KR20230104068A - 뉴클레오사이드 변형 mRNA를 사용한 범용 인플루엔자 백신 - Google Patents
뉴클레오사이드 변형 mRNA를 사용한 범용 인플루엔자 백신 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원, 예컨대 헤마글루티닌 항원 또는 그것의 단편, 뉴라미니다제 항원 또는 그것의 단편, 핵단백질 항원 또는 그것의 단편, 매트릭스 단백질 1 항원 또는 그것의 단편, 또는 매트릭스-2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
Description
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 부여된 AI146101 및 AI153064 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 특정 권리를 가진다.
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 31일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/002,682에 대한 우선권을 주장하며, 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인플루엔자 바이러스는 매년 50만명 이상의 사망으로 이어지는 전세계적으로 인간에서의 상당한 이환(morbidity) 및 사망을 유발한다(WHO, 2019, Influenza(Seasonal) Fact Sheet). 백신 접종은 활용되는 가장 흔한 예방 수단이지만, 현재의 인플루엔자 바이러스 백신은 불완전한 채로 남아 있고 광범위하고 지속적인 보호 면역을 제공하지 못한다. 4가 비활성화된 인플루엔자 바이러스 백신(QIV)은 대중에게 가장 일반적으로 투여되지만, 이들 백신의 유효성은 빈약한 면역원성 및 스트레인 미스매치를 포함한 다양한 요인으로 인해 10-60% 범위에 머물러 있다(CDC, 2019, Seasonal Influenza Vaccine Effectiveness, 2004-2019; Osterholm, MT et al., 2012, Lancet. Infect. Dis., 12:36-44). 더불어, 계절성 백신은 인간 집단에서 순환하는 인플루엔자 바이러스로부터의 보호를 돕기 위해 제형화되지만, 팬데믹 잠재력을 가진 신종 인플루엔자 바이러스로부터 최소한의 보호를 제공한다(DiMenna LJ et al., 2009, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 333:291-321). 그러므로, 광범위한 반응성 및 장기간 지속되는 보호를 제공할 수 있는 인플루엔자 바이러스의 다중 보존된 에피토프를 표적화하는 신규한 백신 플랫폼의 개발이 범용 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 후보로서 매우 바람직하다.
이전의 작업은 광범위한 보호 체액성 및 세포 반응의 유도를 위한 표적으로서 작용할 수 있는 인플루엔자 바이러스의 보존된 영역을 확인하는데 초점이 맞춰졌다. 주요 표면 당단백질인 헤마글루티닌(HA)의 줄기(stalk)는 광범위하게 반응하는 중화 항체를 유도하는 능력으로 인해 많은 관심의 대상이 되었는데, 그것은 광범위한 HA 아형을 나타내는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 보호할 수 있다(Steel J et al., 2010, MBio., 1:e00018-10; Krammer F et al., 2013, J. Virol., 87:6542-6550; Bernstein DI et al., 2019, Lancet. Infect. Dis., 20:80-91; Impagliazzo A et al., 2015, Science, 349:1301-1306; Yassine HM et al., 2015, Nat. Med. 21:1065-1070). 중요하게, HA 줄기에 대한 항체는 인간에서의 보호와 상관이 있는 것으로 나타났다(Jacobsen H et al., 2017, MBio, 8:e01463-17; Ng S et al., 2019, Nat. Med., 25:962-967; Dhar N et al., 2019, Clin. Infect. Dis., ciz927). 보다 최근에, 인플루엔자 바이러스 마이너 표면 당단백질인 뉴라미니다제(NA)가 이 단백질에 대한 항체가 단일 아형 내에서 보호를 제공하는 것으로 나타난 후에 상당한 관심을 불러일으켰고 광범위하게 반응성인 NA 특이적 항체가 인간 기증자로부터 분리되었다(Chen YQ et al., 2018, Cell, 173:417-429; Stadlbauer D et al., 2019, Science, 366:499-504; Wohlbold TJ et al., 2015, MBio, 6:e02556-14; Eichelberger MC et al., 2015, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 386:275-299; Eichelberger MC et al., 2018, Curr. Opin. Immunol., 53:38-44). 인플루엔자 바이러스의 고도로 보존된 매트릭스-2(M2) 이온 채널 단백질 및 핵단백질(NP)이 또한 항체 Fc 매개 메커니즘 및 세포 반응을 통해 광범위한 보호 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다(Deng L et al., 2015, Vaccines, 3:105-136; Schotsaert M et al., 2016, Sci. Rep., 6:24402; Lambe T et al., 2013, Sci. Rep., 3:1443; Rekstin A et al., 2017, Biomed. Res. Int., 637:9359276).
그러므로, 개선된 범용 인플루엔자 백신에 대한 요구가 기술분야에 있다. 본 발명은 이런 요구를 해결한다.
한 측면으로, 본 발명은 대상체에서 하나 이상의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함한다.
다양한 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 당단백질 또는 그것의 단편, 핵단백질(NP) 항원 또는 그것의 단편, 매트릭스-2(M2) 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티닌(HA) 항원 또는 그것의 단편, 뉴라미니다제(NA) 항원 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, 매트릭스 단백질 1(M1) 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 전장 HA 항원 또는 그것의 단편, HA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, HA-헤드 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NA 항원 또는 그것의 단편, NA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, NA-헤드 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NP 항원 또는 그것의 단편, 전장 M1 항원 또는 그것의 단편, 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널-세포외 도메인 또는 그것의 단편, M2 이온 채널-세포내 도메인 또는 그것의 단편, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, HA 항원은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, NA 항원은 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, NP 항원은 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, M2 이온 채널 항원은 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, M1 항원은 서열 번호: 107에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
그러므로, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 HA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NA 항원 또는 그것의 단편, 전장 NP 항원 또는 그것의 단편, 및 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편의 조합이다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HA-줄기 도메인, 서열 번호: 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NA 항원, 서열 번호: 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NP 항원, 및 서열 번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 M2 이온 채널 항원의 조합이다.
다양한 구현예에서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 당단백질 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것들의 임의의 조합을 암호화한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 HA 항원 또는 그것의 단편, NA 항원 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것들의 임의의 조합을 암호화한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 24, 서열 번호: 26, 및 서열 번호: 28로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 34, 서열 번호: 36, 서열 번호: 38, 서열 번호: 40, 서열 번호: 42, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 48, 서열 번호: 50, 서열 번호: 52, 및 서열 번호: 54로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 56, 서열 번호: 58, 서열 번호: 60, 서열 번호: 62, 서열 번호: 64, 서열 번호: 66, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 76, 서열 번호: 78, 및 서열 번호: 80으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 82, 서열 번호: 84, 서열 번호: 86, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 서열 번호: 92, 서열 번호: 94, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 및 서열 번호: 106으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 108에 제시된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
그러므로, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 24, 서열 번호: 26, 서열 번호: 28, 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 34, 서열 번호: 36, 서열 번호: 38, 서열 번호: 40, 서열 번호: 42, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 48, 서열 번호: 50, 서열 번호: 52, 서열 번호: 54, 서열 번호: 56, 서열 번호: 58, 서열 번호: 60, 서열 번호: 62, 서열 번호: 64, 서열 번호: 66, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 76, 서열 번호: 78, 서열 번호: 80, 서열 번호: 82, 서열 번호: 84, 서열 번호: 86, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 서열 번호: 92, 서열 번호: 94, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 서열 번호: 106, 및 서열 번호: 108로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 28에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 42에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 68에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 및 서열 번호: 94에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 적어도 하나의 보조제를 추가로 암호화한다.
한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 LNP 내에 캡슐화된다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 슈도우리딘을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 1-메틸-슈도우리딘을 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 정제된 뉴클레오사이드 변형 mRNA이다.
발명의 한 측면으로, 본 발명의 조성물은 백신이다.
한 측면으로, 본 발명은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
다양한 구현예에서, 조성물은 본 발명의 임의의 조성물이다. 그러므로, 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 본원에 기술된 임의의 뉴클레오사이드 변형 RNA 또는 그것의 단편 또는 변이체이다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 본원에 기술된 임의의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 그것의 단편 또는 변이체이다.
다양한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 인플루엔자 바이러스 D, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 HA 1군 바이러스, 인플루엔자 NA 1군 바이러스, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 HA 1군 바이러스는 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 NA 1군 바이러스는 N1, N4, N5, N8, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 그러므로, 일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9, H6N1, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 인플루엔자 바이러스와 관련된 감염, 질환, 장애, 또는 그것들의 임의의 조합을 치료 또는 예방한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 피내, 피하, 흡입, 비강내, 및 근육내로 이루어지는 군으로부터 선택된 전달 경로에 의해 투여된다.
한 구현예에서, 방법은 조성물의 단일 투여를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 다중 투여를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법은 유효량의 보조제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 유효량의 적어도 하나의 보조제를 추가로 암호화한다.
다음의 발명의 구현예의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 도시된 구현예의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다.
도 1은 인플루엔자 바이러스가 범용 인플루엔자 바이러스 백신의 개발에서 표적화될 수 있는 보존된 에피토프를 나타내는 것을 입증하는 개략도를 도시한다. 인플루엔자 바이러스 스트레인의 대표적인 세트로부터의 단백질의 단일 아미노산 다형성이 Crooks 등에 의해 유래된 식을 사용하여 채점되었다(Crooks GE et al., 2004, Genoe Res., 14:1188-1190). 점수는 상응하는 아미노산 잔기에 대해 지도화되었고 열 지도로서 제시되었다; 청색 잔기는 변이가 없는 것을 보여주고 적색 잔기는 상당한 변이를 보여준다. H1N1 스트레인은 1918년도부터 활용 가능한 각 연도에 대해 선택되었다(n = 49-52/그룹). 인플루엔자 바이러스 스트레인은 인플루엔자 A 1군 HA, 1군 NA, 또는 인플루엔자 A 인간, 조류, 및 M2 및 NP에 대한 돼지 스트레인 사이에 고르게 분포하도록 선택되었다(n = 50/그룹). 모든 항원에 대한 평면도, 측면도, 및 저면도에 대한 각이 도시된다: A/Puerto Rico/8/1934 H1 트라이머(PDB: 1RU7)(Gamblin SJ et al., 2004, Science, 303:1838-1842), A/Brevig Mission/1/1918 N1 테트라머(PDB: 3B7E)(Xu X et al., 2008, J. Virol., 82:10493-10501), A/Udorn/307/1972 M2 테트라머(PDB: 2L0J)(Sharma M et al., 2010, Science, 330:509-512), 및 A/Wilson-Smith/1933 NP 트라이머(PDB:2IQH)(Ye Q et al., 2006, Nature, 444:1078-1082). 단백질은 축척대로 렌더링되지 않았다.
도 2A 내지 도 2C를 포함하는 도 2는 웨스턴 블롯 분석에 의한 뉴라미니다제(NA), 매트릭스-2(M2), 및 mRNA를 암호화하는 미니 HA의 대표적인 특성확인을 도시한다. mRNA는 NIH/3T3 세포에 형질주입되었다. 도 2A는 반딧불이 루시페라제(Luc) 암호화 mRNA 형질주입된 세포 및 음성 대조군으로서 비형질주입(unt) 세포를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 탐색된 세포 용해물에서의 대표적인 NA 발현을 도시한다. 도 2B는 반딧불이 루시페라제(Luc) 암호화 mRNA 형질주입된 세포 및 음성 대조군으로서 비형질주입(unt) 세포를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 탐색된 세포 용해물에서의 대표적인 M2 발현을 도시한다. 도 2C는 반딧불이 루시페라제(Luc) 암호화 mRNA 형질주입된 세포 및 음성 대조군으로서 비형질주입(unt) 세포를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 탐색된 세포 용해물에서의 대표적인 미니 HA 단백질 발현을 도시한다.
도 3은 유동 세포분석에 의한 핵단백질(NP) 암호화 mRNA의 대표적인 특성확인을 도시한다. NP mRNA는 NIH/3T3 세포에 형질주입되었다. 루시페라제 형질주입된 세포(회색)에 비해 NP 형질주입된 세포(자주색)에 대한 항-NP 항체의 양성 결합. 2개의 독립적인 실험이 수행되었고 결과는 유사하였다.
도 4A 내지 도 4G를 포함하는 도 4는 보존된 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-지질 나노입자(LNP) 백신이 마우스에서 왕성한 면역 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 4A는 마우스가 항원당 20 μg의 mRNA-LNP로 피내로 1회 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 백신 접종 후 28일차에 혈청이 수집되었고 상응하는 항원에 대한 항체의 결합이 ELISA에 의해 측정되었다. 도 4B는 미니 HA에 대한 각각의 희석에 대해(그룹당 n = 19-20개의 개별 혈청) SD와 함께 도표화된 490 nm에서의 평균 광학 밀도를 도시한다. 도 4C는 NA(Mich15)에 대한 각각의 희석에 대해(그룹당 n = 19-20개의 개별 혈청) SD와 함께 도표화된 490 nm에서의 평균 광학 밀도를 도시한다. 도 4D는 NP(Mich15)에 대한 각각의 희석에 대해(그룹당 n = 19-20개의 개별 혈청) SD로 도표화된 490 nm에서의 평균 광학 밀도를 도시한다. 도 4E는 M2(Mich15)에 대한 항체 결합을 검출하기 위해 활용된 세포 기반 ELISA를 도시한다. 490 nm에서의 평균 광학 밀도는 SD(n = 모아진 혈청의 4개의 반복)로 나타낸 각각의 희석에 대해 SD로 도표화된다. 도 4F는 백신접종에 의해 유도된 항체의 중화 잠재력을 측정하기 위한 다중 주기 미세중화 검정의 대표적인 종점 역가를 도시한다. 혈청은 H1N1pdm 바이러스에 대해 모아졌고 이중으로 작업되었다. 도 4G는 마우스 FcγRIV와의 결합을 측정하기 위하여 리포터 검정을 사용하여 측정된 혈청의 대표적인 ADCC 활성을 도시한다. 발광이 측정되었고 삼중으로 작업된 모아진 혈청으로부터의 데이터는 SD를 포함하여 배경(음성 웰의 평균 플러스 표준 편차의 3배, 점선으로서 표시됨)을 넘는 배수 변화로서 표시된다.
도 5A 내지 도 5D를 포함하는 도 5는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 암호화된 인플루엔자 바이러스 항원의 조합을 사용한 백신 접종이 매우 치명적인 용량의 매칭된 도전 바이러스로부터 마우스를 보호하는 것을 도시한다. 도 5A는 mRNA-LNP 백신 접종 후 28일 후에 수집된 대표적인 혈청이 H1N1pdm 바이러스에 대해 측정된 것을 도시한다. 개별 데이터는 AUC로서 표시되고 라인은 반응의 평균 및 SD를 나타낸다(그룹당 n= 19-20). 도 5B는 5 x LD50의 H1N1pdm으로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소는 14일 동안 모니터링되었다. 데이터는 평균 및 SEM으로서 표시된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 도 5C는 50 x LD50의 H1N1pdm으로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소는 14일 동안 모니터링되었다. 데이터는 평균 및 SEM으로서 표시된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 도 5D는 500 x LD50의 H1N1pdm으로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소는 14일 동안 모니터링되었다. 데이터는 평균 및 SEM으로서 표시된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 6A 내지 도 6D를 포함하는 도 6은 인플루엔자 바이러스 도전으로부터의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 유도 보호가 주로 면역 체계의 체액성 팔에 의해 매개되는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 6A는 마우스가 10 μg의 mRNA-LNP로 피내로 2회(4주 간격) 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 동물은 초기 백신 접종 후 56일 차에 안락사되었고 혈청이 수집되고 나이브 마우스로 전달되었다. 전달 후 2시간 후, 수령체 마우스는 5 x LD50의 H1N1pdm(IVR-180)로 감염되었고 체중 감소가 14일 동안 모니터링되었다. 도 5B는 전달 전 H1N1pdm에 대한 과면역 마우스로부터의 혈청의 ELISA 반응성을 측정하기 위해 수행된 대표적인 ELISA를 도시한다(그룹당 n = 9-10). 라인은 평균 및 SD를 나타낸다. 도 5C는 모아지고, 나이브 마우스에 전달된 혈청에 대핸 대표적인 결과를 도시하며, H1N1pdm에 대한 반응성은 전달 후 2시간 후에 취한 혈청으로부터 ELISA에 의해 측정되었다(그룹당 n = 5). 라인은 평균 및 SD를 나타낸다. 도 5D는 과면역 혈청을 받은 마우스의 체중 감소 곡선을 도시한다. SEM을 포함한 평균 체중 감소가 도표화된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 7A 및 도 7B를 포함하는 도 7은 비장세포의 입양 전달(adoptive transfer)이 인플루엔자 바이러스 도전으로부터의 보호를 제공하지 못했음을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 7A는 마우스가 10 μg의 mRNA-LNP로 4주 간격으로 피내로 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 동물은 초기 백신 접종 후 56일 차에 안락사되었고 비장세포가 수득되고, 모아지고, 나이브 마우스로 전달되었다. 도 7B는 전달 후 2시간 후, 수령체 마우스는 5 x LD50의 H1N1pdm으로 감염되었고 체중 감소가 14일 동안 모니터링된 것을 도시한다. 마우스의 체중 감소 곡선은 과면역 마우스(n = 5)로부터 8천만 개의 비장세포를 입양으로 전달하였다. SEM과 함께 평균 체중 감소가 도표화된다. 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 8A 내지 도 8I를 포함하는 도 8은 뉴클레오사이드 변형 NA 및 NP mRNA-LNP 백신이 마우스에서 왕성한 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. NA 및 NP 면역화된 마우스로부터의 값이 각각의 사이토카인 조합에 대해 Luc 면역화된 동물로부터의 값과 비교되었다(도 8D, 도 8E, 도 8H, 및 도 8I). 각각의 기호는 한 마리의 동물을 나타내고 오차는 SEM으로서 제시된다(그룹당 n = 10마리 마우스). 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터가 도시된다. 통계적 분석: Mann-Whitney 테스트, *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. 도 8A는 마우스가 20 μg의 NA 또는 NP mRNA-LNP의 단일 용량으로 피내로 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 비장세포는 면역화 후 12일 후에 NA 또는 NP 펩타이드로 자극되었고, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생성이 유동 세포분석에 의해 평가되었다. 도 8B는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD4+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8C는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8D는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD4+ T 세포의 백분율 및 CD4+ 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다. 도 8E는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD8+ T 세포의 백분율 및 CD8+ 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다. 도 8F는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NP 특이적 CD4+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8G는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NP 특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8H는 NP 특이적 CD4+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다. 도 8I는 NP 특이적 CD8+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다.
도 9는 뉴라미니다제 및 핵단백질 mRNA-LNP 면역화된 마우스에서 T 세포 반응의 연구를 위한 유동 세포분석 게이팅 전략을 도시한다. 비자극 및 펩타이드 자극 샘플에 대한 대표적인 유동 세포분석 플롯이 제시된다.
도 10A 내지 도 10D를 포함하는 도 10은 나노그램 범위의 인플루엔자 바이러스 항원의 첨가가 NA 매개 면역의 보호를 향상시키는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 10A는 ELISA 검정으로 H1N1pdm에 대해 테스트된 5, 0.5, 0.05, 또는 0.005 μg의 NA 단독의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP의 단일 피내 용량으로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 루시페라제 mRNA-LNP가 5 μg의 용량으로 음성 대조군으로서 사용되었고 4가 비활성화 인플루엔자 바이러스 백신(QIV)이 1.5 μg의 용량으로 표준 치료 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 및 SD가 도표화된 AUC로서 표시된다. 도 10B는 ELISA 검정으로 H1N1pdm에 대해 테스트된 5, 0.5, 0.05, 또는 0.005 μg의, 미니 HA, M2, 및 NP 구성물이 추가적으로 보충된(조합) NA의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP의 단일 피내 용량으로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 루시페라제 mRNA-LNP가 5 μg의 용량으로 음성 대조군으로서 사용되었고 4가 비활성화 인플루엔자 바이러스 백신(QIV)이 1.5 μg의 용량으로 표준 치료 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 및 SD가 도표화된 AUC로서 표시된다. 도 10C는 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 감염된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중이 14일 동안 모니터링되었다. NA 단독으로 백신 접종된 마우스에 대한 감염 후 체중 감소 곡선. 루시페라제 및 QIV 그룹이 도시된다. 평균 플러스 SEM이 각 그룹에 대해 도표화된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 도 10D는 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 감염된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중이 14일 동안 모니터링되었다. 항원과 조합된 NA로 백신 접종된 마우스에 대한 감염 후 체중 감소 곡선. 루시페라제 및 QIV 그룹이 도시된다. 평균 플러스 SEM이 각 그룹에 대해 도표화된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 11A 내지 도 11D를 포함하는 도 11은 바이러스 도전 스트레인에 상응하는 정제된 바이러스 제제에 대한 백신 유도 반응을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 20 μg의 mRNA-LNP로 피내 백신 접종 후 28일 후에, 마우스는 출혈되어 혈청학적 분석이 수행된다. 개별 마우스 혈청 반응에 대한 AUC의 평균 플러스 SD가 도시된다. 도 11A는 A/New Caledonia/20/1999 H1N1 바이러스(그룹당 n = 5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 11B는 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 바이러스(그룹당 n = 4-5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 11C는 H5N8 바이러스(그룹당 n = 5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 11D는 cH6/1N5 바이러스(그룹당 n = 5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 12는 백신 항원과 상응하는 인플루엔자 바이러스 단백질 사이의 아미노산 동일성을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 백신 항원으로부터의 아미노산 서열은 인플 루엔자 바이러스 도전 스트레인으로부터의 적절한 단백질에 대해 Clustal Omega 다중 서열 정렬 도구(Gamblin SJ et al., 2004, Science, 303:1838-1842)를 사용하여 정렬되었다. 퍼센트 아미노산 동일성은 계산된 퍼센트 동일성 매트릭스를 사용하여 측정되었고 사용된 각각의 바이러스에 대해 조사되었다.
도 13A 내지 도 13E를 포함하는 도 13은 뉴클레오사이드 변형 mRNA 암호화 인플루엔자 바이러스 항원과 조합된 단일 면역화가 이종성 도전으로부터 마우스를 보호하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 20 μg의 mRNA-LNP로 단일 피내 백신 접종한 후 28일 후에 마우스는 출혈되고 5 x LD50의 인플루엔자 바이러스로 도전되었다. 평균 및 SEM이 체중 감소 곡선에 대해 도시된다. 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 5 x LD50의 각각의 바이러스에서의 모든 도전의 최대 체중 감소가 요약되어 제시된다. 평균 및 SEM이 각 그룹에 대해 도표화된다. 통계적 분석: 다중 비교를 위한 Dunnett 보정을 사용한 이원분산분석: *P <0.0332; 807 **P < 0.0021; ***P< 0.0002; ****P <0.0001. 도 13A는 A/New Caledonia/20/1999 H1N1 바이러스(그룹당 n = 5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13B는 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 바이러스(그룹당 n = 4-5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13C는 H5N8 바이러스(그룹당 n = 5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13D는 cH6/1N5 바이러스(그룹당 n = 5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13E는 인플루엔자 A 바이러스(그룹당 n = 5)에 대한 최대 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 14A 내지 도 14C를 포함하는 도 14는 프라임-부스트 요법으로서 투여된 mRNA 백신이 약간의 보호 증가와 함께 혈청 항체 반응을 증가시키는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 다중 백신 접종이 면역 반응에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 10 μg의 백신이 4주 간격으로 2회 전달되었다. 도 14A는 프라임 후 4주 후의 동물로부터의 혈청을 사용하는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 14B는 부스트 후 4주 후의 동물로부터의 혈청을 사용하는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 14C는 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소가 14일 동안 모니터링되었다(그룹당 n = 5). 평균 체중 감소가 SEM과 함께 도표화된다. 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 15는 뉴클레오사이드 변형 PR8 HA mRNA-LNP를 사용한 단일 면역화가 강력한 Tfh 세포 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스가 10 μg의 MF59 보조된 재조합 PR8 HA 단백질 또는 PR8 HA mRNA LNP의 단일 용량으로 근육내로 면역화되었고 비장 Tfh 세포(CD4+CXCR5+PD-1+)의 수가 면역화 후 12일 후에 유동 세포분석에 의해 측정되었다. 오차 막대는 SEM이다. 각각의 기호는 한 마리 동물을 나타낸다.
도 16은 뉴클레오사이드 변형 PR8 HA mRNA-LNP를 사용한 단일 면역화가 높고 지속적인 PR8 HAI 역가를 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스(그룹당 n = 5마리)가 10 μg의 MF59 보조된 재조합 PR8 HA 단백질 또는 PR8 HA mRNA-LNP의 단일 용량으로 근육내로 면역화되었고 혈청 샘플로부터의 PR8 HAI 역가가 측정되었다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 17은 뉴클레오사이드 변형 PR8 HA mRNA-LNP를 사용한 단일 면역화가 지속적인 HA 줄기 특이적 항체 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스(그룹당 n = 5마리)가 10 μg의 PR8 HA mRNA-LNP로 피내로 면역화되었고 전장 H1 HA 및 H1 HA 줄기 프로브에 대한 결합이 ELISA에 의해 측정되었다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 18은 뉴클레오사이드 변형 3가 HSV-2(gC2, gD2 및 gE2) mRNA-LNP 백신을 사용한 면역화가 고수준의 항원 특이적 IgG 역가를 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스가 10 μg의 HSV-2 1가 gD2 또는 gC2-gD2-gE2 또는 3가 gC2-gD2-gE2 mRNA-LNP 또는 대조군 폴리(C) RNA-LNP로 1회(I) 또는 2회(II) 피내로 면역화되었고 항원 특이적 IgG 역가가 ELISA에 의해 측정되었다. 한 그룹의 마우스(3가-I)는 상이한 피내 부위에서 각각의 면역원을 1가 백신으로서 받았다. 또 다른 그룹의 마우스(3가-C)는 조합 3가 백신을 받았다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 각각의 기호는 한 마리 동물을 나타낸다.
도 19는 HA 줄기 특이적 면역화로부터 얻어진 마우스 혈청이 ADCC 리포터 검정에서 활성인 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 6-8주령의 암컷 Balb/c 마우스가 HA 줄기 항체(청색), 계절성 인플루엔자 바이러스 백신(녹색) 또는 PBS(회색)를 유도하는 백신 접종 전략으로 백신 접종되었다. 혈청 샘플은 ADCC 리포터 검정으로 H1N1pdm09 감염 세포에 대해 테스트되었다.
도 20은 미니 HA 아미노산 서열의 대표적인 예(서열 번호: 109-116)를 도시한다.
도 21은 HA 아미노산 서열의 대표적인 예(서열 번호: 117-122)를 도시한다.
도 22는 미니 HA 아미노산 서열의 대표적인 예(서열 번호: 123-133)를 도시한다.
도26A 내지 도 23C를 포함하는 도 23은 조합 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신에 대해 최적화된 인플루엔자 바이러스 항원의 설계의 개략도를 도시한다. 도 23A는 마우스에서 뉴클레오사이드 변형 mRNA 기반 인플루엔자 바이러스 백신에 미치는 항원 변형의 영향을 평가하기 위해 설계된 연구의 개략도를 도시한다. 도 23B는 그 위에 각각의 단백질이 예시되는 각각의 인플루엔자 바이러스 백신 표적에 도입된 돌연변이의 대표적인 모델 이미지를 도시한다. 기능성 부위는 각 항원에 대해 부여된 면역원성 및 반응원성에 대한 돌연변이의 결과적인 영향을 측정하기 위해 표적화되었다. 축척대로 도시되지 않았다. 도 23C는 각각의 개별 항원에 대한 항원 구성물의 비교를 위해 사용된 백신 접종 계획의 대표적인 다이아그램을 도시한다. 마우스에게는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신의 피내 단일 면역화가 제공되었고 이어서 4주 후 혈청이 수집된 후 이종성 H1N1 인플루엔자 바이러스로 도전되었다.
도 24A 내지 도 24E를 포함하는 도 24는 막 결합 헤마글루티닌 구성물이 가용성 형태보다 강력한 면역 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 20 μg의 HA 발현 mRNA-LNP 백신으로 백신 접종되었고 면역화 후 4주 후에 혈청이 수집된 후 NC99 H1N1 바이러스로 도전되었다. 다중 비교를 위해 Tukey 보정이 포함된 이원분산분석이 수행되어 유의미성이 측정되었다: ****p < 0.0001. 도 24A는 개별 마우스로부터의 혈청을 사용하는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 데이터는 그룹 평균과 표준 편차와 함께 각각의 샘플에 대한 곡선 아래의 면적으로서 보고된다(SD; n = 5/그룹). 도 24B는 각각의 그룹으로부터 모아진 혈청을 사용하는 H1N1pdm 바이러스에 대한 혈구응집 억제 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 검정은 삼중으로 작업되었고 개별 값은 종점 역가로서 보고되었다. 막대는 SD가 포함된 보고된 값의 평균을 나타낸다. 도 24C는 H1N1pdm 인플루엔자 바이러스에 대해 평가된 모아진 혈청의 미세중화 능력을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 혈청은 삼중으로 작업되었고 개별 값은 종점 역가로서뿐만 아니라 보고된 값의 평균 플러스 SD로서 보고되었다. 도 24D는 H1N1pdm 감염 MDCK 세포를 사용하여 수행된 항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 각 그룹으로부터 모아진 혈청은 삼중으로 작업되었고 쥐과 FcγRIV를 발현하는 이펙터 세포 및 NFAT 제어 루시페라제 리포터는 감염된 세포와 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 평균 및 SD가 도표화된 배경 표준화 배수 변화값으로부터 계산된 곡선 아래의 면적으로서 표시된다. 도 24E는 NC99로의 도전 후에 계산되었고 각 마우스에 대해 평균 플러스 개별 값으로서 표시된 최대 퍼센트 체중 감소를 입증하는 대표적인 결과를 도시한다.
도 25A 내지 도 25D를 포함하는 도 25는 미가공 ELISA 곡선이 정제된 비리온에 결합하는 항체를 보여주는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 값은 490 nm에서 측정된 흡광도 값의 평균 플러스 SD로서 표시된다(도 25A, 도 25C, 및 도 25D: n = 5/그룹)(도 25B: n = 10/그룹). 도 25A는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 HA 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 25B는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 NA 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 25C는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 M2 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 25D는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 내부 단백질 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 26A 내지 도 26C를 포함하는 도 26은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 검정에 대한 미가공 발광 곡선에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 상대적인 광 단위는 Fc 수용체 결합에 의해 활성화되는 NFAT 프로모터에 의해 제어된 루시페라제 발현에 대한 프록시로서 보고된다. 데이터는 평균 값 플러스 SD로서 보고된다. 혈청이 모아지고 삼중으로 작업되었다. 도 26A는 HA 기반 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스로부터 사용된 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 26B는 NA 기반 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스로부터 사용된 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 26C는 M2 기반 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스로부터 사용된 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 27A 내지 도 27E를 포함하는 도 27은 mRNA-LNP 백신 접종된 마우스의 이종성 감염에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 데이터는 각각의 그룹에 대한 평균 플러스 평균의 표준 오차로서 보고된다(n=5-10). 생존은 각 그룹에 대해 생존하는 마우스의 백분율로서 보고된다. 도 27A는 막 결합 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 막 결합 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27B는 가용성 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 가용성 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27C는 NA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 NA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27D는 M2 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 m2 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27E는 내부 단백질 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 내부 단백질 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다.
도 28A 내지 도 28F를 포함하는 도 28은 감소된 뉴라미니다제 촉매 활성이 면역원성을 보존하면서 반응원성을 감소시킨 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 도 24에서 기술된 것과 같이 백신 접종되고 도전되었다. 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 유의미성이 측정되었다: *p < 0.033, **p < 0.002, ***p < 0.0002, ****p < 0.0001. 도 28A는 결합 역가를 측정하기 위하여 정제된 H1N1pdm 인플루엔자 바이러스 제제에 대해 작업된 개별 마우스로부터의 혈청의 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 데이터는 평균 및 SD 값이 도표화된 곡선 아래의 면적으로서 보고된다(n = 5/그룹). 도 28B는 H1N1pdm 바이러스에 대한 다중 주기 미세중화 검정을 통해 측정된 혈청의 대표적인 중화 잠재력을 도시한다. 각 그룹에 대해 모아진 혈청은 삼중으로 작업되었고 종점 역가가 각 복제물에 대해 보고되었다. 도 28C는 NA 촉매 활성을 차단하는 혈청의 능력을 조사하기 위하여 수행된 H1N1pdm 바이러스에 대한 뉴라미니다제 억제 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 모아진 혈청은 이중으로 작업되었고 효과적인 농도 중앙값이 각 복제물에 대해 보고되었다. 도 28D는 H1N1pdm 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포 상에서 수행된 ADCC 리포터 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 모아진 혈청은 삼중으로 작업되었고 각 그룹에 대해 배경 표준화된 배수 변화 값으로부터 곡선 아래의 면적이 평균 플러스 SD로서 보고된다. 도 28E는 각각의 개별 마우스에 대한 이종성 NC99 도전 후 보고된 대표적인 최대 퍼센트 체중 감소를 도시한다(n = 10/그룹). 도 28F는 투여 간 간격이 3주인 프라임/부스트 요법에서 10 μg의 mRNA-LNP로 피내로 백신 접종된 마우스의 대표적인 이미지를 도시한다. 부스트 후 1주 후, 마우스는 백신 접종 부위에서의 병변을 시각적으로 조사하기 위하여 사진이 촬영되었다(n = 5/그룹). 2개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 이미지가 도시된다.
도 29A 내지 도 29C를 포함하는 도 29는 전장 매트릭스 단백질 2 이온 채널 활성의 제거가 면역원성을 증가시켰음을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 20 μg의 mRNA-LNP 발현 M2 구성물로 피내로 백신 접종되었다. 백신 접종과 이어서 NC99 H1N1 바이러스로 도전 후 4주 후에 혈청이 수집되었다. 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 통계적 유의미성이 측정되었다: *p < 0.033, **p < 0.002, ***p < 0.0002. 도 29A는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대한 개별 마우스로부터의 혈청을 사용하여 수행된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 곡선 아래의 면적은 데이터에 회귀 곡선을 맞춘 후 계산되었고 평균 및 SD가 포함된 개별 값으로서 보고된다(n = 5/그룹). 도 29B는 면역화된 마우스의 혈청에 존재하는 항체의 이펙터 기능성을 측정하기 위해 수행된 ADCC 리포터 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 세포는 H1N1pdm 바이러스로 감염되었고 발광이 Fc 수용체 결합의 판독값으로서 측정되었다. 혈청이 모아졌고 각 그룹에 대해 삼중으로 작업되었다. 도 29C는 각 동물에 대한 각각의 개별 지점이 있는 평균으로서 제시되는 NC99 도전 데이터로부터의 대표적인 최대 퍼센트 체중 감소를 도시한다(n = 5/그룹).
도 30A 내지 도 30E를 포함하는 도 30은 핵단백질 핵 위치 신호의 변경이 시험관내에서 분비를 변경시켰지만 생체내에서 부여된 보호에는 아무 영향을 미치지 않았음을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 30A는 NLS 영역에 돌연변이가 있는 NP 구성물의 설계의 개략도를 도시한다: Wt - A/Michigan/45/2015 H1N1pdm NP, NLS - K7A, R8A, R213A, R214A, 및 R216A 돌연변이가 도입되어 2개의 추정되는 NLS 서열이 제거되었고, 절단 - E14A 및 G16A 돌연변이가 도입되어 추정되는 부위의 절단이 방지되었으며, △1-18 - 처음 18개의 아미노산의 제거가 수행되어 절단이 모방되었다. 6개의 His 태그가 각 구성물의 C 말단에 포함되었다. 축척대로 도시되지 않았다. 도 30B는 세포 용해물 대비 상층액(sup)에서 NP의 풍부성을 측정하기 위해 수행된 His 태그에 대한 웨스턴 블롯에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 30C는 상층액 및 세포 용해물 둘 다에 대해 수행된 단백질 풍부성의 정량화에 대한 대표적인 결과를 도시하며 분비된 NP %는 상층액 값을 세포 용해물 값으로 나누고, 100을 곱한 후, Wt 값으로 나누어서 Wt에 표준화함으로써 계산되었다. 도 30D는 3주 간격의 프라임-부스트 요법에서 각각의 NP 구성물 또는 GFP 대조군을 발현하는 50 μg의 pCAGGS 플라스미드 DNA로 백신 접종된 마우스에 대해 수행된 ELISA 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 부스트 후에 출혈되었고 혈청은 ELISA로 정제된 H1N1pdm 바이러스 제제에 대해 작업되었다. 데이터는 개별 값의 평균 플러스 SD로서 보고된다(n = 5/그룹). 도 30E는 치사 용량의 cH6/1N5 재조합 인플루엔자 바이러스로 도전된 마우스에서 기준선의 퍼센트로서 측정되고 평균 플러스 SEM(n = 5/그룹)으로서 보고된 대표적인 체중 감소를 도시한다. 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 통계적 유의미성이 측정되었다: n.s. p > 0.05.
도 31A 내지 도 31G를 포함하는 도 31은 핵단백질의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 전달이 매트릭스 단백질 1에 비해 향상된 보호를 부여하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 20 μg의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP로 피내 백신 접종되었고 4주 후 혈청학적 분석을 위해 출혈된 후 이종성 H1N1 바이러스로 도전되었다. 매트릭스 단백질 1(M1) 면역화된 마우스로부터의 값이 Luc 면역화된 동물로부터의 값과 비교된다(도 31B 내지 도 31E). 각각의 기호는 한 마리 동물을 나타내고 오차는 SD로서 제시된다(n = 10마리 마우스/그룹). 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터가 제시된다(n = 5마리 마우스/그룹/실험). (도 31A 및 도 31B) 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 통계적 유의미성이 측정되었다: ****p < 0.0001. (도 31D 내지 도 31G) 통계적 분석: 쌍을 이룬 t 테스트, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 도 31A는 H1N1pdm 정제된 바이러스에 대한 각각의 개별 마우스 혈청 샘플 반응성에 대한 곡선 값 아래의 평균 면적으로서 표시된 ELISA 결합 역가에 대한 대표적인 결과를 도시한다(n = 5/그룹). 도 31B는 각각의 개별 값이 도표화된 평균으로서 보고된 이종성 NC99 도전 후의 대표적인 최대 체중 감소 퍼센트를 도시한다. 도 31C는 마우스가 단일 용량의 20 μg의 M1 mRNA-LNP로 피내 백신 접종된 연구의 개략도를 도시한다. 비장세포는 면역화 후 12일 후에 M1 펩타이드 풀(pool)로 자극되었고, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생성은 유동 세포분석에 의해 분석되었다. 도 31D는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 M1 특이적 CD4+ T 세포의 대표적인 백분율을 도시한다. 도 31E는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 M1 특이적 CD8+ T 세포의 대표적인 백분율을 도시한다. 도 31F는 CD4+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 대표적인 빈도를 도시한다. 도 31G는 CD8+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 대표적인 빈도를 도시한다.
도 32는 매트릭스 단백질 1 mRNA-LNP 면역화된 마우스에서 T 세포 반응의 연구를 위한 유동 세포분석 게이팅 전략의 개략도를 도시한다. 비자극 및 펩타이드 자극 샘플에 대한 대표적인 유동 세포분석 플롯이 도시된다.
도 1은 인플루엔자 바이러스가 범용 인플루엔자 바이러스 백신의 개발에서 표적화될 수 있는 보존된 에피토프를 나타내는 것을 입증하는 개략도를 도시한다. 인플루엔자 바이러스 스트레인의 대표적인 세트로부터의 단백질의 단일 아미노산 다형성이 Crooks 등에 의해 유래된 식을 사용하여 채점되었다(Crooks GE et al., 2004, Genoe Res., 14:1188-1190). 점수는 상응하는 아미노산 잔기에 대해 지도화되었고 열 지도로서 제시되었다; 청색 잔기는 변이가 없는 것을 보여주고 적색 잔기는 상당한 변이를 보여준다. H1N1 스트레인은 1918년도부터 활용 가능한 각 연도에 대해 선택되었다(n = 49-52/그룹). 인플루엔자 바이러스 스트레인은 인플루엔자 A 1군 HA, 1군 NA, 또는 인플루엔자 A 인간, 조류, 및 M2 및 NP에 대한 돼지 스트레인 사이에 고르게 분포하도록 선택되었다(n = 50/그룹). 모든 항원에 대한 평면도, 측면도, 및 저면도에 대한 각이 도시된다: A/Puerto Rico/8/1934 H1 트라이머(PDB: 1RU7)(Gamblin SJ et al., 2004, Science, 303:1838-1842), A/Brevig Mission/1/1918 N1 테트라머(PDB: 3B7E)(Xu X et al., 2008, J. Virol., 82:10493-10501), A/Udorn/307/1972 M2 테트라머(PDB: 2L0J)(Sharma M et al., 2010, Science, 330:509-512), 및 A/Wilson-Smith/1933 NP 트라이머(PDB:2IQH)(Ye Q et al., 2006, Nature, 444:1078-1082). 단백질은 축척대로 렌더링되지 않았다.
도 2A 내지 도 2C를 포함하는 도 2는 웨스턴 블롯 분석에 의한 뉴라미니다제(NA), 매트릭스-2(M2), 및 mRNA를 암호화하는 미니 HA의 대표적인 특성확인을 도시한다. mRNA는 NIH/3T3 세포에 형질주입되었다. 도 2A는 반딧불이 루시페라제(Luc) 암호화 mRNA 형질주입된 세포 및 음성 대조군으로서 비형질주입(unt) 세포를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 탐색된 세포 용해물에서의 대표적인 NA 발현을 도시한다. 도 2B는 반딧불이 루시페라제(Luc) 암호화 mRNA 형질주입된 세포 및 음성 대조군으로서 비형질주입(unt) 세포를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 탐색된 세포 용해물에서의 대표적인 M2 발현을 도시한다. 도 2C는 반딧불이 루시페라제(Luc) 암호화 mRNA 형질주입된 세포 및 음성 대조군으로서 비형질주입(unt) 세포를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 탐색된 세포 용해물에서의 대표적인 미니 HA 단백질 발현을 도시한다.
도 3은 유동 세포분석에 의한 핵단백질(NP) 암호화 mRNA의 대표적인 특성확인을 도시한다. NP mRNA는 NIH/3T3 세포에 형질주입되었다. 루시페라제 형질주입된 세포(회색)에 비해 NP 형질주입된 세포(자주색)에 대한 항-NP 항체의 양성 결합. 2개의 독립적인 실험이 수행되었고 결과는 유사하였다.
