定，使用Biacore T200用于亲和力分析并且Pall Pioneer FE用于竞争测定。亲和力测定如先前描述地(Semchenko等人2017,Infect Immun 85(2)e00898-16)进行。简言之，使用胺偶联试剂盒(GE Life Sciences)将MsrA/B以5μL/min的流量固定在Series S CM5传感器芯片的流动池2上持续10分钟。流动池1用作参考池，并且仅用乙醇胺固定。Met(O)使用单循环动力学以0.16nM至100nM的最终浓度范围运行。数据使用BiacoreT200评估软件包进行分析。对于竞争分析，使用胺偶联，利用EDC-NHS反应，将MsrA/B固定在COOH5生物传感器芯片的流动池1并且流动池2的表面上用空白固定。简言之，EDC-NHS混合物以10μL/min流动跨越流动池1和2持续10min。然后，将MsrA/B在乙酸钠pH 4.5中以25μg/mL的浓度以5μL/min流动跨越流动池1持续20min。然后，乙醇胺以10μL/min流动10分钟，以阻断任何剩余的活性NHS。竞争测定在一步测定构建器(OneStep assay builder)中使用NextStep注射进行。免疫前和免疫后MsrA/B小鼠血清用作第一注射(A)，并且Met(O)作为第二注射(B)，其中PBS用作阴性对照。竞争注射运行60秒，其中A在时间零以血清的1:100稀释开始，并且跨越注射时间降低，其中B组分跨越注射时间内增加，在60秒达到10μM。将Met(O)与MsrA/B的结合与血清和无血清以及与免疫前血清和免疫后血清进行比较。数据使用Pioneer软件包进行收集，并且使用Qdat分析软件进行分析。阻断百分比基于具有和没有血清的Met(O)注射以及具有和没有Met(O)的血清的相对RMax来计算。

实施例2

MsrA/B的分布和保守性的评估

为了研究MsrA/B在淋病奈瑟菌菌株中的分布和保守性，用来自淋病奈瑟菌1291的MsrA/B(SEQ ID NO:1；GenBank登录号EEH61172.1)进行BLAST搜索。对GenBank中淋病奈瑟菌基因组菌株的分析揭示了，MsrA/B是高度保守的，在468种菌株中100％存在，在522种氨基酸蛋白的长度上具有99％-100％的氨基酸同一性。在PubMLST数据库中存在35个独特的淋球菌MsrA/B序列，它们之间具有97.5％-100％同一性。在98％的菌株中存在四种主要变体，由以下菌株表示：PID322(54％的菌株；SEQ ID NO:9)、WHO_K(20％；SEQ ID NO:10)、1291(19％；SEQ ID NO:1)和MS-11(5％；SEQ ID NO:11)。淋病奈瑟菌1291MsrA/B序列与脑膜炎奈瑟菌MC58的MsrA/B(SEQ ID NO:12)是98％相同的。

因此，MsrA/B在淋病奈瑟菌中是高度保守的，在所有研究的菌株中具有>97％的氨基酸同一性。总体上，仅两个位点具有共同的变异：～75％的分离株中Thr31被取代为Ala31，并且～25％的分离株中Lys520被取代为Glu520。残基31在MsrA/B的经预测的信号肽中。这在下文在菌株1291、PID322、WHO_K和MS-11的序列中示出，其中位置31和520处的残基呈粗体并且被加下划线。其他变体氨基酸残基都不位于在脑膜炎奈瑟菌MsrA/B中鉴定的任何已知的催化结构域中。来自脑膜炎奈瑟菌MC58的MsrA/B多肽与来自淋病奈瑟菌1291的MsrA/B多肽共享约98％的序列同一性。