도 4A 내지 도 4G를 포함하는 도 4는 보존된 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-지질 나노입자(LNP) 백신이 마우스에서 왕성한 면역 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 4A는 마우스가 항원당 20 μg의 mRNA-LNP로 피내로 1회 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 백신 접종 후 28일차에 혈청이 수집되었고 상응하는 항원에 대한 항체의 결합이 ELISA에 의해 측정되었다. 도 4B는 미니 HA에 대한 각각의 희석에 대해(그룹당 n = 19-20개의 개별 혈청) SD와 함께 도표화된 490 nm에서의 평균 광학 밀도를 도시한다. 도 4C는 NA(Mich15)에 대한 각각의 희석에 대해(그룹당 n = 19-20개의 개별 혈청) SD와 함께 도표화된 490 nm에서의 평균 광학 밀도를 도시한다. 도 4D는 NP(Mich15)에 대한 각각의 희석에 대해(그룹당 n = 19-20개의 개별 혈청) SD로 도표화된 490 nm에서의 평균 광학 밀도를 도시한다. 도 4E는 M2(Mich15)에 대한 항체 결합을 검출하기 위해 활용된 세포 기반 ELISA를 도시한다. 490 nm에서의 평균 광학 밀도는 SD(n = 모아진 혈청의 4개의 반복)로 나타낸 각각의 희석에 대해 SD로 도표화된다. 도 4F는 백신접종에 의해 유도된 항체의 중화 잠재력을 측정하기 위한 다중 주기 미세중화 검정의 대표적인 종점 역가를 도시한다. 혈청은 H1N1pdm 바이러스에 대해 모아졌고 이중으로 작업되었다. 도 4G는 마우스 FcγRIV와의 결합을 측정하기 위하여 리포터 검정을 사용하여 측정된 혈청의 대표적인 ADCC 활성을 도시한다. 발광이 측정되었고 삼중으로 작업된 모아진 혈청으로부터의 데이터는 SD를 포함하여 배경(음성 웰의 평균 플러스 표준 편차의 3배, 점선으로서 표시됨)을 넘는 배수 변화로서 표시된다.
도 5A 내지 도 5D를 포함하는 도 5는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 암호화된 인플루엔자 바이러스 항원의 조합을 사용한 백신 접종이 매우 치명적인 용량의 매칭된 도전 바이러스로부터 마우스를 보호하는 것을 도시한다. 도 5A는 mRNA-LNP 백신 접종 후 28일 후에 수집된 대표적인 혈청이 H1N1pdm 바이러스에 대해 측정된 것을 도시한다. 개별 데이터는 AUC로서 표시되고 라인은 반응의 평균 및 SD를 나타낸다(그룹당 n= 19-20). 도 5B는 5 x LD50의 H1N1pdm으로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소는 14일 동안 모니터링되었다. 데이터는 평균 및 SEM으로서 표시된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 도 5C는 50 x LD50의 H1N1pdm으로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소는 14일 동안 모니터링되었다. 데이터는 평균 및 SEM으로서 표시된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 도 5D는 500 x LD50의 H1N1pdm으로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소는 14일 동안 모니터링되었다. 데이터는 평균 및 SEM으로서 표시된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 6A 내지 도 6D를 포함하는 도 6은 인플루엔자 바이러스 도전으로부터의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 유도 보호가 주로 면역 체계의 체액성 팔에 의해 매개되는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 6A는 마우스가 10 μg의 mRNA-LNP로 피내로 2회(4주 간격) 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 동물은 초기 백신 접종 후 56일 차에 안락사되었고 혈청이 수집되고 나이브 마우스로 전달되었다. 전달 후 2시간 후, 수령체 마우스는 5 x LD50의 H1N1pdm(IVR-180)로 감염되었고 체중 감소가 14일 동안 모니터링되었다. 도 5B는 전달 전 H1N1pdm에 대한 과면역 마우스로부터의 혈청의 ELISA 반응성을 측정하기 위해 수행된 대표적인 ELISA를 도시한다(그룹당 n = 9-10). 라인은 평균 및 SD를 나타낸다. 도 5C는 모아지고, 나이브 마우스에 전달된 혈청에 대핸 대표적인 결과를 도시하며, H1N1pdm에 대한 반응성은 전달 후 2시간 후에 취한 혈청으로부터 ELISA에 의해 측정되었다(그룹당 n = 5). 라인은 평균 및 SD를 나타낸다. 도 5D는 과면역 혈청을 받은 마우스의 체중 감소 곡선을 도시한다. SEM을 포함한 평균 체중 감소가 도표화된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 7A 및 도 7B를 포함하는 도 7은 비장세포의 입양 전달(adoptive transfer)이 인플루엔자 바이러스 도전으로부터의 보호를 제공하지 못했음을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 7A는 마우스가 10 μg의 mRNA-LNP로 4주 간격으로 피내로 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 동물은 초기 백신 접종 후 56일 차에 안락사되었고 비장세포가 수득되고, 모아지고, 나이브 마우스로 전달되었다. 도 7B는 전달 후 2시간 후, 수령체 마우스는 5 x LD50의 H1N1pdm으로 감염되었고 체중 감소가 14일 동안 모니터링된 것을 도시한다. 마우스의 체중 감소 곡선은 과면역 마우스(n = 5)로부터 8천만 개의 비장세포를 입양으로 전달하였다. SEM과 함께 평균 체중 감소가 도표화된다. 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 8A 내지 도 8I를 포함하는 도 8은 뉴클레오사이드 변형 NA 및 NP mRNA-LNP 백신이 마우스에서 왕성한 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. NA 및 NP 면역화된 마우스로부터의 값이 각각의 사이토카인 조합에 대해 Luc 면역화된 동물로부터의 값과 비교되었다(도 8D, 도 8E, 도 8H, 및 도 8I). 각각의 기호는 한 마리의 동물을 나타내고 오차는 SEM으로서 제시된다(그룹당 n = 10마리 마우스). 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터가 도시된다. 통계적 분석: Mann-Whitney 테스트, *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. 도 8A는 마우스가 20 μg의 NA 또는 NP mRNA-LNP의 단일 용량으로 피내로 백신 접종된 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 비장세포는 면역화 후 12일 후에 NA 또는 NP 펩타이드로 자극되었고, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생성이 유동 세포분석에 의해 평가되었다. 도 8B는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD4+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8C는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8D는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD4+ T 세포의 백분율 및 CD4+ 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다. 도 8E는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NA 특이적 CD8+ T 세포의 백분율 및 CD8+ 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다. 도 8F는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NP 특이적 CD4+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8G는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 NP 특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 8H는 NP 특이적 CD4+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다. 도 8I는 NP 특이적 CD8+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 빈도를 도시한다.
도 9는 뉴라미니다제 및 핵단백질 mRNA-LNP 면역화된 마우스에서 T 세포 반응의 연구를 위한 유동 세포분석 게이팅 전략을 도시한다. 비자극 및 펩타이드 자극 샘플에 대한 대표적인 유동 세포분석 플롯이 제시된다.
도 10A 내지 도 10D를 포함하는 도 10은 나노그램 범위의 인플루엔자 바이러스 항원의 첨가가 NA 매개 면역의 보호를 향상시키는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 10A는 ELISA 검정으로 H1N1pdm에 대해 테스트된 5, 0.5, 0.05, 또는 0.005 μg의 NA 단독의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP의 단일 피내 용량으로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 루시페라제 mRNA-LNP가 5 μg의 용량으로 음성 대조군으로서 사용되었고 4가 비활성화 인플루엔자 바이러스 백신(QIV)이 1.5 μg의 용량으로 표준 치료 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 및 SD가 도표화된 AUC로서 표시된다. 도 10B는 ELISA 검정으로 H1N1pdm에 대해 테스트된 5, 0.5, 0.05, 또는 0.005 μg의, 미니 HA, M2, 및 NP 구성물이 추가적으로 보충된(조합) NA의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP의 단일 피내 용량으로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 루시페라제 mRNA-LNP가 5 μg의 용량으로 음성 대조군으로서 사용되었고 4가 비활성화 인플루엔자 바이러스 백신(QIV)이 1.5 μg의 용량으로 표준 치료 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 및 SD가 도표화된 AUC로서 표시된다. 도 10C는 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 감염된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중이 14일 동안 모니터링되었다. NA 단독으로 백신 접종된 마우스에 대한 감염 후 체중 감소 곡선. 루시페라제 및 QIV 그룹이 도시된다. 평균 플러스 SEM이 각 그룹에 대해 도표화된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 도 10D는 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 감염된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중이 14일 동안 모니터링되었다. 항원과 조합된 NA로 백신 접종된 마우스에 대한 감염 후 체중 감소 곡선. 루시페라제 및 QIV 그룹이 도시된다. 평균 플러스 SEM이 각 그룹에 대해 도표화된다(그룹당 n = 5). 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 11A 내지 도 11D를 포함하는 도 11은 바이러스 도전 스트레인에 상응하는 정제된 바이러스 제제에 대한 백신 유도 반응을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 20 μg의 mRNA-LNP로 피내 백신 접종 후 28일 후에, 마우스는 출혈되어 혈청학적 분석이 수행된다. 개별 마우스 혈청 반응에 대한 AUC의 평균 플러스 SD가 도시된다. 도 11A는 A/New Caledonia/20/1999 H1N1 바이러스(그룹당 n = 5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 11B는 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 바이러스(그룹당 n = 4-5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 11C는 H5N8 바이러스(그룹당 n = 5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 11D는 cH6/1N5 바이러스(그룹당 n = 5) 스트레인에 대한 정제된 바이러스(웰당 250 ng)에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 12는 백신 항원과 상응하는 인플루엔자 바이러스 단백질 사이의 아미노산 동일성을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 백신 항원으로부터의 아미노산 서열은 인플 루엔자 바이러스 도전 스트레인으로부터의 적절한 단백질에 대해 Clustal Omega 다중 서열 정렬 도구(Gamblin SJ et al., 2004, Science, 303:1838-1842)를 사용하여 정렬되었다. 퍼센트 아미노산 동일성은 계산된 퍼센트 동일성 매트릭스를 사용하여 측정되었고 사용된 각각의 바이러스에 대해 조사되었다.
도 13A 내지 도 13E를 포함하는 도 13은 뉴클레오사이드 변형 mRNA 암호화 인플루엔자 바이러스 항원과 조합된 단일 면역화가 이종성 도전으로부터 마우스를 보호하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 20 μg의 mRNA-LNP로 단일 피내 백신 접종한 후 28일 후에 마우스는 출혈되고 5 x LD50의 인플루엔자 바이러스로 도전되었다. 평균 및 SEM이 체중 감소 곡선에 대해 도시된다. 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다. 5 x LD50의 각각의 바이러스에서의 모든 도전의 최대 체중 감소가 요약되어 제시된다. 평균 및 SEM이 각 그룹에 대해 도표화된다. 통계적 분석: 다중 비교를 위한 Dunnett 보정을 사용한 이원분산분석: *P <0.0332; 807 **P < 0.0021; ***P< 0.0002; ****P <0.0001. 도 13A는 A/New Caledonia/20/1999 H1N1 바이러스(그룹당 n = 5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13B는 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 바이러스(그룹당 n = 4-5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13C는 H5N8 바이러스(그룹당 n = 5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13D는 cH6/1N5 바이러스(그룹당 n = 5)에 대해 14일 동안 모니터링된 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 13E는 인플루엔자 A 바이러스(그룹당 n = 5)에 대한 최대 체중 감소에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 14A 내지 도 14C를 포함하는 도 14는 프라임-부스트 요법으로서 투여된 mRNA 백신이 약간의 보호 증가와 함께 혈청 항체 반응을 증가시키는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 다중 백신 접종이 면역 반응에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 10 μg의 백신이 4주 간격으로 2회 전달되었다. 도 14A는 프라임 후 4주 후의 동물로부터의 혈청을 사용하는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 14B는 부스트 후 4주 후의 동물로부터의 혈청을 사용하는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 14C는 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 도전된 마우스에 대한 대표적인 결과를 도시하며 체중 감소가 14일 동안 모니터링되었다(그룹당 n = 5). 평균 체중 감소가 SEM과 함께 도표화된다. 사망률은 각 그룹에 대해 생존 마우스의 %로서 보고된다.
도 15는 뉴클레오사이드 변형 PR8 HA mRNA-LNP를 사용한 단일 면역화가 강력한 Tfh 세포 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스가 10 μg의 MF59 보조된 재조합 PR8 HA 단백질 또는 PR8 HA mRNA LNP의 단일 용량으로 근육내로 면역화되었고 비장 Tfh 세포(CD4+CXCR5+PD-1+)의 수가 면역화 후 12일 후에 유동 세포분석에 의해 측정되었다. 오차 막대는 SEM이다. 각각의 기호는 한 마리 동물을 나타낸다.
도 16은 뉴클레오사이드 변형 PR8 HA mRNA-LNP를 사용한 단일 면역화가 높고 지속적인 PR8 HAI 역가를 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스(그룹당 n = 5마리)가 10 μg의 MF59 보조된 재조합 PR8 HA 단백질 또는 PR8 HA mRNA-LNP의 단일 용량으로 근육내로 면역화되었고 혈청 샘플로부터의 PR8 HAI 역가가 측정되었다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 17은 뉴클레오사이드 변형 PR8 HA mRNA-LNP를 사용한 단일 면역화가 지속적인 HA 줄기 특이적 항체 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스(그룹당 n = 5마리)가 10 μg의 PR8 HA mRNA-LNP로 피내로 면역화되었고 전장 H1 HA 및 H1 HA 줄기 프로브에 대한 결합이 ELISA에 의해 측정되었다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 18은 뉴클레오사이드 변형 3가 HSV-2(gC2, gD2 및 gE2) mRNA-LNP 백신을 사용한 면역화가 고수준의 항원 특이적 IgG 역가를 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 8주령의 암컷 Balb/c 마우스가 10 μg의 HSV-2 1가 gD2 또는 gC2-gD2-gE2 또는 3가 gC2-gD2-gE2 mRNA-LNP 또는 대조군 폴리(C) RNA-LNP로 1회(I) 또는 2회(II) 피내로 면역화되었고 항원 특이적 IgG 역가가 ELISA에 의해 측정되었다. 한 그룹의 마우스(3가-I)는 상이한 피내 부위에서 각각의 면역원을 1가 백신으로서 받았다. 또 다른 그룹의 마우스(3가-C)는 조합 3가 백신을 받았다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 각각의 기호는 한 마리 동물을 나타낸다.
도 19는 HA 줄기 특이적 면역화로부터 얻어진 마우스 혈청이 ADCC 리포터 검정에서 활성인 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 생후 6-8주령의 암컷 Balb/c 마우스가 HA 줄기 항체(청색), 계절성 인플루엔자 바이러스 백신(녹색) 또는 PBS(회색)를 유도하는 백신 접종 전략으로 백신 접종되었다. 혈청 샘플은 ADCC 리포터 검정으로 H1N1pdm09 감염 세포에 대해 테스트되었다.
도 20은 미니 HA 아미노산 서열의 대표적인 예(서열 번호: 109-116)를 도시한다.
도 21은 HA 아미노산 서열의 대표적인 예(서열 번호: 117-122)를 도시한다.
도 22는 미니 HA 아미노산 서열의 대표적인 예(서열 번호: 123-133)를 도시한다.
도26A 내지 도 23C를 포함하는 도 23은 조합 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신에 대해 최적화된 인플루엔자 바이러스 항원의 설계의 개략도를 도시한다. 도 23A는 마우스에서 뉴클레오사이드 변형 mRNA 기반 인플루엔자 바이러스 백신에 미치는 항원 변형의 영향을 평가하기 위해 설계된 연구의 개략도를 도시한다. 도 23B는 그 위에 각각의 단백질이 예시되는 각각의 인플루엔자 바이러스 백신 표적에 도입된 돌연변이의 대표적인 모델 이미지를 도시한다. 기능성 부위는 각 항원에 대해 부여된 면역원성 및 반응원성에 대한 돌연변이의 결과적인 영향을 측정하기 위해 표적화되었다. 축척대로 도시되지 않았다. 도 23C는 각각의 개별 항원에 대한 항원 구성물의 비교를 위해 사용된 백신 접종 계획의 대표적인 다이아그램을 도시한다. 마우스에게는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신의 피내 단일 면역화가 제공되었고 이어서 4주 후 혈청이 수집된 후 이종성 H1N1 인플루엔자 바이러스로 도전되었다.
도 24A 내지 도 24E를 포함하는 도 24는 막 결합 헤마글루티닌 구성물이 가용성 형태보다 강력한 면역 반응을 유도하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 20 μg의 HA 발현 mRNA-LNP 백신으로 백신 접종되었고 면역화 후 4주 후에 혈청이 수집된 후 NC99 H1N1 바이러스로 도전되었다. 다중 비교를 위해 Tukey 보정이 포함된 이원분산분석이 수행되어 유의미성이 측정되었다: ****p < 0.0001. 도 24A는 개별 마우스로부터의 혈청을 사용하는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 데이터는 그룹 평균과 표준 편차와 함께 각각의 샘플에 대한 곡선 아래의 면적으로서 보고된다(SD; n = 5/그룹). 도 24B는 각각의 그룹으로부터 모아진 혈청을 사용하는 H1N1pdm 바이러스에 대한 혈구응집 억제 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 검정은 삼중으로 작업되었고 개별 값은 종점 역가로서 보고되었다. 막대는 SD가 포함된 보고된 값의 평균을 나타낸다. 도 24C는 H1N1pdm 인플루엔자 바이러스에 대해 평가된 모아진 혈청의 미세중화 능력을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 혈청은 삼중으로 작업되었고 개별 값은 종점 역가로서뿐만 아니라 보고된 값의 평균 플러스 SD로서 보고되었다. 도 24D는 H1N1pdm 감염 MDCK 세포를 사용하여 수행된 항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 각 그룹으로부터 모아진 혈청은 삼중으로 작업되었고 쥐과 FcγRIV를 발현하는 이펙터 세포 및 NFAT 제어 루시페라제 리포터는 감염된 세포와 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 평균 및 SD가 도표화된 배경 표준화 배수 변화값으로부터 계산된 곡선 아래의 면적으로서 표시된다. 도 24E는 NC99로의 도전 후에 계산되었고 각 마우스에 대해 평균 플러스 개별 값으로서 표시된 최대 퍼센트 체중 감소를 입증하는 대표적인 결과를 도시한다.
도 25A 내지 도 25D를 포함하는 도 25는 미가공 ELISA 곡선이 정제된 비리온에 결합하는 항체를 보여주는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 값은 490 nm에서 측정된 흡광도 값의 평균 플러스 SD로서 표시된다(도 25A, 도 25C, 및 도 25D: n = 5/그룹)(도 25B: n = 10/그룹). 도 25A는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 HA 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 25B는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 NA 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 25C는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 M2 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 25D는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 작업된 내부 단백질 기반 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 26A 내지 도 26C를 포함하는 도 26은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 검정에 대한 미가공 발광 곡선에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 상대적인 광 단위는 Fc 수용체 결합에 의해 활성화되는 NFAT 프로모터에 의해 제어된 루시페라제 발현에 대한 프록시로서 보고된다. 데이터는 평균 값 플러스 SD로서 보고된다. 혈청이 모아지고 삼중으로 작업되었다. 도 26A는 HA 기반 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스로부터 사용된 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 26B는 NA 기반 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스로부터 사용된 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 26C는 M2 기반 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스로부터 사용된 혈청에 대한 대표적인 결과를 도시한다.
도 27A 내지 도 27E를 포함하는 도 27은 mRNA-LNP 백신 접종된 마우스의 이종성 감염에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 데이터는 각각의 그룹에 대한 평균 플러스 평균의 표준 오차로서 보고된다(n=5-10). 생존은 각 그룹에 대해 생존하는 마우스의 백분율로서 보고된다. 도 27A는 막 결합 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 막 결합 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27B는 가용성 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 가용성 HA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27C는 NA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 NA mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27D는 M2 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 m2 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다. 도 27E는 내부 단백질 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다. 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1로의 감염 후, 체중 감소는 매일 측정되었고 내부 단백질 mRNA-LNP 구성물로 백신 접종된 마우스에 대한 기준선의 퍼센트로서 보고된다.
도 28A 내지 도 28F를 포함하는 도 28은 감소된 뉴라미니다제 촉매 활성이 면역원성을 보존하면서 반응원성을 감소시킨 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 도 24에서 기술된 것과 같이 백신 접종되고 도전되었다. 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 유의미성이 측정되었다: *p < 0.033, **p < 0.002, ***p < 0.0002, ****p < 0.0001. 도 28A는 결합 역가를 측정하기 위하여 정제된 H1N1pdm 인플루엔자 바이러스 제제에 대해 작업된 개별 마우스로부터의 혈청의 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 데이터는 평균 및 SD 값이 도표화된 곡선 아래의 면적으로서 보고된다(n = 5/그룹). 도 28B는 H1N1pdm 바이러스에 대한 다중 주기 미세중화 검정을 통해 측정된 혈청의 대표적인 중화 잠재력을 도시한다. 각 그룹에 대해 모아진 혈청은 삼중으로 작업되었고 종점 역가가 각 복제물에 대해 보고되었다. 도 28C는 NA 촉매 활성을 차단하는 혈청의 능력을 조사하기 위하여 수행된 H1N1pdm 바이러스에 대한 뉴라미니다제 억제 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 모아진 혈청은 이중으로 작업되었고 효과적인 농도 중앙값이 각 복제물에 대해 보고되었다. 도 28D는 H1N1pdm 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포 상에서 수행된 ADCC 리포터 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 모아진 혈청은 삼중으로 작업되었고 각 그룹에 대해 배경 표준화된 배수 변화 값으로부터 곡선 아래의 면적이 평균 플러스 SD로서 보고된다. 도 28E는 각각의 개별 마우스에 대한 이종성 NC99 도전 후 보고된 대표적인 최대 퍼센트 체중 감소를 도시한다(n = 10/그룹). 도 28F는 투여 간 간격이 3주인 프라임/부스트 요법에서 10 μg의 mRNA-LNP로 피내로 백신 접종된 마우스의 대표적인 이미지를 도시한다. 부스트 후 1주 후, 마우스는 백신 접종 부위에서의 병변을 시각적으로 조사하기 위하여 사진이 촬영되었다(n = 5/그룹). 2개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 이미지가 도시된다.
도 29A 내지 도 29C를 포함하는 도 29는 전장 매트릭스 단백질 2 이온 채널 활성의 제거가 면역원성을 증가시켰음을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 20 μg의 mRNA-LNP 발현 M2 구성물로 피내로 백신 접종되었다. 백신 접종과 이어서 NC99 H1N1 바이러스로 도전 후 4주 후에 혈청이 수집되었다. 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 통계적 유의미성이 측정되었다: *p < 0.033, **p < 0.002, ***p < 0.0002. 도 29A는 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대한 개별 마우스로부터의 혈청을 사용하여 수행된 ELISA에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 곡선 아래의 면적은 데이터에 회귀 곡선을 맞춘 후 계산되었고 평균 및 SD가 포함된 개별 값으로서 보고된다(n = 5/그룹). 도 29B는 면역화된 마우스의 혈청에 존재하는 항체의 이펙터 기능성을 측정하기 위해 수행된 ADCC 리포터 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 세포는 H1N1pdm 바이러스로 감염되었고 발광이 Fc 수용체 결합의 판독값으로서 측정되었다. 혈청이 모아졌고 각 그룹에 대해 삼중으로 작업되었다. 도 29C는 각 동물에 대한 각각의 개별 지점이 있는 평균으로서 제시되는 NC99 도전 데이터로부터의 대표적인 최대 퍼센트 체중 감소를 도시한다(n = 5/그룹).
도 30A 내지 도 30E를 포함하는 도 30은 핵단백질 핵 위치 신호의 변경이 시험관내에서 분비를 변경시켰지만 생체내에서 부여된 보호에는 아무 영향을 미치지 않았음을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 30A는 NLS 영역에 돌연변이가 있는 NP 구성물의 설계의 개략도를 도시한다: Wt - A/Michigan/45/2015 H1N1pdm NP, NLS - K7A, R8A, R213A, R214A, 및 R216A 돌연변이가 도입되어 2개의 추정되는 NLS 서열이 제거되었고, 절단 - E14A 및 G16A 돌연변이가 도입되어 추정되는 부위의 절단이 방지되었으며, △1-18 - 처음 18개의 아미노산의 제거가 수행되어 절단이 모방되었다. 6개의 His 태그가 각 구성물의 C 말단에 포함되었다. 축척대로 도시되지 않았다. 도 30B는 세포 용해물 대비 상층액(sup)에서 NP의 풍부성을 측정하기 위해 수행된 His 태그에 대한 웨스턴 블롯에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 30C는 상층액 및 세포 용해물 둘 다에 대해 수행된 단백질 풍부성의 정량화에 대한 대표적인 결과를 도시하며 분비된 NP %는 상층액 값을 세포 용해물 값으로 나누고, 100을 곱한 후, Wt 값으로 나누어서 Wt에 표준화함으로써 계산되었다. 도 30D는 3주 간격의 프라임-부스트 요법에서 각각의 NP 구성물 또는 GFP 대조군을 발현하는 50 μg의 pCAGGS 플라스미드 DNA로 백신 접종된 마우스에 대해 수행된 ELISA 검정에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 부스트 후에 출혈되었고 혈청은 ELISA로 정제된 H1N1pdm 바이러스 제제에 대해 작업되었다. 데이터는 개별 값의 평균 플러스 SD로서 보고된다(n = 5/그룹). 도 30E는 치사 용량의 cH6/1N5 재조합 인플루엔자 바이러스로 도전된 마우스에서 기준선의 퍼센트로서 측정되고 평균 플러스 SEM(n = 5/그룹)으로서 보고된 대표적인 체중 감소를 도시한다. 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 통계적 유의미성이 측정되었다: n.s. p > 0.05.
도 31A 내지 도 31G를 포함하는 도 31은 핵단백질의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 전달이 매트릭스 단백질 1에 비해 향상된 보호를 부여하는 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 마우스는 20 μg의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP로 피내 백신 접종되었고 4주 후 혈청학적 분석을 위해 출혈된 후 이종성 H1N1 바이러스로 도전되었다. 매트릭스 단백질 1(M1) 면역화된 마우스로부터의 값이 Luc 면역화된 동물로부터의 값과 비교된다(도 31B 내지 도 31E). 각각의 기호는 한 마리 동물을 나타내고 오차는 SD로서 제시된다(n = 10마리 마우스/그룹). 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터가 제시된다(n = 5마리 마우스/그룹/실험). (도 31A 및 도 31B) 다중 비교를 위한 Tukey 보정이 포함된 일원분산분석이 수행되어 통계적 유의미성이 측정되었다: ****p < 0.0001. (도 31D 내지 도 31G) 통계적 분석: 쌍을 이룬 t 테스트, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 도 31A는 H1N1pdm 정제된 바이러스에 대한 각각의 개별 마우스 혈청 샘플 반응성에 대한 곡선 값 아래의 평균 면적으로서 표시된 ELISA 결합 역가에 대한 대표적인 결과를 도시한다(n = 5/그룹). 도 31B는 각각의 개별 값이 도표화된 평균으로서 보고된 이종성 NC99 도전 후의 대표적인 최대 체중 감소 퍼센트를 도시한다. 도 31C는 마우스가 단일 용량의 20 μg의 M1 mRNA-LNP로 피내 백신 접종된 연구의 개략도를 도시한다. 비장세포는 면역화 후 12일 후에 M1 펩타이드 풀(pool)로 자극되었고, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생성은 유동 세포분석에 의해 분석되었다. 도 31D는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 M1 특이적 CD4+ T 세포의 대표적인 백분율을 도시한다. 도 31E는 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생성하는 M1 특이적 CD8+ T 세포의 대표적인 백분율을 도시한다. 도 31F는 CD4+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 대표적인 빈도를 도시한다. 도 31G는 CD8+ T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 조합의 대표적인 빈도를 도시한다.
도 32는 매트릭스 단백질 1 mRNA-LNP 면역화된 마우스에서 T 세포 반응의 연구를 위한 유동 세포분석 게이팅 전략의 개략도를 도시한다. 비자극 및 펩타이드 자극 샘플에 대한 대표적인 유동 세포분석 플롯이 도시된다.
본 발명은 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 발명은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 백신이고, 백신은 대상체에서 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하므로, 백신은 범용 인플루엔자 백신이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 헤마글루티닌(HA) 항원 또는 그것의 단편, 뉴라미니다제(NA) 항원 또는 그것의 단편, 핵단백질(NP) 항원 또는 그것의 단편, 매트릭스 단백질 1(M1) 항원 또는 그것의 단편, 매트릭스-2(M2) 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것들의 임의의 조합을 암호화한다. 한 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 뉴클레오사이드 변형 mRNA이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화된다.
정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기수분야에서 통상의 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 바, 다음의 각각의 용어는 이 섹션에서 관련된 의미를 가진다.
"단수"를 나타내는 용어는 본원에서 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)의 그 단어의 문법적 대상을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들자면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양, 시간적 지속 기간, 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 본원에서 사용되는 "약"은 명시된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, 또는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미하며, 그러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적절하다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 나타낸다. 항체는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 테트라머이다. 본 발명에서 항체는, 예를 들어, 다클론성 항체, 단클론성 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2, 뿐만 아니라, 단일 사슬 항체 및 인간화된 항체를 포함한 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 나타내며 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항체 중쇄"는 자연적으로 발생하는 입체형태의 모든 항체 분자에 존재하는 폴리펩타이드 사슬의 2가지 유형 중 더 큰 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "항체 경쇄"는 자연적으로 발생하는 입체형태의 모든 항체 분자에 존재하는 폴리펩타이드 사슬의 2가지 유형 중 더 작은 것을 나타낸다. κ 및 λ 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 아이소타입을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "합성 항체"란 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체를 의미한다. 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 기술분야에서 활용 가능하고 잘 알려져 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 얻어졌다. 용어는 또한 항체를 암호화하는 RNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다. RNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산을 발현하며, RNA는 DNA(합성 또는 클로닝된)를 전사함으로써, RNA를 합성함으로써, 또는 기술분야에서 활용 가능하고 잘 알려져 있는 다른 기술에 의해 얻어졌다.
항체와 관련하여 본원에서 사용되는 바, 용어 "특이적으로 결합하는"이란 특이적 항원을 인식하지만, 실질적으로 샘플 중의 다른 분자를 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 다른 종으로부터의 그 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 종 교차 반응성은 그 자체로는 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경시키지는 못한다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 교차 반응성은 그 자체로는 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경시키지는 못한다. 일부 경우에, 항체, 단백질, 또는 제2 화학적 종을 가진 펩타이드의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있는 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 그 상호작용이 화학적 종 상의 특별한 구조(예컨대, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존적인 것을 의미한다; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 그것에 결합한다. 만약 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 에피토프 A(또는 유리된, 미표지 A)를 함유하는 분자의 존재는, 표지된 "A" 및 항체를 함유한 반응에서, 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원"은 개체에서 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 물질의 물질을 나타내는 것으로 의도되며, 상기 적응 면역 반응은 병원체와 유의하게 관여하고, 면역원과 면역학적 특징을 공유하는 면역 반응을 유도할 수 있다. "면역원"은 면역 반응을 생성하기 위해 신체에 도입되는 임의의 물질을 나타낸다. 그 물질은 물리적 분자, 예컨대 단백질이거나, 벡터, 예컨대 DNA, mRNA, 또는 바이러스에 의해 암호화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원" 또는 "Ag"는 적응 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이런 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정한 면역학적으로 기능할 수 있는 세포의 활성화, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 실제로 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하여 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 나아가, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA 또는 RNA로부터 유래될 수 있다. 숙련된 기술자는 적응 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA 또는 RNA가 그러므로 본원에서 사용되는 것과 같은 "항원"을 암호화하는 것을 이해할 것이다. 나아가, 기술분야에 숙련된 사람은 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 암호화될 필요가 없음을 이해할 것이다. 본 발명은, 한정하는 것은 아니지만, 하나 이상의 유전자의 부분적인 뉴클레오타이드 서열의 사용을 포함하며, 이들 뉴클레오타이드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하도록 다양한 조합으로 배열되는 것이 쉽게 드러난다. 더욱이, 숙련된 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성으로 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있는 것이 쉽게 드러난다. 그러한 생물학적 샘플로는, 한정하는 것은 아니지만 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 용어로서 "면역 반응"은, 비제한적인 예를 들자면, T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및/또는 항원 제공 세포(APC)에서 이펙터 기능의 활성화 및/또는 유도를 포함하는 과정을 의미한다. 그러므로, 면역 반응은 숙련된 기술자에 의해 이해되는 것과 같이, 한정하는 것은 아니지만, 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포 활성 또는 반응의 임의의 검출 가능한 항원 특이적 활성화 및/또는 유도, 항체의 생성, 항원 제공 세포 활성 또는 침윤, 대식세포 활성 또는 침윤, 호중구 활성 또는 침윤, 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "면역원성 조성물"은 항원(예컨대, 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 항원을 암호화하는 핵산, 항원 또는 세포의 구성요소를 발현하거나 제공하는 세포, 항원 또는 세포의 구성요소를 발현하거나 제공하는 바이러스, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 임의의 펩타이드 항원의 전부 또는 일부, 또는 그것의 면역원성 기능성 동등물을 포함하거나 암호화한다. 다른 구현예에서, 조성물은 추가적인 면역자극제 또는 그러한 작용제를 암호화하는 핵산을 포함하는 혼합물이다. 면역자극제로는 한정하는 것은 아니지만 추가 항원, 면역조절제, 항원 제공 세포, 지질 나노입자, 또는 보조제를 들 수 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 작용제(들)가 임의의 조합으로 항원 또는 면역자극제에 공유 결합된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "백신"은 대상체에 접종될 때 면역 반응을 유도하는 조성물을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유도된 면역 반응은 보호 면역을 제공한다.
"암호화하는"은 규정된 서열의 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 서열의 아미노산 및 그것으로부터 발생되는 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 특정 서열, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 고유의 특성을 나타낸다. 그러므로, 유전자는 만약 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 생물학적 시스템에서 단백질을 생성한다면 단백질을 암호화한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열에 대해 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비코딩 가닥은 둘 다 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다.
"벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 분리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 한정하는 것은 아니지만, 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함한 수많은 벡터가 기술분야에 알려져 있다. 그러므로, 용어 "벡터"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 또한 비플라스미드 및 핵산의 세포로의 전달을 용이하게 하는 비바이러스 화합물, 예컨대, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜, 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 등을 들 수 있다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 나타낸다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스 작용 요소를 포함한다; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 기술분야에 알려져 있는 모든 벡터, 예컨대 코스미드, 플라스미드(예컨대, 네이키드 또는 리포솜에 함유된) RNA, 및 재조합 폴리뉴클레오타이드를 통합하는 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 관련 바이러스)를 포함한다.
"상동성"은 두 폴리펩타이드 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 나타낸다. 두 비교된 서열 모두에서 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 하위단위에 의해 차지되는 경우, 예컨대, 만약 두 DNA 분자의 각각에서 위치를 아데닌이 차지한다면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 서열간 상동성의 퍼센트는 두 서열에 의해 공유된 매칭된 또는 상동성 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 만약 두 서열의 위치에서 10개 중 6개가 매칭되거나 상동성이라면 두 서열은 60% 상동성이다. 예를 들면, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 두 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬되었을 때 이루어진다.
본원에서 사용되는 바, 뉴클레오타이드 서열은 그것의 뉴클레오타이드 서열이 원래의 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 of 적어도 99.5%의 동일성 정도를 가질 때 본원에 기술된 임의의 뉴클레오타이드 서열에 대해 "실질적으로 상동성"이다.
본원에서 사용되는 바, 아미노산 서열은 그것의 아미노산 서열이 원래의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성 정도를 가질 때 본원에 기술된 임의의 아미노산 서열에 대해 "실질적으로 상동성"이다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성은 BLASTN 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)).
핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 그것의 부분의 보체; (iii) 참조된 핵산 또는 그것의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에서 참조된 핵산, 그것의 보체, 또는 그것에 실질적으로 동일한 서열에 혼성화하는 핵산을 나타낸다. 변이체는 완전한 유전자 서열의 전장 또는 그것의 단편에 대해 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 그것의 단편에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존성 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 나타낸다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열을 가진 참조된 단백질에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 나타낼 수 있다. 아미노산의 보존성 치환, 즉, 유사한 특성(예컨대, 친수성, 대전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 아미노산을 대체하는 것은 기술분야에서 전형적으로 미미한 변화를 포함하는 것으로서 인식된다. 이들 미미한 변화는 부분적으로, 기술분야에서 이해되는 것과 같이, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)를 고려함으로써 확인될 수 있다(Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132). 아미노산의 소수성 인덱스는 그것의 소수성 및 전하의 고려를 토대로 한다. 기술분야에는 유사한 소수성 인덱스의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 유지하는 것으로 알려져 있다. 한 측면으로, ±2의 소수성 인덱스를 가진 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성이 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래할 수 있을 치환을 드러내기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 아주 상관관계가 있는 것으로 보고된 유용한 척도인, 그 펩타이드의 가장 큰 국지적 평균 친수성의 계산을 허용한다. 미국 특허 제 4,554,101호, 본원에 전체가 참조로 포함됨. 유사한 친수성 값을 가지는 아미노산의 치환은, 기술분야에서 이해되는 것과 같이, 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 유지하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 가진 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 인덱스 및 친수성 값은 모두 아미노산의 특정 측쇄에 영향을 받는다. 그런 관찰과 일관되게, 생물학적 기능과 부합하는 아미노산 치환은 아미노산의 상대적인 유사성, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 나타나는 바, 그런 아미노산의 측쇄에 좌우되는 것으로 이해된다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 그것의 단편에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 그것의 단편에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "단편" 또는 "기능성 단편"은 대상체에게 투여되었을 때, 증가된 면역 반응을 제공하는 인플루엔자 바이러스 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 서열의 단편을 나타낸다. 단편은 일반적으로 길이가 10개 이상의 아미노산 또는 핵산이다. "단편"은 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 항원의 단편은 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산이 누락되는 것을 제외하고 전장에 100% 동일할 수 있으며, 각각의 경우에 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있거나 없을 수 있다. 단편은 특정 전장 항원의 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있으며, 첨가된 임의의 이종성 신호 펩타이드는 배제된다. 단편은 항원에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드의 단편을 포함할 수 있고 동일성 퍼센트를 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 추가적으로 포함한다.
항원을 암호화하는 핵산 서열의 단편은 5' 및/또는 3' 단부로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 누락되는 것을 제외하고 전장에 100% 동일할 수 있으며, 각각의 경우에 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 암호화하는 서열이 있거나 없을 수 있다. 단편은 특정 전장 코딩 서열의 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있으며, 첨가된 임의의 이종성 신호 펩타이드는 배제된다. 단편은 항원에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 단편을 포함할 수 있고 동일성 퍼센트를 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 추가적으로 선택적으로 포함한다.
"분리된"은 자연적인 상태로부터 변경된 또는 제거된을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 대상체에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "분리된" 것은 아니지만, 자연적인 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "분리된" 것이다. 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 또는 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 흔하게 발생하는 뉴클레오사이드(N-글리코시드 연결을 통해 리보스 또는 데옥시리보스에 결합된 핵염기)에 대한 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 나타내고, "C"는 시티딘을 나타내며, "G"는 구아노신을 나타내고, "T"는 티미딘을 나타내며, "U"는 우리딘을 나타낸다.
다르게 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이란 구절은 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있을 정도로 인트론을 포함할 수 있다. 더불어, 뉴클레오타이드 서열은 세포에서 번역 기계에 의해 번역될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드를 함유할 수 있다. 예시의 변형된 뉴클레오사이드는 본원의 다른 곳에서 기술된다. 예를 들어, 우리딘의 일부 또는 전부가 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘, 또는 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같은 또 다른 변형된 뉴클레오사이드로 대체되어 있는 mRNA. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 일부 또는 전부의 시티딘이 메틸화된 시티딘, 또는 또 다른 변형된 뉴클레오사이드, 예컨대 본원의 다른 곳에서 기술된 것으로 대체된 서열을 함유할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종성 핵산 서열 사이에서 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는 기능적 연결을 나타낸다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 만약 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 또는 RNA 서열은 연속적이고, 필요한 경우 동일한 리딩 프레임에서 두 단백질 코딩 영역을 연결시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 사슬로서 정의된다. 나아가, 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 그러므로, 본원에서 사용되는 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 상호교환 가능하다. 기술분야에 숙련된 사람은 핵산이 폴리뉴클레오타이드이고, 단량체 "뉴클레오타이드"로 가수분해될 수 있다는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용되는 바 폴리뉴클레오타이드는, 한정하는 것은 아니지만, 제한 없이, 재조합 수단, 즉, 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 통상적인 클로닝 기술 및 PCRTM, 등을 사용하는 핵산 서열의 클로닝을 포함하는 기술분야에서 활용될 수 있는 임의의 수단에 의해, 및 합성 수단에 의해 얻어지는 모든 핵산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 핵산을 나타내는 "뉴클레오사이드 변형 핵산"이다. "변형된 뉴클레오사이드"는 변형이 있는 뉴클레오사이드를 나타낸다. 예를 들어, 100개를 넘는 상이한 뉴클레오사이드 변형이 RNA에서 확인되었다(Rozenski, et al., 1999, The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197).
본원에서 사용되는 바, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기들로 구성된 화합물을 나타낸다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대해 제한은 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로에게 연결된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어는 예를 들어, 기술분야에서 또한 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로서 언급되는 짧은 사슬, 및 일반적으로 기술분야에서 단백질로서 언급되며, 많은 유형이 있는 더 긴 사슬을 모두 나타낸다. "폴리펩타이드"는, 예를 들어, 다른 것들 중에서도, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 그것들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 세포의 합성 기계에 의해 인지되는, 또는 합성 기계에 의해 도입되는, 폴리뉴클레오타이드 서열의 특정 전사를 개시하기 위해 필요한 DNA 서열로서 정의된다. 비제한적인 예를 들면, 박테리오파지 RNA 중합효소에 의해 인식되고 시험관내 전사에 의해 mRNA를 생성하기 위해 사용되는 프로모터이다.
본원에서 사용되는 용어 "보조제"는 항원 특이적 적응 면역 반응을 향상시키는 임의의 분자로서 정의된다.
일부 구현예에서, "슈도우리딘"은 m1acp3Ψ(1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘)을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 m1Ψ(1-메틸슈도우리딘)을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 Ψm(2'-O-메틸슈도우리딘)을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 m5D(5-메틸다이하이드로우리딘)을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 m3Ψ(3-메틸슈도우리딘)을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 추가로 변형되지 않는 슈도우리딘 모이어티를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 위의 슈도우리딘 중 임의의 것의 일인산염, 이인산염, 또는 삼인산염을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 슈도우리딘을 나타낸다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
용어 "지질 나노입자"는 나노미터 단위 이상의 치수(예컨대, 1-1,000 nm)를 갖는 입자를 나타내며, 하나 이상의 지질을 포함한다.