淋病奈瑟菌菌株1291(SEQ ID NO:1)：

淋病奈瑟菌菌株PID322(SEQ ID NO:9)：

淋病奈瑟菌株WHO_K(SEQ ID NO:10)：

淋病奈瑟菌菌株MS-11(SEQ ID NO:11)：

脑膜炎奈瑟菌菌株MC58(SEQ ID NO:12)：

实施例3

MsrA/B的定位

基于细胞分级分离实验(cell fractionation experiments)，提出淋病奈瑟菌MsrA/B是外膜蛋白(Skaar等人，2002,Proc Natl Acad Sci U S A 99(15),10108-10113)，然而MsrA/B在外膜中的取向并未确定。因此进行了进一步阐明MsrA/B定位的研究。

使用TMHMM(Krogh等人，2001,J Mol Biol 305(3),567-580)进行拓扑预测分析，并且表明MsrA/B不具有任何跨膜结构域，且整个蛋白位于膜外(数据未示出)。为了直接研究MsrA/B是否是表面暴露的，用针对重组MsrA/B产生的小鼠抗血清进行了淋病奈瑟菌1291和脑膜炎奈瑟菌

的野生型和msr::kan突变体菌株的全细胞ELISA。

全细胞ELISA表明，抗MsrA/B与野生型1291和

完整细胞结合(分别地，256,000和512,000的滴度)，但与突变体菌株的结合显著降低(分别地，8,000和1,000的滴度)(图1A)。此外，类似于脑膜炎球菌表面蛋白PorA，当完整的细菌细胞用10μg或20μg胰蛋白酶处理60min时，MsrA/B对消化完全易感(图1B)。细胞内蛋白GNA2091不受胰蛋白酶处理的影响。该ELISA和蛋白印迹数据确认MsrA/B位于淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌二者的表面上。胰蛋白酶处理不影响细胞生存力，因为胰蛋白酶处理前和胰蛋白酶处理后之间的CFU计数不存在显著差异(数据未示出)。

实施例4

MsrA/B的免疫原性

为了研究MsrA/B的免疫原性，10只小鼠用重组MsrA/B与氢氧化铝(MsrA/B-明矾)或弗氏佐剂(MsrA/B-弗氏)进行免疫接种。血清通过ELISA和蛋白印迹进行评估。重组MsrA/B的ELISA结果表明了用MsrA/B和任一佐剂进行免疫接种的小鼠中的优势IgG1应答，其中MsrA/B-明矾的几何平均滴度(GMT)为1,222,945，并且MsrA/B-弗氏的几何平均滴度(GMT)为8,914,438(图2A)。与MsrA/B-明矾相比，在免疫接种MsrA/B-弗氏的小鼠中检测到IgG2a、IgG2b和IgG3的更高滴度，而两种佐剂的IgM滴度是类似的(图2A、表4和表5)。

对淋病奈瑟菌1291野生型、1291msr::kan突变体和互补的菌株的全细胞ELISA表明，来自每只小鼠的MsrA/B抗血清能够识别细菌表面上的天然MsrA/B蛋白(图2B、表4和表5)。存在针对来自用任一佐剂进行免疫接种的小鼠的野生型的类似应答(MsrA/B-明矾的GMT为155,496，MsrA/B-弗氏的GMT为183,792(p＝0.52))，并且存在对msr::kan突变体菌株的显著降低的应答(两种佐剂的GMT为2,000，p<0.001对比野生型)。通过针对淋病奈瑟菌野生型和msr::kan突变体的全细胞裂解物的蛋白印迹对MsrA/B抗血清的分析确认，MsrA/B抗血清特异性识别MsrA/B。在免疫前血清中不存在针对MsrA/B的反应性，而特异性识别野生型菌株中MsrA/B的所有小鼠产生抗体应答(表4和表5)。

该ELISA和蛋白印迹数据确认MsrA/B是有免疫原性的，并且抗MsrA/B抗血清可以特异性识别淋病奈瑟菌的表面上的MsrA/B。MsrA/B的表达和MsrA/B抗血清的交叉反应性通过对来自粘膜和播散性淋球菌感染的20种临床分离株的蛋白印迹分析来确认(图3)。