용어 "지질"은 지방산의 유도체(예컨대, 에스테르)인 유기 화합물의 그룹을 나타내며 일반적으로 물에는 불용성이지만 많은 유기 용매에서 가용성인 것을 특징으로 한다. 지질은 보통 적어도 3개의 부류로 나누어진다: (1) 지방 및 오일과 뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질".
본원에서 사용되는 바, 용어 "양이온성 지질"은 양이온성인 또는 pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pK보다 아래로 저하됨에 따라 양이온성이(양성자화) 되지만, 더 높은 pH 값에서는 점진적으로 보다 중성인 지질을 나타낸다. pK보다 아래의 pH에서, 지질은 음전하 핵산과 회합할 수 있게 된다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 pH 감소시 양전하를 가정하는 쯔비터이온성 지질을 포함한다.
용어 "중성 지질"은 생리적 pH에서 비전하 또는 중성 쯔비터이온성 형태로 존재하는 많은 지질 종 중 임의의 하나를 나타낸다. 대표적인 중성 지질로는 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 다이하이드로 스핑고미엘린, 세팔린, 및 세페브로사이드를 들 수 있다.
용어 "음이온성 지질"은 생리적 pH에서 음전하인 임의의 지질을 나타낸다.
용어 "중합체 콘쥬게이션된 지질"은 지질 부분과 중합체 부분을 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 중합체 콘쥬게이션된 지질의 예는 페길화된 지질이다.
용어 "페길화된 지질"은 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 페길화된 지질은 기술분야에 알려져 있고 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-s-DMG) 등을 포함한다.
"리포솜"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 가진 소포 구조를 갖는 것으로 특징지어질 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질층을 가지고 있다. 그것은 인지질이 과잉의 수성 용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성요소는 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기 재배열을 진행하고 물과 용해된 용질을 지질 이중층 사이에 가둔다(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 일반적인 소포 구조와 용액에서 상이한 구조를 가지는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셸 구조를 가정하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
용어 "대상체", "환자", "개체", 등은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 본원에 기술된 방법이 적용될 수 있는 임의의 동물, 시험관에 있거나 제자리에 있는 그것의 세포를 나타낸다. 일부 비제한적인 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 포유류, 조류, 가금류, 소, 돼지, 말, 양, 흰 족제비속, 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 박쥐, 또는 인간이다.
"질환"은 대상체가 항상성을 유지할 수 없고, 질환이 개선되지 않는다면 대상체의 건강이 계속적으로 악화되는 대상체의 건강 상태이다.
대조적으로, 대상체에서 "장애"는 대상체가 항상성을 유지할 수 있지만, 대상체의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 선호되는 건강 상태이다. 치료되지 않은 채로 방치되면, 장애는 대상체의 건강 상태를 반드시 추가로 감소시키지는 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "조절하는"이란 치료 또는 화합물의 부재 하에 대상체의 반응의 수준과 비교되고/거나, 그렇지 않으면 동일하지만 치료되지 않은 대상체의 반응 수준과 비교된 대상체의 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 용어는 고유 신호 또는 반응을 교란 및/또는 영향을 미침으로써 대상체, 예컨대 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어로서 질환을 "치료"하는 것은 대상체가 경험하는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 신호 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료적 효과는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 신호 또는 증상의 억제, 감소, 차도, 예방, 또는 근절에 의해 얻어진다.
용어 "치료적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 대상 화합물의 양을 나타낸다. 용어 "치료적 유효량"은 투여되었을 때, 치료되는 장애 또는 질환의 하나 이상의 신호 또는 증상의 발생을 방지하거나, 어느 정도까지 완화시키기에 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료적 유효량은 화합물, 질환 및 그것의 중증도 및 치료되는 대상체의 연령, 체중, 등에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "형질주입된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포에 전달되거나 도입되는 과정을 나타낸다. "형질주입된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 형질주입되었거나, 형질전환되었거나 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상 세포 및 그것의 자손을 포함한다.
본원에서 사용되는 구절 "전사 제어 하에" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터가 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 정확한 위치 및 방향에 있어서 RNA 중합효소에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "추가 성분"으로, 한정하는 것은 아니지만, 다음 중 하나 이상을 들 수 있다: 부형제; 계면활성제; 분산제; 비활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 착향료; 착색제; 보존제; 생리적으로 분해될 수 있는 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생물질; 항진균제; 안정화제; 및 제약학적으로 허용되는 중합체 또는 소수성 물질. 발명의 제약학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"이 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)에서 기술되며, 위의 내용은 참조로 본원에 포함된다.
범위: 본 개시 전체에서, 발명의 다양한 측면이 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 기술은 단순히 편리성 및 간결성을 위한 것이며 발명의 범주에 대한 완강한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기술은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위를 가질뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 숫자 값을 가지는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위범위, 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 가지는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
설명
본 발명은 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 발명은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 백신이며, 백신은 대상체에서 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하므로, 백신은 범용 인플루엔자 백신이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 HA 항원 또는 그것의 단편, NA 항원 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, M1 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것들의 임의의 조합을 암호화한다. 한 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 뉴클레오사이드 변형 mRNA이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 LNP에 캡슐화된다.
백신
한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신이다. 조성물이 백신으로서 유용해지기 위해서는, 조성물은 세포, 조직 또는 대상체에서 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도해야 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포, 조직 또는 대상체에서 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 경우에, 백신은 대상체에서 보호 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 백신은 핵산 및/또는 세포 구성요소의 조성이 다를 수 있다. 한 구현예에서, 백신은 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 핵산을 포함한다. 비제한적인 예에서, 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 핵산은 또한 보조제와 함께 제형화되어야 한다. 물론, 본원에 기술된 다양한 조성물은 추가 구성요소를 추가로 포함할 수 있는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 백신 구성요소가 지질, 리포솜, 또는 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 백신은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신, 및 그것의 다양한 구성요소는 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 또는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려진 것과 같이 본 개시의 측면에서 제조되고/거나 투여될 수 있다.
다양한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원의 발현에 의한 면역의 유도는 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 숙주의 면역 체계의 전부 또는 임의의 일부의 생체내 또는 시험관내 반응을 관찰함으로써 검출될 수 있다.
예를 들어, 세포독성 T 림프구의 유도를 검출하는 방법은 잘 알려져 있다. 살아있는 신체에 진입하는 외래 물질은 항원 제공 세포(APC)의 작용에 의해 T 세포 및 B 세포에 제시된다. APC에 의해 제공된 항원에 항원 특이적 방식으로 반응하는 일부 T 세포는 항원에 의한 자극으로 인해 세포독성 T 세포(또한 세포독성 T 림프구 또는 CTL로 언급됨)로 분화된다. 이들 항원 자극 세포는 그런 후 증식한다. 이 과정은 본원에서 T 세포의 "활성화"로 언급된다. 그러므로, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프에 의한 CTL 유도는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프를 APC에 의해 T 세포에 제공하고, CTL의 유도를 검출함으로써 평가될 수 있다. 나아가, APC는 B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포, 호산성 세포 및 NK 세포를 활성화하는 효과를 가진다.
APC로서 수지상 세포(DC)를 사용하여 CTL의 유도 작용을 평가하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. DC는 APC 중에서 강력한 CTL 유도 작용을 가진 대표적인 APC이다. 발명의 방법에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프는 처음에 DC에 의해 발현된 후 이 DC는 T 세포와 접촉한다. DC와 접촉된 후에 관심 있는 세포에 대해 세포독성 효과를 가진 T 세포의 검출은 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프가 세포독성 T 세포를 유도하는 활성을 가지는 것을 보여준다. 나아가, 유도된 면역 반응은 또한 고정된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합을 운반하는 항원 제공 세포의 존재 하에 CTL에 의해 생성되고 방출된 IFN-감마를, 항-IFN-감마 항체, 예컨대 ELISPOT 검정을 사용하여 시각화함으로써 측정하여 조사될 수 있다.
DC와 별개로, 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 또한 APC로서 사용될 수 있다. CTL의 유도는 PBMC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 배양함으로써 향상되는 것으로 보고된다. 유사하게, CTL은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 IL-7의 존재 하에 PBMC를 배양함으로써 유도되는 것으로 나타났다.
이들 방법에 의해 CTL 유도 활성을 가지는 것으로 확인된 항원은 DC 활성화 효과 및 후속되는 CTL 유도 활성을 가지는 항원이다. 나아가, APC에 의한 항원의 제공으로 인해 세포독성을 획득한 CTL이 또한 항원 관련 장애에 대한 백신으로서 사용될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 항원의 발현에 의한 면역의 유도는 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 항체 생성의 유도를 관찰함으로써 추가로 확인될 수 있다. 예를 들어, 항원에 대한 항체가 항원을 암호화하는 조성물로 면역화된 실험실 대상체에서 유도될 때, 그리고 항원 관련 병리가 그런 항체에 의해 억제될 때, 조성물은 면역을 유도하는 것으로 측정된다.
대상체에서 유도된 항체 반응의 특이성은 전달된 항원의 많은 영역에 대한 결합, 뿐만 아니라 감염을 예방하거나 질환 중증도를 감소시킬 수 있는 중화 항체의 유도를 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 항원의 발현에 의한 면역의 유도는 T 세포, 예컨대 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 그것들의 조합의 유도를 관찰함으로써 추가로 확인될 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 또한 표적 세포를 용해시킬 수 있지만, 주로 CTL 및 항체 생성을 포함한, 다른 유형의 면역 반응의 유도에 도움을 공급한다. CD4+ T 세포 도움의 유형은 Th1, Th2, Th9, Th17, T조절(Treg), 또는 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포로서 특성화될 수 있다. CD4+ T 세포의 각각의 하위유형은 특정 유형의 면역 반응에 도움을 공급한다. 한 구현예에서, 조성물은 강력한 항체 반응을 구동시키는 T 여포 헬퍼 세포를 선택적으로 유도한다.
발명의 치료적 화합물 또는 조성물은 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 발병의 위험이 있는(또는 발병에 취약한) 대상체에게 예방적으로(즉, 질환 또는 장애를 예방하기 위하여) 또는 치료적으로(즉, 질환 또는 장애를 치료하기 위하여) 투여될 수 있다. 그러한 대상체는 표준 임상 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예방적 투여는 질환의 명백한 임상 증상이 표시되기 전에 발생하여, 질환 또는 장애가 방지되거나 또는 대안으로 진행이 지연된다. 의학 분야의 맥락에서, 용어 "예방"은 질환으로부터의 사망 또는 이환의 부담을 감소시키는 임의의 활동을 포함한다. 예방은 일차, 이차 및 삼차 예방 수준으로 일어날 수 있다. 일차 예방으로 질환의 발생을 피하는 한편, 이차 및 삼차 수준의 예방은 질환의 진행 및 증상의 출현을 방지할뿐만 아니라 기능을 복원시키고 질환 관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적 영향을 감소시키 목적의 활동을 포함한다.
항원
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스 항원을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 암호화하는 정제된, 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함한다. 항원은, 한정하는 것은 아니지만, 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 바이러스, 또는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 세포를 들 수 있다.
다양한 구현예에서, 항원은 인플루엔자 바이러스와 관련된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하여서, 항원은 항원, 및 그러므로 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도한다. 한 구현예에서, 항원은 인플루엔자 바이러스와 관련된 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 단편을 포함하여서, 항원은 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도한다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 적어도 하나의 당단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 핵단백질(NP) 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 매트릭스 단백질 1(M1) 항원 또는 그것의 단편, 매트릭스-2(M2) 이온 채널 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 적어도 하나의 당단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, 당단백질 항원은 헤마글루티닌(HA) 항원 또는 그것의 단편이다. 일부 구현예에서, HA 항원은 전장 HA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, HA-줄기 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, HA-헤드 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, HA 헤드 없는(headless) 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 전장 HA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 HA 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 미니 HA 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
예를 들어, 한 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 HA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NA 항원 또는 그것의 단편, 전장 NP 항원 또는 그것의 단편, 및 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편의 조합이다.
한 구현예에서, HA 항원은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. HA 항원에 대한 다른 아미노산 서열은, 한정하는 것은 아니지만, HA 헤드 없는 도메인에 대한 아미노산 서열(예컨대, 미국 특허 제 9,051,359호 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0314490 A1 참고) 및 미니 HA 도메인에 대한 아미노산 서열(예컨대, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/191435 A1 참고)을 포함하여 기술분야에 알려져 있으며, 인용된 출원의 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 2 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 4 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 6 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 8 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 10 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 12 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 14 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 16 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 18 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 20 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 22 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 24 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 26 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 HA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 28 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
HA 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 암호화하는 다른 핵산 서열이, 한정하는 것은 아니지만, HA 헤드 없는 도메인을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 암호화하는 핵산 서열(예컨대, 미국 특허 제 9,051,359호 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0314490 A1 참고) 및 미니 HA 도메인을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 암호화하는 핵산 서열(예컨대, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/191435 A1 참고)을 포함하여 기술분야에 알려져 있고, 인용된 출원의 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
한 구현예에서, 당단백질 항원은 뉴라미니다제(NA) 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, NA 항원은 전장 NA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, NA-줄기 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, NA-헤드 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 테트라머화 도메인을 가진 NA-헤드 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 분비된 NA 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 전장 NA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 NA 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
한 구현예에서, NA 항원은 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 30 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 32 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 34 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 36 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 38 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 40 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 42 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 44 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 46 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 48 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 50 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 52 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NA 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 54 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 적어도 하나의 NP 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, NP 항원은 전장 NP 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 전장 NP 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 NP 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
한 구현예에서, NP 항원은 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 56 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 58 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 60 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 62 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 64 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 66 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 68 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 70 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 72 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 74 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 76 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 78 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NP 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 80 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 적어도 하나의 M2 이온 채널 단백질 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, M2 이온 채널 항원은 전장 M2 이온 채널 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 전장 M2 이온 채널 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 M2 이온 채널 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편 또는 변이체, M2 이온 채널-세포외 도메인 또는 그것의 단편 또는 변이체, M2 이온 채널-세포내 도메인 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
한 구현예에서, M2 이온 채널 항원은 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 82 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 84 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 86 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 88 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 90 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 92 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 94 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 96 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 98 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 100 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 102 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 104 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 106 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 적어도 하나의 M1 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, M1 항원은 전장 M1 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 전장 M1 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 최적화된 M1 도메인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
한 구현예에서, M1 항원은 서열 번호: 107에 제시된 아미노산 서열 또는 그것의 변이체 또는 단편을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 M1 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 108 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 적어도 하나의 당단백질 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, NP 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, M2 이온 채널 단백질 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 적어도 하나의 HA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, NA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, NP 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, M1 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 M2 이온 채널 단백질 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 또는 그것들의 임의의 조합에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
그러므로, 한 구현예에서, 조성물은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 또는 그것들의 단편 또는 변이체 중 적어도 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 그러한 아미노산 서열의 추가의 예는 서열 번호: 109, 서열 번호: 110, 서열 번호: 111, 서열 번호: 112, 서열 번호: 113, 서열 번호: 114, 서열 번호: 115, 서열 번호: 116, 서열 번호: 117, 서열 번호: 118, 서열 번호: 119, 서열 번호: 120, 서열 번호: 121, 서열 번호: 122, 서열 번호: 123, 서열 번호: 124, 서열 번호: 125, 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 또는 그것의 단편 또는 변이체에 제시된 아미노산 서열에, 및/또는 미국 특허 제: 10,328,144호에 제공되며, 인용된 출원의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, 한 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HA-줄기 도메인, 서열 번호: 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NA 항원, 서열 번호: 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NP 항원, 및 서열 번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 M2 이온 채널 항원의 조합이다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HA-줄기 도메인의 단편, 서열 번호: 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NA 항원의 단편, 서열 번호: 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NP 항원의 단편, 및 서열 번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 M2 이온 채널 항원의 단편의 조합이다.
일부 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 24, 서열 번호: 26, 서열 번호: 28, 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 34, 서열 번호: 36, 서열 번호: 38, 서열 번호: 40, 서열 번호: 42, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 48, 서열 번호: 50, 서열 번호: 52, 서열 번호: 54, 서열 번호: 56, 서열 번호: 58, 서열 번호: 60, 서열 번호: 62, 서열 번호: 64, 서열 번호: 66, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 76, 서열 번호: 78, 서열 번호: 80, 서열 번호: 82, 서열 번호: 84, 서열 번호: 86, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 서열 번호: 92, 서열 번호: 94, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 서열 번호: 106, 서열 번호: 108, 또는 그것의 단편 또는 변이체 중 적어도 하나를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 그러한 핵산 서열의 추가의 예는 미국 특허 제: 10,328,144호에 제공되며, 출원의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 HA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, NA 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, NP 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, M1 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 M2 이온 채널 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하며, 핵산 서열은 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 24, 서열 번호: 26, 서열 번호: 28, 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 34, 서열 번호: 36, 서열 번호: 38, 서열 번호: 40, 서열 번호: 42, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 48, 서열 번호: 50, 서열 번호: 52, 서열 번호: 54, 서열 번호: 56, 서열 번호: 58, 서열 번호: 60, 서열 번호: 62, 서열 번호: 64, 서열 번호: 66, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 76, 서열 번호: 78, 서열 번호: 80, 서열 번호: 82, 서열 번호: 84, 서열 번호: 86, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 서열 번호: 92, 서열 번호: 94, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 서열 번호: 106, 서열 번호: 108, 또는 그것의 단편 또는 변이체 중 적어도 하나를 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되고, 핵산 서열은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
예를 들어, 한 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 28에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 42에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 68에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 및 서열 번호: 94에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 항원은 MHC 부류 II로부터의 신호 펩타이드(SP)를 포함하는 단백질을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 신호 펩타이드로는, 한정하는 것은 아니지만, IL-2, tPA, 마우스 및 인간 IgG로부터 유래된 신호 서열, 및 합성 최적화된 신호 서열을 들 수 있다.
인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스의 임의의 유형 또는 스트레인의 것일 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 한정하는 것은 아니지만, 인플루엔자 바이러스 A 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 인플루엔자 바이러스 B 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 인플루엔자 바이러스 C 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 인플루엔자 바이러스 D 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 인플루엔자 바이러스 스트레인의 단백질, 또는 그것의 단편이다. 한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은, 한정하는 것은 아니지만, H1N1 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H2N2 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H3N2 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H5N1 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H7N7 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H1N2 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H9N2 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H7N2 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H7N3 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H10N7 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H7N9 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H6N1 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 및 그것들의 임의의 조합을 포함하는 인플루엔자 바이러스 스트레인의 단백질, 또는 그것의 단편이다.
한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은, 한정하는 것은 아니지만, 인플루엔자 HA 1군 바이러스 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 인플루엔자 NA 1군 바이러스 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 및 그것들의 임의의 조합을 포함하는 인플루엔자 바이러스 스트레인의 단백질, 또는 그것의 단편이다. 한 구현예에서, 인플루엔자 HA 1군 바이러스 스트레인으로는, 한정하는 것은 아니지만, H1 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H2 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H3 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H4 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H5 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H6 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H7 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H8 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H9 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H10 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H11 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H12 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H13 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H15 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H15 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H16 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H17 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, H18 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다. 한 구현예에서, 인플루엔자 NA 1군 바이러스 스트레인으로는, 한정하는 것은 아니지만, N1 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N2 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N3 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N4 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N5 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N6 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N7 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N8 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N9 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N10 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, N11 스트레인, 또는 그것의 단편 또는 변이체, 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 본원에 기술된 인플루엔자 바이러스 항원의 아미노산 서열에 실질적으로 상동하고 원래의 아미노산 서열의 면역원성 기능을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원의 아미노산 서열은 원래의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성 정도를 가진다.
한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 항원은 핵산 분자의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 바이러스 DNA, 그것의 변이체, 그것의 단편, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 핵산 서열은 변형된 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서 인플루엔자 바이러스 항원 암호화 핵산 서열은 본원의 다른 곳에서 상세하게 기술되는 것과 같이, 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결되는 링커 또는 태그 서열을 암호화하는 추가 서열을 포함한다.
보조제
한 구현예에서, 조성물은 보조제를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 보조제를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 보조 암호화 핵산 분자는 IVT RNA이다. 한 구현예에서, 보조 암호화 핵산 분자는 뉴클레오사이드 변형 RNA이다. 한 구현예에서, 보조 암호화 핵산 분자는 뉴클레오사이드 변형 mRNA이다.
예시의 보조제로는, 한정하는 것은 아니지만, 알파 인터페론, 감마 인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부의 T 세포 유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선 발현 케모카인(TECK), 점막 관련 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86을 들 수 있다. 유용한 보조제일 수 있는 다른 유전자로는 다음을 암호화하는 것들을 들 수 있다: MCP-I, MIP-Ia, MIP-Ip, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-I, VLA-I, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-I, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-I, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-I, Ap-I, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP 1, TAP2, 항-CTLA4-sc, 항-LAG3-Ig, 항-TIM3-Ig, 및 그것들의 기능성 단편.
일부 구현예에서, 조성물은 LNP를 포함하며, LNP는 보조제로서 작용한다.
핵산
한 구현예에서, 발명은 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 발명은 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하여 복수의 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 적응 면역 반응을 유도하는 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, 발명은 보조제를 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함한다.
핵산 분자는 한정하는 것은 아니지만, 시험관내 전사, 화학적 합성, 등을 포함한 기술분야의 임의의 방법론을 사용하여 만들어질 수 있다.
본원에서 기술된, 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 대안으로 원래의 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 결과적으로 생성되는 폴리뉴클레오타이드가 발명에 따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 조건으로, 서열 변이, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 범주는 본원에서 인용된 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상동성이고 관심 있는 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상동성인 뉴클레오타이드 서열은 전형적으로, 예를 들어 보존성 또는 비보존성 치환을 도입하는 수단에 의해 뉴클레오타이드 서열에 함유된 정보를 토대로 항원의 생산자 유기체로부터 분리될 수 있다. 가능한 변형의 다른 예로는 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 서열의 임의의 단부에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 또는 서열의 임의의 단부 또는 내부에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 들 수 있다. 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 동일성 정도는 기술분야에 숙련된 사람들에게 널리 알려져 있는 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 측정된다.
추가로, 발명의 범주는 본원에서 나열된 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 암호화하고 원래의 아미노산 서열의 면역원성 기능을 보존하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 발명은 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 구성물은 복수의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 복수의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 구성물은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 모든 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, 발명은 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 구성물은 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 보조제를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 복수의 구성물을 포함하며, 각각의 구성물은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 조성물은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 구성물을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 약 5 내지 11개의 구성물을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 구성물; 및 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 구성물을 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 구성물은 번역 제어 요소에 작동 가능하게 결합된다. 구성물은 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해 작동 가능하게 결합된 조절 서열을 통합할 수 있고, 그로써 발현 카세트를 형성할 수 있다.
벡터
인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제를 코딩하는 핵산 서열은 기술분야에 알려져 있는 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 유전자를 포함하는 것으로 알려져 있는 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 그것을 함유하고 있는 세포 및 조직으로부터 표준 기법을 사용하여 직접 분리함으로써 얻을 수 있다. 대안으로, 관심 있는 유전자는 합성으로 제조될 수 있다.
핵산은 많은 유형의 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 한정하는 것은 아니지만 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, PCR 생성 선형 DNA 서열, 및 코스미드를 포함한 벡터에 클로닝될 수 있다. 특히 관심이 있는 벡터로는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 서열분석 벡터 및 시험관내 전사를 위해 최적화된 벡터를 들 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단으로는 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼을 포함하는 지질 기반 시스템, 미셸, 복합 미셸, 탄수화물, 펩타이드, 양이온성 중합체, 및 리포솜을 들 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시의 콜로이드성 시스템은 리포솜(예컨대, 인공 막 소포)이다.
비바이러스 전달 시스템이 활용되는 경우에, 예시의 전달 비히클은 리포솜이다. 핵산의 숙주 세포로의 도입을 위해(시험관내, 생체외 또는 생체내) 지질 제형의 사용이 고려된다. 또 다른 측면으로, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 회합되는 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 갇히거나, 리포솜과 복합체를 형성하거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중의 현탁액으로서 함유되거나, 미셸에 함유되거나 복합체를 형성하거나, 또는 그렇지 않으면 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/RNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액에서 임의의 특정 구조로 한정되지 않는다. 예를 들어, 그것은 이중층 구조에, 미셸로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그것은 또한 간단히 용액에 산재되어, 크기 또는 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 가능성이 있다. 지질은 자연적으로 발생할 수 있거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소를 함유하는 화합물 및 그것의 유도체 부류, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 다이미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO로부터 얻을 수 있고; 다이세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(Plainview, NY)로부터 얻을 수 있으며; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 얻을 수 있고; 다이미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)로부터 얻을 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발되기 때문에 사용된다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위해 또는 다르게는 세포를 본 발명의 조성물에 노출하기 위해 사용된 방법과 관계 없이, 숙주 세포에서 mRNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 그러한 검정으로는, 예를 들어, 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 "분자 생물학" 검정, 예컨대, 노던 블롯팅 및 RT-PCR; "생화학적 검정", 예컨대 특정 펩타이드의 존재 또는 부재를, 예컨대, 면역원성 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 발명의 범주 내에 속하는 작용제를 확인하기 위해 본원에서 기술된 검정에 의해 검출하는 것을 들 수 있다.
시험관내 전사된 RNA
한 구현예에서, 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 시험관내 전사된(IVT) RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 발명의 조성물은 복수의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 IVT RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 발명의 조성물은 보조제를 암호화하는 IVT RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 발명의 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 및 하나 이상의 보조제를 암호화하는 IVT RNA를 포함한다.
한 구현예에서, IVT RNA는 세포에 일시적인 형질주입의 형태로서 도입될 수 있다. RNA는 합성에 의해 생성된 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 있는 DNA가 PCR에 의해 적절한 프라이머 및 RNA 중합효소를 사용하여 직접 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 한 구현예에서, 시험관내 전사를 위해 원하는 주형은 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 인플루엔자 바이러스 항원이다. 한 구현예에서, 시험관내 전사를 위해 원하는 주형은 적응 면역 반응을 향상시킬 수 있는 보조제이다.
한 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터의 자연적으로 발생하는 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, DNA는 유전자의 일부분의 관심 있는 전장 유전자이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 미번역 영역(UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 진균을 포함한 병원성 또는 상업용 유기체로부터의 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는, 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 진균을 포함한 병원성 또는 상업용 유기체로부터의 유전자이다. DNA는 대안으로 정상적으로는 자연적으로 발생하는 유기체에서 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시의 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 일부를 함유하는 서열이다. 함께 결찰되는 DNA의 일부는 단일 유기체로부터 또는 하나 이상의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR을 위한 DNA의 공급원으로서 사용될 수 있는 유전자는 유기체에서 적응 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 유전자는 단기 치료에 유용하다. 일부 경우에, 유전자는 발현된 유전자의 투여량과 관련하여 제한된 안전성 문제를 가진다.
다양한 구현예에서, 플라스미드는 형질주입에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 가진 화학적 구조물이 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 5' 및 3' UTR을 가진다. 한 구현예에서, 5' UTR은 길이가 0 내지 3000개 뉴클레오타이드이다. 코딩 영역에 첨가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 한정하는 것은 아니지만, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR을 위한 프라이머를 설계하는 것을 포함한 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 전사된 RNA의 형질주입 후에 최적의 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 있는 유전자에 대한 자연적으로 발생하는, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안으로, 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열이 전방향 및 역방향 프라이머에 UTR 서열을 통합시킴으로써 또는 주형의 다른 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키기 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU 풍부 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 3' UTR은 기술분야에 잘 알려져 있는 UTR의 특성을 토대로 전사된 RNA의 안정성을 증가시키기 위해 선택되거나 설계될 수 있다.
한 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 함유할 수 있다. 대안으로, 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 5' UTR이 위에서 기술된 것과 같이 PCR에 의해 첨가되는 경우, 공통 Kozak 서열이 5' UTR 서열을 첨가함으로써 재설계될 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사물의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역을 할 수 있게 하는데 필요한 것으로 보이지 않는다. 많은 mRNA에 대해 Kozak 서열에 대한 요건은 기술분야에 알려져 있다. 다른 구현예에서 5' UTR은 그것의 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서 다양한 뉴클레오타이드 유사체가 3' 또는 5' UTR에 사용되어 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해할 수 있다.
DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위하여, 전사의 프로모터가 전사될 서열의 상류에서 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 중합효소에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 전방향 프라이머의 5' 단부에 첨가될 때, RNA 중합효소 프로모터는 전사될 오픈 리딩 프레임의 상류에서 PCR 생성물에 통합된다. 한 구현예에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에서 기술된 T7 RNA 중합효소 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터로는, 한정하는 것은 아니지만, T3 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터를 들 수 있다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오타이드 서열은 기술분야에 알려져 있다.
한 구현예에서, mRNA는 5' 단부 및 3' 폴리(A) 꼬리상에서 모두 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서의 mRNA의 안정성을 결정하는 캡을 가지고 있다. 원형 DNA 주형, 예를 들어, 플라스미드 DNA 상에서, RNA 중합효소는 긴 연쇄체 생성물을 생성하는데, 그것은 진핵 세포에서의 발현에는 적합하지 않다. 3' UTR의 단부에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 정상적인 크기의 mRNA를 초래하고, 그것은 전사 후 폴리아데닐화될 때 진핵 형질주입에 효과적이다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 중합효소는 전사물의 3' 단부를 주형의 마지막 염기를 지나 연장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36(1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65(2003)).
폴리A/T 구간을 DNA 주형에 통합시키는 종래 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 그것은 플라스미드 증식을 위한 재조합 무능 박테리아 세포의 사용을 통해 개선될 수 있다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 폴리(A) 중합효소, 예컨대 대장균 폴리A 중합효소(E-PAP) 또는 효모 폴리A 중합효소의 사용으로 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100개 뉴클레오타이드로부터 300 내지 400개 뉴클레오타이드로 증가시키는 것은 RNA의 번역 효율의 약 2배 증가를 초래한다. 추가적으로, 3' 단부에 대한 상이한 화학적 기의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 그러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오타이드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체가 폴리(A) 중합효소를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 통합될 수 있다. ATP 유사체는 추가로 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한 mRNA 분자에 안정성을 제공할 수 있다. 한 구현예에서, RNA는 5' 캡1 구조를 포함하도록 방법에 의해 생성된다. 그러한 캡1 구조는 백시니아 캡핑 효소 및 2'-O-메틸트랜스퍼라제 효소(CellScript, Madison, WI)를 사용하여 생성될 수 있다. 대안으로, 5' 캡은 기술분야에 알려져 있고 본원에서 기술되는 기법을 사용하여 제공된다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444(2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95(2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966(2005)).
RNA는 많은 상이한 방법 중 임의의 방법, 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 유전자 펄서 II(BioRad, Denver, Colo.), 멀티포레이터(Eppendort, Hamburg Germany), 리포펙션을 사용하는 양이온성 리포솜 매개 형질주입, 중합체 캡슐화, 펩타이드 매개 형질주입, 또는 "유전자 총"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템(예를 들어, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70(2001) 참고)을 포함하는 상업적으로 활용 가능한 방법을 사용하여 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서 발명의 RNA는, 일부 경우에, 높은 효율, 저독성의 형질주입을 제공하는 TransIT®-mRNA 형질주입 키트(Mirus, Madison WI)의 사용을 포함하는 방법으로 세포에 도입된다.
뉴클레오사이드 변형 RNA
한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 포함한 복수의 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 보조제를 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 및 하나 이상의 보조제를 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 계통 계획을 따르기 위해 각각의 후속 주입에 대해 변경되는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 일련의 뉴클레오시드-변형된 핵산을 포함한다.
예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 뉴클레오사이드 변형 mRNA를 포함한다. 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 예를 들어, 증가된 안정성, 낮거나 없는 선천성 면역원성, 및 향상된 번역을 포함한, 비변형 mRNA보다 특별한 장점을 가진다. 본 발명에 유용한 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 추가로 미국 특허 제 8,278,036호, 제 8,691,966호, 및 제 8,835,108호에서 기술되며, 이들 특허의 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 임의의 병태생리학적 경로를 활성화하지 않으며, 매우 효율적으로 그리고 거의 전달 직후 번역하고, 수일 내지 수주 동안 지속되는 생체내 연속적인 단백질 생성을 위한 주형으로서 작용한다(Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953). 생리적 효과를 나타내기 위해 필요한 mRNA의 양은 작아서, 인간 치료법에 적용할 수 있게 만든다. 예를 들어, 본원에서 기술된 것과 같이, 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 항원 특이적 항체 생성을 유도하는 능력을 입증하였다. 예를 들어, 일부 경우에, 뉴클레오사이드 변형 mRNA에 의해 암호화된 항원은 비변형 mRNA에 의해 암호화된 항원과 비교하여 더 큰 항원 특이적 항체 생성을 유도한다.
일부 경우에, 암호화 mRNA를 전달함으로써 단백질을 발현시키는 것은 단백질, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터을 사용하는 방법보다 많은 이익을 가진다. mRNA 형질주입 중에, 원하는 단백질의 코딩 서열은 세포에 전달되는 유일한 물질이고, 그로써 플라스미드 백본, 바이러스 유전자, 및 바이러스 단백질과 관련된 모든 부작용을 피할 수 있다. 보다 중요하게, DNA- 및 바이러스 기반 벡터와 달리, mRNA는 게놈에 통합될 위험을 지니지 않으며 단백질 생성은 mRNA 전달 직후에 시작된다. 예를 들어, 고수준의 순환 단백질이 암호화 mRNA의 생체내 주입 후 15 내지 30분 이내에 측정되었다. 일부 구현예에서, 단백질보다 오히려 mRNA를 사용하는 것이 또한 많은 장점을 가진다. 순환계 또는 조직에서의 단백질의 반감기는 종종 짧아서, 단백질 치료는 빈번한 투약을 필요로 하겠지만, mRNA는 수일 내지 수주 동안 연속적인 단백질 생성을 위한 주형을 제공한다. 단백질의 정제는 문제의 소지가 있고 그것은 부작용을 유발하는 응집체 및 다른 불순물을 함유할 수 있다(Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265).
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 자연적으로 발생하는 변형된 뉴클레오사이드 슈도우리딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 슈도우리딘의 포함은 mRNA를 보다 안정적이고, 비면역원성이며, 고도로 번역 가능하게 만든다(Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892; Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338; Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953; Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175).
RNA에서 슈도우리딘을 포함하여, 변형된 뉴클레오사이드의 존재는 그것의 선천성 면역원성을 억제하는 것이 입증되어 있다(Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175). 추가로, 단백질 암호화, 시험관내 전사된 슈도우리딘 함유 RNA는 그것이 없거나 다른 변형된 뉴클레오사이드를 함유한 RNA보다 더 효율적으로 번역될 수 있다(Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840). 후속적으로, 슈도우리딘의 존재는 RNA의 안정성을 개선하며(Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338) PKR의 활성화 및 번역 억제를 모두 약화시키는(Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892) 것을 보여준다.
슈도우리딘에 대해 기술된 유사한 효과가 또한 1-메틸-슈도우리딘을 함유한 RNA에 대해서 관찰되었다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 정제된 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물은 이중 가닥 오염물을 제거하기 위하여 정제된다. 일부 경우에, 예비용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제 과정이 우수한 번역 잠재력을 가지며 선천성 면역원성이 없는 슈도우리딘 함유 RNA를 얻기 위해 사용된다(Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142). 마우스 및 및 마카크 원숭이에 에리트로포이에틴을 코딩하는 HPLC-정제된, 슈도우리딘 함유 RNA를 투여하여 혈청 EPO 수준의 상당한 증가가 초래되었고(Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953), 그로써 슈도우리딘 함유 mRNA가 생체내 단백질 요법에 적합한 것이 확인되었다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 비-HPLC 방법을 사용하여 정제된다. 일부 경우에, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 한정하는 것은 아니지만 HPLC 및 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 포함한 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제된다. 예시의 FPLC 기반 정제 과정이 Weissman et al., 2013, Methods Mol Biol, 969: 43-54에 기술되어 있다. 예시의 정제 과정은 또한 미국 특허 출원 공개 번호 US2016/0032316에서 기술되며, 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 RNA, 올리고리보뉴클레오타이드, 및 폴리리보뉴클레오타이드 분자를 포괄한다. 일부 구현예에서, 조성물은 항원을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하며, 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 항원, 보조제, 또는 그것들의 조합을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하며, 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
한 구현예에서, 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 본원의 다른 곳에서 기술된 IVT RNA이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 T7 파지 RNA 중합효소에 의해 합성된다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 SP6 파지 RNA 중합효소에 의해 합성된다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 T3 파지 RNA 중합효소에 의해 합성된다.
한 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m1acp3Ψ(1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필) 슈도우리딘이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m1Ψ(1-메틸슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Ψm(2'-O-메틸슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m5D(5-메틸다이하이드로우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m3Ψ(3-메틸슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 추가로 변형되지 않는 슈도우리딘 모이어티이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 위의 슈도우리딘 중 임의의 것의 일인산염, 이인산염, 또는 삼인산염이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 슈도우리딘 유사 뉴클레오사이드이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA에서 변형되는 뉴클레오사이드는 우리딘(U)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 시티딘(C)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 아데노신(A)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 구아노신(G)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 뉴클레오사이드는 m5C(5-메틸시티딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m5U(5-메틸우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m6A(N6-메틸아데노신)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 s2U(2-티오우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Ψ(슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Um(2'-O-메틸우리딘)이다.
다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m1A(1-메틸아데노신); m2A(2-메틸아데노신); Am(2'-O-메틸아데노신); ms2m6A(2-메틸티오-N6-메틸아데노신); i6A(N6-아이소펜테닐아데노신); ms2i6A(2-메틸티오-N6아이소펜테닐아데노신); io6A(N6-(cis-하이드록시아이소펜테닐)아데노신); ms2io6A(2-메틸티오-N6-(cis-하이드록시아이소펜테닐) 아데노신); g6A(N6-글리시닐카바모일아데노신); t6A(N6-트레오닐카바모일아데노신); ms2t6A(2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신); m6t6A(N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신); hn6A(N6-하이드록시노르발릴카바모일아데노신); ms2hn6A(2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴 카바모일아데노신); Ar(p)(2'-O-리보실아데노신(포스페이트)); I(이노신); m1I(1-메틸이노신); m1Im(1,2'-O-다이메틸이노신); m3C(3-메틸시티딘); Cm(2'-O-메틸시티딘); s2C(2-티오시티딘); ac4C(N4-아세틸시티딘); f5C(5-포르밀시티딘); m5Cm(5,2'-O-다이메틸시티딘); ac4Cm(N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘); k2C(리시딘); m1G(1-메틸구아노신); m2G(N2-메틸구아노신); m7G(7-메틸구아노신); Gm(2'-O-메틸구아노신); m2 2G(N2,N2-다이메틸구아노신); m2Gm(N2,2'-O-다이메틸구아노신); m2 2Gm(N2,N2,2'-O-트라이메틸구아노신); Gr(p)(2'-O-리보실구아노신(포스페이트)); yW(위부토신); o2yW(퍼옥시위부토신); OHyW(하이드록시위부토신); OHyW*(과소변형 하이드록시위부토신); imG(와이오신); mimG(메틸와이오신); Q(퀴오신); oQ(에폭시퀴오신); galQ(갈락토실-퀴오신); manQ(만노실-퀴오신); preQ0(7-시아노-7-데아자구아노신); preQ1(7-아미노메틸-7-데아자구아노신); G+(아캐오신); D(다이하이드로우리딘); m5Um(5,2'-O-다이메틸우리딘); s4U(4-티오우리딘); m5s2U(5-메틸-2-티오 우리딘); s2Um(2-티오-2'-O-메틸우리딘); acp3U(3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘); ho5U(5-하이드록시우리딘); mo5U(5-메톡시우리딘); cmo5U(우리딘 5-옥시아세트산); mcmo5U(우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르); chm5U(5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘)); mchm5U(5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르); mcm5U(5-메톡시카르보닐메틸우리딘); mcm5Um(5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘); mcm5s2U(5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘); nm5s2U(5-아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5U(5-메틸아미노메틸우리딘); mnm5s2U(5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5se2U(5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘); ncm5U(5-카바모일메틸우리딘); ncm5Um(5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5U(5-카르복시메틸아미노메틸우리딘); cmnm5Um(5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5s2U(5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘); m6 2A(N6,N6-다이메틸아데노신); Im(2'-O-메틸이노신); m4C(N4-메틸시티딘); m4Cm(N4,2'-O-다이메틸시티딘); hm5C(5-하이드록시메틸시티딘); m3U(3-메틸우리딘); cm5U(5-카르복시메틸우리딘); m6Am(N6,2'-O-다이메틸아데노신); m6 2Am(N6,N6,O-2'-트라이메틸아데노신); m2,7G(N2,7-다이메틸구아노신); m2,2,7G(N2,N2,7-트라이메틸구아노신); m3Um(3,2'-O-다이메틸우리딘); m5D(5-메틸다이하이드로우리딘); f5Cm(5-포르밀-2'-O-메틸시티딘); m1Gm(1,2'-O-다이메틸구아노신); m1Am(1,2'-O-다이메틸아데노신); τm5U(5-타우리노메틸우리딘); τm5s2U(5-타우리노메틸-2-티오우리딘)); imG-14(4-데메틸와이오신); imG2(아이소와이오신); 또는 ac6A(N6-아세틸아데노신)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 2개 이상의 위의 변형의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 3개 이상의 위의 변형의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 3개를 넘는 위의 변형의 조합을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA의 잔기의 0.1% 내지 100%가 변형된다(예컨대, 슈도우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 또는 또 다른 변형된 뉴클레오사이드 염기의 존재에 의해). 한 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.1%이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 55%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 65%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 75%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 85%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 91%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 92%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 93%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 94%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 95%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 96%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 97%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 98%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 99%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 100%이다.
또 다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
또 다른 구현예에서, 주어진 뉴클레오사이드의 잔기(즉, 우리딘, 시티딘, 구아노신, 또는 아데노신)의 0.1%가 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 55%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 65%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 75%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 85%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 91%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 92%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 93%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 94%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 95%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 96%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 97%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 98%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 99%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 100%이다. 또 다른 구현예에서, 변형되는 주어진 뉴클레오타이드의 분율은 8% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
일부 구현예에서, 조성물은 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA의 정제된 제제를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA의 정제된 제제는 실질적으로 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 없다. 일부 구현예에서, 정제된 제제는 모든 다른 핵산 분자(DNA, dsRNA, 등)에 비해 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93 % 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.9%가 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 세포에서 동일한 서열을 가진 비변형 RNA 분자보다 더 효율적으로 번역된다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 표적 세포에 의해 번역되는 향상된 능력을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 번역은 비변형 대응물에 비해 2배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 3배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 4배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 5배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 6배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 7배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 8배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 9배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 10배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 15배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 20배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 50배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 100배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 200배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 500배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 1000배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 2000배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-100배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-200배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-300배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-500배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 20-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 30-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 50-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 100-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 200-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 번역은 임의의 다른 유의미한 양 또는 양의 범위만큼 향상된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 항원 암호화 RNA는 동일한 서열의 비변형 시험관내 합성 RNA 분자와 비교하여 상당히 더 강력한 적응 면역 반응을 유도한다. 또 다른 구현예에서, 변형된 RNA 분자는 그것의 비변형 대응물에서보다 2배 더 큰 적응 면역 반응을 유도한다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 3배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 4배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 5배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 6배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 7배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 8배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 9배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 10배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 15배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 20배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 50배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 100배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 200배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 500배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 1000배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 2000배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 또 다른 배수 차이만큼 증가된다.