实施例5

MsrA/B抗血清的杀细菌和调理吞噬活性

研究了小鼠MsrA/B-明矾和MsrA/B-弗氏抗血清引发对淋病奈瑟菌的血清杀细菌活性(SBA)和调理吞噬(OPA)杀伤的能力。将淋病奈瑟菌与汇集的MsrA/B抗血清和作为补体来源的人类血清的系列稀释物一起孵育，表明MsrA/B-弗氏抗血清介导剂量依赖性杀伤，具有100的SBA滴度(图4A)。对来自10只个体小鼠的MsrA/B-弗氏血清的SBA分析显示，9/10只小鼠的剂量依赖性杀伤，以及8/10只小鼠的SBA滴度从免疫前血清到免疫后血清的≥2倍增加(表5)。在测试的稀释度观察到MsrA/B-明矾血清的最小杀伤(滴度<50；表4)。

将淋病奈瑟菌与汇集的MsrA/B-弗氏抗血清、人类PMN和作为补体来源的人类血清一起孵育揭示了剂量依赖性调理吞噬杀伤，具有400的滴度(图4B)。对来自10只个体小鼠的MsrA/B-弗氏血清的分析显示剂量依赖性杀伤，以及9/10只小鼠的OPA滴度从免疫前血清到免疫后血清的≥2倍增加(表5)。MsrA/B-明矾抗血清不介导任何调理吞噬杀伤(表4)。

实施例6

MsrA/B抗血清对MsrA/B与Met(O)结合的影响

为了研究MsrA/B抗血清是否能够阻断MsrA/B的功能作用，在不存在血清的情况下，以及在存在免疫前抗血清和MsrA/B-弗氏抗血清的情况下，对MsrA/B与甲硫氨酸亚砜(Met(O))的结合进行SPR分析。将重组MsrA/B固定在SPR传感器芯片上，并且使游离的Met(O)流过固定的蛋白。MsrA/B以高亲和力与Met(O)结合，具有15.4±3.7nM的KD(平衡解离常数)(数据未示出)。用汇集的MsrA/B-弗氏抗血清进行的竞争测定将MsrA/B-Met(O)结合从100％降低至32％(图4C；p≤0.002对比无血清或免疫前血清)，而汇集的免疫前血清并未显著降低MsrA/B-Met(O)相互作用(81％±12％结合，p＝0.05)。对个体血清的筛选显示，与无血清和免疫前血清对照相比，9/10小鼠血清显著阻断了MsrA/B-Met(O)结合(p＜0.05，表5)，其中来自一只小鼠的血清阻断了＞99％的MsrA/B与Met(O)的结合。

实施例7

用MsrA和MsrB结构域进行的免疫接种

msrA和msrB结构域分别使用以下引物从淋病奈瑟菌1291扩增：15bmsrAFor_NdeI(TTGGGCCATATGAAACATTCGTTCTAC；SEQ ID NO：22)和15bmsrARev_XhoI(GGCTTTCTCGAGTTAGCCCGGCAGCGGTTCGT；SEQ ID NO：23)；和15bmsrBFor_NdeI(GGCAAACATATGAAAGCGGCAACGTATAAAA；SEQ ID NO：24)和15bmsrBRev_XhoI(TGCGGCCTCGAGTTATTTCACTTTGCCCTTCAA；SEQ ID NO：25)。将所得的PCR产物克隆到pET15b中以获得Msr表达构建体pET15bmsrA和pET15bmsrB。将这两个构建体转化到大肠杆菌BL21Star(DE3)pLysS宿主菌株(Novagen)中，并且将MsrA和MsrB过表达并纯化。纯化的MsrA和MsrB蛋白的his标签通过凝血酶CleanCleaveTM试剂盒(Sigma-Aldrich)去除。