또 다른 구현예에서, "상당히 더 강력한 적응 면역 반응을 유도하는"은 적응 면역 반응의 검출 가능한 증가를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 적응 면역 반응의 배수 증가를 나타낸다(예컨대, 위에서 열거된 배수 증가 중 하나). 또 다른 구현예에서, 용어는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 여전히 유사하게 효과적인 적응 면역 반응을 유도하면서 비변형 RNA 분자보다 더 적은 용량 또는 빈도로 투여될 수 있도록 하는 증가를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 증가는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 효과적인 적응 면역 반응을 유도하기 위하여 단일 용량을 사용하여 투여될 수 있도록 하는 정도이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 동일한 서열의 비변형 시험관내 합성 RNA 분자보다 상당히 더 적은 선천성 면역원성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 변형된 RNA 분자는 그것의 비변형 대응물보다 2배 더 적은 선천성 면역원성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 3배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 4배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 5배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 6배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 7배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 8배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 9배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 10배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 15배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 20배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 50배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 100배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 200배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 500배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 1000배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 2000배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 또 다른 배수 차이만큼 감소된다.
또 다른 구현예에서, "상당히 더 적은 선천성 면역원성을 나타내는"은 선천성 면역원성의 검출 가능한 감소를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 선천성 면역원성의 배수 감소를 나타낸다(예컨대, 위에서 열거된 배수 감소 중 하나). 또 다른 구현예에서, 용어는 유효량의 뉴클레오사이드 변형 RNA가 검출 가능한 선천성 면역 반응을 촉발시키지 않으면서 투여될 수 있도록 하는 감소를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 변형된 RNA에 의해 암호화된 단백질의 생성을 검출 가능하게 감소시키기에 충분한 선천성 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복적으로 투여될 수 있도록 하는 감소를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 감소는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 변형된 RNA에 의해 암호화된 단백질의 검출 가능한 생성을 제거하기에 충분한 선천성 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복적으로 투여될 수 있도록 하는 정도이다.
지질 나노입자
한 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA의 전달은 본원의 다른 곳에서 기술된 예시의 RNA 형질주입 방법을 포함한 임의의 적합한 전달 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA의 대상체에의 전달은 접촉 단계 전에 뉴클레오사이드 변형 RNA를 형질주입 시약과 혼합하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 뉴클레오사이드 변형 RNA를 형질주입 시약과 함께 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 양이온성 지질 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 양이온성 중합체 시약이다.
또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 지질 기반 형질주입 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 단백질 기반 형질주입 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 탄수화물 기반 형질주입 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 양이온성 지질 기반 형질주입 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 양이온성 중합체 기반 형질주입 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 폴리에틸렌이민 기반 형질주입 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 칼슘 포스페이트이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 리포펙틴®, 리포펙타민®, 또는 TransIT®이다. 또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 형질주입 시약이다.
또 다른 구현예에서, 형질주입 시약은 리포솜을 형성한다. 리포솜은, 또 다른 구현예에서, 세포내 안정성을 증가시키고, 흡수 효율을 증가시키며 생물학적 활성을 개선시킨다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 세포막을 구성하는 지질과 유사한 방식으로 배열된 지질로 구성된 중공 구형 소포이다. 그것은 또 다른 구현예에서, 수용성 화합물을 가두기 위한 내부 수성 공간을 가지며 직경이 0.05 내지 수 마이크론 범위의 크기를 가진다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 생물학적 활성 형태로 RNA를 세포에 전달할 수 있다.
한 구현예에서, 조성물은 지질 나노입자(LNP) 및 본원에 기술된 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 LNP 및 하나 이상의 항원, 보조제, 또는 그것들의 조합을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 RNA 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 나노미터 차수(예컨대, 1-1,000 nm)의 적어도 하나의 크기를 가지는 입자이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 지질을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 지질은 식 (I), (II) 또는 (III)의 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본원에 기술된 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 제형에 포함된다. 일부 구현예에서, 그러한 지질 나노입자는 양이온성 지질(예컨대, 식 (I), (II) 또는 (III)의 지질) 및 중성 지질, 대전된 지질, 스테로이드 및 중합체 콘쥬게이션된 지질(예컨대, 구조 (IV)의 페길화된 지질과 같은 페길화된 지질)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 지질 나노입자의 지질 부분 또는 지질 나노입자의 일부 또는 전부의 지질 부분에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화됨으로써, 효소적 분해 또는 숙주 유기체 또는 세포의 메커니즘에 의해 유도된 다른 바람직하지 못한 효과, 예컨대 불리한 면역 반응으로부터 보호된다.
다양한 구현예에서, 지질 나노입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 무독성이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는, 지질 나노입자에 존재할 때, 뉴클레아제로의 분해에 대해 수용액에서 저항성이다.
LNP는 하나 이상의 핵산 분자가 부착되거나, 또는 하나 이상의 핵산 분자가 그 안에 캡슐화되는 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질로는 중성 지질 및 페길화된 지질을 들 수 있다.
한 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 선택된 pH, 예컨대 생리적 pH에서 전체 양성 전하를 운반하는 많은 지질 종 중 임의의 것을 포함한다. 그러한 지질로는, 한정하는 것은 아니지만, N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB); N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N―(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카르복시아미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA), 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-다이메틸-2,3-다이올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)를 들 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 사용될 수 있는 양이온성 지질의 많은 상업적 제제가 이용 가능하다. 이것들로는, 예를 들어, 리포펙틴®(DOTMA 및 1,2-다이올레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜, GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y. 제품); 리포펙타민®(N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N-(2-(스퍼민카르복시아미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및 (DOPE)를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜, GIBCO/BRL사 제품); 및 TRANSFECTAM®(에탄올에 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질, Promega Corp., Madison, Wis. 제품)을 들 수 있다. 다음의 지질은 양이온성이며 생리적 pH 아래의 pH에서 양전하를 가진다: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLenDMA).
한 구현예에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다. 발명에 유용한 적합한 아미노 지질로는 WO 2012/016184에서 기술된 것들을 들 수 있고, 위 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 대표적인 아미노 지질로는, 한정하는 것은 아니지만, 1,2-다이리놀레이옥시-3-(다이메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-다이리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-다이리놀레오일-3-다이메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일티오-3-다이메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-다이리놀레오일-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-다이리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-다이리놀레일아미노)-1,2-프로판다이올(DLinAP), 3-(N,N-다이올레일아미노)-1,2-프로판다이올(DOAP), 1,2-다이리놀레일옥소-3-(2-N,N-다이메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 및 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA)을 들 수 있다.
적합한 아미노 지질은 다음 식을 가지는 것들을 포함한다:
식에서 R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 독립적으로 선택적으로 치환된 C10-C24 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C24 알케닐, 선택적으로 치환된 C10-C24 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 C10-C24 아실이고;
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐이거나 또는 R3 및 R4는 결합하여 4 내지 6개의 탄소 원자 및 질소 및 산소로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자의 선택적으로 치환된 헤테로고리형 고리를 형성하고;
R5는 없거나 존재하며 존재하는 경우 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
m, n, 및 p는 동일하거나 상이하며 독립적으로 0 또는 1이고, 단 m, n, 및 p는 동시에 0이 아니며 0;
q는 0, 1, 2, 3, 또는 4이고; 그리고
Y 및 Z는 동일하거나 상이하며 독립적으로 O, S, 또는 NH이다.
한 구현예에서, R1 및 R2는 각각 리놀레일이고, 아미노 지질은 다이리놀레일 아미노 지질이다. 한 구현예에서, 아미노 지질은 다이리놀레일 아미노 지질이다.
대표적인 유용한 다이리놀레일 아미노 지질은 다음 식을 가진다:
식에서 n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이다.
한 구현예에서, 양이온성 지질은 DLin-K-DMA이다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 DLin-KC2-DMA(상기 DLin-K-DMA, 식에서 n은 2임)이다.
한 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 구성요소는 식 (I)의 구조:
또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 호변체, 선구약물 또는 입체이성질체를 가지며, 식에서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 탄소-탄소 이중 결합이고;
R1a 및 R1b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R2a 및 R2b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R3a 및 R3b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R4a 및 R4b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 메틸 또는 사이클로알킬이고;
R7은, 각각의 발생시에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이며;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께 하나의 질소 원자를 포함하는 5, 6, 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성하고;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 24의 정수이며;
b 및 c는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고; 그리고
e는 1 또는 2이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, 또는 L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다. 다른 구현예에서, R1a 및 R1b는 a가 6인 경우 아이소프로필이 아니거나 a가 8인 경우 n-부틸이 아니다.
식 (I)의 또한 추가의 구현예에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, 또는 L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이고; 및
R1a 및 R1b는 a가 6인 경우 아이소프로필이 아니거나 a가 8인 경우 n-부틸이 아니다.
식 (I)의 다른 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는, 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 하나의 질소 원자를 포함하는 5, 6, 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성한다.
식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 임의의 하나는 -O(C=O)- 또는 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다. L1 및 L2는 각각 -O(C=O)-이거나 또는 각각 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다.
식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2는 둘 다 -O(C=O)-이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2는 둘 다 -(C=O)O-이다.
식 (I)의 일부 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2는 둘 다 탄소-탄소 이중 결합이다.
식 (I)의 또 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고 L1 또는 L2 중 다른 하나는 -(C=O)O-이다. 또 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고 L1 또는 L2 중 다른 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다. 또한 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이고 L1 또는 L2 중 다른 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다.
"탄소-탄소" 이중 결합은, 명세서 전체에서 사용되는 바, 다음 구조식 중 하나를 나타내는 것으로 이해된다:
식에서 Ra 및 Rb는, 각각의 발생시에, 독립적으로 H 또는 치환기이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 Ra 및 Rb는, 각각의 발생시에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬, 예를 들어 H 또는 C1-C12 알킬이다.
다른 구현예에서, 식 (I)의 지질 화합물은 다음 구조식(Ia)를 가진다:
다른 구현예에서, 식 (I)의 지질 화합물은 다음 구조식(Ib)를 가진다:
또 다른 구현예에서, 식 (I)의 지질 화합물은 다음 구조식(Ic)를 가진다:
식 (I)의 지질 화합물의 일부 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 구현예에서, a는 0이다. 일부 구현예에서, a는 1이다. 다른 구현예에서, a는 2이다. 또 다른 구현예에서, a는 3이다. 또 다른 구현예에서, a는 4이다. 일부 구현예에서, a는 5이다. 다른 구현예에서, a는 6이다. 또한 다른 구현예에서, a는 7이다. 또 다른 구현예에서, a는 8이다. 일부 구현예에서, a는 9이다. 다른 구현예에서, a는 10이다. 또한 다른 구현예에서, a는 11이다. 또 다른 구현예에서, a는 12이다. 일부 구현예에서, a는 13이다. 다른 구현예에서, a는 14이다. 또한 다른 구현예에서, a는 15이다. 또 다른 구현예에서, a는 16이다.
식 (I)의 일부 다른 구현예에서, b는 1이다. 다른 구현예에서, b는 2이다. 또한 다른 구현예에서, b는 3이다. 또 다른 구현예에서, b는 4이다. 일부 구현예에서, b는 5이다. 다른 구현예에서, b는 6이다. 또한 다른 구현예에서, b는 7이다. 또 다른 구현예에서, b는 8이다. 일부 구현예에서, b는 9이다. 다른 구현예에서, b는 10이다. 또한 다른 구현예에서, b는 11이다. 또 다른 구현예에서, b는 12이다. 일부 구현예에서, b는 13이다. 다른 구현예에서, b는 14이다. 또한 다른 구현예에서, b는 15이다. 또 다른 구현예에서, b는 16이다.
식 (I)의 일부 또 다른 구현예에서, c는 1이다. 다른 구현예에서, c는 2이다. 또 다른 구현예에서, c는 3이다. 또 다른 구현예에서, c는 4이다. 일부 구현예에서, c는 5이다. 다른 구현예에서, c는 6이다. 또한 다른 구현예에서, c는 7이다. 또 다른 구현예에서, c는 8이다. 일부 구현예에서, c는 9이다. 다른 구현예에서, c는 10이다. 또한 다른 구현예에서, c는 11이다. 또 다른 구현예에서, c는 12이다. 일부 구현예에서, c는 13이다. 다른 구현예에서, c는 14이다. 또한 다른 구현예에서, c는 15이다. 또 다른 구현예에서, c는 16이다.
식 (I)의 일부 다른 구현예에서, d는 0이다. 일부 구현예에서, d는 1이다. 다른 구현예에서, d는 2이다. 또한 다른 구현예에서, d는 3이다. 또 다른 구현예에서, d는 4이다. 일부 구현예에서, d는 5이다. 다른 구현예에서, d는 6이다. 또한 다른 구현예에서, d는 7이다. 또 다른 구현예에서, d는 8이다. 일부 구현예에서, d는 9이다. 다른 구현예에서, d는 10이다. 또한 다른 구현예에서, d는 11이다. 또 다른 구현예에서, d는 12이다. 일부 구현예에서, d는 13이다. 다른 구현예에서, d는 14이다. 또한 다른 구현예에서, d는 15이다. 또 다른 구현예에서, d는 16이다.
식 (I)의 일부 다른 다양한 구현예에서, a 및 d는 동일하다. 일부 다른 구현예에서, b 및 c는 동일하다. 일부 다른 특정 구현예에서, a 및 d는 동일하고 b 및 c는 동일하다.
식 (I)에서 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 원하는 특성을 가진 식 (I)의 지질을 얻기 위해 달라질 수 있는 요인이다. 한 구현예에서, a 및 b는 그들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수가 되도록 선택된다. 다른 구현예에서, c 및 d는 그들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수가 되도록 선택된다. 추가의 구현예에서, a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 둘 다 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 또한 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 그러한 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합이 12 이상이 되도록 선택된다.
식 (I)의 일부 구현예에서, e는 1이다. 다른 구현예에서, e는 2이다.
식 (I)의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서의 치환기는 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각각의 발생시에 H이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 전술한 구현예의 일부에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각각의 발생시에 C1-C12 알킬이다.
식 (I)의 추가의 구현예에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 또는 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각각의 발생시에 H이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 전술한 다른 구현예에서 R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (I)의 R5 및 R6 에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 메틸이다. 일부 다른 구현예에서 R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 사이클로알킬, 예를 들어 사이클로헥실이다. 이들 구현예에서 사이클로알킬은 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있다. 일부 다른 구현예에서 사이클로알킬은 C1-C12 알킬, 예를 들어 tert-부틸로 치환된다.
R7에서의 치환기는 식 (I)의 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 적어도 하나의 R7은 H이다. 일부 다른 구현예에서, R7은 각각의 발생시에 H이다. 일부 다른 구현예에서 R7은 C1-C12 알킬이다.
식 (I)의 전술한 구현예의 일부 다른 예에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서, R8 및 R9는 모두 메틸이다.
식 (I)의 일부 상이한 구현예에서, R8 및 R9는, 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성한다. 전술한 일부 구현예에서, R8 및 R9는, 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5-원 헤테로고리형 고리, 예를 들어 피롤리디닐 고리를 형성한다.
다양한 상이한 구현예에서, 식 (I)의 지질은 아래의 표 1에 제시된 구조식 중 하나를 가진다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (I)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서 식 (I)의 지질은 화합물 I-5이다. 일부 구현예에서 식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다.
일부 다른 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 구성요소는 식 (II)의 구조:
또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 호변체, 선구약물 또는 입체이성질체를 가지며, 식에서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, 또는 직접 결합이고;
G1은 C1-C2 알킬렌, -(C=O)-, -O(C=O)-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)- 또는 직접 결합이며;
G2는 -C(=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)S-, -C(=O)NRa 또는 직접 결합이고;
G3은 C1-C6 알킬렌이며;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1a 및 R1b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R2a 및 R2b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R3a 및 R3b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R4a 및 R4b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고;
R7은 C4-C20 알킬이며;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는, 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성하고;
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이며; 그리고
x는 0, 1 또는 2이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이다. 다른 구현예에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다. 일부 상이한 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이고; G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다.
식 (II)의 일부 상이한 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRa-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, -NRaS(O)xNRa-이다.
식 (II)의 전술한 구현예의 다른 예에서, 지질 화합물은 다음의 구조식 (IIA) 또는 (IIB) 중 하나를 가진다:
식 (II)의 일부 구현예에서, 지질 화합물은 구조식 (IIA)를 가진다. 다른 구현예에서, 지질 화합물은 구조식 (IIB)를 가진다.
식 (II)의 임의의 전술한 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -O(C=O)-이다.
식 (II)의 일부 상이한 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -(C=O)O-이다.
식 (II)의 상이한 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 직접 결합이다. 본원에서 사용되는 바, "직접 결합"은 기(예컨대, L1 또는 L2)가 없는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 직접 결합이다.
식 (II)의 다른 상이한 구현예에서, R1a 및 R1b 중 적어도 하나의 발생의 경우, R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 또 다른 상이한 구현예에서, R4a 및 R4b 중 적어도 하나의 발생의 경우, R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 또한 다른 구현예에서, R2a 및 R2b 중 적어도 하나의 발생의 경우, R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 다른 상이한 구현예에서, R3a 및 R3b 중 적어도 하나의 발생의 경우, R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 다양한 다른 구현예에서, 지질 화합물은 다음 구조식 (IIC) 또는 (IID) 중 하나를 가진다:
식에서 e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 1 내지 12의 정수이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, 지질 화합물은 구조식 (IIC)를 가진다. 다른 구현예에서, 지질 화합물은 구조식 (IID)를 가진다.
구조식 (IIC) 또는 (IID)의 다양한 구현예에서, e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 4 내지 10의 정수이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 구현예에서, a는 0이다. 일부 구현예에서, a는 1이다. 다른 구현예에서, a는 2이다. 또한 다른 구현예에서, a는 3이다. 또 다른 구현예에서, a는 4이다. 일부 구현예에서, a는 5이다. 다른 구현예에서, a는 6이다. 또한 다른 구현예에서, a는 7이다. 또 다른 구현예에서, a는 8이다. 일부 구현예에서, a는 9이다. 다른 구현예에서, a는 10이다. 또한 다른 구현예에서, a는 11이다. 또 다른 구현예에서, a는 12이다. 일부 구현예에서, a는 13이다. 다른 구현예에서, a는 14이다. 또한 다른 구현예에서, a는 15이다. 또 다른 구현예에서, a는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, b는 1이다. 다른 구현예에서, b는 2이다. 또한 다른 구현예에서, b는 3이다. 또 다른 구현예에서, b는 4이다. 일부 구현예에서, b는 5이다. 다른 구현예에서, b는 6이다. 또한 다른 구현예에서, b는 7이다. 또 다른 구현예에서, b는 8이다. 일부 구현예에서, b는 9이다. 다른 구현예에서, b는 10이다. 또한 다른 구현예에서, b는 11이다. 또 다른 구현예에서, b는 12이다. 일부 구현예에서, b는 13이다. 다른 구현예에서, b는 14이다. 또한 다른 구현예에서, b는 15이다. 또 다른 구현예에서, b는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, c는 1이다. 다른 구현예에서, c는 2이다. 또한 다른 구현예에서, c는 3이다. 또 다른 구현예에서, c는 4이다. 일부 구현예에서, c는 5이다. 다른 구현예에서, c는 6이다. 또한 다른 구현예에서, c는 7이다. 또 다른 구현예에서, c는 8이다. 일부 구현예에서, c는 9이다. 다른 구현예에서, c는 10이다. 또한 다른 구현예에서, c는 11이다. 또 다른 구현예에서, c는 12이다. 일부 구현예에서, c는 13이다. 다른 구현예에서, c는 14이다. 또한 다른 구현예에서, c는 15이다. 또 다른 구현예에서, c는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, d는 0이다. 일부 구현예에서, d는 1이다. 다른 구현예에서, d는 2이다. 또한 다른 구현예에서, d는 3이다. 또 다른 구현예에서, d는 4이다. 일부 구현예에서, d는 5이다. 다른 구현예에서, d는 6이다. 또한 다른 구현예에서, d는 7이다. 또 다른 구현예에서, d는 8이다. 일부 구현예에서, d는 9이다. 다른 구현예에서, d는 10이다. 또한 다른 구현예에서, d는 11이다. 또 다른 구현예에서, d는 12이다. 일부 구현예에서, d는 13이다. 다른 구현예에서, d는 14이다. 또한 다른 구현예에서, d는 15이다. 또 다른 구현예에서, d는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, e는 1이다. 다른 구현예에서, e는 2이다. 또한 다른 구현예에서, e는 3이다. 또 다른 구현예에서, e는 4이다. 일부 구현예에서, e는 5이다. 다른 구현예에서, e는 6이다. 또한 다른 구현예에서, e는 7이다. 또 다른 구현예에서, e는 8이다. 일부 구현예에서, e는 9이다. 다른 구현예에서, e는 10이다. 또한 다른 구현예에서, e는 11이다. 또 다른 구현예에서, e는 12이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, f는 1이다. 다른 구현예에서, f는 2이다. 또한 다른 구현예에서, f는 3이다. 또 다른 구현예에서, f는 4이다. 일부 구현예에서, f는 5이다. 다른 구현예에서, f는 6이다. 또한 다른 구현예에서, f는 7이다. 또 다른 구현예에서, f는 8이다. 일부 구현예에서, f는 9이다. 다른 구현예에서, f는 10이다. 또한 다른 구현예에서, f는 11이다. 또 다른 구현예에서, f는 12이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, g는 1이다. 다른 구현예에서, g는 2이다. 또한 다른 구현예에서, g는 3이다. 또 다른 구현예에서, g는 4이다. 일부 구현예에서, g는 5이다. 다른 구현예에서, g는 6이다. 또한 다른 구현예에서, g는 7이다. 또 다른 구현예에서, g는 8이다. 일부 구현예에서, g는 9이다. 다른 구현예에서, g는 10이다. 또한 다른 구현예에서, g는 11이다. 또 다른 구현예에서, g는 12이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, h는 1이다. 다른 구현예에서, h는 2이다. 또한 다른 구현예에서, h는 3이다. 또 다른 구현예에서, h는 4이다. 일부 구현예에서, h는 5이다. 다른 구현예에서, h는 6이다. 또한 다른 구현예에서, h는 7이다. 또 다른 구현예에서, h는 8이다. 일부 구현예에서, h는 9이다. 다른 구현예에서, h는 10이다. 또한 다른 구현예에서, h는 11이다. 또 다른 구현예에서, h는 12이다.
식 (II)의 일부 다른 다양한 구현예에서, a 및 d는 동일하다. 일부 다른 구현예에서, b 및 c는 동일하다. 일부 다른 특정 구현예에서 a 및 d는 동일하고 b 및 c는 동일하다.
식 (II)의 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 원하는 특성을 가진 지질을 얻기 위해 달라질 수 있는 요인이다. 한 구현예에서, a 및 b는 그들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수가 되도록 선택된다. 다른 구현예에서, c 및 d는 그들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수가 되도록 선택된다. 추가의 구현예에서, a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 둘 다 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 또한 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합이 12 이상이 되도록 선택된다.
식 (II)의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서의 치환기는 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 H이다. 일부 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각각의 발생시에 H이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 전술한 구현예의 일부에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각각의 발생시에 C1-C12 알킬이다.
식 (II)의 추가의 구현예에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 또는 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각각의 발생시에 H이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 전술한 다른 구현예에서 R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 R5 및 R6에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R5 또는 R6 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서 R5 또는 R6의 각각은 메틸이다.
식 (II)의 R7에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R7은 C6-C16 알킬이다. 일부 다른 구현예에서, R7은 C6-C9 알킬이다. 이들 구현예의 일부에서, R7은 -(C=O)ORb, -O(C=O)Rb, -C(=O)Rb, -ORb, -S(O)xRb, -S-SRb, -C(=O)SRb, -SC(=O)Rb, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -C(=O)NRaRb, -NRaC(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaS(O)xNRaRb, -NRaS(O)xRb 또는 -S(O)xNRaRb로 치환되며, 여기서: Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고; Rb는 C1-C15 알킬이며; x는 0, 1 또는 2이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 R7은 -(C=O)ORb 또는 -O(C=O)Rb로 치환된다.
식 (II)의 전술한 다양한 구현예에서, Rb는 분지형 C1-C15 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 Rb는 다음 구조식 중 하나를 가진다:
식 (II)의 전술한 구현예의 일부 다른 예에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서, R8 및 R9는 둘 다 메틸이다.
식 (II)의 일부 상이한 구현예에서, R8 및 R9는, 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성한다. 전술한 일부 구현예에서, R8 및 R9는, 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5-원 헤테로고리형 고리, 예를 들어 피롤리디닐 고리를 형성한다. 전술한 일부 상이한 구현예에서, R8 및 R9는, 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 6-원 헤테로고리형 고리, 예를 들어 피페라지닐 고리를 형성한다.
식 (II)의 전술한 지질의 또한 다른 구현예에서, G3은 C2-C4 알킬렌, 예를 들어 C3 알킬렌이다.
다양한 상이한 구현예에서, 지질 화합물은 아래의 표 2에 제시된 구조식 중 하나를 가진다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (II)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-9이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-10이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-11이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-12이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-32이다.
일부 다른 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 구성요소는 식 (III)의 구조식:
또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 호변체, 선구약물 또는 입체이성질체를 가지며, 식에서:
L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2의 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이며;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 비치환 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고;
G3은 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, C3-C8 사이클로알케닐렌이며;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이며;
R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5C(=O)R4이고;
R4는 C1-C12 알킬이며;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고; 그리고
x는 0, 1 또는 2이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, 지질은 다음 구조식 (IIIA) 또는 (IIIB) 중 하나를 가진다:
식에서:
A는 3 내지 8-원 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고;
R6은, 각각의 발생시에, 독립적으로 H, OH 또는 C1-C24 알킬이며;
n은 1 내지 15의 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, 지질은 구조식 (IIIA)을 가지며, 다른 구현예에서, 지질은 구조식 (IIIB)을 가진다.
식 (III)의 다른 구현예에서, 지질은 다음 구조식 (IIIC) 또는 (IIID) 중 하나를 가진다:
식에서 y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 12 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예 중 임의의 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -O(C=O)-이다. 전술한 임의의 구현예의 일부 상이한 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -(C=O)O-이다.
식 (III)의 일부 상이한 구현예에서, 지질은 다음 구조식 (IIIE) 또는 (IIIF) 중 하나를 가진다:
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, 지질은 다음의 구조식 (IIIG), (IIIH), (IIII), 또는 (IIIJ) 중 하나를 가진다:
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, n은 2 내지 12, 예를 들어 2 내지 8 또는 2 내지 4의 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, n은 5이다. 일부 구현예에서, n은 6이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부 다른 예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10의 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 9 또는 4 내지 6의 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, R6은 H이다. 전술한 구현예의 다른 예에서, R6은 C1-C24 알킬이다. 다른 구현예에서, R6은 OH이다.
식 (III)의 일부 구현예에서, G3은 비치환된다. 다른 구현예에서, G3은 치환된다. 다양한 상이한 구현예에서, G3은 선형 C1-C24 알킬렌 또는 선형 C1-C24 알케닐렌이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부 다른 예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 C6-C24 알케닐이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각, 독립적으로 다음 구조식을 가진다:
식에서:
R7a 및 R7b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
a는 2 내지 12의 정수이며,
R7a, R7b 및 a는 각각 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12의 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, R7a의 적어도 하나의 발생은 H이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R7a는 각각의 발생시에 H이다. 전술한 다른 상이한 구현예에서, R7b의 적어도 하나의 발생은 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
식 (III)의 상이한 구현예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 다음 구조식 중 하나를 가진다:
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, R3은 OH, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R4이다. 일부 구현예에서, R4는 메틸 또는 에틸이다.
다양한 상이한 구현예에서, 식 (III)의 양이온성 지질은 아래의 표 3에 제시된 구조식 중 하나를 가진다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (III)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 션택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서 식 (III)의 지질은 화합물 III-3이다. 일부 구현예에서 식 (III)의 지질은 화합물 III-7이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 LNP에 약 30 내지 약 95 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 LNP에 약 30 내지 약 70 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 LNP에 약 40 내지 약 60 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 LNP에 약 50 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, LNP는 양이온성 지질만을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 입자의 형성 중에 입자의 형성을 안정화시키는 하나 이상의 추가 지질을 포함한다.
적합한 안정화 지질로는 중성 지질 및 음이온성 지질을 들 수 있다.
예시의 음이온성 지질로는, 한정하는 것은 아니지만, 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-석시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 결합된 다른 음이온성 변형기를 들 수 있다.
예시의 중성 지질로는, 예를 들어, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE) 및 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민(SOPE), 및 1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(트랜스DOPE)을 들 수 있다. 한 구현예에서, 중성 지질은 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
일부 구현예에서, LNP는 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된 중성 지질을 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질(예컨대, 식 (I)의 지질) 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위이다.
다양한 구현예에서, LNP는 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 추가로 포함한다. "스테로이드"는 다음 탄소 골격을 포함하는 화합물이다:
일부 구현예에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 이들 구현예의 일부에서, 양이온성 지질(예컨대, 식 (I)의 지질) 대 콜레스테롤의 몰비는 약 2:1 내지 1:1의 범위이다.
일부 구현예에서, LNP는 당지질(예컨대, 모노시알로강글리오시드 GM1)을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 중합체 콘쥬게이션된 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜-지질(페길화된 지질)인 추가의, 안정화 지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질로는 PEG 변형 포스파티딜에탄올아민, PEG 변형 포스파티드산, PEG 변형 세라마이드(예컨대, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG 변형 다이알킬아민, PEG 변형 다이아실글리세롤, PEG 변형 다이알킬글리세롤을 들 수 있다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질로는 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, 및 PEG-s-DMG를 들 수 있다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-아민(PEG-c-DMA)이다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 구현예에서, LNP는 페길화된 다이아실글리세롤(PEG-DAG), 예컨대 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 석시네이트 다이아실글리세롤(PEG-S-DAG), 예컨대 4-O-(2',3'-다이(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄다이오에이트(PEG-S-DMG), 페길화된 세라마이드(PEG-cer), 또는 PEG 다이알콕시프로필 카바메이트, 예컨대 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트 또는 2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트를 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질 대 페길화된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1의 범위이다.
일부 구현예에서, LNP는 다음 구조식 (IV)을 가지는 페길화된 지질:
또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 호변체 또는 입체이성질체를 포함하며, 식에서: R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고, 알킬 사슬은 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 선택적으로 방해되며; z는 30 내지 60 범위의 평균 값을 가진다.
페길화된 지질 (IV)의 전술한 구현예의 일부에서, R10 및 R11은 둘 다 z가 42인 경우 n-옥타데실이 아니다. 일부 다른 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12 내지 16개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 14개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 다른 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 16개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 또 다른 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 18개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 또 다른 구현예에서, R10은 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고 R11은 14개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다.
다양한 구현예에서, z는 (II)의 PEG 부분이 약 400 내지 약 6000 g/mol의 평균 분자량을 갖도록 선택되는 범위에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 평균 z는 약 45이다.
다른 구현예에서, 페길화된 지질은 다음 구조식 중 하나를 가진다:
식에서 n은 페길화된 지질의 평균 분자량이 약 2500 g/mol이 되도록 선택된 정수이다.
일부 구현예에서, 추가 지질은 LNP에 약 1 내지 약 10 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 LNP에 약 1 내지 약 5 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 LNP에 약 1 몰 퍼센트 또는 약 1.5 몰 퍼센트의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (I)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서 식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다. 상이한 구현예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 다른 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 또 다른 상이한 구현예에서, 페길화된 지질은 화합물 IVa이다.
일부 구현예에서, LNP는 세포 또는 세포 집단에 LNP를 표적화할 수 있는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 표적화 모이어티는 세포 표면에서 발견되는 수용체에 LNP를 지시하는 리간드이다.
일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 내재화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 세포에 결합하여 LNP의 내재화를 유도하는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 하나 이상의 내재화 도메인은 세포 표면에서 발견되는 수용체에 결합하여 LNP의 수용체 매개 흡수를 유도한다. 일부 구현예에서, LNP는 생체내에서 생체분자에 결합할 수 있고, LNP 결합된 생체분자는 그런 후 세포 표면 수용체에 의해 인식되어 내재화가 유도될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 전신성 ApoE에 결합하고, 그것은 LNP 및 관련된 운반물(cargo)의 흡수로 이어진다.
다른 예시의 LNP 및 그것의 제조는 기술분야에, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US20120276209, Semple et al., 2010, Nat Biotechnol., 28(2):172-176; Akinc et al., 2010, Mol Ther., 18(7): 1357-1364; Basha et al., 2011, Mol Ther, 19(12): 2186-2200; Leung et al., 2012, J Phys Chem C Nanomater Interfaces, 116(34): 18440-18450; Lee et al., 2012, Int J Cancer., 131(5): E781-90; Belliveau et al., 2012, Mol Ther Nucleic Acids, 1: e37; Jayaraman et al., 2012, Angew Chem Int Ed Engl., 51(34): 8529-8533; Mui et al., 2013, Mol Ther Nucleic Acids. 2, e139; Maier et al., 2013, Mol Ther., 21(8): 1570-1578; and Tam et al., 2013, Nanomedicine, 9(5): 665-74에 기술되어 있고, 이들 문헌의 각각은 그 전체가 참조로 포함된다.
다음의 반응 계획은 식 (I), (II) 또는 (III)의 지질을 제조하는 방법을 예시한다.
일반 반응 계획 1
식 (I)의 지질의 구현예(예컨대, 화합물 A-5)는 일반 반응 계획 1("방법 A")에 따라 제조될 수 있으며, 식에서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이며 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응 계획 1을 참조하면, 구조식 A-1의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구매하거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. A-1, A-2 및 DMAP의 혼합물이 DCC로 처리되어 브로마이드 A-3이 얻어진다. 브로마이드 A-3, 염기(예컨대, N,N-다이아이소프로필에틸아민) 및 N,N-다이메틸다이아민 A-4의 혼합물은 임의의 필요한 후처리 및/또는 정제 단계 후에 A-5를 생성하기에 충분한 온도 및 시간에서 가열된다.
일반 반응 계획 2
식 (I)의 화합물의 다른 구현예(예컨대, 화합물 B-5)는 일반 반응 계획 2("방법 B")에 따라 제조될 수 있으며, 식에서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이며 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응 계획 2에서 나타난 것과 같이, 구조식 B-1의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구매하거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. B-1(1 당량)의 용액이 산 염화물 B-2(1 당량) 및 염기(예컨대, 트라이에틸아민)로 처리된다. 미정제 생성물은 산화제(예컨대, 클로로크롬산 피리디늄)로 처리되고 중간 생성물 B-3이 회수된다. 미정제 B-3, 산(예컨대, 아세트산), 및 N,N-다이메틸아미노아민 B-4의 용액이 그런 후 환원제(예컨대, 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드)로 처리되어 임의의 필요한 후처리 및/또는 정제 후에 B-5가 얻어진다.
비록 출발 물질인 A-1 및 B-1이 위에서 포화 메틸렌 탄소만을 포함하는 것으로 설명되었어도, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 출발 물질이 또한 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 화합물의 제조에 사용될 수 있는 것이 주지되어야 한다.
일반 반응 계획 3
식 (I)의 지질의 상이한 구현예(예컨대, 화합물 C-7 또는 C9)는 일반 반응 계획 3("방법 C")에 따라 제조될 수 있으며, 식에서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이며 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응 계획 3을 참조하면, 구조식 C-1의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구매하거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다.
일반 반응 계획 4
식 (II)의 화합물의 구현예(예컨대, 화합물 D-5 및 D-7)는 일반 반응 계획 4("방법 D")에 따라 제조될 수 있으며, 식에서 R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, R4b, R5, R6, R8, R9, L1, L2, G1, G2, G3, a, b, c 및 d는 본원에서 정의된 것과 같고, R7'는 R7 또는 C3-C19 알킬을 나타낸다. 일반 반응 계획 1을 참조하면, 구조식 D-1 및 D-2의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구매하거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. D-1 및 D-2의 용액이 환원제(예컨대, 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드)로 처리되어 임의의 필요한 후처리 후에 D-3이 얻어진다. D-3과 염기(예컨대 트라이메틸아민, DMAP)의 용액이 염화 아실 D-4(또는 카르복실산 및 DCC)로 처리되어 임의의 필요한 후처리 및/또는 정제 후에 D-5가 얻어진다. D-5는 LiAlH4 D-6으로 환원되어 임의의 필요한 후처리 및/또는 정제 후에 D-7이 얻어진다.
일반 반응 계획 5
식 (II)의 지질의 구현예(예컨대, 화합물 E-5)는 일반 반응 계획 5("방법 E")에 따라 제조될 수 있으며, 식에서 R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, R4b, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2, G3, a, b, c 및 d는 본원에서 정의된 것과 같다. 일반 반응 계획 2를 참조하면, 구조식 E-1 및 E-2의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구매하거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. E-1(과잉량), E-2 및 염기(예컨대, 탄산 칼륨)의 혼합물이 가열되어 임의의 필요한 후처리 후에 E-3이 얻어진다. E-3 및 염기(예컨대 트라이메틸아민, DMAP)의 용액이 염화 아실 E-4(또는 카르복실산 및 DCC)로 처리되어 임의의 필요한 후처리 및/또는 정제 후에 E-5가 얻어진다.
일반 반응 계획 6
일반 반응 계획 6은 식 (III)의 지질의 제조를 위한 예시의 방법(방법 F)을 제공한다. 일반 반응 계획 6에서 G1, G3, R1 및 R3은 식 (III)에 대해 본원에서 정의된 것과 같고, G1'는 G1의 탄소 하나가 짧은 상동체를 나타낸다. 구조식 F-1의 화합물은 구매하거나 기술분야에 알려져 있는 방법에 따라 제조된다. 적절한 축합 조건(예컨대, DCC) 하에서 F-1과 다이올 F-2의 반응은 에스테르/알코올 F-3을 생산하고, 그런 후 산화되어(예컨대, PCC) 알데하이드 F-4가 생성될 수 있다. 환원성 아민화 조건 하에서 F-4와 아민 F-5와의 반응으로 식 (III)의 지질이 얻어진다.
식 (III)의 지질의 제조를 위한 다양한 대체 전략이 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에게 이용 가능한 것이 주지되어야 한다. 예를 들어, L1 및 L2가 에스테르 이외의 것인 식 (III)의 다른 지질은 적절한 출발 물질을 사용하여 유사한 방법에 따라 제조될 수 있다. 추가로, 일반 반응 계획 6은 식 (III)의 지질의 제조를 설명하며, 식에서 G1 및 G2는 동일하다; 그러나, 이것은 발명의 필요한 측면이 아니며 G1 및 G2가 상이한 화합물을 생성하기 위해 위의 반응 계획에 대한 변형이 가능하다.
기술분야에 숙련된 사람들에게는 본원에 기술된 과정에서 중간 화합물의 작용기가 적합한 보호기에 의해 보호될 필요가 있을 수 있다는 것이 인정될 것이다. 그러한 작용기로는 하이드록시, 아미노, 머캡토 및 카르복실산을 들 수 있다. 하이드록시에 대한 적합한 보호기로는 트라이알킬실릴 또는 다이아릴알킬실릴(예를 들어, t-부틸다이메틸실릴, t-부틸다이페닐실릴 또는 트라이메틸실릴), 테트라하이드로피라닐, 벤질, 등을 들 수 있다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노에 대한 적합한 보호기로는 t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 등을 들 수 있다. 머캡토에 대한 적합한 보호기로는 -C(O)-R"(여기서 R"는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 들 수 있다. 카르복실산에 대한 적합한 보호기로는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르를 들 수 있다. 보호기는 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있고 본원에 기술된 표준 기법에 따라 첨가되거나 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis(1999), 3rd Ed., Wiley에서 상세하게 설명된다. 기술분야에 숙련된 사람이 인정하게 되는 바와 같이, 보호기는 또한 Wang 수지, Rink 수지 또는 2-클로로트리틸-염화물 수지와 같은 중합체 수지일 수 있다.
제약학적 조성물
본원에 기술된 제약학적 조성물의 제형은 약물학 기술분야에서 공지되었거나 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 부속 성분에 가교시키는 단계, 및 그런 후, 필요하거나 바람직하다면, 생성물을 원하는 단일 또는 다중 용량 단위로 성형 또는 포장하는 단계를 포함한다.
비록 본원에 제공된 제약학적 조성물의 설명은 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 제약학적 조성물에 관한 것이지만, 숙련된 기술자에게는 그러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 대상체에 대한 투여에 적합한 것이 이해될 것이다. 조성물이 다양한 대상체에 대한 투여에 적합하게 되기 위해 인간에 투여하기에 적합한 제약학적 조성물의 변형은 잘 이해되며, 통상적인 지식을 가진 수의학적 약물학자는 그러한 변형을 설계하고, 있다면 단순히 통상적인 실험으로 수행할 수 있다. 발명의 제약학적 조성물이 투여되는 것이 고려되는 대상체로는, 한정하는 것은 아니지만, 인간 및 다른 영장류, 비인간 영장류와 같은 상업적으로 관련된 포유류를 포함한 포유류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 및 개를 들 수 있다.
발명의 방법에 유용한 제약학적 조성물은 안과, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 볼, 정맥내, 뇌실내, 피내, 근육내, 또는 다른 경로의 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 다른 고려되는 제형으로는 사출된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유한 재밀봉된 적혈구, 및 면역원성 기반 제형을 들 수 있다.
발명의 제약학적 조성물은 대용량으로, 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약학적 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 예를 들어, 그러한 투여량의 절반 또는 1/3과 같은 편리한 분획과 같다.