编码从pET15bmsrA表达和纯化的MsrA的核酸序列：

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAACATTCGTTCTACAAACCCGACACTCAGAAAAAGGATTCAGCAATCATGAACACGCGCACCATCTACCTCGCCGGCGGCTGCTTCTGGGGCTTGGAAGCCTATTTCCAACGCATCGACGGCGTGGTTGACGCGGTATCCGGCTACGCCAACGGCAACACGGAAAACCCGAGCTACGAAGACGTGTCCTACCGCCATACGGGCCATGCCGAGACCGTCAAAGTGACCTACGATGCCGACAAACTCAGCCTGGACGACATCCTGCAATATTATTTCCGCGTCGTTGATCCGACCAGCCTCAACAAACAGGGTAACGACACCGGCACGCAATACCGCAGCGGCGTGTACTACACCGACCCCGCCGAAAAAGCCGTCATCGCCGCCGCCCTCAAACGCGAGCAGCAAAAATACCAACTGCCCCTCGTTGTTGAAAACGAACCGCTGAAAAACTTCTACGACGCCGAGGAATACCATCAGGACTACCTGATTAAAAACCCCAACGGCTACTGCCACATCGACATCCGCAAAGCCGACGAACCGCTGCCGGGCTAA(SEQ ID NO：26)

从pET15bmsrA表达和纯化的MsrA的氨基酸序列(通过凝血酶裂解去除的his标签区域呈粗体)：

从pET15bmsrA表达和纯化的MsrA的氨基酸序列，其中his标签区域通过凝血酶裂解去除：

GSHMKHSFYKPDTQKKDSAIMNTRTIYLAGGCFWGLEAYFQRIDGVVDAVSGYANGNTENPSYEDVSYRHTGHAETVKVTYDADKLSLDDILQYYFRVVDPTSLNKQGNDTGTQYRSGVYYTDPAEKAVIAAALKREQQKYQLPLVVENEPLKNFYDAEEYHQDYLIKNPNGYCHIDIRKADEPLPG(SEQ ID NO：28)

编码从pET15bmsrB表达和纯化的MsrB的核酸序列：

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAAGCGGCAACGTATAAAAAACCGAGTGACGCCGAACTCAAACGCACCCTGACCGAAGAGCAATACCAAGTGACCCAAAACAGCGCGACCGAATACGCCTTCAGCCACGAATACGACCATTTGTTCAAACCCGGCATTTATGTGGACGTTGTCAGCGGCGAACCCCTGTTCAGCTCCGCCGACAAATATGATTCCGGCTGCGGCTGGCCGAGCTTCACGCGCCCGATTGATGCAAAATCCGTTACCGAACACGATGATTTCAGC不CAATATGCGCCGCACCGAAGTCAGAAGCCGCGCCGCCGATTCGCACTTGGGACACGTCTTCCCCGACGGCCCCCGCGACAAAGGCGGACTGCGCTACTGCATCAACGGCGCGAGCTTGAAATTCATCCCGCTGGAACAAATGGACGCGGCAGGCTACGGCGCGTTGAAGGGCAAAGTGAAATAA(SEQ ID NO：29)

从pET15bmsrB表达和纯化的MsrB的氨基酸序列(通过凝血酶裂解去除的his标签区域呈粗体)：

从pET15bmsrB表达和纯化的MsrB的氨基酸序列，其中his标签区域通过凝血酶裂解去除：

GSHMKAATYKKPSDAELKRTLTEEQYQVTQNSATEYAFSHEYDHLFKPGIYVDVVSGEPLFSSADKYDSGCGWPSFTRPIDAKSVTEHDDFSFNMRRTEVRSRAADSHLGHVFPDGPRDKGGLRYCINGASLKFIPLEQMDAAGYGALKGKVK(SEQ ID NO：31)

为了测试MsrA和MsrB的免疫原性，将5只小鼠的组用MsrA或MsrB与弗氏佐剂进行免疫接种。血清通过ELISA评估，并且结果示于图5中。全细胞ELISA表明，抗MsrA和抗MsrB与野生型1291和1291Δmsr_C完整细胞结合。对于1291和1291Δmsr_C，MsrA抗血清分别具有10，000和20,000的平均滴度。对于1291和1291Δmsr_C，MsrB抗血清具有稍微较高的结合滴度，但这种差异不是统计学显著的(分别地，16,000和40,000的滴度)。MsrA和MsrB抗血清与突变体菌株的结合显著降低(分别地，1,000和1,000的滴度)。MsrA和MsrB之间不存在显著的抗原性差异。该数据展示出，MsrA和MsrB中的每个均可以用作用于淋病奈瑟菌的疫苗中的免疫原。

实施例8

用利用OMV配制的MsrA/B进行的免疫接种

MsrA/B用OMV以以下方式进行配制：1)天然淋病奈瑟菌OMV加重组MsrA/B，有或没有明矾或弗氏；2)去垢剂提取的淋病奈瑟菌OMV加重组MsrA/B，有或没有明矾或弗氏；3)过表达MsrA/B的天然的淋病奈瑟菌OMV，有或没有明矾或弗氏；和4)去垢剂提取的过表达MsrA/B的淋病奈瑟菌OMV，有或没有明矾或弗氏菌。重组MsrA/B用血清组B脑膜炎球菌疫苗

进行配制，该疫苗

包含来自血清组B菌株NZ98/254的外膜囊泡、用三种重组蛋白NadA、fHBP和NHBA进行配制。

天然OMV的分离

天然分泌的天然淋病奈瑟菌OMV如先前描述地(Semchenko等人2017,InfectImmun 85(2)e00898-16)进行分离。简言之，天然OMV通过短暂离心(5,000x g)和随后过滤上清液(0.22μm过滤器)，从6小时培养物(GC肉汤，OD600为～0.8)中分离。将滤液离心(100,000x g，1小时，4℃)并且将包含OMV的沉淀用PBS洗涤三次。将沉淀溶解在含有0.2％SDS的PBS中。OMV通过SDS-PAGE进行分析，并且蛋白浓度使用BCA蛋白测定进行测量。对于天然OMV，内毒素活性因lpxL1基因的缺失而减弱。

去垢剂提取的OMV的分离

去垢剂提取的OMV使用脱氧胆酸盐(DOC)如先前描述地(Fredriksen等人1991,NIPH Ann.14,67-79)进行分离。简言之，将6小时培养物在包含10mM EDTA和0.5％DOC的0.1M Tris-HCl,pH 8.6中在室温孵育30min，然后离心(20,000×g；30min；4℃)。将上清液超速离心(125,000×g；2小时；4℃)并且将OMV沉淀重悬在50mM Tris-HCl,pH 8.6、2mMEDTA、1.2％DOC、20％蔗糖中，然后进行第二轮超速离心。然后将OMV在30％蔗糖中均质化。

MsrA/B在OMV中的过表达

为了在淋病奈瑟菌中过表达MsrA/B，将全长的完整msrA/B基因使用互补构建体pCTS32_msr引入1291msr::kan突变体的淋球菌基因组中的porB基因座中，其中msrA/B表达处于强启动子(例如porB启动子)的控制下。用于产生Δmsr_C互补的菌株的pCTS32_msr构建体被修饰以掺入porB上游的100bp(NC_003112.2 2157429-2157528；CAGACATGGAATCGCCGAAAACGTCGGCGGTAAATGCAAAGCTAAGCGGCTTGGAAAGCCCGGCCGGCTTAAATTTCTTAACCAAAAAAGGAATACAGCA(SEQ ID NO:32)，其将替代pCTS32_msr构建体中msrA/B上游的200bp。使用引物PmeI_For(GTTTAAACATGAAACACCGTACTTTCTT；SEQ ID NO:33)和PmeI_Rev(AAACTTTTGATGTTTCCTGTGTGG；SEQ ID NO:34)进行反向PCR以在pCTS32_msr中的msrA/B基因的上游产生限制性位点(PmeI)，并且所得的PCR被自连接以产生pCTS32_msr2。使用引物pCTS32_porBPromoter_AflIIFor(AGTTTCCTTAAGCAGACATGGAATCGCCGAAAACG；SEQ ID NO:35)和pCTS32_porBPromoter_PmeIRev(TTCATTGTTTAAACTGCTGTATTCCTTTTTTGG；SEQ ID NO:36)扩增脑膜炎奈瑟菌菌株MC58中porB上游的100bp。所得的PCR产物用限制性酶AflII和PmeI消化，并且连接至pCTS32_msr2中的AflII和PmeI位点。为了构建pCTS32_msr，msrA/B基因和上游的200bp使用在5’端产生AflII位点并且在3’端产生SmaI位点的引物pCTS32_Msr_AflIIFor(CTCGAGCTTAAGCCGGCGTTTCCTGTTTTTTC；SEQ ID NO:37)和pCTS32_Msr_SmaIRev(TGCGGCCCCGGGTTATTTCACTTTGCCCTTCAACG；SEQ ID No:38)从菌株1291中进行PCR扩增。将所得的PCR产物克隆到经AflII和SmaI消化的pCTS32中以产生pCTS32_msr。