발명의 제약학적 조성물 중의 활성 성분, 제약학적으로 허용되는 담체, 및 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 정체성, 크기, 및 상태에 따라, 추가로 조성물이 투여될 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 조성물은 0.1% 내지 100%(중량/중량)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성 성분 외에, 발명의 제약학적 조성물은 하나 이상의 추가의 제약학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
발명의 제약학적 조성물의 제어된- 또는 지속성 방출 제형이 종래 기술을 사용하여 만들어질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 제약학적 조성물 의 "비경구 투여"는 대상체의 조직의 물리적 파열 및 조직의 파열을 통한 제약학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 그러므로 비경구 투여는, 한정하는 것은 아니지만, 조성물의 주사에 의한, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용에 의한, 조직 침투 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용에 의한, 등의 제약학적 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여로는 한정하는 것은 아니지만, 안내, 유리체내, 피하, 복강내, 근육내, 피내, 흉골내 주사, 종양내, 정맥내, 뇌실내 및 신장 투석 주입 기법을 들 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물의 제형은 제약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균된 등장 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 볼러스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 단위 투여 형태로, 예컨대 앰풀 또는 보존제를 함유하는 다중 용량 용기로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로는, 한정하는 것은 아니지만, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클의 에멀젼, 페이스트, 및 이식 가능한 지속성 방출 또는 생분해성 제형을 들 수 있다. 그러한 제형은, 한정하는 것은 아니지만, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 한 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예컨대 멸균된 발열원 없는 물)로 재구성되기 위한 건조한(즉 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
제약학적 조성물은 멸균된 주사용 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이런 현택액 또는 용액은 기술분야에 알려져 있는 대로 제형화될 수 있고, 활성 성분 외에, 본원에 기술된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 그러한 멸균된 주사용 제형은 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예컨대 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 다이올을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용되는 희석제 및 용매로는, 한정하는 것은 아니지만, 링거액, 등장성 염화 나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드와 같은 고정 오일을 들 수 있다. 유용한, 다른 비경구적으로 투여 가능한 제형으로는 활성 성분을 미정질 형태로, 리포솜 제제로, 또는 생분해성 중합체 시스템의 구성요소로서 포함하는 것들을 들 수 있다. 지속성 방출 또는 이식을 위한 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염과 같은 제약학적으로 허용되는 중합체 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
발명의 제약학적 조성물은 구강을 통해 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 그러한 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.5 내지 약 7 나노미터 범위의 직경을 가지는 건조한 입자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 활성 성분을 포함하고 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 가지는 건조한 입자를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 편리하게 분말을 분산시키기 위하여 추진제 스트림이 향할 수 있는 건조 분말 저장고를 포함하는 장치를 사용하여 또는 밀봉된 용기 내에서 저비등 추진제에 용해된 또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치와 같은 자체 추진 용매/분말 분배 용기를 사용하여 투여하기 위한 건조한 분말의 형태이다. 일부 구현예에서, 그러한 분말은 중량 기준으로 입자의 적어도 98%가 0.5 나노미터보다 큰 직경을 가지며 수 기준으로 입자의 적어도 95%가 7 나노미터보다 작은 직경을 가지는 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중량 기준으로 입자의 적어도 95%는 1 나노미터보다 큰 직경을 가지며 수 기준으로 입자의 적어도 90%는 6 나노미터보다 작은 직경을 가진다. 일부 구현예에서, 건조한 분말 조성물은 당(sugar)과 같은 고형 미세 분말 희석제를 포함하며 단위 용량 형태로 편리하게 제공된다.
저비등 추진제는 일반적으로 대기압에서 65℉ 아래의 비등점을 가지는 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(중량/중량)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20%(중량/중량)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제(일부 경우에 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 차수의 입자 크기를 가짐)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물의 제형은 제약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균된 등장성 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 볼러스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사용 제형은 단위 용량 형태로, 예컨대 앰풀로 또는 보존제를 함유하는 다중 용량 용기로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로는, 한정하는 것은 아니지만, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클의 에멀젼, 페이스트, 및 이식 가능한 지속성 방출 또는 생분해성 제형을 들 수 있다. 그러한 제형은, 한정하는 것은 아니지만, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 한 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예컨대 멸균된 발열원 없는 물)로 재구성되기 위한 건조한(즉 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
제약학적 조성물은 멸균된 주사용 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이런 현택액 또는 용액은 기술분야에 알려져 있는 대로 제형화될 수 있고, 활성 성분 외에, 본원에 기술된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 그러한 멸균된 주사용 제형은 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예컨대 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 다이올을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용되는 희석제 및 용매로는, 한정하는 것은 아니지만, 링거액, 등장성 염화 나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드와 같은 고정 오일을 들 수 있다. 유용한, 다른 비경구적으로 투여 가능한 제형으로는 활성 성분을 미정질 형태로, 리포솜 제제로, 또는 생분해성 중합체 시스템의 구성요소로서 포함하는 것들을 들 수 있다. 지속성 방출 또는 이식을 위한 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염과 같은 제약학적으로 허용되는 중합체 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법
본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 적응 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 방법은 대상체에서 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스 감염, 또는 인플루엔자 바이러스와 관련된 질환 또는 장애에 대한 면역을 제공한다. 그러므로 본 발명은 인플루엔자 바이러스와 관련된 감염, 질환, 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스와 관련된 감염, 질환, 또는 장애를 가지는 대상체에게 투여된다. 한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스와 관련된 감염, 질환, 또는 장애가 발병할 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 조성물은 인플루엔자 바이러스와 접촉될 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스가 유행하는 지리적 지역에 살고 있거나, 여행하였거나, 여행할 예정인 대상체에게 투여된다. 한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 바이러스가 유행하는 지리적 지역에 살고 있거나, 여행하였거나, 여행할 예정인 또 다른 사람과 접촉하였거나 접촉할 것으로 예상되는 대상체에게 투여된다. 한 구현예에서, 조성물은 직업, 또는 기타 접촉을 통해 인플루엔자 바이러스에 고의적으로 노출된 대상체에게 투여된다.
한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 제1 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 제2 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 복수의 계통 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 제1 조성물을 투여하는 단계 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 복수의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 각각의 조성물은 본원에 기술된 하나 이상의 계통 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 조성물의 시차 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 복수의 인플루엔자 바이러스 항원, 보조제, 또는 그것들의 조합을 암호화하는 복수의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 발명의 방법은 투여 후 적어도 수일 동안 본원에 기술된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제의 지속적인 발현을 허용한다. 일부 구현예에서, 발명의 방법은 투여 후 적어도 2주 동안 본원에 기술된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제의 지속적인 발현을 허용한다. 일부 구현예에서, 발명의 방법은 투여 후 적어도 1개월 동안 본원에 기술된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제의 지속적인 발현을 허용한다. 그러나, 방법은, 일부 구현예에서, 또한 일부 구현예에서 핵산이 대상체 게놈에 통합되지 않기 때문에 일시적인 발현을 제공한다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제의 안정적인 발현을 제공하는, 뉴클레오사이드 변형 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA의 투여는 선천성 면역 반응을 거의 내지 전혀 초래하지 않지만, 효과적인 적응 면역 반응을 유도한다.
일부 구현예에서, 방법은 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 방법은 2주 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 1개월 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 2개월 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 3개월 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 4개월 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 5개월 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 6개월 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 1년 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 제공한다.
한 구현예에서, 조성물의 단일 면역화는 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 지속적인 보호를 유도한다.
치료 방법에서 발명의 조성물의 투여는 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 많은 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 한 구현예에서, 발명의 방법은 예를 들어 장내 또는 비경구 투여를 포함하여 대상체의 전신성 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 조성물의 피내 전달을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 조성물의 정맥내 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 조성물의 근육내 전달을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 피하 전달을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 흡입을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 비강내 전달을 포함한다.
발명의 조성물은 대상체에게 단독으로, 또는 또 다른 작용제와 함께 투여될 수 있는 것이 인정될 것이다.
그러므로 발명의 치료 및 예방 방법은 발명의 방법을 실시하기 위하여 본원에 기술된 인플루엔자 바이러스 항원, 보조제, 또는 그것들의 조합을 암호화하는 제약학적 조성물의 사용을 포함한다. 발명의 실시에 유용한 제약학적 조성물은 1 ng/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 용량을 전달하기 위해 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 발명은 포유류에서 10 nM 내지 10 μM의 본 발명의 화합물의 농도를 초래할 용량의 투여를 구상한다.
전형적으로, 발명의 방법에서 포유류, 예컨대 인간에게 투여될 수 있는 투여량은 포유류의 체중 킬로그램당 0.01 μg 내지 약 50 mg의 양의 범위지만, 투여된 정확한 투여량은 한정하는 것은 아니지만, 포유류의 유형 및 치료되는 질환 상태의 유형, 포유류의 연령 및 투여 경로를 포함한 많은 요인 중 임의의 요인에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 화합물의 투여량은 포유류의 체중 킬로그램당 약 0.1 μg 내지 약 10 mg으로 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 투여량은 포유류의 체중 킬로그램당 약 1 μg 내지 약 1 mg으로 달라질 것이다.
조성물은 1일에 여러 번의 정도로 빈번하게 포유류에게 투여되거나 또는 더 적은 빈도로, 예컨대 1일 1회, 주 1회, 2주마다 1회, 월 1회, 또는 보다 더 적은 빈도로, 예컨대 수개월, 수년마다 1회, 또는 더 적은 빈도로, 예컨대 10-20년마다, 15-30년마다, 또는 더 적은 빈도로, 예컨대 50-100년마다 투여될 수 있다. 용량의 빈도는 숙련된 기술자에게 쉽게 드러날 것이며 임의의 많은 요인, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 포유류의 유형 및 연령, 등에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 투여는 단일 투여에 의해 수행되거나 다중 투여에 의해 부스팅될 수 있다.
한 구현예에서, 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제를 암호화하는 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 부가 효과를 가지는데, 조합의 투여의 전체 효과는 대략 각각의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제를 투여하는 효과의 합과 동등하다. 다른 구현예에서, 방법은 시너지 효과를 가지는데, 조합의 투여의 전체 효과는 각각의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 보조제를 투여하는 효과의 합보다 더 크다.
실험예
발명은 다음의 실험예를 참조로 한층 더 상세하게 기술된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며, 명시되지 않는한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 그러므로, 발명은 어떤 방식으로든 다음의 실시예에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 하지만, 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해질 임의의 및 모든 변화를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 기술 없이, 기술분야의 통상적인 지식을 가진 사람은 선행 기술 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명을 제조하고 활용할 수 있으며 청구된 방법을 실시할 수 있다. 그러므로 다음의 작업예는 어떠한 방식으로든 개시의 나머지를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 다중 표적화, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 인플루엔자 바이러스 백신은 마우스에서 광범위한 보호를 제공하였다
뉴클레오사이드 변형 mRNA-지질 나노입자(LNP) 백신은 최근에 범용 인플루엔자 바이러스 백신 후보의 전달을 위해 바람직한 많은 특성을 나타내는 백신 벡터로서 부상하였다(Scorza FB et al., 2018, Vaccines, 6:20). 바이러스로부터의 단일 항원은 연장된 시간 동안 고수준으로 발현될 수 있어서, 바이러스 감염의 역학을 보다 밀접하게 모방할 수 있다(Pardi N et al., 2015, J. Control. Release., 217:345-351). 외래 벡터의 결핍은 적응 면역 체계가 유입을 인식하는 것을 방지하여, 면역 반응의 실질적인 부스팅을 달성하기 위한 백신 접종의 다중 회기에 대한 가능성을 허용한다. 추가적으로, 합성 mRNA 백신의 생성은 난(egg) 의존적이어서, 인플루엔자 바이러스 백신을 위한 발육된 계란에 대한 의존도를 제거한다. 이 연구에 사용된 mRNA 벡터는 RNA 센서에 의한 인식을 방지하는 1-메틸슈도우리딘(m1Ψ)을 포함하도록 변형되었고, 그로써 과잉 염증을 피하고 단백질(항원) 발현을 증가시킨다(Kariko K et al.,2005, Immunity, 645:165-175; Durbin AF et al., 2016, MBio, 7:648).
이 실시예에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 기술은 보존된 항원의 조합을 표적으로 하는 범용 인플루엔자 바이러스 백신 후보를 효과적으로 전달하기 위해 활용되었고 단일 저용량의 투여 후 마우스에서 광범위한 보호를 제공하였다.
이들 실험에 사용된 물질 및 방법을 이제 기술한다.
바이러스, 세포, 및 단백질: 활용된 인플루엔자 A 바이러스는 다음과 같이 기술된다. H1N1pdm(IVR-180): A/Singapore/GP1908/2015 H1N1pdm 바이러스로부터의 HA 및 NA 및 A/Texas/1/1977 H3N2 바이러스로부터의 나머지 단백질을 가진 재조합 인플루엔자 A 바이러스. NC99: A/New Caledonia/20/1999 H1N1 바이러스. PR8: A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 바이러스. cH6/1N5: A/mallard/Sweden/81/2002 H6N1 바이러스로부터의 HA 헤드 도메인, A/California/04/2009 H1N1pdm 바이러스로부터의 HA 줄기 도메인, A/mallard/Sweden/86/2003 H12N5 바이러스로부터의 NA, 및 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 바이러스로부터의 나머지 단백질을 가진 재조합 키메라 인플루엔자 A 바이러스. H5N8: A/Vietnam/1203/2004 H5N1 바이러스로부터 유래된 다중염기 절단 부위가 제거된 저병원성 H5 HA, A/mallard/Sweden/50/2002 H3N8 바이러스로부터의 N8, 및 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 바이러스로부터의 나머지 단백질을 함유한 재조합 인플루엔자 A 바이러스.
바이러스를 100 플라크 형성 단위의 인플루엔자 바이러스를 각각의 난에 주입한 후 10일이 지난 발육된 계란(Charles River)에서 증식시켰다. 난을 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 4℃에서 밤새 놓아두었다. 요막액(allantoic fluid)을 각각의 난으로부터 수득하여 3000 g에서 10분 동안 4℃에서 회전시켜서 파편을 제거하였다. 결과적으로 생성된 상층액을 분취하여 -80℃에서 냉동시켜서 바이러스 스톡을 형성하였다. 바이러스의 정제된 스톡을 만들기 위하여, 이 상층액을 5 mL의 30% 수크로스 용액이 함유된 튜브에서 4℃에서 125,000 g에서 2시간 동안 회전시켰다. 결과적으로 생성된 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고, 분취하고, -80℃에서 냉동시켜서 정제된 스톡을 형성하였다. 단백질 농도를 Bradford 검정을 사용하여 측정하였다.
NIH/3T3 세포(ATCC)를 2 mM L-글루타민(Corning) 및 10% 소 태아 혈청(FBS; HyClone) 및 100 단위 mL-1 페니실린 및 100 μg mL-1 스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 로스웰 파크 메모리얼 연구소(RPMI) 1640 배지(완전 배지)에서 배양하였다. NIH/3T3 세포주를 ATCC로부터 수령 후 팽창 및 냉동보존 전에 미코플라스마 오염에 대해 테스트하였다. Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포 및 HEK293T 세포(ATCC)를 10% FBS(Gibco), 100 단위 mL-1 페니실린 및 100 μg mL-1 스트렙토마이신(Gibco), 및 1 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES; Gibco)이 보충된 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)에서 배양하였다.
발현 플라스미드(pcDNA3.1)를 Impagliazzo 등(Impagliazzo A et al., 2015, Science, 349:1301-1306)에 의해 기술된 안정화된, 트라이머 헤드 없는 H1(즉, 미니 HA), N1 뉴라미니다제(A/Michigan/45/2015), 또는 바이러스 NP(A/Michigan/45/2015)에 대해 구성하고 GenScript에 의해 합성하였다. NA 구성물은 N-말단 신호 펩타이드, 헥사히스티딘 태그, 및 혈관 확장 인단백질(VASP) 테트라머화 도메인과 이어서 이전에 기술된 NA 엑토도메인(Margine I et al., 2013, J. Vis. Exp., e51112)을 특징으로 한다. 미니 HA 및 NP는 둘 다 C-말단 헥사히스티딘 정제 태그를 특징으로 한다. 플라스미드를 4 μg mL-1 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 6 x 107 Expi293F 현탁 세포(Life Technologies)에 형질주입하였다. 상층액을 형질주입 후 96시간 후에 수득하고 재조합 단백질을 니켈 니트릴로트라이아세트산 아가로스(Qiagen)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 유리 상층액으로부터 정제하였다. 발현을 항-HIS(Abcam) 웨스턴 블롯에 의해 확인하였고 관련되었을 때, 재조합 단백질의 멀티머화를 입체형태 에피토프(예컨대, CR9114 및 FI6)를 인식하는 단클론성 항체를 사용하여 ELISA에 의해 확인하였다. 발현 수준은 다음과 같았다: 미니 HA 15-20 mg L-1, N1 및 NP는 둘 다 1-0.5 mg L-1.
보존 다이아그램: 인플루엔자 바이러스 단백질의 아미노산 보존을 측정하기 위하여, 전장, 완전한 인플루엔자 바이러스 분리물을 함유한 데이터 세트를 fludb.org를 검색함으로써 확립하였다. H1N1 하위유형 변이에 대해, 인간 분리물을 무작위로 뽑아서 년간 하나의 스트레인을 선택하였다(n = 49-52). 추가적으로, 인플루엔자 바이러스 분리물을 무작위로 뽑아서 HA 1군 하위유형(H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, 및 H16), NA 1군 하위유형(N1, N4, N5, 및 N8)에 걸쳐, 또는 M2 및 NP의 경우 인간, 조류, 및 돼지 인플루엔자 A 분리물에 걸쳐서 스트레인이 공평하게 펼쳐지도록 하였다(n = 50). 단일 뉴클레오타이드 다형성 채점을 Crooks 등(Crooks GE et al., 2004, Genome Res., 14:1188-1190)으로부터 변형된 공식을 토대로 수행하였다. 간단히 설명하면, 공통 서열을 분석된 단백질 서열을 토대로 생성하고 공통으로부터 변이를 대립유전자 또는 indel의 수 및 풍부성을 토대로 채점하였다. 이들 점수를 사용하여 PyMOL(Schrodinger)을 사용하여 아미노산 잔기를 색칠하였다.
mRNA 제조: A/Michigan/45/2015 H1N1 인플루엔자 바이러스 NA, NP, M2(pUC-ccTEV-Michigan NA-A101, pUC-ccTEV-Michigan NP-A101, pUC-ccTEV-Michigan M2-A101), Crucell 미니 HA #4900(pUC-ccTEV-CRC HA-A101), 또는 반딧불이 루시페라제(pUC-ccTEV-Luc2-A101)의 서열을 코돈 최적화하고, 합성하여(GenScript) mRNA 생성 플라스미드에 클로닝하였다. 발현 벡터에 결찰 시킨 후, mRNA를 선형화된 플라스미드 상에서 T7 RNA 중합효소(Megascript, Ambion)를 사용하여 생성하였다. 101개 뉴클레오타이드 길이의 폴리(A) 꼬리를 함유하는 mRNA가 전사되었다. UTP 대신 m1Ψ 5'-삼인산염(TriLink)을 사용하여 변형된 뉴클레오사이드 함유 mRNA를 생성하였다. 시험관내 전사된 mRNA의 캡핑을 트라이뉴클레오타이드 cap1 유사체인 CleanCap(TriLink)을 사용하여 전사와 동시에 수행하였다. mRNA를 기술된 것과 같이 셀룰로스 정제에 의해 정제하였다(Baiersdorfer M et al., 2019, Mol. Ther. Nucleic Acids, 15:26-35). 모든 mRNA를 변성 또는 천연 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고 -20℃에서 냉동 보관하였다.
mRNA의 LNP 제형: 셀룰로스 정제된 m1Ψ 함유 RNA를 이온화 가능한 양이온성 지질, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜-지질의 에탄올계 지질 혼합물이 산성 pH에서 mRNA 함유 수용액과 신속하게 혼합되는, 이전에 기술된 자가 조립 과정을 사용하여 LNP에 캡슐화하였다(Pardi N et al., 2015, J. Control. Release, 217:345-351). RNA가 부하된 입자를 특성화하고 후속해서 1 μg μL-1의 농도로 -80℃에서 보관하였다. 이들 mRNA-LNP의 평균 유체역학적 직경은 약 80 nm였고 다분산 지수는 0.02-0.06이었으며 캡슐화 효율은 약 95%였다.
mRNA 형질주입: NIH/3T3 세포의 형질주입을 TransIT-mRNA(Mirus Bio)를 이용하여, 제조사의 지침에 따라 수행하였다: mRNA(0.3 μg)를 17 μL의 혈청 유리 배지에서 TransIT-mRNA 시약(0.34 μL) 및 부스트 시약(0.22 μL)과 조합하고, 복합체를 183 μL의 완전 배지에 3 x 104 세포로 첨가하였다. 밤새 37℃에서 인큐베이션한 후, NA 및 M2 mRNA 형질주입된 세포를 얼음에서 방사선 면역침전 검정(RIPA) 완충액(Sigma)에서 30분 동안 용해시키고, 미니 HA mRNA 형질주입된 세포를 1X NativePAGE 샘플 완충액(Invitrogen)으로 용해시키고, NP 형질주입된 세포를 염색 및 유동 세포분석기 분석을 위해 수집하였는데, 모두 형질주입 후 18시간째에 수행하였다.
NA, M2, 및 미니 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석: 6 x 104 NA 및 M2 mRNA 형질주입된 세포로부터 얻은 전세포 용해물을 NA 및 M2 단백질에 대해 변성 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 웨스턴 블롯에 의해 검정하였다. 샘플을 4X Laemmli 완충액(Bio-Rad)과 조합하고 95℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 4%-15% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 미니 단백질 TGX 겔(Bio-Rad) 상에서 120 V에서 1시간 동안 분리하였다.
6 x 104 미니 HA mRNA 형질주입된 세포로부터 얻은 전세포 용해물을 비변성 조건 하에 웨스턴 블롯에 의해 HA 단백질에 대해 검정하였다. 샘플을 4X NativePAGE 샘플 완충액(Invitrogen)과 조합한 후, NativePAGE 4-16% Bis-Tris 단백질 겔(Invitrogen) 상에서 150 V에서 1시간 동안, 이어서 250 V에서 30분 동안, 모두 얼음상에서 분리시켰다. 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로의 전달을 10 V에서 1시간 동안 수평 반건식 전자 블로터(Ellard Instrumentation)를 사용하여 완료하였다.
NA 및 M2에 대해, 막을 0.1% Tween-20을 함유한 Tris 완충 식염수 완충액(TBS-T)에서 5% 무지방 분유로 차단하였다. HA의 경우, 막을 8% 아세트산에서 15분 동안 인큐베이션하여 단백질을 고정시킨 후, 5분 동안 메탄올로 세정하여 배경 염료를 제거한 후, NA 및 M2에 대한 것과 동일한 방식으로 차단하였다. NA, M2, 및 HA 단백질을 1 mg mL-1의 1:2,000 희석의 4A5(항-NA)(Wohlbold TJ et al., 2015, MBio, 6:e02556-14), E10(항-M2)(Bourmakina SV et al., 2005, J. Virol., 79:7926-7932), 및 KB2(항-HA)(Heaton NS et al., 2013, J. Virol., 87:8272-8281) 마우스 단클론성 항체와 밤새 4℃에서 인큐베이션하고, 이어서 1:5,000 희석의 당나귀 항-마우스 양고추냉이 과산화효소(HRP)-IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 프로빙하였고, 이때 모든 항체는 TBS-T 중의 5% 무지방 분유에 희석하였다. 블롯을 Amersham ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약을 사용하여 Amersham 영상화기 600(둘 다 GE Healthcare 제품) 시스템 상에서 전개시켰다.
NP mRNA 형질주입된 NIH/3T3 세포 및 마우스 비장세포의 염색 및 유동 세포분석기 분석: 1.2 x105 NP 또는 Luc mRNA 형질주입된 NIH/3T3 세포를 4℃에서 10분 동안 Cytofix/Cytoperm 용액과 함께 인큐베이션한 후, 1X Perm/세척 완충액(둘 다 BD Biosciences 제품)으로 세척하였다. 그런 후 세포를 4℃에서 30분 동안 1:100 희석의 항-NP 마우스 단클론성 항체(BioXCell, BE0159)와 함께 인큐베이션하고 다시 1X Perm/세척으로 세척하였다. 마지막으로, 세포를 4℃에서 30분 동안 1:900 희석의 염소 항-마우스(IgG + IgM) FITC 콘쥬게이션된 이차 항체(Cayman Chemical)와 함께 인큐베이션하였다. 추가로 세척한 후, 세포를 FACS 완충액(2% FBS가 있는 PBS)에 재현탁하고 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다. NP 양성 세포의 백분율을 변형된 LSR II 유동 세포분석기(BD Biosciences) 상에서 검출하였다. 각 샘플당 적어도 25,000개 사건을 기록하고 데이터를 FlowJo 10 소프트웨어로 분석하였다.
비장 단일 세포 현탁액을 완전 RPMI 1640 배지에서 만들었다. 샘플당 3 x 106 세포를 6시간 동안 37℃ 5% CO2에서 펩타이드당 5 μg mL-1의 중복 NA(BEI Resources, NR-19249) 또는 NP(JPT 펩타이드, PM-INFA-NPH2N2) 펩타이드 풀 및 항-CD28 항체(1 μg mL-1; 클론 37.51; BD Biosciences)의 존재 하에 자극하였다. 골지 플러그(Golgi Plug)(5 μg mL-1; 브레펠딘 A; BD Biosciences) 및 골지 스탑(Golgi Stop)(10 μg mL-1; 모넨신; BD Biosciences)을 자극 후 1시간 후에 각 샘플에 첨가하였다. 각 동물에 대한 비자극 샘플을 포함시켰다. 포볼(phorbol) 12-미리스테이트-13-아세테이트(10 μg mL-1) 및 이오노마이신(200 ng mL-1; Sigma) 자극 샘플을 양성 대조군으로서 포함시켰다.
자극 후에, 세포를 PBS로 세척하고 LIVE/DEAD 고정 가능한 아쿠아 데드 셀 염색 키트(Life Technologies)로 염색한 후 표면을 단클론성 항체(mAb) 항-CD4 PerCP/Cy5.5(클론 GK1.5; BioLegend) 및 항-CD8 퍼시픽 블루(클론 53-6.7; BioLegend)로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 표면 염색 후, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 고정하고(1% 파라포름알데하이드 함유 PBS), Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences)를 사용하여 침투시켰다. 세포를 항-CD3 APC-Cy7(클론 SP34-2; BD Biosciences), 항-TNF-α PE-Cy7(클론 MP6-XT22; BD Biosciences), 항-IFN-γ AF700(클론 XMG1.2; BD Biosciences), 및 항-IL-2 BV711(클론 JES6-5H4; BioLegend) mAb를 사용하여 30분 동안 4℃에서 세포내로 염색하였다. 다음에, 세포를 침투 완충액으로 세척하고, 앞에서와 같이 고정하고, 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다.
비장 세포를 변형 LSR II 유동 세포분석기(BD Biosciences) 상에서 분석하였다. 표본당 500,000개 사건을 수집하였다. 각 기능에 대해 게이트를 생성한 후에, Boolean 게이트 플랫폼을 사용하여 3가지 기능을 테스트할 때 7개의 반응 패턴에 해당하는 가능한 조합의 전체 배열을 생성하였다. 데이터를 FlowJo 10 프로그램으로 분석하였다. 데이터를 비자극 염색된 세포의 백분율을 펩타이드 풀 자극된 염색 샘플의 백분율로부터 뺌으로써 표시하였다.
효소 결합 면역흡착 검정: 평평한 바닥의 96 웰 플레이트(Immulon 4 HBX(Thermo Fisher Scientific))를 2 μg mL-1의 재조합 단백질 또는 5 μg mL-1의 전체 정제된 인플루엔자 비리온으로 웰당 50 μL의 부피로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 보관하였다. 다음날 아침, 플레이트를 0.1% Tween 20(Fisher Scientific) 함유 PBS(PBS-T)로 3회 세척하였다. 220 μL의 차단 완충액(PBS-T 중의 5% 우유 및 3% 염소 혈청(Gibco))을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온(RT)에서 한 시간 동안 놓아두었다.
차단 완충액을 웰로부터 제거하고, 신선한 차단 완충액을 웰당 100 μL의 최종 부피가 보장되도록 첨가하였다. 마우스 혈청을 첨가하고 엣지 효과를 설명하기 위하여 제1 및 마지막 칼럼을 블랭크로 놓아두고 플레이트에서 3배 연속 희석을 수행하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 보관하였다.
그런 후 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 이차 항체(양고추냉이 과산화효소 결합 다클론성 염소 항-마우스 IgG(Abcam))를 1:15,000의 희석으로 각 웰에 50 μL의 최종 부피로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 놓아둔 후, 흔들어주는 단계를 포함하면서 PBST로 4회 세척하였다. 100 μL의 SigmaFast o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드 기질(Sigma)을 첨가하고 전개 10분 후 50 μL의 3 M 염산(Fisher)으로 퀀칭하였다. 플레이트를 Synergy H1 하이브리드 다중모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek) 상에서 490 nm에서 판독하였다. 데이터를 Prism 8.0(GraphPad)을 사용하여 분석하고 곡선 아래의 면적(AUC)을 모든 대조군 웰의 평균의 기준선에 표준 편차의 3배를 더한 값, 또는 기준선이 0.07보다 낮은 경우 0.07을 사용하여 계산하였다. 1 미만의 모든 AUC 값을 1의 값으로 조정하였다. 반응성을 보이지 않는 지점을 모든 선이 단일 그래프 상에서 보이는 것을 보장하기 위해 살짝 건드렸다.
세포 기반 ELISA의 경우, 4x104 293T 세포를 폴리 L-리신(Sigma)으로 이전에 코팅된 96 웰 플레이트에서 혈청 유리 DMEM에 플레이팅하였다. 24시간 인큐베이션 후, 세포를 웰당 100 ng DNA당 0.3 μL의 TransIT-LT1(Mirus)을 사용하여 100 ng의 pCAGGS 벡터 Mich15 M2(촉매적으로 비활성)로 형질주입하였다. 세포를 밤새 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중의 3.7% 파라포름알데하이드(Fisher)로 24시간 동안 4℃에서 고정한 후 PBS로 세척하고 위에서와 같이 차단하였다. 세포가 플레이트로부터 떨어지는 것을 피하기 위해 부드러운 피펫팅을 사용하면서 위에서 기술한 것과 같이 과정을 계속하였다.
mRNA 백신 접종 및 바이러스 도전: 적절한 바이러스 도전 용량을 측정하기 위하여, 감염성 인플루엔자 바이러스의 용량 증가를 사용한 감염을 생후 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson labs)에서 수행하였다. 3마리의 마우스를 로그 간격으로 10 PFU 내지 105 PFU 범위의 각 용량으로 감염시켰다. 마우스를 케타민/자일라진 혼합물로 마취하고 각 용량의 50 μL의 바이러스를 비강내 경로를 통해 도입하였다. 체중 감소를 14일 동안 모니터링하고 초기 체중의 25%가 감소된 마우스를 인간적으로 희생시켰다. 마우스의 50%가 감염에 굴복한 용량을 미래 도전 연구를 위한 LD50으로서 결정하였다.
생후 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 마취시키고 털을 깎아 등의 피부를 노출시켰다. 70% 에탄올로 멸균시킨 후, PBS에 100 μL당 10 또는 20 μg으로 희석된 mRNA 백신을 등에서 서로 떨어져 있는 2개 부위에 총 100 μL의 부피로 피내 주사하였다. 백신 접종 후 4주 후에, 마우스를 마취시키고 50 μL의 인플루엔자 바이러스로 비강내로 감염시켰다. 추가적으로, 마우스를 혈청학적 분석을 위해 출혈시켰다. 체중 감소를 14일 동안 모니터링하고 초기 체중의 25% 이상이 감소된 마우스를 인간적으로 안락사시켰다.
혈청 및 비장세포의 수동 전달: 생추 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 마우스당 10 μg의 mRNA 백신으로 두 번의 백신 접종과 후속 수득 사이에 4주 간격으로 프라임-부스트 요법을 수행하였다. 마우스를 안락사시킨 후, 심장 천공을 수행하여 전혈을 모았다. 혈액을 실온에서 1시간 동안 응고되도록 한 후 4℃에 30분 동안 놓아두었다. 그런 후 혈액을 12,000 g에서 10분 동안 4℃에서 회전시켜서 혈청을 나머지 혈액 구성요소로부터 분리시키고 추후 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 200 μL의 혈청을 나이브 마우스에 복강내로 전달하고 2 내지 6시간 후에 인플루엔자 바이러스로 도전하였다. 전달 후 마우스를 출혈시키고, 전달이 성공적이었는지를 확실하게 하기 위해 혈청을 ELISA에 의해 적절한 항원에 대해 테스트하였다. 비장을 안락사시킨 마우스로부터 절제하여 70 μm 필터(Falcon)를 통해 처리하여 세포를 분리하고, 비장 및 세포를 이 과정 전체에서 얼음 상의 RPMI 1640 배지(Gibco)에 놓았다. 적혈구를 ACK 용해 완충액(Gibco)으로 5분 동안 용해시킨 후 PBS로 퀀칭하였다. 투명해진 비장세포를 계수하고 8천만개의 세포를 나이브 마우스에 정맥내로 전달하고 2 내지 4시간 후에 인플루엔자 바이러스로 도전하였다.
미세중화 검정: MDCK 세포를 웰당 2.5 x 104 세포의 농도로 96 웰 접시에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈청 샘플을 제조사 가이드라인에 따라 작업 희석의 수용체 파괴 효소(RDE)(Seiken)로 3:1의 비율로 밤새 37℃ 수조에서 처리하였다. 다음날 아침, RDE 처리된 혈청을 시트르산 나트륨(Fisher)의 2.5% 용액과 함께 3:4의 비율로 56℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 1에서 10 희석으로 만들기 위하여, PBS를 3:7의 최종 비율로 용액에 첨가하였다. 6-(1-토실아미도-2-페닐) 에틸 클로로메틸 케톤(TPCK) 처리된 트립신을 mL당 1 μg의 농도로 울트라-MDCK 배지(Lonza)에 첨가함으로써 검정 완충액을 만들었다. 혈청을 검정 완충액으로 96 웰에서 1:2로 연속적으로 희석하였다. 인플루엔자 바이러스 IVR-180을 울트라-MDCK 배지로 100 x TCID50으로 희석하였다. 60 μL의 희석된, RDE 처리된 혈청을 60 μL의 바이러스와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 흔들어주었다. 이때, MDCK 세포를 PBS로 세정하였다. 그런 후 100 μL의 혈청/바이러스 혼합물을 세포에 첨가하고 바이러스를 세포에 1시간 동안 33℃에서 흡착되도록 하였다. 그런 후 바이러스/혈청 혼합물을 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후 동일한 희석의 혈청을 함유한 배지로 교체하고 72시간 동안 33℃에서 인큐베이션하였다. 혈구응집 검정을 동일한 부피의 세포 상층액을 0.5% 닭 적혈구(Lampire)와 혼합함으로써 수행하였다. 적혈구가 응집된 웰을 바이러스가 결핍된 것으로 측정하여, 혈청의 중화 잠재력을 측정하였다.
항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 검정: MDCK 세포를 웰당 2.5 x 104 세포의 농도로 96 웰 접시에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 인플루엔자 바이러스 IVR-180을 울트라-MDCK 배지에 웰당 2.5 x 105 PFU로 희석하고(세포의 2배 증가를 가정하면 5의 MOI) MDCK 세포를 PBS로 세척한 후 100 μL의 희석된 바이러스를 TPCK 처리 트립신의 부재 하에 첨가하였다.
감염을 24시간 동안 37℃에서 진행되도록 하였다. 검정 완충액을 4% 울트라 저-IgG FBS(Gibco)를 RPMI-1640(Gibco)에 첨가함으로써 제조하였다. 혈청 샘플을 1:25에서 시작하여 검정 완충액으로 연속적으로 3배 희석하였다. 배지를 감염된 MDCK 세포로부터 제거하고 25 μL의 따뜻한 검정 완충액을 25 μL의 희석된 혈청과 함께 각 웰에 첨가하였다. ADCC 이펙터 세포(마우스 FcγRIV 세포 표면 수용체를 발현하는 Jurkat 세포주(Promega))를 신속하게 해동하고 따뜻한 검정 완충액으로 3 x 106 세포/mL(25 μL당 7.5 x 104 세포)의 농도로 희석하고 25 μL의 세포 희석액을 각 웰에 첨가하고 혼합물을 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 및 Bio-Glo 루시페라제 기질(Promega)을 실온으로 조정한 후, 75 μL의 루시페라제 기질을 각 웰에 첨가하고 즉시 발광을 Synergy H1 하이브리드 다중모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek) 상에서 판독하였다. 배수 변화를 테스트 웰의 상대 발광 단위를 평균으로 나눈 값에 배경 웰의 표준 편차의 3배를 더한 값으로서 계산하였다.
통계적 분석: 통계적 분석을 Prism 6.0 프로그램(GraphPad Software, San Diego, CA-USA)을 사용하여 수행하였다. 도 10: 데이터를 Mann-Whitney(양측) 테스트와 비교하였다. < 0.05의 모든 p 값을 95%의 신뢰도 구간으로 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. (*) p<0.05; (**) p<0.01; (***) p<0.001. 도 14: 데이터를 다중 비교를 위한 Dunnett 보정을 사용한 이원분산분석을 사용하여 비교하였다. < 0.0332의 모든 조정된 p 값을 95%의 신뢰도 구간으로 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. (*) p<0.0332; (**) p<0.0021; (***) p<0.0002; (****) p<0.0001.
범용적으로 보호되는 인플루엔자 바이러스 백신 항원의 선택
조합 범용 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 항원으로서 제안된 인플루엔자 바이러스 단백질의 변이 정도를 측정하기 위하여, 보존 다이아그램을 생성하였다. H1N1 하위유형 내에 있는 완전한 게놈 서열을 가진 인간 인플루엔자 바이러스 분리물을 알려진 변이를 포함하기 위해 1918년도부터 활용 가능한 각 연도에 대해 선택하였다. H1N1 하위유형 전체에서, HA 줄기 영역은 보존된 채로 남아 있지만 헤드 도메인은 실질적인 가변성을 나타냈고(도 1), 이것은 이전의 보고와 일치한다(Thyagarajan B et al., 2014, eLife, 3:e03300; Fulton BO et al., 2018, J. Virol., 655 92:e00754-18). NA 헤드는 고도의 보존을 보였고, 고용량의 NA 단백질로의 백신 접종이 N1 하위유형 내에서 교차 반응성 항체를 제공할 수 있다는 근거를 확고하게 해주었다(Chen YQ et al., 2018, Cell, 173:417-429; Wohlbold TJ et al., 2015, MBio, 6:e02556). M2 및 NP 단백질은 둘 다 노출된 M2 엑토도메인을 포함한 하위유형 전체에서 고도로 보존된다.
유사하게, 인플루엔자 HA 1군 바이러스(H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, 및 H16) 뿐만 아니라 NA 1군 바이러스(N1, N4, N5, 및 N8)에 걸쳐있는 바이러스에 대해 종 지향성에 의해 제한되지 않는 서열을 획득하였다(Nachbagauer R et al., 2017, Nat. Immunol., 18:464-473; Krammer F et al., 2018, MBio, 9: e02332-17). 항체 매개 면역에 의한 이들 분자 모두에 대한 강력한 선택적 압력은 1군 내에서 보존된 도메인의 소수에서 분명하였다(도 1). HA 줄기는 광범위하게 교차 반응성인 항체가 결합하는 것으로 기술된 보존의 일부 패치를 가졌다(Lee PS et al., 2015, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 386:323-341). NA 활성 부위는 또한 1군 NA 내에 잘 보존되었고(도 1), 교차 반응성 항체를 이 부위에 결합하는 것으로 보고되었다(Stadlbauer D et al., 2019, Science, 366:499-504). M2 및 NP의 차이는 대부분 종 사이에서 발견되며(Zhuang, Q et al., 2019, Virol. J., 16:85), 그러므로, 서열을 인간, 조류, 및 돼지 스트레인으로부터 선택하여 계절성 및 팬데믹 문제가 있는 인플루엔자 바이러스의 폭을 모델화하였다(도 1). M2 및 NP 단백질은 모두 더 많이 노출된 당단백질과 비교하여 고수준의 보존을 보이며 둘 다 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 항원으로서 이전에 연구되었다(Schotsaert M et al., 2016, Sci. Rep., 6:24402; Lambe T et al., 2013, Sci. Rep., 3:1443; Antrobus RD et al., 2014, Mol. Ther., 22:668-674; Coughlan L et al., 2018, EBioMedicine, 29:146-154).
그러므로, 보존 프로파일 및 이전의 고무적인 접근법은 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신을 사용하는 조합 백신 접종 접근법을 위한 이들 4개의 단백질의 선택을 지지하였다. 보존된 HA 줄기 도메인에 대한 항체를 유도하기 위하여, A/Brisbane/59/2007 H1N1 HA를 토대로 하고 HA의 고도로 가변적인 구형 헤드 도메인이 결핍되도록 설계된 "미니 HA" 구성물을 사용하였다(Impagliazzo A et al., 2015, Science, 349:1301-1306). A/Michigan/45/2015 H1N1pdm(Mich15)으로부터의 야생형, 막 결합 NA를 사용하여 현재 순환하는 계절성 인플루엔자 바이러스 스트레인에 매칭시켰다. 유사하게, Mich15로부터의 야생형 NP를 사용하였는데, 그것은 현재 순환하는 H1N1 바이러스에 매칭되며 전체적으로 고도로 보존되었다. M2에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여, 아미노산 잔기 29-31이 결실되어 있는 구성물(Mich15를 토대로 함)을 사용하였다. 이 돌연변이는 이온 채널 활성을 비기능적으로 만들고 세포 표면 상에서의 과다발현의 결과로서 잠재적 세포독성을 감소시키기 위하여 도입되었다(Watanabe T et al., 2001, J. Virol., 75:5656-5662). 중요하게, mRNA 접근법은 T 세포 에피토프를 보유하였고 이전의 백신 접종 접근법과 비교하여 세포 표면 상에 더 자연스러운 항원 제공으로 이어지는 경막 영역을 포함한 전장 M2 이온 채널의 암호화를 가능하게 하였다.
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 접종은 강력한 체액성 면역 반응을 유도하였다
미니 HA, NA, 및 M2 면역원을 암호화하는 mRNA로부터의 단백질 생성을 형질주입된 NIH/3T3 세포로부터 만들어진 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다(도 2). NP mRNA 형질주입된 NIH/3T3 세포에서 NP 단백질의 생성을 유동 세포분석에 의해 검증하였다(도 3).
백신 접종 후 28일에 생성된 혈청 항체의 유도된 역가뿐만 아니라 특이성 및 기능성을 그런 후 조사하였다. 마우스를 단일 용량의 상이한 보존된 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는(조합하여 또는 개별적으로) 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 또는 반딧불이 루시페라제(Luc)를 암호화하는 무관한 제형으로 백신 접종하였다(도 4A). 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에서, 백신은 강력한 항원 특이적 항체를 유도하는 것으로 나타났고, 유사한 결과를 4개의 구성물을 개별적으로 또는 조합하여 투여했을 때 관찰하였다(도 4B 내지 도 4E).