用OMV配制的MsrA/B进行的免疫接种

在第0天、第21天和第28天，10只雌性BALB/c小鼠(6周龄)的组在存在或不存在

(氢氧化铝，InvivoGen)或弗氏(FCA/FIA,Sigma-Aldrich)佐剂的情况下，用MsrA/B+OMV(10μg天然或去垢剂提取的OMV加5μg重组MsrA/B，或10μg过表达MsrA/B的OMV)进行皮下免疫接种。终末出血在第42天收集。小鼠在不存在另外的佐剂的情况下用

加5μg重组MsrA/B进行免疫接种。对于弗氏佐剂，在第0天使用弗氏完全佐剂(FCA)，并且在第21天和第28天的加强中使用弗氏不完全佐剂(FIA)。免疫接种前4天收集每只小鼠的前-出血。

如实施例1中描述的，MsrA/B+OMV制剂中存在的MsrA/B水平使用抗MsrA/B血清进行评估。如实施例1中描述的，评估了MsrA/B+OMV制剂的免疫原性和MsrA/B+OMV抗血清的活性。

SBA滴度；血清杀细菌滴度(60min后诱导多于50％杀伤的最低抗体稀释度的倒数)。OPA滴度；调理吞噬滴度(90min后诱导多于50％杀伤的最低抗体稀释度的倒数)。GMT，几何平均滴度；-，未确定的。^针对全细胞淋病奈瑟菌1291菌株的免疫前血清滴度为≤200。

SBA滴度；血清杀细菌滴度(60min后诱导多于50％杀伤的最低抗体稀释度的倒数)。OPA滴度；调理吞噬滴度(90min后诱导多于50％杀伤的最低抗体稀释度的倒数)。GMT，几何平均滴度。^针对全细胞淋病奈瑟菌1291菌株的免疫前血清滴度为≤200。*当没有达到最终滴度时(即，<50或<100)，使用下一个2倍稀释度的值(即，分别地，25或50)来计算GMT。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其整体并入本文。

本文中对任何参考文献的引用不应被理解为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选的实施方案，而不是将本发明限制于任何一种实施方案或具体的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，可以在所例举的特定实施方案中进行各种修改和改变，而不脱离本发明的范围。所有这样的修改和改变意在包括于所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含：

a)重组或合成的MsrA/B多肽，或编码所述MsrA/B多肽的重组或合成的多核苷酸，和佐剂；或者

b)病毒载体，所述病毒载体包含编码所述MsrA/B多肽的多核苷酸；

其中所述MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者所述MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原性片段包含至少或约30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个或510个氨基酸残基。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述抗原性片段缺乏在对应于SEQID NO:l的氨基酸1-31的氨基酸中列出的推定信号序列的全部或一部分。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中与全长MsrA/B多肽相比，所述抗原性片段在N末端被截短了至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述抗原性片段包含MsrA结构域的全部或一部分。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述抗原性片段包含对应于SEQ IDNO:1的氨基酸181-362或199-354的氨基酸的全部或一部分。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述抗原性片段包含MsrB结构域的全部或一部分。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述抗原性片段包含对应于SEQ IDNO:1的氨基酸375-522或383-506的氨基酸的全部或一部分。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述抗原性片段包含硫氧还蛋白结构域的全部或一部分。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述抗原性片段包含对应于SEQID NO:1的氨基酸17-174的氨基酸的全部或一部分。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述MsrA/B多肽与辅助性T细胞表位连接。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述MsrA/B多肽与载体蛋白连接。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM-197。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述佐剂选自铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、3-<9-脱酰化-4'-单磷酰基脂质A(MPL)、包含MPL的佐剂、toll样受体(TLR)激动剂、基于皂苷的佐剂、脂质体、病毒微体、病毒样颗粒(VLP)、外膜囊泡(OMV)、细胞因子、趋化因子和生长因子。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述OMV是脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、大肠杆菌(E.coli)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的OMV。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述水包油乳剂包含角鲨烯。

17.根据权利要求14所述的组合物，其中所述基于皂苷的佐剂包括来自皂树(Quillajasaponaria)、人参(Panax ginseng)、三七(Panax notoginseng)、西洋参(Panaxquinquefolium)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、美远志(Polygala senega)、远志(Polygala tenuifolia)、巴西皂树(Quillaja brasiliensis)、黄芪(Astragalusmembranaceus)或牛膝(Achyranthes bidentate)的皂苷或皂苷衍生物。

18.根据权利要求14所述的组合物，其中所述基于皂苷的佐剂是iscom或iscom基质。

19.根据权利要求14所述的组合物，其中所述TLR激动剂是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和/或TLR10激动剂。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，所述组合物还包含另外的抗原。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述另外的抗原是淋病奈瑟菌抗原。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述淋病奈瑟菌抗原选自PilC、PilQ、Opa、AniA、TdfJ、PorB、Lst、TbpB、TbpA、OmpA、OpcA、MetQ、MtrE和2C7表位或表位模拟物中。

23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述另外的抗原是脑膜炎奈瑟菌抗原。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述脑膜炎奈瑟菌抗原选自NadA、fHbp、NHBA、GNA1030、GNA2091、HmbR、NspA、Nhha、App、Omp85、TbpA、TbpB、Cu,Zn-超氧化物歧化酶以及来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的荚膜多糖或寡糖。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，所述组合物还包含2种、3种、4种、5种或更多种另外的抗原。

26.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体选自逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒(例如，巨细胞病毒(CMV))、甲病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒(例如，仙台病毒)、细小病毒、小RNA病毒、痘病毒(例如，牛痘病毒)和披膜病毒载体。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

28.一种用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组或合成的MsrA/B多肽或编码所述MsrA/B多肽的重组或合成的多核苷酸；其中

所述MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者所述MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；并且

施用导致对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的保护性免疫应答的产生。

29.一种用于针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组或合成的MsrA/B多肽或编码所述MsrA/B多肽的重组或合成的多核苷酸；其中

30.一种用于抑制受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的发展或进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组或合成的MsrA/B多肽或编码所述MsrA/B多肽的重组或合成的多核苷酸；其中

31.根据权利要求28或30中任一项所述的方法，其中施用引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的保护性体液应答。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述保护性体液免疫应答包括为杀细菌的和/或调理吞噬的抗MsrA/B抗体。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述保护性体液免疫应答包括抗MsrA/B的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和/或IgA抗体。

34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段包含至少或约30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个或510个氨基酸残基。

35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段缺乏在对应于SEQID NO:l的氨基酸1-31的氨基酸中列出的推定信号序列的全部或一部分。

36.根据权利要求35所述的方法，其中与全长MsrA/B多肽相比，所述抗原性片段在N末端被截短了至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。

37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段包含MsrA结构域的全部或一部分。

38.根据权利要求28至37中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段包含对应于SEQID NO:1的氨基酸181-362或199-354的氨基酸的全部或一部分。