백신 유도 항체의 기능성 및 효능을 추가로 평가하기 위하여, 다중 주기 중화 검정을 현재 계절성 H1N1pdm 바이러스에 대한 백신 스트레인을 사용하여 수행하였다(도 4F). 백신의 NA 구성요소는 조합 접근법의 맥락에서도 높은 중화 역가를 유도하는 것으로 나타났다. NA 특이적 항체는 일반적으로 바이러스 진입을 간섭하지 않았던 한편, 사용된 다중 주기 검정은 또한 작용 메커니즘일 가능성이 있는 바이러스 출구를 간섭하는 항체를 검출할 수 있다. 대조적으로, NP, M2, 및 미니 HA 백신 접종 그룹으로부터의 혈청은 검정에서 중화를 보이지 않았다. NP는 비리온 표면에 노출되지 않았고 따라서 중화 항체를 유도하지 않았다. M2 특이적 항체는 이전에 중화 항체 기능성이 결핍된 것으로 나타났지만, Fc 기능을 통해 보호를 매개한다(El Bakkouri K et al., 2011, J. Immunol., 186:1022-1031). HA 줄기 항체는 중화 활성을 나타낼 수 있지만, 이들 항체를 나이브 동물 모델에서 유도하기 위하여 반복된 투여를 필요로 할 수 있다. M2 특이적 항체와 유사하게, HA 줄기 특이적 항체는 생체내에서 Fc 매개 보호를 부여하는 것으로 나타났다(JSacobsen H et al., 2017, MBio, 8:e01463-17).
혈청 항체가 Fc 매개 이펙터 기능을 유도하는 능력을 평가하기 위하여, 쥐과 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 리포터 검정을 활용하였다(Cheng ZJ et al., 2014, J. Immunol. Methods, 414:69-81; Choi A et al., 2019, Immunohorizons, 3:133-148). M2 암호화 mRNA-LNP로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청은 ADCC 리포터 검정에서 가장 강력한 활성을 보였다(도 4G). 더 낮은 반응을 1가 NA 또는 미니 HA mRNA-LNP 백신으로 면역화된 그룹에서 관찰하였고 NP mRNA-LNP 백신만이 제공된 마우스에서는 활성이 검출되지 않았다.
더불어, 혈청 항체가 개별적인 재조합 단백질보다는 오히려 비리온 입자에 대한 결합을 측정하기 위하여 H1N1pdm 바이러스의 정제된 스톡에 대한 혈청을 ELISA에 의해 측정하였다(도 5A). 가장 강력한 결합을 NA 및 NP 백신을 받은 그룹에서 관찰하였고, 이것은 내부 NP에 대한 강력한 항체 반응을 드러낸다. 미니 HA로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청은 더 낮은 결합을 나타냈고, 이것은 다시 반복된 백신 접종이 HA 줄기 특이적 항체의 강력한 친화성 성숙에 필요할 수 있음을 나타낸다. M2로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청은 전체 바이러스에 대해 가장 약한 반응성을 보였고, 이것은 비리온 표면 상의 M2의 낮은 보급으로 인할 가능성이 있다(Lamb RA et al., 1985, Cell, 40:627-633). 조합 백신은 비리온에 대해 더 높은 반응성을 초래하지는 못하였지만, 항원 포화는 NA 및 NP 특이적 항체에 의해 달성되었을 수 있다.
전체적으로, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신에 의해 유도된 항체는 항원 특이적이었고, 바이러스에 결합하며, 다중 검정에서 기능성을 나타낸다.
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 접종된 마우스는 인플루엔자 바이러스로의 도전으로부터 보호되었다
단일 피내(I.D.) 백신 접종 후 28일 후에, 마우스를 인플루엔자 바이러스 H1N1pdm 도전 스트레인으로 도전시켰다(도 4A). 1가 또는 조합된 인플루엔자 바이러스 백신으로 백신 접종된 모든 동물은 미니 HA, M2, 및 NP 그룹에서 일부 이환이 있었음에도 불구하고 50% 치사량(LD50)의 5배로의 도전에도 생존하였다(도 5B). 동일한 용량의 Luc mRNA LNP로 백신 접종된 모든 마우스는 감염에서 생존하지 못하였다. NA 단독 및 조합 백신 그룹 둘 다에서 이환의 완전한 결여로 인해, 더 높은 용량의 바이러스(50 x 및 500 x LD50)를 사용한 추가의 도전 실험을 수행하였다(도 5C 및 도 5D). 미니 HA, M2, 또는 NP 단독으로의 백신 접종은 50 x LD50에서 부분적인 보호만을 부여하였고 500 x LD50에서는 보호하지 못하였다. NA 단독 백신은 2개의 고용량 도전에서 마우스에서의 사망을 방지하였다. 최고 감염 용량에서 NA 단독에 비해 조합 백신으로 개선된 보호 경향이 관찰되었다(도 5D). 그러나, 이것은 백신 매칭된 도전 바이러스 설정에서 NA 기반 보호에 대한 강력한 지지였다.
인플루엔자 바이러스 도전으로부터의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 유도된 보호는 주로 항체에 의해 매개되었다
면역 체계의 어떤 구성요소(들)가 보호에 기여했는지를 측정하기 위하여, 입양 전달 시스템을 확립하였다. 마우스를 10 μg의 mRNA-LNP 백신(단일 및 조합 제형)으로 투여간 4주 간격으로 2회 백신 접종하여 강력한 면역 반응을 생성하였다(도 6A). 그런 후 마우스를 부스트 후 4주 후에 안락사키시고 말단부 출혈을 수행하여 혈청을 수집하였다. 또한 면역화된 동물로부터 비장을 추출하고 나이브 마우스를 사용하는 입양 전달 실험을 위해 적혈구 용해 후 비장세포를 분리하고 모았다. 말단 출혈로부터의 혈청을 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 ELISA에 의해 테스트하였고 고도로 반응성인 것으로 나타났다(도 6B). 그런 후 이 혈청을 모아서 나이브 마우스에 복강내 투여를 통해 전달하였다. 동시에, 추가 그룹의 나이브 마우스에게 면역 프라임 숙주로부터의 8천만개의 비장세포를 정맥내 경로를 통해 입양 전달하였다. 전달 후 2시간 후에, 수령 마우스로부터의 혈청을 수득하고 후속해서 ELISA에 의해 테스트하였다(도 6C). 테스트된 혈청은 전달전 혈청과 유사하게 반응하였지만, 마우스의 총 혈액 부피(약 2 ml)에 비해 적은 부피(200 μL)의 전달로 인해 반응의 손실이 주지되었다. 그런 후 동물을 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 도전시키고 체중 감소를 14일 동안 모니터링하였다. 항원의 조합 또는 백신의 NA 구성요소 단독으로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청을 받은 동물은 도전으로부터 보호되었지만(도 6D), 미니 HA 또는 M2 단독을 받은 동물은 이환 및 부분적인 보호를 보였다. NP 면역화된 도너로부터의 혈청을 받은 마우스는 심각한 이환율 및 사망률을 보였다. 비장세포 전달 후, 모든 동물은 이환 또는 사망으로부터의 보호가 관찰되지 않으면서 감염에 굴복하였다(도 7). 이들 결과는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신에 의해 유도된 면역이 주로 항체 매개였음을 보여준다. 그러나, 접근법은 세포 매개 보호를 검출하기에 충분히 민감하지 않을 수 있고, 이것은 직접 도전 설정에서 NP에 대해 관찰된 더 강한 보호에 기여했을 가능성이 있다.
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP로의 백신 접종에 의해 유도된 세포 면역 반응의 유도를 측정하기 위하여, T 세포 레퍼토리의 분석을 수행하였다. 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP로의 백신 접종 후 마우스에서 유도된 면역 반응은 강력한 생식 중심 B 세포 반응 및 후속적인 항체 생성을 자극하는 항원 특이적 CD4+ 헬퍼 T-세포의 높은 빈도를 유도하는 것으로 이전에 보고되었다(Pardi N et al., 2018, J. Exp. Med., 215:1571-1588). 이들 발견과 일직선상으로, NA에 대한 다중기능성 CD4+ T 세포 반응 및 강력한 CD8+ T 세포 활성화를 20 μg의 NA mRNA-LNP로의 단일 피내 면역화 후 12일 후에 마우스에서 측정하였다(도 7A 내지 도 7E 및 도 9). 20 μg의 NA mRNA-LNP의 단일 용량의 피내 투여 후에 강력한 NP 특이적 CD8+ T 세포 활성화(도 7F, 도 7I, 및 도 9)를 또한 측정하였다. 그러므로, 이들 세포 반응은 감염에 대항하는 역할을 수행할 수 있지만, 입양 전달 검정은 보호 세포 면역을 검출하기에 충분히 민감하지 않을 수 있다(도 6D).
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신의 용량 감소는 단일 용량의 투여 후 나노그램 범위의 보호를 보였다
NA 단독 또는 미니 HA, M2, 및 NP 구성물 외에 NA(조합)의 감소하는 용량으로 마우스를 백신 접종하였다. 매칭된 계절성 QIV를 "표준 치료"로서 근육내로(I.M.) 투여하였다. 백신 투여 후 28일 후, 마우스를 출혈시키고 혈청을 ELISA에 의해 정제된 H1N1pdm 바이러스에 대해 분석하였다. NA 단독을 제공한 마우스는 0.050 μg의 mRNA 정도로 낮은 용량의 정제된 바이러스에 대한 반응을 보였고, 반응은 0.005 μg 용량에서는 검출할 수 없는 수준에 도달하였다(도 9A). 조합 백신으로 백신 접종된 마우스로부터의 혈청은 유사한 용량에서 ELISA에 의해 더 반응성이었고, 이것은 NA 외에 투여된 추가 항원에 의해 설명될 수 있다(도 9B). 반응은 0.05 μg(항원당) 용량에서 일관되게 검출 가능하였고 두 혈청 샘플은 0.005 μg 용량에서 배경을 초과하여 반응하였다. 그런 후 마우스를 5 x LD50의 H1N1pdm 바이러스로 도전시키고 체중 감소를 14일 동안 모니터링하였다. 모든 NA 백신 접종 마우스는 0.5 μg 용량에서 감염으로부터 보호되었고, 이환 또는 사망은 관찰되지 않았다(도 9C). 약간의 이환이 0.05 μg 용량에서 관찰되었지만, 모든 마우스는 도전에서 생존하였다. 0.005 μg 용량에서, 마우스는 감염에 굴복하거나 또는 수령 전 체중의 거의 25%가 감소되었다. 조합 백신 접종 그룹에서, 항원당 0.05 μg의 mRNA-LNP 백신으로 면역화된 마우스에서 이환 또는 사망이 주지되지 않으면서 보호는 더 강력하였다(도 9D). 각 항원에 대해 0.005 μg이 제공된 5마리 마우스 중 4마리가 감염에 굴복하였다. 한 마리 마우스만이 초기 체중의 10%가 감소하였고 ELISA에 의해 최고 응답자로서 확인되었다.
요약하면, 0.05 μg의 단일 저용량의 NA 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 단독으로의 백신 접종이 NA 매칭 도전 스트레인으로의 이환 및 사망으로부터 동물을 보호할 수 있지만, 미니 HA, M2, 및 NP 항원의 첨가가 이런 보호에 추가로 기여하여 이 용량에서의 이환율을 개선한다.
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 인플루엔자 바이러스 백신으로의 단일 면역화는 광범위한 1군 인플루엔자 A 바이러스로부터의 보호를 유도하였다
이 백신 접종 접근법이 1군 인플루엔자 바이러스로부터의 보호를 제공하는 잠재력을 평가하기 위하여, 광범위한 패널의 도전 바이러스를 이용하였다. 마우스를 위에서 기술된 것과 같이 프라임 단독 요법으로 백신 접종하였다. 백신 접종 후 28일 후, 마우스를 출혈시켜서 상응하는 정제된 도전 바이러스에 대한 혈청의 반응성을 ELISA에 의해 측정하였다(도 11). 2009년도 팬데믹 전에 분리된 H1N1 하위유형 바이러스 및 또한 조류 당단백질을 가진 인플루엔자 바이러스를 테스트하여 교차 반응성 수준을 측정하였다(도 12). A/New Caledonia/20/1999 H1N1(NC99) 및 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1(PR8) 바이러스를 팬데믹 이전의 H1N1 하위유형 내에서 이들 바이러스의 서로와의 상대적인 거리로 인해 선택하였다(Nachbagauer R et al., 2017, Nat. Immunol., 18:464-473). 조류 N5 당단백질(cH6/1N5)과 커플링된 조류 H6 헤드 도메인 및 H1N1pdm 줄기 도메인을 가진 인플루엔자 바이러스를 저병원성 조류 H5 및 조류 N8(H5N8)을 포함한 바이러스와 함께 선택하여 HA 및 NA 둘 다에 대한 보호의 1군 폭을 나타냈다.
마우스를 이 광범위한 패널로부터의 인플루엔자 바이러스로 도전시키고 체중 감소를 모니터링하여 이환 및 사망을 관찰하였다. H1N1 하위유형의 바이러스의 경우, 이환이 단일 구성요소 백신으로 면역화된 동물에서 관찰되었지만, 모든 마우스는 NC99 바이러스로의 도전에서 생존하였고(도 13A) 일부 사망이 PR8 바이러스로의 도전 후에 관찰되었다(도 13B). 전부 4개의 인플루엔자 바이러스 항원의 조합이 제공되었을 때, 마우스는 제한된 이환율(<5% 초기 체중 감소)을 보였고 전부 바이러스 도전에서 생존하였다. 백신 반응의 폭을 추가로 평가하기 위하여, 조류 당단백질을 포함한 바이러스를 감염에 사용하였다. 흥미롭게도, 백신(M2 및 NP)의 내부 단백질 구성요소에 의해 매개되었을뿐만 아니라 미니 HA 단독에 의해 자극된 보호는 H5N8 또는 cH6/1N5로의 감염에서 이환 및 사망으로부터 마우스를 보호하기에 충분하였다(도 13C 및 도 13D). NA 기반 반응은 cH6/1N5로의 감염시 완전한 사망 및 H5N8로는 실질적인 이환을 초래하였지만, 모든 마우스는 도전에서 생존하였다. N5 및 N8 포함 바이러스에 부여된 이런 최소 보호는 일반적으로 NA 항체가 하위유형 특이적 폭을 초과하지 않았기 때문에 놀라운 것은 아니었다(Wohlbold TJ et al., 2015, MBio, 6:e02556-14). 각각의 개별 마우스에 대한 최대 체중 감소를 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신에 의해 유도된 보호 효능의 효능 및 폭을 더 잘 비교하기 위해 단일 그래프로 편집하였다(도 13E).
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신은, 헤르페스 단순 바이러스-2, 인간 사이토메갈로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 지카 바이러스, 및 에볼라 바이러스와 같은 중요한 감염성 병원체에 대해 보호 면역을 유도하였기 때문에 다수의 최근 연구에서 큰 가능성을 입증하였다(Pardi N et al., 2018, J. Exp. Med., 215:1571-1588; Awasthi S et al., 2019, Sci. Immunol., 4:eaaw7083; Bahl K et al., 2017, Mol. Ther., 25:1316-1327; Pardi N et al., 2017, Nature, 543:248-251; Richner JM et al., 2017, Cell, 169:1114-1125; John S et al., 2018, Vaccine, 36:1689-1699; Meyer M et al., 2018, J. Infect. Dis., 217, 451-455; Pardi N et al., 2018, Nat. Commun., 9:3361). 단일 전장 HA 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 인플루엔자 바이러스 mRNA-LNP 백신은 잘 연구되었고 마우스에서 강력한 T 여포성 헬퍼 세포 및 체액성 면역 반응의 유도를 통해 지속적인 보호 면역 반응(종종 단일 면역화 후에)을 유도하였다(Pardi N et al., 2018, J. Exp. Med., 215:1571-1588; Bahl K et al., 2017, Mol. Ther., 25:1316-1327; Pardi N et al., 2018, Nat. Commun., 9:3361; Lindgren G et al., 2017, Front. Immunol., 8:1539).
이들 백신의 보호 효능을 확대시키기 위해, 본 연구에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 인플루엔자 바이러스 백신을 인플루엔자 바이러스의 여러 보존된 항원(HA 줄기, NA, M2, 및 NP)에 대한 주로 항체 기반 보호를 유도하기 위해 개발하였다. 다중 항원이 함께 전달되었을 때, 단일 항원 단독으로 전달되었을 때와 비교하여 체액성 면역 반응의 크기의 실질적인 차이는 검출되지 않았다. 이것은 단일 투여에서 다수의 개별적인 mRNA 암호화 항원을 조합하는 것이 백신 접종에 의해 유도된 면역 반응의 폭을 증가시킨다는 근거를 확고하게 하였다. 조합 백신으로의 단일 면역화 후에 얻어진 혈청 항체는 팬데믹 이전의 H1N1 하위유형으로부터의 스트레인 및 조류 분리물로부터의 당단백질을 포함하는 스트레인을 포함하여, 다양한 패널의 인플루엔자 바이러스 스트레인에 결합하는 것으로 나타났다. 마우스는 계절성 인플루엔자 바이러스로의 감염, H1N1 하위유형(NC99 및 PR8) 내에서의 이종성 도전, 및 조류 당단백질(H5N8 및 cH6/1N5)을 포함하는 바이러스로의 이종하위유형 도전에 대해 조합 백신의 단일 용량 후에 보호되었다. 참고로, 대부분의 이전 인플루엔자 바이러스 mRNA 백신 연구는 1-80 μg의 백신 용량을 사용하여 마우스에서 보호를 유도하였다(Scorza FB et al., 2018, Vaccines, 6:20). 조합 백신 제형은 항원당 0.05 μg의 단일 용량의 투여 후에 계절성 인플루엔자 바이러스 도전으로부터의 보호를 유도하였다. 이 수준의 보호는 범용 인플루엔자 바이러스 백신으로서의 추가의 개발에 대한 이 백신 접근법의 잠재력을 강조한다.
효능 외에, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 플랫폼은 종래의 인플루엔자 바이러스 백신을 능가하는 중요한 장점, 구체적으로: 1) 난 또는 세포주 및 복잡한 정제 과정을 필요로 하지 않는 합성 mRNA 백신의 신속하고, 확장 가능한 서열 의존성 제조; 2) 여러 항원 암호화 mRNA의 백신 보호의 더 큰 폭을 초래하는 단일 요법으로의 조합을 허용하는 mRNA 백신 기술의 수많은 유연성(Awasthi S et al., 2019, Sci. Immunol., 4:eaaw7083; John S et al., 2018, Vaccine, 36:1689-1699; Chahal JS et al., 2018, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113:E4133-4142); 3) 시토졸에서 직접 발현될 수 있어서 감염 중에 발생하는 발현을 더 잘 요약하는 여러 인플루엔자 바이러스 항원(M2 및 내부 단백질)을 사용하는 능력을 가졌으며 이것은 재조합 단백질의 투여를 통해 달성할 수 없다 - 여기서 기술된 연구는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 플랫폼이 광범위한 보호 면역 반응을 유도하기 위하여 백신 접종을 위해 M2 및 NP(및 가능하게 다른 항원)의 사용을 가능하게 하였음을 보여주었다.
개별적으로, 미니 HA 구성요소로의 단일 면역화는 H5N8 및 cH6/1N5 스트레인뿐만 아니라 모든 H1N1 도전 스트레인으로부터의 보호를 제공하였고, 줄기 특이적 반응에 의해 제공된 보호의 폭을 강조하였다. 항체는 미세중화 검정에 의해 측정된 중화 항체의 부재 하에 보호하는 기능을 했지만, 낮은 ADCC-리포터 활성을 보였다. 잠재적인 제한은 부스터 백신 접종 후 항체 반응의 개선에 의해 입증된 것과 같이 강력한 HA 줄기 반응에 대한 친화성 성숙을 필요로 하는 가능성이었다(도 14). 중요하게, 대부분의 인간은 이미 HA 줄기 반응에 대해 프라임되었고 HA 줄기 기반 백신에 대해 보다 효과적으로 반응하였다(Bernstein DI et al., 2019, Lancet. Infect. Dis., 20:80-91). HA 줄기 기반 구성물을 사용하는 중요한 이익은 매우 스트레인 특이적인 헤마글루티닌의 면역우세적인 가변성 헤드 도메인에 대한 항체 반응의 결핍이었지만, HA 줄기 항체는 매우 다양한 스트레인에 대한 보호를 부여하는 것으로 나타났다(Krammer F et al., 2015, Nat. Rev., Drug Discov., 14:167-182).
NA로의 백신 접종은 계절성 H1N1pdm 스트레인으로의 도전이 수행되었을 때 모든 다른 단일 구성요소를 능가하였다. 이 항원에 의해 유도된 항체는 LD50의 500배의 최대 도전 용량에 대해 마우스를 보호하였고, 다른 백신 구성요소의 첨가로 이환율은 관찰되지 않았다(<5%). NA가 다중 주기 미세중화 검정에서 중화 항체를 유도한 유일한 백신 구성요소였고, 항체는 또한 적당한 ADCC 활성을 유도하는 것으로 나타났다. 중요하게, 백신 용량을 0.05 μg으로 감소시켰고 사망으로부터 여전히 완전 보호를 유도하였다. 이환으로부터의 보호는 추가 항원이 백신 요법에 포함되었을 때 입증되었다. 이런 저용량의 백신 접종은 mRNA 백신에 대한 주요 제한이 주사 부위에서 염증을 유발하는 고용량의 LNP와 관련된 부작용이었기 때문에 유망하였다(Feldman RA et al., 2019, Vaccine, 37:3326-3334).
이 백신 접근법에서 설계된 M2 구성물을 수령 세포에서 과다발현될 때 과다 세포독성을 방지하기 위하여 이온 채널 활성을 제거하기 위해 돌연변이시켰다(Watanabe T et al., 2001, J. Virol., 75:5656-5662). 이 접근법은 경막 도메인에 존재하는 T 세포 에피토프를 유지하는, 항원으로서의 전장 M2 단백질의 전달을 허용하였다(Deng L et al., 2015, Vaccines, 3:105-136). 또한, M2의 세포내 발현은 입체형태 에피토프의 보다 효율적인 제공을 초래한다. M2는 고도로 보존되었고 M2 단독으로의 백신 접종 후 테스트된 항체는 높은 ADCC 활성을 가지는 것으로 나타났다. 추가로, M2 단독은 다중 인플루엔자 스트레인으로의 도전에서 사망을 방지하였다. 보호는 PR8 바이러스에 대해 완전하지 않았지만, H5N8 또는 cH6/1N5 바이러스 스트레인으로의 도전 후에 이환은 관찰되지 않았다. 흥미롭게, 이들 바이러스는 모두 동일한 M2 서열뿐만 아니라, 유사한 현상이 관찰된 NP를 공유한다. 비록 임의의 특정 이론에 매이지는 않지만, 이것은 바이러스 복제의 동역학으로 인한 것일 가능성이 있고, 또한 PR8에 비교하여 cH6/1N5에 대한 체중 감소의 지연을 초래하였다. 바이러스 복제의 초기 지연은 추가 바이러스 확산이 일어나기 전에 감염된 세포를 정화하기 위한 체액성 및 세포 면역에 충분할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 감염, 팬데믹 발생의 위협, 및 현재 백신의 제한된 유효성에 의해 발생된 전 세계적으로 상당한 건강 부담으로 인해, 이들 위험을 완화 또는 제거하기 위해 새로운 백신 플랫폼을 개발되어야 한다. 본원에 기술된 연구는 다중 인플루엔자 바이러스 항원을 전달할 잠재력이 있는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신이 인플루엔자 바이러스 감염을 방지하는데 필요한 면역 반응의 폭 및 효능을 제공할 수 있어서, 범용 인플루엔자 바이러스 백신 후보로서 이 접근법의 개발을 보증한다는 것을 보여주었다.
요약하면, 인플루엔자 바이러스는 매년 최대 650,000건의 사망이 발생하는 전 세계적인 건강 공중 문제의 호흡기 병원체이다. 계절성 인플루엔자 바이러스 백신이 질환을 예방하기 위해 사용되지만, 유효성이 제한된다. 장기간 지속되고, 광범위한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 잠재력이 있는 범용 인플루엔자 바이러스 백신의 개발이 인플루엔자 바이러스 유병률을 감소시키는데 필요하였다. 이 연구에서, 지질 나노입자 캡슐화된 뉴클레오사이드 변형 mRNA 백신이 보존된 인플루엔자 바이러스 항원의 조합(헤마글루티닌 줄기, 뉴라미니다제, 매트릭스-2 이온 채널, 및 핵단백질)을 전달하고 마우스 모델에서 실질적인 폭 및 효능으로 강력한 면역 반응을 유도하기 위하여 이용되었다. 뉴클레오사이드 변형 mRNA-지질 나노입자 백신에 의해 부여된 면역은 단일 면역화의 투여 후에 치사 용량 중앙값의 500배의 팬데믹 H1N1 바이러스로의 도전으로부터 보호를 제공하였고, 백신은 나노그램 범위의 낮은 백신 용량에서 보호적이었다. 단일 용량의 조합 백신의 광범위한 보호 잠재력은 인플루엔자 A 바이러스의 다양한 패널로의 도전에 의해 확인하였다. 이들 발견은 범용 인플루엔자 바이러스 백신 후보로서 다수의 보존된 항원을 발현하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA- 지질 나노입자 백신의 발전을 지지한다.
실시예 2: 뉴클레오사이드 변형 DNA를 사용하는 범용 인플루엔자 백신
인플루엔자 바이러스 감염은 매년 상당한 이병률 및 사망률을 유발하며, 팬데믹 발생 중에 더 많은 사망자가 발생한다. 인플루엔자 바이러스 발생은 매년 발생하며 매년 약 300만 내지 500만 명의 중증 질병이 발생하고 최대 650,000명이 사망한다(who.int/mediacentre/news/releases/2017/seasonal-flu/en/). 인플루엔자 바이러스는 그들의 엔벨로프 당단백질, HA 및 NA의 항원 특징에서 일정한 변화를 진행하여 인간 집단 면역을 피할 수 있게 한다. 적도 주변에서는 연중 언제든지 발병이 발생하지만, 세계의 북부 및 남부 지역에서는 발병이 주로 겨울에 발생한다. 팬데믹으로 알려진 대규모 발병은 덜 빈번하다. 20세기 동안 세 번의 인플루엔자 팬데믹이 발생하였다: a) 1918년의 스페인 인플루엔자, b) 1958년의 아시아 인플루엔자, 및 c) 1968년의 홍콩 인플루엔자. 가장 최근의 팬데믹은 10년이 채 되기 전인 2009년에 발생하였고, 이때 새로운 H1N1 스트레인이 인간 집단에 도입되었다. 이들 팬데믹은 수백만명의 사망을 초래하였다. 현재 허가된 인플루엔자 바이러스 백신이 매칭된 순환 인플루엔자 바이러스 스트레인에 대해 일부 수준의 보호만을 제공하기 때문에, 광범위하고 지속적인 보호를 유도하는 새로운 백신 플랫폼 및 면역화 계획의 개발이 시급히 필요하다.
현재의 인플루엔자 바이러스 백신은 우선적으로 면역지배적이고 일정하게 변화하는 HA 헤드 도메인을 표적으로 하여서, 바이러스가 면역 압력으로부터 벗어날 수 있게 한다. 그러므로, 계절성 백신은 해마다 다시 제형화되고 재투여되어야 할 필요가 있다. 최근 연구는 막 근위 HA 줄기, NA, NP의 일부 영역, 및 이온 채널M2(M2e)의 엑토도메인과 같은 보존된 바이러스 영역을 확인하였고, 이들은 전부 인플루엔자 바이러스에 대한 잠재적 취약성을 나타낸다. 대부분의 계절성 백신은 이들 면역-하위지배적인 영역에 대한 빈약한 면역 반응을 유도한다. HA와 달리, NA, NP 및 M2e 면역원은 훨씬 더 적게 연구되었고 현재 백신에 의해 특이적으로 표적화되지 않는다. 그러나, 이들 바이러스 도메인은 상이한 바이러스 스트레인 사이에서 고도로 보존되며 다가 백신에 그것을 포함시키면 광범위한 교차 보호성 면역을 유도하는 유연한 전략을 제공한다. 인간에서 지속적이고 광범위한 보호 면역 반응의 유도는 도전적이며 현재의 백신 접종 전략으로는 얻을 수 없을 것이다. 신규한, 보다 강력한 백신 플랫폼, 예컨대 mRNA 백신 접종이 이런 한계를 극복하는데 도움이 될 것이다.
핵산 기반 백신이 종래의 백신 접근법에 대한 유망한 대안으로서 부상하였다. 생체내에서 전달된 잠재적으로 치료적 단백질을 암호화하는 메신저 RNA(mRNA)의 첫 번째 사용은 1990년도에 발생하였는데, Wolff 등이 mRNA를 마우스에 직접 주사한 후 리포터 단백질의 발현을 입증하였다. 흥미롭게, 이들 초기 유망한 결과는 대부분 mRNA 불안정성, 높은 선천성 면역원성 및 비효율적인 생체내 전달과 관련된 문제로 인해 mRNA 치료제를 개발하는 실질적인 투자로 이어지지 못하였다. 대신, 이 분야는 DNA 기반 및 단백질 기반 접근법을 추구하였다. mRNA의 사용은 하위단위, 사멸된 및 살아있는 약독화 바이러스 및 DNA 기반 백신을 능가하는 몇 가지 유익한 특징을 가진다: 1) 안전성: mRNA가 비감염성, 비통합 플랫폼이기 때문에, 감염 또는 삽입성 돌연변이생성의 잠재적 위험이 없다. 추가적으로, mRNA는 정상적인 세포 과정에 의해 분해되며, 그것의 생체내 반감기는 다양한 변형 및 전달 방법의 사용을 통해 조절될 수 있다. mRNA의 고유한 면역원성은 안전성 프로파일을 추가로 증가시키기 위해 하향조절될 수 있다. 2) 효능: 치료적으로 전달된 mRNA는 미번역 영역(UTR), 캡 폴리(A) 꼬리, 또는 코딩 서열의 변화에 의해 제어될 수 있는 일시적인 번역만을 초래한다. 다양한 변형이 mRNA를 보다 안정적이고 고도로 번역 가능하게 만들 수 있다. 효율적인 생체내 전달은 mRNA를 담체 분자에 제형화하고, 세포질에서 신속한 흡수 및 발현을 허용함으로써 달성될 수 있다. mRNA는 최소 유전자 벡터이다; 그러므로, 항-벡터 면역을 피할 수 있고, mRNA 백신은 반복적으로 투여될 수 있다. 3) 제조: 현재 FDA에서 허가한 인플루엔자 백신은 3 또는 4개의 바이러스 스트레인(하나의 H1N1 인플루엔자 A, 하나의 H3N2 인플루엔자 A, 및 하나 또는 두 인플루엔자 B 바이러스)을 포함한다. 매년, 세계 보건 기구(WHO)는 계절성 백신에 포함시킬 스트레인을 권장한다. WHO는 1952년에 세계 인플루엔자 감시 네트워크(Global Influenza Surveillance Network)를 설립하여 항원적으로 구별되는 바이러스 스트레인의 확산을 모니터링한다. 105개 나라의 135개 이상의 국립 인플루엔자 센터로 이루어진 이 감시 팀은 매년 약 8,000개의 바이러스 분리물을 광범위하게 특성화한다. 각각의 바이러스 분리물의 게놈을 서열분석하고 항원성 프로파일을 흰 족제비에서 생성된 참조 혈청을 사용하여 혈구응집 억제(HAI) 검정을 통해 측정한다. 인플루엔자 바이러스 백신 관점으로부터, mRNA 백신의 가장 중요한 장점은 신속한 개발 및 제조의 용이성이다. 이들 백신은 종래의 인플루엔자 바이러스 백신이 제조될 때 흔히 발생하는 세포 배양 및 난 적응성 돌연변이를 거치지 않는 것이 주지할만하다. 현재 이용 가능한 계절성 인플루엔자 바이러스 백신은 항원적으로 표류하는 바이러스 스트레인에 대해 잘 보호하지 못하며 신종 팬데믹 스트레인에 대한 보호를 거의 제공하지 못한다. 새로운 팬데믹 바이러스에 대한 종래의 FDA 승인 백신의 제조는 적어도 6개월이 걸려서, 이 기간 동안 집단은 보호되지 못한 채로 남겨진다. 그와는 대조적으로, 표적 HA(또는 다른) 항원의 유전자 서열이 알려지면, mRNA-LNP 백신은 잠재적으로 수주 내에 제조될 수 있다.
보존된 HA 줄기 도메인에 대한 항체를 유도하기 위하여, "미니-HA" 구성물을 사용하였다(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26303961에서 공개된 바와 같음). 그것은 AlBrisbane/59/2007 H1 N1 HA를 토대로 하며 HA의 고도로 가변적인 구형 헤드 도메인이 결핍되도록 설계된 것이다. NMichigan/45/2015 H1 N1 pdm으로부터의 야생형, 막 결합 NA를 사용하여 현재 순환하는 계절성 인플루엔자 바이러스 스트레인에 매칭시켰다. 유사하게, 현재 순환하는 H1N1 바이러스에 매칭되는, H1N1pdm으로부터의 야생형 NP를 사용하였다. M2에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여, 아미노산 잔기 29-31이 결실된 H1N1pdm 기반 M2 구성물을 사용하였다. 이 돌연변이는 이온 채널 활성을 비기능성으로 만들기 위해 그리고 세포 표면에서의 과다발현의 결과로서 잠재적 세포독성을 감소시키기 위해 도입하였다. 중요하게, mRNA 접근법은 T 세포 에피토프를 보유하는 경막 영역을 포함하여 전장 M2 이온 채널의 암호화를 가능하게 한다. 이것은 이전의 백신 접종 접근법과 비교하여 세포 표면에 보다 자연적인 항원 제공을 향한 수단을 제공한다.
이전의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 연구는 백신 접종을 위하여 단일 전장 HA 암호화 mRNA-LNP를 사용하였다. 이들 백신은 마우스 및 흰 족제비에서 강력한 면역 반응을 유도하였다. 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신의 보호 효능을 확대시키기 위하여, 이 연구에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 인플루엔자 바이러스 백신을 인플루엔자 바이러스의 여러 보존된 항원(HA 줄기, NA, M2, 및 NP)에 대해 보호 항체를 유도하도록 개발하였다. 다중 항원이 함께 전달되었을 때, 보호 면역 반응은 현저하였다. 이것은 단일 투여에서 다수의 개별 항원을 조합하는 것이 백신 접종에 의해 유도된 면역 반응의 폭을 증가시킨다는 근거를 확고히 한다. 조합 제제의 단일 면역화 후에 얻어진 혈청 항체는 팬데믹 이전의 H1 N1 하위유형으로부터 유래된 것과 외국의 조류 분리물로부터의 당단백질을 포함하는 것을 포함하여, 다양한 패널의 인플루엔자 바이러스 스트레인에 결합하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 마우스는 계절성 인플루엔자 바이러스(H1N1pdm)로의 감염, H1N1 하위유형(NC99 및 PRS) 내의 변이체로의 감염, 및 조류 당단백질(H5NS 및 cH6/1 N5)을 포함하는 바이러스로의 감염에 대한 조합 백신 접종 접근법에 의해 보호되었다. 참고로, 대부분의 이전 인플루엔자 mRNA 백신 연구는 마우스에서 보호를 유도하기 위하여 최대 80 μg 백신 용량을 사용하였다. 본원에 기술된 조합 백신은 50 ng의 mRNA의 단일 용량의 투여 후에 엄격한, 매우 치명적인 H1 N1 pdm 바이러스 도전으로부터 보호를 유도하였다. 이환 및 사망으로부터의 이런 수준의 보호는 범용 인플루엔자 바이러스 백신으로서의 추가의 개발을 위한 이 백신 접근법의 잠재력을 강조한다.
본 연구는 백신 전달 시스템으로서의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP의 개발을 기술하였고 그것이 종래의 비활성화 병원체, 단백질 하위유닛 또는 살아있는 바이러스 백신과 직접 비교했을 때 우수한 백신인 것을 발견하였다. 이 전달 접근법을 진정으로 혁신적인 것으로 만드는 것은 분명하게 우수한 면역 반응을 보이는 한편, 바이러스 전달 시스템과 관련된 어떠한 잠재적인 부작용을 가질 가능성이 없다는 것이다. mRNA의 모든 구성요소는 생리적인 것이고 세포 경로에 의해 분해된다. mRNA와 복합체를 형성하는 LNP는 부작용 없이 3상 임상 실험에 진입하였다(임상 실험 번호: NCT01960348). 추가적으로, 비복제성 mRNA 백신은 관심 있는 특정 항원(들)을 배타적으로 암호화하여 표적화된 병원체에 대한 보다 특이적이로 바람직한 면역 반응을 유도할 가능성이 있다.
Tfh 세포의 강력한 활성화는 높은 친화성, 광범위하게 보호성인 항체를 생성하는 데 중요하지만, 현재 사용되는 백신 보조제는 종종 효율적인 Tfh 세포 면역 반응을 유도하지 못한다. 대조적으로, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신은 매우 강력한 CD4 헬퍼 및, 가장 중요하게, Tfh 세포 반응을 유도한다. 그러한 강력한 Tfh 반응을 유도하는 능력은 신규하고 혁신적이며 많은 백신 개발 연구의 목표이다.
인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인은, 이 보존된 바이러스 영역에 대한 항체가 항원적으로 구별되는 인플루엔자 바이러스로부터 보호할 수 있기 때문에 매력적인 백신 표적을 나타낸다. 최근에 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신이 단일 용량 면역화 후에 지속적인 HA 억제를 매개한 고역가의 IgG를 유도한 것이 입증되었다. 중요하게, HA 줄기에 대한 실질적인 반응이 또한 관찰되었다. 추가적으로, 단일 면역화는 상동성 및 이종성 바이러스 도전에 대해 마우스를 보호하였고 두 면역화는 이종성 하위유형 인플루엔자 바이러스 스트레인에 대한 보호 면역 반응을 유도하였다. 전장 HA 면역원을 암호화하는 1가 mRNA-LNP 백신을 이들 연구에 사용하였고, 그로써, 비록 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 최적화된 줄기 유도 헤드 없는 HA 면역원을 단독으로 또는 보존된 NA, NP, 및 M2e 서열과 조합하여 가진 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 플랫폼의 사용이 임상에서 쉽게 사용할 수 있는 신규하고, 매우 혁신적이며, 우수한 플랫폼을 제공하는 것으로 가설을 세웠다.
mRNA는 현재 그것의 LNP에서의 제형과 같이 GMP로 제조된다. mRNA 백신 항원은 쉽게 업데이트될 수 있고(주 단위) mRNA에 의해 암호화된 항원은 난에서 성장하는 바이러스로 발생할 수 있는 것과 같은, 제조 과정 중에 돌연변이를 획득할 위험이 없다. 비록 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 이들 고도로 혁신적인 발견을 사용하여 "범용 인플루엔자 바이러스 백신"이 될 잠재력이 높은 오래 지속되고 폭넓은 중화 반응을 생성하는 쉽게 투여되고 안전한 인플루엔자 백신을 초래한다는 가설을 세웠다.
전장 PR8 HA 암호화 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP로의 단일 면역화는 마우스에서 강력한 T 여포성 헬퍼(Tfh) 세포 반응을 유도한다
다수의 연구가 Tfh 세포의 활성화가 지속적인, 보호 중화 항체 반응에 중요한 것을 입증하였다. 최근에 보조제 첨가된 재조합 A/PuertoRico/8/1934(PR8) HA 또는 비활성화된 PR8 바이러스 백신으로의 면역화 후에 유의미한 Tfh 세포 활성화의 결핍이 입증되었다. 대조적으로, 10 μg의 PR8 HA 뉴클레오사이드 변형 mRNALNP로의 단일 면역화는 마우스에서 강력한 Tfh 세포 반응을 유도한 것으로 나타났다(도 15).
뉴클레오사이드 변형 HA mRNA-LNP 백신 유도된 강력한 Tfh 세포 면역 반응은 지속적인 HA 억제(HAI) 역가 및 HA 줄기 특이적 항체의 유도와 관련된다
PR8 HA 억제 역가는 10 μg의 단일 용량의 PR8 HA mRNA-LNP로 면역화된 마우스에서 추적하였다. 놀랍게도, 높고 안정적인 HAI 역가를 면역화 후 20주 후에 측정하였고(도 16), 이것은 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 인플루엔자 백신이 강력하고 지속적인 항체 반응을 유도한다는 이전의 관찰을 확인시켜준다.
위에서 논의된 것과 같이, 허가된 인플루엔자 바이러스 백신은 면역지배적이고 계속해서 변화하는 HA 헤드 도메인을 우선적으로 표적화하며, 따라서 바이러스는 면역 압력으로부터 벗어날 수 있다. HA 줄기 도메인은 보존되며 이 영역에서의 돌연변이가 종종 유의미한 바이러스 체력 손실을 초래하기 때문에 광범위한 보호/범용 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 매력적인 표적이다. 최근에 전장 PR8 또는 A/California/07/2009(A/Cal09) HA 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP로의 면역화가 마우스 및 흰 족제비에서 지속적인 HA 줄기 특이적 항체 반응을 유도한 것이 입증되었다(도 17). 이들 발견은 강력한 Tfh 세포 면역 반응이 항원적으로 구별되는 인플루엔자 바이러스 하위유형으로부터의 보호를 부여하는 교차 반응성 HA 줄기 특이적 항체의 유도에 중요할 가능성이 있음을 시사하였다. 실제로, A/Cal09 뉴클레오사이드 변형 HA mRNA-LNP 백신으로의 단일 면역화가 상동성(A/Cal09) 및 이종성(PR8) 인플루엔자 바이러스로부터의 보호를 유도하였고, 가장 중요하게, 2가지 면역화는 마우스를 이종하위유형(H5N1) 바이러스 도전으로부터 보호한 것으로 나타났다. 이들 중요한 발견은 보호 효능을 한층 더 증가시키기 위한 mRNA 백신 요법으로서 최적화된 HA 줄기 면역원 및 다른 상당히 보존된 인플루엔자 바이러스 항원(NA, NP 및 M2e)을 사용하는 추가 개발에 대한 기초로서 작용한다.