39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段包含MsrB结构域的全部或一部分。

40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段包含对应于SEQID NO:1的氨基酸181-375-522或383-506的氨基酸的全部或一部分。

41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段包含硫氧还蛋白结构域的全部或一部分。

42.根据权利要求28至41中任一项所述的方法，其中所述抗原性片段包含对应于SEQID NO:1的氨基酸17-174的氨基酸的全部或一部分。

43.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述MsrA/B多肽与辅助性T细胞表位连接。

44.根据权利要求28至43中任一项所述的方法，其中所述MsrA/B多肽与载体蛋白连接。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述运载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM-197。

46.根据权利要求28至45中任一项所述的方法，所述方法还包括施用佐剂。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述佐剂选自铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、3-<9-脱酰化-4'-单磷酰基脂质A(MPL)、包含MPL的佐剂、toll样受体(TLR)激动剂、基于皂苷的佐剂、脂质体、病毒微体、病毒样颗粒(VLP)、外膜囊泡、细胞因子、趋化因子和生长因子。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述OMV是脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌OMV。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述水包油乳剂包含角鲨烯。

50.根据权利要求47所述的方法，其中所述基于皂苷的佐剂包括来自皂树(Quillajasaponaria)、人参(Panax ginseng)、三七(Panax notoginseng)、西洋参(Panaxquinquefolium)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、美远志(Polygala senega)、远志(Polygala tenuifolia)、巴西皂树(Quillaja brasiliensis)、黄芪(Astragalusmembranaceus)或牛膝(Achyranthes bidentate)的皂苷或皂苷衍生物。

51.根据权利要求47所述的方法，其中所述基于皂苷的佐剂是iscom或iscom基质。

52.根据权利要求47所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和/或TLR10激动剂。

53.根据权利要求28至52中任一项所述的方法，所述方法还包括施用另外的抗原。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述另外的抗原是淋病奈瑟菌抗原。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述淋病奈瑟菌抗原选自PilC、PilQ、Opa、AniA、TdfJ、PorB、Lst、TbpB、TbpA、OmpA、OpcA、MetQ、MtrE和2C7表位或表位模拟物中。

56.根据权利要求53所述的方法，其中所述另外的抗原是脑膜炎奈瑟菌抗原。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述脑膜炎奈瑟菌抗原选自NadA、fHbp、NHBA、GNA1030、GNA2091、HmbR、NspA、Nhha、App、Omp85、TbpA、TbpB、Cu,Zn-超氧化物歧化酶以及来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的荚膜多糖或寡糖。

58.根据权利要求28至57中任一项所述的方法，所述方法还包括施用2种、3种、4种、5种或更多种另外的抗原。

59.根据权利要求28至58中任一项所述的方法，其中编码所述MsrA/B多肽的多核苷酸包含在病毒载体中。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒(例如，巨细胞病毒(CMV))、甲病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒(例如，仙台病毒)、细小病毒、小RNA病毒、痘病毒(例如，牛痘病毒)和披膜病毒载体。

61.根据权利要求28至60中任一项所述的方法，其中施用是经由皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮内、鼻内或口服途径。

62.一种用于治疗受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用对MsrA/B多肽特异性的抗原结合分子；其中

所述MsrA/B多肽包含SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者所述MsrA/B多肽是包含以下的多肽的抗原性片段：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39中任一项中列出的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗原结合分子是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgA抗体。

64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述抗原结合分子是单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。

65.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述抗原结合分子表现出杀细菌活性、调理吞噬活性和/或抑制MsrA/B的功能。

66.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答、针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种、抑制受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的发展或进展，和/或治疗或预防受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染。

67.重组或合成的MsrA/B多肽或编码所述MsrA/B多肽的重组或合成的多核苷酸用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中引发对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答的、针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌对受试者进行免疫接种、抑制受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染的发展或进展，和/或用于治疗或预防受试者中淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌感染；其中