위에서 기술된 데이터는 MF59-보조제 첨가된 PR8 HA 재조합 단백질 백신과 달리, 뉴클레오사이드 변형 PR8 HA mRNA-LNP 백신이 강력한 Tfh 세포 반응 및 높은 PR8 HAI 역가를 유도했음을 입증하였다. 가장 중요하게, PR8 HA 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 접종은 단일 면역화 후에 지속적인 HA 줄기 특이적 면역 반응을 유도하였다. 아래의 세 섹션은 인플루엔자 바이러스의 보존된 영역에 대한 최적화된 mRNA 면역원의 설계 및 제조, 마우스에서 mRNA-LNP 백신 제형의 면역원성 및 보호 효능 평가, 및 인플루엔자 mRNA-LNP 백신에 의한 강력한 Tfh 세포 및 체액성 면역 반응의 메커니즘 측정을 기술한다.
과학적 엄격함: 모든 마우스 실험을 실험당 적어도 5마리 마우스로 3회 반복한다. 이것은 모델을 사용한 광범위한 경험을 토대로 한다. 더 작은 그룹의 크기는 개체 간의 과도한 변동으로 이어져서, 추가 실험 및 궁극적으로 더 많은 동물 사용이 필요해진다. 마우스를 무작위로 블라인드식으로 다양한 실험 그룹에 배정한다. 엄격함을 확실히 하기 이하여, 각 마우스 및 흰 족제비 연구로부터 혈청학적 실험을 기술적 3중으로 수행한다. 실험 결과를 평가, 측정 또는 정량화하는 조사자도 역시 블라인드식이다. 운영자 간 변동성은 SOP 및 특정 교육을 통해 최소화한다. 모든 미가공 데이터 포인트는 예비 분석에 포함된다. 데이터 배제는 예외적인 경우에만, 예컨대 병든 마우스, 싸움의 상처, 부분적인 치료, 오염된 샘플, 등에 적용된다. 결과적으로 생성된 데이터는 Mann-Whitney 테스트가 사용되는 비-가우스 분포가 존재하지 않는 한, Student 쌍을 이룬/독립적인 t-테스트를 사용하여 비교한다. 분산분석은 그룹내 및 그룹간 변동을 테스트한다. 0.05 미만의 p 값을 유의미한 것으로 간주한다. 그룹당 4마리의 흰 족제비를 각 실험에서 테스트한다. 이 숫자는 백신 접종 접근법을 연구하기 위하여 흰 족제비 모델을 사용하는 이전 경험 및 동물 크기로 인한 하우징 제한을 토대로 한다. 핵심 실험을 반복하여 샘플 크기를 증가시키고 통계적 검정력을 개선시킨다.
생물학적 변수: 성별 및 한배새끼 대조군을 항상 실험에 포함시킨다. 만약 성별간 차이가 없다면, 결과를 조합할 수 있다. 동물은 특정 병원체가 없고(SPF) 사내에서 사육되거나 상업적 공급처로부터 구입한다. 모든 마우스는 생후 6 내지 12주였다. 흰 족제비는 생후 4개월이다.
인플루엔자 바이러스의 보존된 영역에 대한 mRNA 면역원의 설계 및 제조
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 인플루엔자 백신은 잠재력이 큰 유망한 새로운 백신 부류인 것이 입증되었다. 그러나, 주로 최적화된 백신 요법을 설계하는 것을 통해 현재의 인플루엔자 바이러스 RNA 백신을 개선시키고 백신의 결합가를 증가시키는 다수의 방법이 있다.
이 연구의 전체적인 목표는 인플루엔자 바이러스의 보존된 에피토프에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신을 생성하는 것이다. 고도로 보존된 HA 줄기 도메인이 광범위한 보호 항체를 유도하기 위해 표적화되고 현재 계절성 바이러스의 NA에 대한 항체를 유도하는 것을 목표로 하며, 이것은 동일한 NA 하위유형을 공유하는 바이러스(조류 바이러스 포함)에 대한 광범위한 보호를 제공할 수 있다. M2e 항원은 또한 조류 및 인간 바이러스에 대해 포함되는데, 이것은 모든 인플루엔자 A 바이러스에 대한 광범위한 보호 면역을 제공할 수 있다. 마지막으로, NP 암호화 mRNA-LNP가 모든 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위하게 보호하는 T 세포 반응을 유도하기 위해 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대해 포함된다. 이들 백신 접종 접근법은 개별적으로 테스트된 후 가장 강력한 보호 면역원을 조합하여 신규한 mRNA 기반 범용 인플루엔자 바이러스 백신을 생성한다.
대부분의 인플루엔자 바이러스 RNA 백신 연구는 면역원으로서 단일 전장 HA를 사용하였다. 본원에서 기술된 연구는 마우스 및 흰 족제비에서 강력한 단백질 면역화 요법인 것으로 증명된 헤드 없는 HA-페리틴 입자를 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA를 생성한다. 3개의 상이한 암호화 mRNA는 인플루엔자 A 1군(H1) 및 2군(H3) 및 인플루엔자 B 헤드 없는 HA-페리틴에 대해 만들어진다. 이들 3개의 면역원을 사용하여, 모든 인플루엔자 A 및 B 스트레인에 대한 HA 줄기 기반 광범위한 보호를 달성할 수 있다.
NA는 감염으로부터의 보호에 기여하는 것으로 나타난 상당히 보존된 바이러스 당단백질이다. 이환율 및 바이러스 배출(viral shedding)을 감소시키는 잠재력에도 불구하고, 그것은 크게 무시되는 백신 표적이다. NA 특이적 면역이 주로 하위유형에 제한되는 한편, 하위유형 내에서 교차 보호가 관찰되었다. 예를 들어, PR8 실험실 스트레인의 NA로 백신 접종된 마우스는 잠재적 팬데믹 H5N1 바이러스뿐만 아니라 2009-팬데믹 H1N1 분리물 둘 다로의 도전으로부터 보호되었다. 현재 인간 병원성 바이러스 N1(A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09), N2(A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)) 및 인플루엔자 B(B/Colorado/06/2017) 바이러스 NA의 하위유형을 암호화하는 3개의 최적화된 mRNA가 설계된다. 이들 NA는 현재 계절성 분리물(년간 전체적인 인플루엔자 사망률의 가장 큰 기여자)을 포함하며 일부 인간 N1 및 N2 특이적 항체에 의해 입증되는 바 H5N1 및 H7N2와 같은 일부 잠재적 팬데믹 조류 스트레인에 대해 교차 보호할 수 있다. 인플루엔자 B HA와 대조적으로, NA는 항원적으로 구별되는 계통으로 분리되지 않았고 선택된 스트레인에 대해 유발된 항체는 모든 현재 인플루엔자 B 분리물에 대해 교차 보호할 가능성이 있다.
고도로 보존된 인플루엔자 바이러스 항원에 대한, 특히 NP에 대한 T 세포 반응은 백신 보호에 기여하는 것으로 나타났다. 그러므로, NP 암호화 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신을 설계하고 그것의 백신 효능에 대한 기여를 평가한다. NP는 대다수의 인플루엔자 바이러스 스트레인에 대한 교차 보호를 제공하는 가능성이 있는 상당히 보존된 항원이다. 그러므로, 인플루엔자 A 1군 및 2군 및 인플루엔자 B NP mRNA-LNP 백신 요법을 생성한다.
M2e는 인간 및 조류 인플루엔자 A 바이러스에서 모두 고도로 보존된 바이러스 항원이며 그것에 대한 면역 반응은 임상전 및 임상 환경에서 보호와 꽤 상관이 있는 것으로 나타났다. 그것을 아주 매력적인 백신 항원으로 만드는 것은 그것의 길이가 단지 23개 아미노산이고 하위유형과 관계 없이 모든 인간 전염병 스트레이에서 거의 변화하지 않는다는 것이다. 초기 연구에서 입증되는 바와 같이, 여러 M2e 서열을 탠덤으로 함유하는 구성물은 고역가의 M2e 특이적 항체를 유도하였고 바이러스 도전으로부터의 보호를 개선시켰다. 그러므로, 조류 및 인간 M2e 복사물을 모두 암호화하는 mRNA를 기술된 것과 같이 생성하고 계절성 및 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 이들 mRNA-LNP 백신의 보호 효능을 평가한다. 각 mRNA 구성물로부터의 단백질 생성을 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석에 대해 mRNA 형질주입된 인간 배아 신장(HEK)293T 세포를 사용하여 확인한다. 추가적으로, 조합된 mRNA-LNP 제형을 또한 HEK293T 세포 형질주입에 의해 테스트하여 모든 암호화된 단백질이 mRNA로부터 번역된 것을 확인한다.
처음에, 제안된 인플루엔자 바이러스 면역원을 암호화하는 1가 mRNA-LNP 백신 제형을 만들어서 평가한 후 가장 보호적인 요법을 단일 제형으로 조합한다. 3개의 상이한 HSV-2 면역원 암호화 mRNA가 단일 백신으로 조합되었고 각각이 단독으로 투여되었을 때와 동일한 수준의 항원 특이적 IgG가 얻어진 것이 이전에 관찰되었다(도 18); 그러므로, 모든 인플루엔자 바이러스 면역원 mRNA(HA, NA, NP 및 M2e)가 조합될 때, 반응의 감소는 없을 가능성이 있지만, 이것은 직접 테스트된다. 만약 감소가 관찰되면, 단일 백신 중의 면역원의 수는 감소되며 반응이 평가된다.
마우스 및 흰 족제비에서 뉴클레오사이드 변형 인플루엔자 mRNA-LNP 백신의 면역원성 및 보호 효능
위에서 기술된 데이터(도 15 내지 도 17)는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신이 인플루엔자 바이러스에 대해 강력한 Tfh 세포 및 중화 항체 반응을 유도하는 능력을 입증하였다. 연구는 1가 전장 PR8 또는 A/Cal09 HA 암호화 mRNA-LNP 백신을 사용하였다. 중요하게, 심지어 이들 백신은 1회 또는 2회 면역화 후 마우스에서 상동성, 이종성 및 이종하위유형 바이러스로부터의 보호를 유도하였다. 그러므로, 비록 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 다가 백신에서 최적화된 HA 면역원 및 4개의 상당히 보존된 항원(헤드 없는 HA-페리틴, NA, NP 및 M2e)의 조합의 사용은 상당히 증가된 보호 효능을 초래한다는 가설을 세웠다.
이 연구 과정 동안, 인플루엔자 A 1군, 인플루엔자 A 2군 및 인플루엔자 B 항원(HA, NA, NP 및 M2e)을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 제형을 개별적으로 및 조합된 제형에서 평가한다. T 및 B 세포 면역 반응 및 각 백신의 단기 및 장기 보호 효능을 평가한다. 대다수의 인플루엔자 바이러스 백신을 근육내로 투여하고 일부(예를 들어 플루존)는 피내로 주사한다. 최근에 뉴클레오사이드 변형 mRNALNP 백신은 근육내 및 피내 전달 후에 잘 작용하지만, 피내 전달이 약간 더 강력한 면역 반응을 유도한 것이 입증되었다. 그러므로, 피내 경로를 사용하여 인플루엔자 mRNA-LNP 백신 후보를 평가한다.
마우스에서 T 세포 면역 반응의 평가: 10마리의 Balb/c 마우스(5마리 수컷과 5마리 암컷) 그룹에 10 μg(이전에 강력한 항체 반응을 유도한 것으로 나타남)의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신을 피내로 1회 주사하고 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 림프절(LN) 및 비장 거주 T 세포에서 단일 면역화 후 12일 후에 각각의 백신 항원에 대한 중복 펩타이드 풀로의 자극과 이어서 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2(CD4) 또는 IFN-γ, IL-2 및 CD107a(CD8)에 대한 세포내 염색에 의해 평가한다. T 세포 면역 반응을 또한 2회의 면역화 후에 평가한다(백신 투여간 4주 간격, 동물은 제2 용량의 투여 후 12일 후에 희생됨). Tfh 세포 면역 반응을 1회 면역화 후에 백신 투여 후 12일 후의 비장의 CD4+CXCR5+PD-1+T 세포를 계수함으로써 평가한다. 더불어, 개별 항원 백신 접종으로부터뿐만 아니라, 조합된 백신 접종 접근법으로부터의 비장 세포를 바이러스 감염 세포의 사멸 검정으로 테스트한다. 이것은 각각의 백신 접종 접근법에 의해 유도된 T 세포 매개 사멸의 수준을 정량화하고 T 세포 반응에 미치는 조합 백신 접근법의 이익을 평가하는 것을 허용한다.
마우스에서 항원 특이적 체액성 면역 반응의 평가: 10마리의 Balb/c 마우스(5마리 수컷과 5마리 암컷) 그룹에 10 μg의 mRNA-LNP 백신을 피내로 1회 또는 2회(4주 간격) 주사하고 혈청을 4, 8, 12, 16 및 20주차에 수집한다. 항원 특이적 IgG 역가를 ELISA에 의해 측정한다. 더불어, 면역 반응의 폭을 다양한 이종성 항원(조류 및 인간 인플루엔자 바이러스 항원의 큰 패널을 포함함)에 대한 혈청을 테스트함으로써 평가한다. 헤드 없는 HA 면역원을 사용하기 때문에, 혈구응집 억제 검정(HAI)에서 활성인 항체는 유도되지 않으며, 그러므로 HA 헤드 특이적 반응이 유도되지 않는 것을 확인하기 위하여 도전 바이러스에 대해서만 수행된다. 뉴라미니다제 억제(NAI)를 측정하고 또한 시험관내 미세중화 검정을 수행한다. 뉴클레오사이드 변형 1가 HA(전장) mRNALNP 백신은 매우 높은 HAI 역가 및 상동성 바이러스 스트레인에 대한 보호를 유도하였다(도 16). 흥미롭게, 그것은 이종성 및 이종하위유형 인플루엔자 바이러스에 대한 HAI 역가의 부재 하에서 이들 바이러스에 대한 보호 효능을 나타냈다. 본 연구는 또한 HA mRNA-LNP 백신이 HA 줄기 특이적 항체를 유도한 것을 입증하였다. 함께 취합하면, HA 줄기 특이적 항체가 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신의 보호 효능에 영향을 미치는데 있어 중요한 역할을 할 가능성이 있는 것으로 의심되지만, 기본 메커니즘은 아직 측정되지 않은 채로 남아 있다. A/Cal09 HA mRNALNP 면역화 마우스로부터의 혈청이 시험관내에서 H5N1 바이러스를 중화하지 못했지만 동물이 치사량의 H5N1 바이러스 도전으로부터 보호된 것으로 나타났기 때문에, HA 줄기 특이적 항체가 다양한 이펙터 면역 메커니즘을 통해 작용하여 이종하위유형 백신 보호를 유도했을 가능성이 있다. 이것은 여러 최근 연구가 HA 줄기 특이적 항체의 효능이 종종 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 Fc 수용체 매개 메커니즘에 의해 향상된 것을 입증하는 바 문헌과 일치한다. 그러므로, ADCC 리포터 검정을 헤드 없는 HA 암호화 mRNA-LNP 면역화 마우스로부터의 혈청에 대해 ADCC를 촉발시키는 것으로 알려져 있는 쥐과 Fc 수용체(mFcγRIV)를 발현하도록 조작된 Jurkat 세포를 이용하는 상업적으로 이용 가능한 리포터 시스템을 사용함으로써 수행한다. 활성화된 세포에서 하류 캐스케이드는 루시페라제의 발현으로 이어지며, 그것은 발광 판독값으로 검출될 수 있다(도 19).
마우스에서 보호 백신 효능의 평가: 각각의 개별적인 백신 접종 접근법의 보호 효능을 평가하기 위하여, 10마리의 Balb/c 마우스(5마리 수컷과 5마리 암컷) 그룹을 각각의 백신 접종 접근법에 대해 1회 또는 2회 백신접종한 후 백신에 함유된 백신 표적에 대한 야생형 변이체를 함유하는 치사량의 인플루엔자 A 1군(A/Netherlands/602/2009(H1N1)), 2군(A/Hong Kong/1/1968(H3N2)) 또는 인플루엔자 B 바이러스 스트레인(B/Malaysia/2506/2004)으로 도전하였다. 반딧불이 루시페라제를 암호화하는 RNA 백신으로 주사한 마우스 그룹을 음성 대조군으로서 포함시킨다. 인플루엔자 B 도전은 M2e 백신 접근법에 대해서는 수행하지 않는데, 이 바이러스 그룹에는 표적이 존재하지 않기 때문이다.
이들 도전 연구에서 음성 대조군 그룹에 비교하여 유의미한 보호 효과를 보이는 모든 접근법을 조합 백신 접종 접근법에 포함시킨다. 각각의 개별 백신 접종 접근법을 능가하는 조합 백신 접종 접근법의 우수성을 확인하기 위하여, 백신 접종 표적의 외국 변이체(A/Vietnam/1203/2004(H5N1) 및 A/Shanghai/1/2013(H7N9) 포함)를 발현하는 저병원성 PR8 재배열체 바이러스의 패널에 대한 도전에서 개별 면역화 전략에 대해 나란히 테스트한다. 인플루엔자 B 바이러스만이 인간에서 순환한다. 이들 바이러스에 대한 광범위한 보호를 보기 위하여, 70년에 걸쳐 항원 소변이를 일으킨, 1940년도에 처음 분리된 인플루엔자 B 바이러스(B/Lee/1940)를 포함하여 오래된 분리물뿐만 아니라 두 인간 계통의 도전 바이러스를 포함시킨다. 백신 접종 접근법간 차이가 관찰되는 것을 확실히 하기 위하여, 고도로 치명적인 바이러스 용량을 도전에 사용한다.
흰 족제비에서 뉴클레오사이드 변형 인플루엔자 바이러스 mRNA-LNP 백신의 면역원성 및 보호 효능: 흰 족제비는 바이러스 감염 후 인간과 유사한 임상 신호를 보이기 때문에 인플루엔자 백신을 테스트하기 위한 황금 표준 모델이다. A형 및 B형 인간 인플루엔자 바이러스는 둘 다 흰 족제비를 자연적으로 감염시킨다. 마우스 연구로부터의 최상 작업 면역화 계획 및 백신 유형을 흰 족제비에서 평가한다. 보호 효능뿐만 아니라 항체 반응의 크기 및 폭을 조사한다.
4마리의 생후 4개월된, 거세되고, 후손인 수컷 Fitch 흰 족제비를 50 μg(흰 족제비에 대해 이전에 확립된 mRNA 용량)의 다가 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 범용 인플루엔자 바이러스 백신으로 백신 접종하고 그들을 A/Michigan/45/2015(H1N1), A/Hong Kong/4801/2014(H3N2) 및 B/Florida/04/2006을 포함한 인간 계절성 인플루엔자 바이러스 분리물로 도전시킨다. 2회 인간 용량의 비활성화된 계절성 인플루엔자 바이러스 백신을 받은 대조군 그룹을 포함시킨다(인간 치료 표준 대조군 그룹). 반딧불이 루시페라제를 암호화하는 mRNA 백신을 주사한 동물 그룹을 음성 대조군으로서 포함시킨다. 백신 접종 횟수는 마우스 실험을 토대로 결정한다. 단일 면역화가 멸균 면역 반응을 유도할 가능성은 거의 없고, 그로써 흰 족제비는 2 또는 3회 면역될 필요가 있을 가능성이 있다. 인간 인플루엔자 바이러스는 상부 및 하부 호흡기관에서 잘 복제하지만, 일반적으로 흰 족제비 모델에서 치명적이지 않다. 그러므로, 도전 후 1일 및 3일차에 비강 세척물을 수집하여 상부 호흡기관에서의 복제 동역학의 차이를 관찰한다. 도전 후 4일차에, 흰 족제비를 안락사시키고 조직을 수집하여 상부 및 하부 호흡기관에서의 바이러스 복제를 측정한다.
인간 계절성 인플루엔자 바이러스로의 도전 후에, 고도로 병원성인 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 백신의 보호 효과를 또한 평가한다. 추가 그룹의 흰 족제비를 계절성 인플루엔자 바이러스 도전에 대한 것과 동일한 백신 접종 요법을 사용하여 백신 접종한다. 이들 실험에 대한 양성 대조군 그룹은 보조제 첨가된, 매칭된 비활성화된 전체 바이러스 백신 접종을 받는다. 그런 후 흰 족제비를 A/Vietnam/1203/2004(H5N1) 및 A/Shanghai/1/2013(H7N9)을 포함한 야생형 고도 병독성 조류 인플루엔자 바이러스로 도전시킨다. 고도 병원성 야생형 조류 바이러스가 사용되기 때문에, 이들 실험을 생체안전성 수준 3 설정에서 수행한다. 이들 바이러스는 흰 족제비에서는 치명적이며 바이러스 역가를 비교하는 대신, 바이러스 도전 후 체중 감소 및 생존을 모니터링한다. 백신 접종의 보호 효과를 체중 감소의 감소 및 증가된 생존을 토대로 평가한다. 이들 고도 병원성 인플루엔자 바이러스에 대해 관찰된 보호는 백신이 또한 조류 인플루엔자 바이러스에 대해서도 보편적인 보호를 유도하며 팬데믹 예방책으로서 사용될 수 있음을 확인시켜준다.
세포 및 체액성 면역 반응을 모두 각각의 mRNA-LNP 백신에 대해 평가하고 항체 반응의 폭을 추정할 수 있다. 각각의 백신 접종 접근법이 강력한 면역 반응을 초래할 가능성이 있지만, 일부 백신은 시험관내 검정에서 낮은 반응성을 보이는 면역 반응을 유도하는 것이 가능하다. 백신 접종 접근법은 시험관내 검정 결과를 토대로 제거되지 않지만, 원하는 품질의 백신 접종이 보호를 부여하는 것이기 때문에 생체내 도전 결과에 의해 판단된다. 시험관내 결과와 생체내 결과 사이의 불일치는 보호의 상관관계를 확인하기 위하여 사용된 시험관내 검정의 최적화를 필요로 한다. 더불어, 연속적인 바이러스 도전으로 입양 혈청 또는 T 세포 전달을 수행하여 어떤 구성요소가 관찰된 보호에 가장 기여하는지를 확인할 수 있다.
대부분의 접근법이 상이한 백신 접종 전략을 사용하여 보호성인 것으로 나타났기 때문에, 개별 백신 접종에 대해 보호를 관찰할 가능성이 있다. 그러나, 일부 백신 접종 접근법은 각각위 하위 구성요소에 대해 상이한 수준의 보호를 보이는 것이 가능하다. 예를 들어, 인플루엔자 B 도전 스트레인에 대한 것이 아닌, 인플루엔자 A에 대한 유의미한 NP 기반 보호를 관찰할 수 있다. 그러한 경우에, 하위 구성요소는 용량 증가 연구에서 개별적으로 테스트되어 최소 보호 용량을 확인할 수 있고, 따라서 그것은 조합 백신을 조정하는 수단을 제공한다.
백신 표적의 야생형 변이체를 발현하는 많은 인플루엔자 A 1군 및 인플루엔자 B 바이러스 도전 스트레인이 쥐과 도전 모델에 이용 가능하다. 최근 H3N2 인플루엔자 바이러스 분리물(인플루엔자 A 2군)은 쉽게 마우스를 감염시키지 않으며, 주로 표면 당단백질에 의존적인 것으로 보인다. 그러나, 마우스에서 고도로 치명적인 오래된 재배열체 바이러스가 이용 가능하다. 적절한 NP 및 M2e 단백질을 발현하는 유사한 재배열체를 생성하여 도전 연구에 사용할 수 있다. HA 및 NA 구성요소가 광범위한 보호를 유도하기 때문에, 그것들은 또한 오래된 버전의 표면 당단백질에 대해 보호할 수 있다. 더불어, 최근 인간 H3N2 바이러스 분리물을 흰 족제비 도전 실험에 사용한다.
이전에 수행된 인플루엔자 바이러스 백신 접종 연구를 토대로, 흰 족제비 모델 및 마우스 모델에서 유사한 보호를 관찰할 것으로 예상하였다. 그러나, 흰 족제비 도전 연구를 먼저 덜 병원성인 인간 인플루엔자 바이러스 분리물을 사용하여 수행하여 고도 병원성 조류 인플루엔자 바이러스로 진행하기 전에 보호를 확인한다. 만약 인간 바이러스에 대해 관찰된 보호가 만족스럽지 못하면, 추가의 면역화 또는 더 높은 백신 접종 용량을 테스트할 수 있다. 이것은 또한 백신 접종의 번역 잠재력에 대해 매우 유익한 정보이며 인간 백신 접종에 더 높은 용량이 필요한지를 나타낸다.
결론적으로, 본 연구는 작은 및 큰 동물에서 다양한 바이러스 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도한 신규한 고도로 효과적이고 안전한 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 플랫폼을 사용하여 신규한 광범위하게 보호하는/범용 인플루엔자 바이러스 백신의 개발을 기술하였다. 더욱이, mRNA로서 암호화된 보존된 NA, NP, 및 M2e 서열을 가진 최적화된 줄기 유도 헤드 없는 HA 면역원의 사용은 우수한, 광범위한 보호 인플루엔자 바이러스 백신의 개발로 이어질 수 있는 신규한, 매우 혁신적인 접근법이다.
효능 외에, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신의 제조는 쉽고 서열 의존적이며 난 또는 값비싼 세포 배양 및 단백질 정제 시스템을 필요로 하지 않는다. 백신의 mRNA 및 LNP 구성요소는 둘 다 현재 GMP로 제조된다.
요약하면, 향상된 효능 외에, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 플랫폼은 종래의 인플루엔자 바이러스 백신을 능가하는 중요한 장점을 가진다: 1) 합성 mRNA 백신의 제조는 신속하고, 확장 가능하며, 서열 의존적이고 난 또는 세포주 또는 복잡한 정제 과정을 필요로 하지 않으며; 2) mRNA 백신 기술은 유연성을 제공하며 여러 항원 암호화 mRNA의 백신 보호의 더 큰 폭을 초래하는 단일 요법으로의 조합을 허용하고; 3) 과거에 여러 인플루엔자 바이러스 항원(M2 및 내부 단백질)은 효과적인 보호 반응을 유도하지 못하였다. - 본 연구는 mRNA-LNP 백신 플랫폼이 광범위한 보호를 유도하기 위하여 백신 접종을 위해 M2 및 NP(및 다른 항원)의 사용을 가능하게 하였음을 보여주었다.
본 연구는 또한 마우스에서 광범위한 다양한 인플루엔자 바이러스에 대해 보호하는 다중 항원의 조합의 효능을 강조하며, 그것은 임의의 개별 구성요소보다 더 잘 보호한다. 나아가, mRNA로서 전달된 기능적으로 비활성인(무독성) M2 이온 채널 단백질은 강력한 M2-지향 면역을 유도하며; 기능적으로 활성인, 막 결합 NA는 하위유형 내 변이 스트레인에 대한 보호를 제공한다. 더욱이, 마우스에서의 보호는 50 ng의 mRNA로 낮은 용량에서 관찰되었다. 인플루엔자 A 1군 특이적 면역원을 테스트하였고 이들 연구를 백신 면역원성 및 안정성을 증가시키고 인플루엔자 A 2군 및 인플루엔자 B 특이적 면역원을 부가시키기 위해 이들 면역원의 다양한 돌연변이 버전으로 확장하였다.
실시예 3: 항원 변형은 마우스에서 뉴클레오사이드 변형 mRNA 기반 인플루엔자 바이러스 백신을 개선시켰다
인플루엔자 바이러스는 연간 50만 명 이상의 사망과 수백만 명의 입원 및 무증상 감염을 유발한다(WHO, 2020, Influenza(Seasonal) Fact Sheet). 계절성 인플루엔자 바이러스 백신은 불량한 면역원성 또는 잠재적 스트레인 미스매치로 인해 차선 유효성을 부여한다(CDC, 2019, Seasonal Influenza Vaccine Effectiveness, 2004-2019). 이상적인 치료를 위해 이들 장애물을 극복하기 위하여, 우수하고 오래 지속되는 면역 반응의 가능성을 제공하는 광범위하게 보호성인 인플루엔자 바이러스 백신을 현재 개발중이다(Nachbagauer R et al., 2020, Annu. Rev. Med., 71:315-327).
인플루엔자 바이러스 HA 보존된 줄기 도메인은, 이 영역이 다중 인플루엔자 A 및 B 바이러스와 교차 반응하는 능력을 가진 항체를 유도하고 직접 중화 및 Fc 매개 이펙터 기능을 통해 보호를 부여하는 작용을 하는 것으로 발견되었기 때문에(DiLillo DJ et al., 2014, Nat. Med., 20:143-151) 여러 백신 전략 및 인간 임상 실험의 표적이었다(Bernstein DI et al., 2020, Lancet. Infect. Dis., 20:80-91; Impagliazzo A et al., 2015, Science, 349:1301-1306; NIAID, 2019, Dose, safety, tolerability and immunogenicity of an influenza H1 stabilized stem ferritin vaccine, VRCFLUNPF099-00-VP, in healthy adults; Yassine HM et al., 2015, Nat. Med., 21:1065-1070). 합리적으로 설계된 백신 후보는 키메라 HA 단백질(Bernstein DI et al., 2020, Lancet. Infect. Dis., 20:80-91), 헤드 없는 HA 줄기 단독 구성물(Impagliazzo A et al., 2015, Science, 349:1301-1306; Yassine HM et al., 2015, Nat. Med., 21:1065-1070), 또는 과다글리코실화된 HA 헤드 도메인 단백질(Eggink D et al., 2014, J. Virol., 88:699-704; Bajic G et al., 2019, Cell Host Microbe, 25:827-835)로의 순차적인 백신 접종을 통해 이 부류의 항체를 유도하기 위해 시도한다.
바이러스 NA는 그것이 하위유형 내에서 강력하게 중화하는 항체 유도 능력으로 인해 잠재적 백신 항원으로서의 탄력을 얻었다(Wohlbold TJ et al., 2015, MBio., 6:e02556). 최근에, NA 활성 부위를 표적으로 하는 광범위하게 교차 반응성인 항체가 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 결합하여 억제할 수 있는 것으로 나타났다(Stadlbauer D et al., 2019, Science, 366:499-504). 전체적인 백신 유효성을 개선하기 위하여 현재 인플루엔자 바이러스 백신을 NA 구성요소로 보충하기 위한 전략이 논의되었다(Krammer F et al., 2018, MBio., 9: e02332-17).
범용 인플루엔자 바이러스 백신 항원으로서 작용하는 매트릭스 단백질 2(M2e) 이온 채널의 세포외 도메인의 잠재력을 조사한 여러 연구가 있었다(Deng L et al., 2015, Vaccines(Basel), 3:105-136; El Bakkouri, K et al., 2011, J. Immunol., 186:1022-1031; Schotsaert M et al., 2016, Sci. Rep., 6:24402). M2e 영역은 인플루엔자 A 바이러스 전체에서 고도로 보존되며 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성을 통해 보호를 부여하는 비중화 항체를 유도하는 것으로 알려진다(El Bakkouri, K et al., 2011, J. Immunol., 186:1022-1031). 전장 M2 단백질이 또한 항체 반응을 향상시키거나 세포 면역 반응을 자극하는 작용을 할 수 있는 여러 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 알려진다(Deng L et al., 2015, Vaccines(Basel), 3:105-136).
종종 내부 인플루엔자 바이러스 단백질의 벡터화된 발현의 사용을 통해, 광범위하게 반응성인 세포 반응을 자극하기 위한 전략을 또한 연구중이었다. 바이러스 NP 및 매트릭스 단백질 1(M1) 단백질은 고도로 보존된 T 세포 에피토프의 존재로 인해 세포 면역을 자극하기 위한 선호되는 항원이다(Berthoud TK et al., 2011, Clin. Infect. Dis., 52:1-7). 광범위하게 교차 반응성인 세포 반응은 감염된 세포의 제거로 이어지고, 그것은 증상 및 바이러스 전파의 감소로 이어지는 것으로 나타났다(Topham DJ et al., 1997, J. Immunol., 159:5197-5200). 이들 항원을 표적으로서 이용하는 백신은 현재 임상 실험에서 테스트되고 있다(Lillie PJ et al., 2012, Clin. Infect. Dis., 55:19-25).
스트레인 특이성 및 제한된 효능 외에, 종래의 인플루엔자 바이러스 백신 플랫폼의 주요 제한 중 하나는 난 또는 세포주에서의 제조의 어려움 및 고도로 바람직한 특정 변형을 신속하게 통합시키는 유연성의 결여이다(Houser K et al., 2015, Cell Host Microbe., 17:295-300). 차세대 백신 기술은 보존된 항원의 전달을 허용하고 면역 체계를 우선적으로 왜곡시켜서 원하는 반응을 촉발시킴으로써 인플루엔자 백신 개발 분야를 발전시켰다. LNP 캡슐화된 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 최근에 예외적인 효능뿐만 아니라, 바이러스 위협에 대한 신속하고, 확장 가능한 반응을 제공하는 백신 플랫폼으로서 개발되었다(Pardi N et al., 2015, J. Control. Release, 217:345-351; Alameh MG et al., 2020, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1-35). 이들 백신은 전임상 연구에서 다양한 병원체에 대해 효과적인 것으로 나타났고(Alameh MG et al., 2020, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1-35), 인간 사이토메갈로바이러스(NCT04232280), 호흡기 융합 바이러스(NCT04528719), 중증의 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스 2(NCT04470427 및 NCT04537949) 및 기타에 의해 유발된 질환을 포함한 바이러스 질환을 예방하기 위해 여러 임상 연구가 진행 중이다.
중요하게, 여러 연구는 다중 백신 항원이 단일 면역화에서의 전달을 위해 mRNA-LNP로 제형화되었고(John S et al., 2018, Vaccine, 36:1689-1699; Awasthi S et al., 2019, Sci. Immunol., 4; Egan KP et al., 2020, PLoS Pathog., 16:e1008795; Freyn AW et al., 2020, Mol. Ther., 28:1569-1584), 이 백신 플랫폼이 기본 서열의 변형을 통해 그들이 발현하는 항원의 용이한 변경을 허용하는 것(Espeseth AS et al., 2020, NPJ Vaccines, 5:16)을 입증하였다. 인플루엔자 바이러스 백신 표적 상에서 개선하기 위하여, 본 연구는 위에서 기술된 돌연변이를 활용함으로써 단백질 기능성 도메인을 변경시키는 것에 초점을 맞추었다.
이들 실험에 사용한 물질 및 방법을 이제 기술한다.
윤리적 진술: 본원에 기술된 연구는 국립 연구 위원회(National Research Council), 생명 과학에 관한 실험 동물 자원 위원회 관리 위원회에 의한 "실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침"을 준수한다. 마우스 연구는 펜실베니아 대학교(UPenn)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 마운트 시나이의 아이칸 의과대학(ISMMS)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다. 모든 동물을 국제 실험동물 보호협회(AAALAC) 인증 시설의 평가 및 승인을 위한 지역, 주, 및 연방 정책에 따라 하우징 및 관리하였다.
바이러스, 세포, 및 단백질: 인플루엔자 A 바이러스 A/Michigan/45/2015 H1N1pdm(Mich15), A/New Caledonia/20/1999 H1N1(NC99), 및 IVR-180( A/Singapore/GP1908/2015 H1N1pdm 바이러스로부터의 HA 및 NA 및 A/Texas/1/1977 H3N2로부터의 비-당단백질)을 이 연구에 이용하였다. 바이러스를 10일간 발육된 계란(Charles River)에서 48시간 동안 37℃에서 성장시킨 후 4℃에서 밤새 놓아두었다. 요막액을 수득하고 4000 x g에서 10분 동안 4℃에서의 원심분리를 통해 파편을 제거하였다. 혈구응집 양성(아래 기술됨)인 것으로 나타난 깨끗해진 요막액을 모으고, 분취하여, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 바이러스를 정제 및 농축하기 위하여, 모아진 요막액을 100,000 x g에서 2시간 동안 4℃에서 30% 수크로스 쿠션 상에서 회전시켰다. 바이러스 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고, 단백질 농도를 Bradford 검정을 사용하여 측정하고, 분취액을 사용할 때까지 -80℃에서 냉동시켰다.
Madin-Darby 개과 신장(MDCK) 세포를 완전 둘베코 변형 이글스 배지(10% FBS(Gibco), 100 단위/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco), 및 1 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES; Gibco))에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다.
mRNA 제조: A/Michigan/45/2015 H1N1pdm 바이러스 분절 서열을 항원 설계에 이용하였다. 코돈 최적화된 HA, NA, NP, M1, 및 M2를 합성하고(Genscript) 돌연변이를 중합효소 연쇄 반응에 유도된 증폭을 통해 뉴클레오타이드 서열에 포함시켰다. 구성물을 mRNA 제조 벡터에 결찰시키고, 벡터를 선형화하고, 시험관내 전사 반응(Megascript, Ambion)으로 T7 구동을 수행하여 101개 뉴클레오타이드 길이 폴리(A) 꼬리를 가진 mRNA를 생성하였다. mRNA의 캡핑을 트라이뉴클레오타이드 cap1 유사체, CleanCap(TriLink)의 첨가를 통한 전사와 함께 수행하고 m1Ψ 5'-삼인산염(TriLink)을 UTP 대신 반응에 포함시켰다. mRNA의 셀룰로스 기반 정제를 기술된 것과 같이 수행하였다(Baiersdorfer M et al., 2019, Mol. Ther. 핵산, 15:26-35). 그런 후 mRNA를 아가로스 겔 상에서 체크한 후 -20℃에서 보관하였다(Baiersdorfer M et al., 2019, Mol. Ther. Nucleic Acids, 15:26-35).
mRNA의 지질 나노입자 형성: 정제된 mRNA를 이온화 가능 양이온성 지질, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 폴리에틸렌 글리콜-지질의 자가 조립 에탄올 지질 혼합물을 사용하여 지질 나노입자로 제형화하였다. 이 혼합물을 이전에 기술된 것과 같이 산성 pH에서 mRNA를 함유한 수용액과 신속하게 조합하였다(Pardi N et al., 2015, J. Control. Release, 217:345-351). 이온화 가능한 양이온성 지질(6.0-6.5의 범위의 pKa, Acuitas Therapeutics 전매품) 및 LNP 조성은 특허 출원 WO 2017/004143에서 기술된다. 평균 유체역학적 직경은 약 80 nm였고 다분산 지수는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)를 사용하여 동적 광산란에 의해 측정된 바 0.02-0.06이었으며 캡슐화 효율은 Ribogreen 검정을 사용하여 측정된 바 약 95%였다.
mRNA 백신 접종 및 바이러스 도전: 생후 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Labs-ISMMS 및 Charles River Laboratories-UPenn)를 이 연구에 이용하였다. 마우스를 저용량의 케타민/자일라진 혼합물(ISMMS) 또는 아이소플루란(UPenn)으로 마취시키고 면도한 후 PBS에 희석된 mRNA-LNP 백신을 총 부피 100 μL로 등의 2곳의 상이한 지점에서 피내 전달하였다.
인플루엔자 바이러스 도전 용량을 바이러스의 로그 배수 감소 플라크 형성 단위로의 마우스의 감염을 통해 결정하였다. 치사 용량의 중앙값(LD50)을 마우스의 생존 및 받은 용량을 토대로 계산하고 5 x LD50의 도전 용량을 계산하였다. 도전시, 마우스를 케타민/자일라진 혼합물로 마취하고 체중을 측정하고 5 x LD50의 인플루엔자 바이러스를 50 μL의 PBS에 담아 비강내로 투여하였다. 마우스의 체중을 매일 측정하고 만약 체중 감소가 초기 체중의 25% 이상이거나 실험 끝에 있다면 희생시켰다. 모든 동물 작업을 마운트 시나이의 아이칸 의과대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.
효소 결합 면역흡착 검정: Immulon 4 HBX 평평 바닥, 96 웰 플레이트(Thermo Fisher)를 PBS 중의 정제된 바이러스로 웰당 250 ng의 최종 농도로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션되도록 하였다. 다음날 아침, 플레이트를 PBS 중의 0.1% Tween 20(Fisher)(PBST)으로 3회 세척하고 차단 완충액(PBST 중의 3% 염소 혈청(Gibco) 및 0.25% 우유(Quality Biological))에서 1시간 동안 실온(RT)에서 차단시켰다. 차단 완충액을 제거한 후, 샘플을 새로운 차단 완충액으로 연속적으로 3배 희석하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 그런 후 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 염소 항-마우스 IgG Fc 양고추냉이 과산화효소(HRP) 결합 이차 항체(Abcam, 97265)를 차단 완충액 중의 1:15,000의 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 플레이트를 추가로 흔들어주면서 PBST로 4회 세척하고 SigmaFast o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드 기질(OPD; Sigma)을 10분 동안 사용하여 전개한 후 3 M HCl(Fisher)로 퀀칭하였다. 플레이트를 Synergy H1 하이브리드 다중모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek) 상에서 490 nm에서 판독하였다. 데이터를 Prism 8.0(GraphPad)을 사용하여 처리하고 곡선 아래의 면적을 평균의 기준선에 음성 웰의 표준 편차의 3배 또는 0.07 중 더 높은 값을 더한 값을 사용하여 계산하였다.
혈구응집 억제 검정: 혈구응집 역가를 PBS 중의 2배 연속 희석 바이러스와 PBS 중의 0.5%의 동일한 부피의 닭 적혈구(RBC)와의 4℃에서의 인큐베이션을 통해 측정하였다. 역가를 펠릿이 형성되는 것을 방지하는 RBC의 응집을 유발할 수 있는 최종 희석으로서 측정하였다.
혈청을 수용체 파괴 효소 (RDE; Seiken)로 제조사의 지침대로 처리하였다. 간단히 설명하면, 혈청을 RDE와 함께 밤새 37℃에서 인큐베이션한 후 반응을 2.5% 시트르산 나트륨(Fisher)으로 퀀칭하고 56℃에서 30분 동안 열 비활성화한 후, PBS로 1:10의 최종 농도로 희석하였다. 그런 후 혈청을 PBS로 연속적으로 2배 희석하였다. 바이러스를 PBS에서 4 혈구응집 단위로 희석하여 혈청 희석에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 흔들어준 후 PBS 중에 0.5%의 닭 RBC에 첨가하고 4℃에서 전개되도록 하였다. 종점 역가를 펠릿화된 RBC로 시각적으로 표시되는 RBC의 응집을 방지할 수 있는 최종 상호 희석으로서 측정하였다.
미세중화 검정: 조직 배양 감염성 용량 중앙값(TCID50)을 이 검정에서 사용한 각 바이러스에 대해 측정하였다. MDCK 세포를 조직 배양 처리된 96 웰 접시에서 웰당 2.5 x 104 세포로 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2.에서 밤새 배양되도록 놓아두었다. 다음날 아침, 바이러스를 검정 완충액(1 μg/mL 6-(1-토실아미도-2-페닐) 에틸 클로로메틸 케톤(TPCK) 처리된 트립신이 포함된 울트라 MDCK 배지(Lonza))으로 반-로그 증분으로 연속적으로 희석하였다. 세포를 PBS로 세척하고 바이러스 희석으로 72시간 동안 33℃에서 감염시켰다. 혈구응집 검정을 각 웰로부터의 50 μL의 상층액을 50 μL의 0.5% 닭 RBC(Lampire)와 혼합시킴으로써 수행하였다. RBC의 응집을 유발할 수 있는 마지막 희석을 기록하고 TCID50을 계산하는데 사용하였다.
MDCK 세포를 96 웰 접시에 2.5 x 104 세포/웰로 플레이팅하였다. 혈청 샘플을 모으고 위에서 기술한 것과 같이 RDE 처리하였다. 그런 후 혈청을 검정 완충액으로 2배로 희석한 후 동일한 부피의 희석된 혈청을 검정 완충액에 희석된 100 TCID50의 인플루엔자 바이러스와 함께 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 흔들어준 후 PBS로 세척한 MDCK 세포를 첨가하고 바이러스가 1시간 동안 33℃ 및 5% CO2에서 흡착되도록 하였다. 세포를 PBS로 세척하고 나머지 혈청을 동일한 부피의 검정 완충액으로 희석한 후 상응하는 웰에 첨가하였다. 혈구응집 검정을 통해 플레이트를 판독하기 전에 감염이 진행되도록 하였다. RBC의 응집을 유발할 수 있는 마지막 희석을 종점 역가로서 측정하였다.
항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 검정: MDCK 세포를 흰색 벽의 96 웰 접시에(CoStar) cDMEM에 2.5 x 104 세포/웰로 플레이팅하고 밤새 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 세포를 PBS로 세척하고 TPCK 처리된 트립신의 부재 하에 5의 감염 다중도에서 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 감염이 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 진행되도록 하였다. 배지를 세포로부터 제거하고 25 μL의 검정 완충액(4% 낮은 IgG FBS(Gibco)가 있는 RPMI 16-40)을 각 웰에 첨가하였다. 혈청을 검정 완충액으로 연속적으로 3배 희석하고 25 μL를 감염된 세포에 첨가하였다. NFAT 구동 루시페라제 카세트(Promega)를 사용하여 쥐과 FcγRIV를 발현하는 이펙터 ADCC 세포를 25 μL에 3 x 106 세포/mL의 최종 카운트로 첨가하였다. 반응을 6시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션되도록 한 다음 실온(RT)에 대해 표준화하였다. Bio-Glo 루시페라제 기질(Promega)을 각 웰에 첨가하고 Synergy H1 하이브리드 다중모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek)로 발광을 즉시 판독하였다. 배수 변화를 각 웰을 배경 웰의 평균에 표준 편차의 3배을 더한 값으로 나눔으로써 측정하였다. 회귀 곡선을 배경 보정값에 맞추었고 곡선 아래의 면적을 Prism 8.0(GraphPad)에서 1의 기준선 한계값으로 계산하였다.
뉴라미니다제 억제 검정: 효소 결합 렉틴 검정을 수행하여 NI 검정에 필요한 바이러스의 양을 측정하였다. 페투인(Sigma-Aldrich)을 96 웰 접시에 100 μL의 PBS에서 25 μg/mL의 최종 농도로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 보관하였다. 다음날, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 PBS-T 중의 5% BSA로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 바이러스를 1% BSA(Sigma-Aldrich)를 가진 PBS로 연속적으로 2배 희석하고 차단된 플레이트에 2시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 첨가하였다. 그런 후 플레이트를 PBS-T로 6회 세척하고 5 μg/mL의 100 μL의 HRP 콘쥬게이션된 땅콩 아글루티닌(PNA)을 첨가하고 플레이트를 2시간 동안 실온에서 암실에서 인큐베이션하였다. PBS-T로 6회 세척한 후, 100 μL의 SigmaFast OPD(Sigma)를 첨가하고 10분 동안 전개되도록 놓아둔 후 3 M HCl(Fisher)로 퀀칭하였다. 플레이트를 Synergy H1 하이브리드 다중모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek) 상에서 490 nm에서 판독하였다. 곡선을 Prism 8.0(GraphPad)으로 비선형 회귀를 사용하여 맞추었고 90% 유효 농도(EC90)를 측정하고 후속 뉴라미니다제 억제 검정에 사용하였다.
96 웰 접시를 100 μL의 PBS 중의 25 μg/mL 페투인으로 코팅하고 밤새 4℃에서 보관하였다. 혈청을 56℃에서 열처리한 후 1% BSA가 있는 PBS로 2배 희석하였다. 바이러스를 EC90 값을 토대로 1% BSA가 있는 PBS로 희석하고 동일한 부피로 혈청 희석에 첨가하고 실온에서 1시간 반 동안 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 페투인 코팅된 플레이트를 세척하고 위에서 기술한 것과 같이 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단 완충액을 제거한 후, 바이러스/혈청 혼합물을 페투인 플레이트에 첨가하고 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 플레이트를 PBST로 6회 세척하고 HRP 결합 PNA를 2시간 동안 실온에서 암실에서 첨가하였다. 플레이트를 다시 PBST로 6회 세척하고 위에서 기술한 것과 같이 전개시켰다. 비선형 회귀 곡선을 Prism 8.0(GraphPad)을 사용하여 맞추고 EC50 값을 측정하였다.
마우스 비장세포의 염색 및 유동 세포분석기 분석: 마우스 비장세포의 단일 세포 현탁액을 완전 RPMI-1640 배지에서 생성하였다. 샘플당 3 x 106 세포를 6시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 5 μg/mL의 중복하는 M1 펩타이드 풀(JPT Peptide Technologies, MP1/California H1N1) 및 1 μg/mL의 항-CD28 항체(BD Biosciences, 클론 37.51)의 존재 하에 자극하였다. 5 μg/mL의 골지플러그(BD Biosciences, 브레펠딘 A) 및 10 μg/mL의 골지스탑(BD Biosciences, 모넨신)을 자극을 시작하고 1시간 후 각 샘플에 첨가하였다. 각 동물에 대해 비자극 샘플을 또한 포함시켰다. 10 μg/mL의 포볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(Sigma) 및 200 ng/mL의 이오노마이신(Sigma)으로 자극된 샘플을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 자극 후, 세포를 PBS로 세척하고 LIVE/DEAD 고정 가능한 아쿠아 데드 셀 염색 키트(Life Technologies)로 10분 동안 실온의 암실에서 염색하였다. 세포를 후속해서 미표지 CD16/CD32 래트 항-마우스(BD Biosciences, 클론 2.4G2) 및 항-CD4 PerCP(페리디닌 클로로필 단백질)/Cy5.5(BioLegend, 클론 GK1.5) 및 항-CD8 퍼시픽 블루(BioLegend, 클론 53-6.7) 단클론성 항체(mAb)로 30분 동안 4℃의 암실에서 표면을 염색하였다. 표면 염색 후, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 고정시키고(1% 파라포름알데하이드 함유 PBS), 투과/고정 용액 키트(BD Biosciences)를 사용하여 투과시켰다. 그런 후 세포를 항-CD3 알로피코시아닌(APC)-Cy7(BD Biosciences, 클론 SP34-2), 항-종양 괴사 인자(TNF)-α 피코에리트린(PE)-Cy7(BD Biosciences, 클론 MP6-XT22), 항-인터페론(IFN)-γ Alexa Fluor 700(AF700)(BD Biosciences, 클론 XMG1.2), 및 항-인터류킨(IL)-2 브릴리언트 바이올렛 711(BV711)(BioLegend, 클론 JES6-5H4) mAb로 30분 동안 4℃의 암실에서 세포내로 염색하였다. 마지막으로, 세포를 투과 완충액으로 세척하고, 이전과 같이 고정시키고, 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다. 비장세포를 변형된 LSR II 유동 세포분석기(BD Biosciences) 상에서 분석하였다. 표본당 500,000개 사건을 수집하였다. 각각의 기능에 대해 게이트를 전개시킨 후, Boolean 게이트 플랫폼을 사용하여 3가지 기능을 테스트할 때 7가지 응답 패턴에 해당하는 가능한 조합의 전체 배열을 생성하였다. 데이터를 FlowJo 10 프로그램으로 분석하였다. 데이터를 펩타이드 풀 자극 염색된 샘플의 빈도로부터 비자극 염색된 세포의 빈도를 뺌으로써 표시하였다.
막 고정 헤마글루티닌 항원이 가용성 구성물을 능가하였다
벡터화된 백신 접근법은 천연, 막 결합 형태로 항원을 표시하는 능력을 제공하였다. 가용성 및 막 결합 HA 구성물을 비교하기 위하여, 전장 야생형 A/Michigan/45/2015 H1N1pdm(Mich15) HA 서열을 함유하거나 경막 및 시토졸성 도메인이 제거되고 T4 접혀진 트라이머화 도메인으로 교체되어 있는 mRNA 서열을 설계하였다(도 23B; Krammer F et al., 2012, PLoS One, 7:e43603).
추가로, 면역 반응을 유도하는데 미치는 HA 수용체 결합 활성의 영향을 조사하기 위하여, 추가 돌연변이(Y98F)를 수용체 결합 부위(RBS)에 도입하여 시알산 결합을 감소시켰다(Martin J et al., 1998, Virology, 241:101-111). 또한, HA 절단 부위의 돌연변이(R334A 및 G335A)를 수행하여 단백질 가수분해성 절단의 감소가 피내 백신 접종의 맥락에서 항원 제공 또는 안정성에서 역할을 하는지를 관찰하였다. 가용성 및 경막 도메인 포함 구성물을 또한 A/Brisbane/59/2007 H1N1 인플루엔자 바이러스의 보존된 줄기 도메인을 토대로 한 CR #4900 미니 HA를 사용하여 제조하였다(Impagliazzo A et al., 2015, Science, 349:1301-1306). 마우스를 20 μg의 단일 mRNA-LNP 구성물로 피내로(I.D.) 백신 접종하고 4주 후 분석을 위해 혈청을 얻었다(도 23C). 혈청을 분석하여 효소 결합 면역흡착 검정에 의한 항체 결합(ELISA; 도 24A 및 도 25A), 혈구응집 억제에 의한 HA 수용체 결합 활성의 간섭(도 24B), 다중 주기 미세중화 검정에 의한 중화(도 24C), 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 검정을 통한 항체 Fc 매개 이펙터 기능성(도 24D 및 도 26A)을 측정하였다. RBS 및 HA 절단 부위의 돌연변이는 테스트된 용량 수준에서 항원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 전장, 막 결합 구성물로서의 HA의 발현은 가용성 HA와 비교하여 항체 반응의 품질을 상당히 개선시키는 것으로 나타났다. 미니 HA 구성물에 의해 유도된 반응은 전체적으로 더 낮았고 막 결합 HA와 분비된 HA 사이에 차이는 검출되지 않았다. 그러나, 이들 구성물은 안정적인 분비된 항원으로서 구조적으로 설계된 것이고 경막 도메인을 이들 구성물에 도입하는 것의 영향은 명확하지 않다. 추가로, 미니 HA가 팬데믹 이전의 A/Brisbane/59/2007 H1N1을 토대로 한 것이지만 모든 다른 구성물은 이들 검정을 위해 사용된 바이러스와 매칭된 팬데믹 후 Mich15 서열을 토대로 한 것이 주지되었다.
백신 접종 후 4주 후, 마우스를 팬데믹 이전 A/New Caledonia/20/1999 H1N1(NC99) 바이러스로 도전시켜서 막 결합된(도 27A) 및 가용성(도 27B) 구성물에 의해 부여된 보호의 차이를 체중 감소를 토대로 관찰하였다. 최대 체중 감소율 데이터를 도표화하고(도 24E) HA 구성물이 전장 막 결합 단백질로서 발현되었을 때 보호에 상당한 증가가 있음을 입증하였다. 야생형 항원에 비해 임의의 돌연변이에 대해 실질적인 체중 감소의 차이는 관찰되지 않았고, 이것은 테스트된 용량에서 HA 면역원성을 변경시키기 위한 기능성 돌연변이의 효과의 부족을 입증한다. 인플루엔자 도전 바이러스 NC99가 팬데믹 후 Mich15 기반 구성물보다 팬데믹 이전 미니 HA와 유전자적으로 더 유사한 것을 주지하는 것이 중요하다.
뉴라미니다제 촉매 활성의 변경은 반응원성을 감소시켰다
NA 촉매 부위의 돌연변이의 영향을 기능성 활성을 감소시키는 것으로 이전에 기술된(Zhu X et al., 2012, J. Virol., 86:13371-13383), mRNA 서열에의 D151G 돌연변이의 도입에 의해 조사하였다(도 23B). 이것과 나란히, 촉매 부위 돌연변이가 있거나 없는 4분지 테트라머화 도메인에 융합된 NA 헤드 도메인의 분비된 형태를 테스트하였다(Margine I et al., 2013, J. Vis. Exp., e51112). 마우스를 위에서 기술한 것과 같이 20 μg의 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP로 면역화하고 혈청학적 검정을 백신 접종 후 4주 후에 수행하였다. 모든 구성물은 매칭된 H1N1pdm 인플루엔자 바이러스에 대한 ELISA에 의해 유사한 수준의 항체를 유도하는 것으로 나타났지만, 야생형 NA는 약간 더 높은 반응을 유도하였다(도 28A 및 도 25B). 중화 역가는 그룹간에 유사하였지만(도 28B), 효소 결합 렉틴 검정(ELISA)에 의해 측정된 뉴라미니다제 억제는 다시 야생형 구성물에 대해 더 높은 수준의 경향을 보였다(도 28C). ADCC 리포터 검정에서, 막 결합 구성물로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 더 강한 신호를 유도하였다(도 28D 및 도 26B). 보호에 미치는 변형의 영향을 측정하기 위하여, 마우스를 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1 바이러스 스트레인으로 감염시켰다. 최대 체중 감소는 그룹간에 유사하였고, 관찰된 보호에 유의할만한 차이는 없었다(도 28E 및 도 27C).
흥미롭게, 병변의 형태의 반응원성을 야생형 NA 구성물을 피내 프라임/부스트 요법(10 μg의 mRNA로 2회; 3주 간격)으로 테스트하였을 때 관찰하였다. 병변은 NA 항원을 테스트했을 때와 부스터 백신 접종 후에만 관찰되었고(도 28F), 이것은 적응 면역 반응이 포함된 것을 시사한다. 중요하게, NA의 촉매 부위를 돌연변이시키는 것은 반응원성을 실질적으로 감소시켰지만 돌연변이는 면역원성을 실질적으로 변경시키지 않거나 보호를 부여한 것으로 나타났다.
이온 채널 활성을 가진 전장 M2의 발현은 개선된 면역원성을 제거하였다
mRNA 및 다른 벡터화된 백신은 전장 경막 단백질의 발현을 허용한다. 전장 M2 mRNA-LNP와 일반적인 제어 비억제성 4(GCN4) 테트라머화 도메인(M2e)에 부착된 M2 엑토도메인만을 발현하는 구성물과의 비교를 백신 접종과 이어서 혈청학적 분석 및 도전을 통해 수행하였다(De Filette M et al., 2008, J. Biol. Chem., 283:11382-11387). 추가적으로, 아미노산 29-31이 결실된 mRNA-LNP를 암호화하는 전장 M2(iM2)를 또한 사용하였는데(도 23B), 이 돌연변이가 이전에 이온 채널 활성을 제거하는 것으로 밝혀졌기 때문이다(Watanabe T et al., 2001, J. Virol., 75:5656-5662).
ELISA 분석은 iM2로 백신 접종된 마우스가 테스트된 다른 구성물보다 표적에 대해 상당히 더 강한 반응을 마운팅한 것을 드러냈다(도 29A 및 도 25C). 이 패턴은 ADCC 리포터 검정에 의한 유도된 항체의 기능성 조사를 통해 지속되었고 iM2 > M2 > M2e였다(도 29B 및 도 26C). 이종성 A/New Caledonia/20/1999 H1N1 스트레인으로의 도전 후, 위에서 기술된 것과 같이 체중 감소율의 분석을 통해 보호를 조사하였다(도 27D). 최대 체중 감소율은 iM2로 백신 접종된 마우스에서 가장 낮은 것으로 나타났으며, 이것은 다른 두 백신 그룹보다 상당히 더 나은 보호를 나타냈다(도 29C).
핵단백질은 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP에 의해 전달되었을 때 매트릭스 단백질 1에 대한 우수한 항원이었다
인플루엔자 비리온의 내부 단백질을 바이러스 벡터화된 접근법을 통해 광범위하게 반응성인 세포 반응을 자극하기 위한 표적으로서 이용하였다(Berthoud TK et al., 2011, Clin. Infect. Dis., 52:1-7; Antrobus RD et al., 2014, Mol. Ther., 22:668-674). 이들 항원이 mRNA-LNP를 통한 전달 후에 보호를 제공하는 능력을 평가하기 위하여, 야생형 NP 및 M1(A/Michigan/45/2015 H1N1pdm) 발현 백신을 제형화하였다. 백신 접종을 위에서 기술한 것과 같이 수행한 후에 혈청학적 평가 및 바이러스 도전을 수행하였다. 감소된 분비를 통해 항체 반응을 감소시키려는 시도를 위해 NP 단백질 핵 국지화 신호 서열에 대한 변형을 또한 테스트하였지만, 생체내에서의 차이로 해석되지 않았다(도 30).
NP 발현 구성물은 ELISA에 의해 정제된 H1N1pdm 표적에 대해 고수준의 항체를 자극하는 것으로 나타난 한편, 체액성 반응은 M1 발현 mRNA-LNP로의 백신 접종 후에 무시할 정도였다(도 31A 및 도 25D). 바이러스 도전 후 생존은 두 항원에 대해 모두 완전하였지만(도 31B), 최대 체중 감소율은 NP 발현 mRNA-LNP를 받은 마우스에서 상당히 더 낮았다(도 27E).
T 세포 반응의 분석을 M1 암호화 mRNA-LNP에 대해 수행하여 NP 발현 mRNA-LNP 백신 접종에 대한 이전에 공개된 결과와 비교하였다(Freyn AW et al., 2020, Mol. Ther., 28:1569-1584). 마우스를 20 μg의 M1 mRNA-LNP로 백신 접종하고 12일 후에 분석을 위해 비장을 수득하였다(도 31C). T 세포를 M1 특이적 펩타이드로 자극하고 유동 세포분석을 세포내 사이토카인 염색과 함께 이용하여 항원 특이적 T 세포 활성화를 측정하였다. 총 CD3+ 세포 중에서 사이토카인 발현 T 세포의 비율을 CD4+ 및 CD8+ 두 집단에 대해 보고하였다(도 31D, 도 31E, 및 도 32). 또한, 다중기능성을 Boolean 게이팅을 통해 평가하여 다중 사이토카인을 동시에 발현하는 세포 집단을 측정하였다(도 31F 및 도 31G). CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응은 모두 M1 백신 접종된 마우스에서 검출되었다. mRNA-LNP 백신 접종 후 NP 특이적 T 세포 반응에 대한 이전에 공개된 데이터에 비교하여, CD8+ M1 특이적 T 세포 집단은 실질적으로 더 약하였다(Freyn AW et al., 2020, Mol. Ther., 28:1569-1584).
백신의 항원 변형을 일반적으로 사용하여 재조합으로 발현된 단백질 항원의 안정성/면역원성을 증가시켰다(Graham BS et al., 2019, Annu. Rev. Med., 70:91-104). 이 과정을 기능성 도메인의 변경을 포함하도록 확장시키는 것을 변형이 면역원성 및 반응원성에 미치는 특정 효과를 측정하기 위해 탐색하였다(Graham BS et al., 2019, Annu. Rev. Med., 70:91-104). 완전히 합성된 본질로 인해, 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 기술은 기본 서열의 변형을 통해 단백질 표적에 대한 변화의 신속한 통합을 가능하게 하였다. 이 과정을 각각의 구성요소를 최적화하기 위한 시도로 잠재적으로 광범위하게 보호성인 인플루엔자 바이러스 백신 항원에 적용하였다.
온전한 경막 영역을 가진 전장 HA로의 백신 접종이 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP에 의해 전달되었을 때 가용성 구성물보다 더 기능적이고 보호적 항체 반응을 유도한 것으로 나타났다. 비록 임의의 특정 이론에 매이지는 않지만, 이것은 외래 가용성 트라이머화 도메인 또는 B 세포 수용체 교차결합을 용이하게 하는 세포 표면 상에서의 과다발현보다는 오히려 이런 천연 도메인을 통한 HA 단백질의 증가된 안정화로 인한 것일 가능성이 있었다. 나아가, 세포 표면 상에서 막 결합 항원의 축적은 B 세포 수용체의 보다 효과적인 교차 결합을 용이하게 하며, 결과적으로 더 강력한 항체 반응을 초래한다. 이런 유익한 효과는 나노입자, 예컨대 페리틴 상에서의 제공을 통한 중합화에 의해 분비된 항원에 전달된다(Yassine HM et al., 2015, Nat. Med., 21:1065-1070). HA RBS 또는 절단 부위의 돌연변이는 분비된 또는 막 결합 형태의 면역원성에 거의 영향을 미치지 않았다.
나아가, 비록 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 수용체 결합 활성의 감소는, 감소된 "끈적임"으로 인해 항원 분포를 변화시킬 수 있기 때문에, 더 낮은 용량에서 면역원성의 관찰 가능한 차이를 초래한다는 것을 배제할 수 없다. 미니 HA 항원은 또한 부여된 보호가 이종성 도전 후 야생형 항원과 유사했기 때문에 경막 도메인의 재이식으로부터 이익을 얻었다. 관찰된 보호 효과는 모든 구성물에 대해 유사했지만, 미니 HA가 팬데믹 후 Mich15 기반 구성물보다 팬데믹 이전 NC99 도전 바이러스와 아미노산 서열이 더 밀접했음을 주지하는 것이 중요하다. 그러므로, 비록 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 시험관내에서 미니 HA 백신 접종된 마우스로부터의 혈청의 감소된 활성을 토대로, 전장 항원은 매칭된 스트레인으로의 도전에 대해 우수한 보호를 초래할 가능성이 있었다.
NA의 변형은 항원의 면역원성에 대해 감소된 촉매 활성의 영향을 거의 나타내지 않았다. 일부 장점을 결합 및 기능성 검정에서 야생형 항원에 대해 볼 수 있었지만, 테스트된 모든 항원에 의해 부여된 부호는 유사하였다. ADCC 활성은 항원 변형에 의해 가장 영향을 받았으며, 전장 구성물은 그것의 분비된 대응물에 비해 리포터 활성에서 증가를 보였다. 이것은 ADCC 활성에 의해 매개된 항체에 의해 표적화된 에피토프가 전체 줄기 도메인이 제거되어 가용성 구성물이 설계되었을 때 감소되었음을 나타냈다. 흥미롭게, 반응원성은 항원의 촉매 활성이 감소되었을 때 실질적으로 감소된 것으로 나타났다. 이 발견은 다양한 플랫폼에 대해 NA 기반 백신의 안전성을 개선하기 위해 광범위하게 적용할 수 있으며 효소 활성을 가진 항원에 일반적으로 적용된다.
M2 구성물의 분석은 T 세포 에피토프를 함유하였으며 항원의 적절하게 접힌 입체형태를 세포 표면에 제공하는데 관여하는 전체 경막 도메인을 보존하는 이점을 드러냈다. 비록 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 이온 채널 활성의 제거는 대부분 세포 표면 상의 활성 이온 채널의 과다발현이 부여할 독성의 감소로 인한 것일 가능성으로 인해, 자극된 면역 반응을 증가시켰다. 가용성 M2e 구성물의 발현은 mRNA-LNP의 전달의 맥락에서 빈약한 면역원성을 보였는데, 이것은 생체내에서 발현되었을 때 적절한 입체형태의 결핍, 또는 작은, 분비된 항원의 맥락에서 제한된 B 세포 수용체 교차 결합으로 인한 것일 가능성이 있다. 항원을 박테리아 시스템에서 전형적으로 발현시켰고 고도로 정제하여 정확하게 접혀진 테트라머 구성물만을 유지하였다(Schotsaert M et al., 2016, Sci. Rep., 6:24402). 생체내에서의 이런 품질 제어의 결핍은 대부분의 잘못 접혀진 또는 부적절한 항원의 발현으로 이어질 가능성이 있고, 그것은 최적 반응을 방지한다. 또한, 이 항원을 프라임-부스트 요법으로 전달하는 것은 그것의 효능을 증가시킨다.
바이러스 벡터화된 백신에 대해 이전에 선택된 내부 단백질의 비교는 mRNA-LNP에 의한 NP 전달이 M1을 능가하는 이점을 나타냈다. NP에 의해 부여된 보호 수준은 M1의 전달을 통해 볼 수 있었던 것보다 상당히 높았고, 이전 데이터의 비교는 CD8+ T 세포의 자극이 NP에 대한 노출 후에 훨씬 더 컸음을 보여주었다. 이들 항원에 대한 항체 반응은 상당히 상이하였는데, 매우 강력한 항체 반응은 NP에 대해 관찰되었고 M1 반응은 거의 내지 전혀 검출되지 않았다. 이것은 M1이 불량한 B 세포 표적임을 시사하는 일반 집단에서의 M1 특이적 반응의 낮은 혈청 유병률을 발견한 이전 연구를 확증시켜준다(Cretescu L et al., 1978, Infect. Immun., 22:322-327). NP 특이적 항체의 기능성은 현장에서 논의되었지만, 잠재적으로 이들 반응과 강력한 T 세포 반응의 조합은 쥐과 모델에서 인플루엔자 바이러스 도전으로부터의 효과적인 보호로 이어졌다.
요약하면, 항원의 변형은 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신 플랫폼을 이용하는 범용 인플루엔자 바이러스 백신 표적의 면역원성 및 반응원성을 변경하는 것으로 나타났다. 이 연구에서 사용된 백신 접종의 용량은 각각의 개별 구성물에 대해 발현된 항원의 높은 양으로 이어지며, 이것은 더 낮은 용량이 사용된 경우 돌연변이가 면역원성에 미치는 미묘한 효과의 일부를 압도한다. 이 연구에서 결과의 일부는 다른 백신 플랫폼 및 바이러스 항원에 광범위하게 적용된다. 합리적인 백신 설계에 대한 구조 기반 접근법은 항원의 안정화 또는 특정 에피토프의 제공에 초점을 맞추려는 경향이 있다(Graham BS et al., 2019, Annu. Rev. Med., 70:91-104). 이런 노력을 기능성 도메인의 변형과 조합하면 개선된 항원 특징으로 이어지고, 일반적인 백신 개발에 이익이 된다.
전체적으로, 본 연구는 단백질 변형, 예컨대 기능성 분위를 돌연변이를 일으키고, 분비 잠재력을 변경시키며, 단백질 입체형태를 변경시키는 것이 mRNA 기반 인플루엔자 바이러스 백신의 안전성 및/또는 효능을 개선시켰음을 입증하였다. 마우스를 인플루엔자 바이러스 HA, NA, M2, NP, 또는 M1의 야생형 또는 돌연변이 구성물로 피내로 백신 접종하였다. 막 결합 HA 구성물은 분비된 형태보다 더 강력하고 보호적인 항체 반응을 유도하였다. 효소 활성을 감소시키기 위하여 NA의 촉매 부위를 변경시키면, 반응원성을 감소하지만 보호 면역원성은 유지되었다. M2 이온 채널 활성의 파괴는 면역원성 및 보호 효능을 개선시켰다. 내부 단백질 NP 및 M1의 비교는 인플루엔자 바이러스 도전으로부터 보호를 부여하는 데 NP의 우월성을 나타냈다. 이들 결과는 다른 병원체로 확장되는 인플루엔자 바이러스에 대한 유도 항원 설계를 위한 뉴클레오사이드 변형 mRNA 플랫폼의 사용을 지지한다.
실시예 4: 서열 목록
HA 서열
1918 H1N1 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 1)
1918 H1N1 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 2)
1957 H2N2 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 3)
1957 H2N2 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 4)
1968 H3N2 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 5)
1968 H3N2 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 6)
1977 H1N1 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 7)
1977 H1N1 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 8)
2007 H1N1 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 9)
2007 H1N1 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 10)
2009 H1N1 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 11)
2009 H1N1 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 12)
2015 H1N1 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 13)
2015 H1N1 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 14)
2017 H3N2 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 15)
2017 H3N2 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 16)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 17)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호:18)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 19)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 20)
2015 H5N1 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 21)
2015 H5N1 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 22)
2017 H7N9 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 23)
2017 H7N9 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 24)
2013 H10N8 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 25)
2013 H10N8 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 26)
미니 HA 도메인 - HA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 27)
미니 HA 도메인 - HA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 28)
NA 서열
1918 H1N1 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 29)
1918 H1N1 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 30)
1957 H2N2 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 31)
1957 H2N2 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 32)
1968 H3N2 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 33)
1968 H3N2 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 34)
1977 H1N1 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 35)
1977 H1N1 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 36)
2007 H1N1 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 37)
2007 H1N1 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 38)
2009 H1N1 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 39)
2009 H1N1 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 40)
2015 H1N1 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 41)
2015 H1N1 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 42)
2017 H3N2 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 43)
2017 H3N2 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 44)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 45)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 46)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 47)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 48)
2015 H5N1 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 49)
2015 H5N1 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 50)
2017 H7N9 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 51)
2017 H7N9 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 52)
2013 H10N8 - NA 항원 아미노산 서열(서열 번호: 53)
2013 H10N8 - NA 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 54)
NP 서열
1918 H1N1 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 55)
1918 H1N1 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 56)
1957 H2N2 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 57)
1957 H2N2 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 58)
1968 H3N2 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 59)
1968 H3N2 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 60)
1977 H1N1 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 61)
1977 H1N1 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 62)
2007 H1N1 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 63)
2007 H1N1 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 64)
2009 H1N1 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 65)
2009 H1N1 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 66)
2015 H1N1 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 67)
2015 H1N1 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 68)
2017 H3N2 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 69)
2017 H3N2 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 70)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 71)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 72)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 73)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 74)
2015 H5N1 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 75)
2015 H5N1 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 76)
2017 H7N9 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 77)
2017 H7N9 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 78)
2013 H10N8 - NP 항원 아미노산 서열(서열 번호: 79)
2013 H10N8 - NP 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 80)
M2 서열
1918 H1N1 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 81)
1918 H1N1 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 82)
1957 H2N2 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 83)
1957 H2N2 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 84)
1968 H3N2 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 85)
1968 H3N2 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 86)
1977 H1N1 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 87)
1977 H1N1 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 88)
2007 H1N1 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 89)
2007 H1N1 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 90)
2009 H1N1 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 91)
2009 H1N1 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 92)
2015 H1N1 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 93)
2015 H1N1 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 94)
2017 H3N2 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호:95)
2017 H3N2 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 96)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 97)
2017 인플루엔자 B(Victoria 계통) - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 98)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 99)
2013 인플루엔자 B(Yamagata 계통) - GISAID에만 있는 서열 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 100)
2015 H5N1 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 101)
2015 H5N1 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 102)
2017 H7N9 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 103)
2017 H7N9 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 104)
2013 H10N8 - M2 이온 채널 항원 아미노산 서열(서열 번호: 105)
2013 H10N8 - M2 이온 채널 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 106)
M1 서열
M1 항원 아미노산 서열(서열 번호: 107)
M1 항원을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 최적화된 DNA 서열(서열 번호: 108)
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원, 및 출판물의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본 발명은 특정 구현예를 참조로 개시되었지만, 본 발명의 다른 구현예 및 변동이 기술분야에 숙련된 다른 사람들에 의해 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 고안될 수 있다는 것이 분명하다. 첨부된 청구범위는 모든 그러한 구현예 및 동등한 변동을 포함하는 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다.
<110> The Trustees of the University of Pennsylvania
Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Pardi, Norbert
Nachbagauer, Raffael
Palese, Peter
Weissman, Drew
Krammer, Florian
Garcia-Sastre, Adolfo
Freyn, Alec W
<120> Universal Influenza Vaccine Using Nucleoside-Modified mRNA
<130> 046483-6188-00WO
<150> US 63/002,682
<151> 2020-03-31
<160> 133
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - HA antigen Amino Acid sequence
<400> 1
Met Glu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Ala Ala Thr Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Ser Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Lys Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Glu
130 135 140
Thr Thr Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser Tyr Ala Gly Ala Ser Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Gly Ser Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Val His His Pro Pro Thr Gly Thr Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser Lys Tyr Asn
210 215 220
Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Ala Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Leu Asn Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asp Ala Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro His Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn
405 410 415
Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Arg Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asp Ala Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 2
<211> 1698
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 2
atggaggccc gcctgctggt gctgctgtgc gccttcgccg ccaccaacgc cgacaccatc 60
tgcatcggct accacgccaa caactccacc gacaccgtgg acaccgtgct ggagaagaac 120
gtgaccgtga cccactccgt gaacctgctg gaggactccc acaacggcaa gctgtgcaag 180
ctgaagggca tcgcccccct gcagctgggc aagtgcaaca tcgccggctg gctgctgggc 240
aaccccgagt gcgacctgct gctgaccgcc tcctcctggt cctacatcgt ggagacctcc 300
aactccgaga acggcacctg ctaccccggc gacttcatcg actacgagga gctgcgcgag 360
cagctgtcct ccgtgtcctc cttcgagaag ttcgagatct tccccaagac ctcctcctgg 420
cccaaccacg agaccaccaa gggcgtgacc gccgcctgct cctacgccgg cgcctcctcc 480
ttctaccgca acctgctgtg gctgaccaag aagggctcct cctaccccaa gctgtccaag 540
tcctacgtga acaacaaggg caaggaggtg ctggtgctgt ggggcgtgca ccaccccccc 600
accggcaccg accagcagtc cctgtaccag aacgccgacg cctacgtgtc cgtgggctcc 660
tccaagtaca accgccgctt cacccccgag atcgccgccc gccccaaggt gcgcgaccag 720
gccggccgca tgaactacta ctggaccctg ctggagcccg gcgacaccat caccttcgag 780
gccaccggca acctgatcgc cccctggtac gccttcgccc tgaaccgcgg ctccggctcc 840
ggcatcatca cctccgacgc ccccgtgcac gactgcaaca ccaagtgcca gaccccccac 900
ggcgccatca actcctccct gcccttccag aacatccacc ccgtgaccat cggcgagtgc 960
cccaagtacg tgcgctccac caagctgcgc atggccaccg gcctgcgcaa catcccctcc 1020
atccagtccc gcggcctgtt cggcgccatc gccggcttca tcgagggcgg ctggaccggc 1080
atgatcgacg gctggtacgg ctaccaccac cagaacgagc agggctccgg ctacgccgcc 1140
gaccagaagt ccacccagaa cgccatcgac ggcatcacca acaaggtgaa ctccgtgatc 1200
gagaagatga acacccagtt caccgccgtg ggcaaggagt tcaacaacct ggagcgccgc 1260
atcgagaacc tgaacaagaa ggtggacgac ggcttcctgg acatctggac ctacaacgcc 1320
gagctgctgg tgctgctgga gaacgagcgc accctggact tccacgactc caacgtgcgc 1380
aacctgtacg agaaggtgaa gtcccagctg aagaacaacg ccaaggagat cggcaacggc 1440
tgcttcgagt tctaccacaa gtgcgacgac gcctgcatgg agtccgtgcg caacggcacc 1500
tacgactacc ccaagtactc cgaggagtcc aagctgaacc gcgaggagat cgacggcgtg 1560
aagctggagt ccatgggcgt gtaccagatc ctggccatct actccaccgt ggcctcctcc 1620
ctggtgctgc tggtgtccct gggcgccatc tccttctgga tgtgctccaa cggctccctg 1680
cagtgccgca tctgcatc 1698
<210> 3
<211> 562
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - HA antigen Amino Acid sequence
<400> 3
Met Ala Ile Thr Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp
1 5 10 15
Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp
20 25 30
Thr Ile Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro
65 70 75 80
Glu Cys Asp Arg Phe Leu Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu
85 90 95
Lys Glu Asn Pro Arg Tyr Ser Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp
100 105 110
Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys
115 120 125
Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Gly Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly
130 135 140
Gly Ser Met Ala Cys Ala Val Ser Gly Lys Pro Ser Phe Phe Arg Asn
145 150 155 160
Met Val Trp Leu Thr Glu Lys Gly Gln Asn Tyr Pro Val Ala Lys Gly
165 170 175
Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val
180 185 190
His His Pro Asn Asp Glu Ala Glu Gln Arg Ala Leu Tyr Gln Lys Val
195 200 205
Gly Thr Tyr Val Ser Ala Ser Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr
210 215 220
Pro Glu Ile Ala Ala Arg Pro Lys Val Asn Gly Leu Gly Ser Arg Met
225 230 235 240
Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu
245 250 255
Ser Thr Gly Asn Leu Val Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys
260 265 270
Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys
275 280 285
Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro
290 295 300
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Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly
340 345 350
Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn
355 360 365
Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala
370 375 380
Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn
385 390 395 400
Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Ser Asn Leu Glu Lys Arg
405 410 415
Leu Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp
420 425 430
Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu
435 440 445
Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met
450 455 460
Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe
465 470 475 480
Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Asp Ser Val Lys Asn Gly Thr
485 490 495
Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu
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515 520 525
Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala
530 535 540
Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile
545 550 555 560
Cys Ile
<210> 4
<211> 1686
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 4
atggccatca cctacctgat cctgctgttc accgccgtgc gcggcgacca gatctgcatc 60
ggctaccacg ccaacaactc caccgagaag gtggacacca tcctggagcg caacgtgacc 120
gtgacccacg ccaaggacat cctggagaag acccacaacg gcaagctgtg caagctgaac 180
ggcatccccc ccctggagct gggcgactgc tccatcgccg gctggctgct gggcaacccc 240
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225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 12
<211> 1698
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2009 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 12
atgaaggcca tcctggtggt gctgctgtac accttcgcca ccgccaacgc cgacaccctg 60
tgcatcggct accacgccaa caactccacc gacaccgtgg acaccgtgct ggagaagaac 120
gtgaccgtga cccactccgt gaacctgctg gaggacaagc acaacggcaa gctgtgcaag 180
ctgcgcggcg tggcccccct gcacctgggc aagtgcaaca tcgccggctg gatcctgggc 240
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ttctacaaga acctgatctg gctggtgaag aagggcaact cctaccccaa gctgtccaag 540
tcctacatca acgacaaggg caaggaggtg ctggtgctgt ggggcatcca ccacccctcc 600
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gagaagatga acacccagtt caccgccgtg ggcaaggagt tcaaccacct ggagaagcgc 1260
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ctggtgctgg tggtgtccct gggcgccatc tccttctgga tgtgctccaa cggctccctg 1680
cagtgccgca tctgcatc 1698
<210> 13
<211> 574
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H1N1 - HA antigen Amino Acid sequence
<400> 13
Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val
1 5 10 15
Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu
165 170 175
Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Asn Gln Ser Tyr Ile Asn
180 185 190
Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser
195 200 205
Thr Thr Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val
210 215 220
Phe Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala
225 230 235 240
Thr Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp
245 250 255
Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn
260 265 270
Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Thr Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser
275 280 285
Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys
290 295 300
Gln Thr Pro Glu Gly Ala Ile Asn Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile
305 310 315 320
His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys
325 330 335
Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg
340 345 350
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly
355 360 365
Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser
370 375 380
Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Lys Ile
385 390 395 400
Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr
405 410 415
Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu
420 425 430
Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala
435 440 445
Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp
450 455 460
Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Asn Gln Leu Lys Asn
465 470 475 480
Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
485 490 495
Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro
500 505 510
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515 520 525
Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr
530 535 540
Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe
545 550 555 560
Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 570
<210> 14
<211> 1722
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 14
atggccatct ccggcgtgcc cgtgctgggc ttcttcatca tcgccgtgct gatgtccgcc 60
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<210> 15
<211> 566
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - HA antigen Amino Acid sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (262)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 15
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Cys Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
50 55 60
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
85 90 95
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100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala
130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Lys
145 150 155 160
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys
165 170 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asn Gln Ile
195 200 205
Ser Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
225 230 235 240
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Leu Ile Xaa Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
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Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
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370 375 380
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Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
435 440 445
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450 455 460
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Met Gly Ser
485 490 495
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
500 505 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
515 520 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
530 535 540
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
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Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210> 16
<211> 1698
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<220>
<221> misc_feature
<222> (784)..(786)
<223> any nucleotide
<400> 16
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acctacgacc acaacgtgta ccgcgacgag gccctgaaca accgcttcca gatcaagggc 1560
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ttcctgctgt gcgtggccct gctgggcttc atcatgtggg cctgccagaa gggcaacatc 1680
cgctgcaaca tctgcatc 1698
<210> 17
<211> 583
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - HA antigen Amino Acid
sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (210)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 17
Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Ser Ala Asp
1 5 10 15
Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys
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Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr
35 40 45
Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr
50 55 60
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val
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Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys Thr Gly Lys Ile Pro Ser Ala Arg Val
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Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile
100 105 110
Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu His Val Arg Leu Ser Thr His Asn Val Ile Asn Ala Glu Gly
130 135 140
Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Lys Ile Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn
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Ile Thr Asn Gly Asn Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro
165 170 175
Asp Lys Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Ile Glu Val Pro Tyr
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Val Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser
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Asp Xaa Glu Thr Gln Met Ala Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Lys Pro Gln
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Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser
405 410 415
Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu
420 425 430
Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg
435 440 445
Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn
450 455 460
Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg
465 470 475 480
Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly
485 490 495
Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Lys Ile
500 505 510
Ala Ala Gly Thr Phe Asp Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp
515 520 525
Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn
530 535 540
His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val
545 550 555 560
Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Val Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn
565 570 575
Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580
<210> 18
<211> 1749
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - Optimized DNA sequence
encoding the nucleic acid sequence encoding HA antigen
<220>
<221> misc_feature
<222> (628)..(630)
<223> any nucleotide
<400> 18
atgaaggcca tcatcgtgct gctgatggtg gtgacctcct ccgccgaccg catctgcacc 60
ggcatcacct cctccaactc cccccacgtg gtgaagaccg ccacccaggg cgaggtgaac 120
gtgaccggcg tgatccccct gaccaccacc cccaccaagt cccacttcgc caacctgaag 180
ggcaccgaga cccgcggcaa gctgtgcccc aagtgcctga actgcaccga cctggacgtg 240
gccctgggcc gccccaagtg caccggcaag atcccctccg cccgcgtgtc catcctgcac 300
gaggtgcgcc ccgtgacctc cggctgcttc cccatcatgc acgaccgcac caagatccgc 360
cagctgccca acctgctgcg cggctacgag cacgtgcgcc tgtccaccca caacgtgatc 420
aacgccgagg gcgcccccgg cggcccctac aagatcggca cctccggctc ctgccccaac 480
atcaccaacg gcaacggctt cttcgccacc atggcctggg ccgtgcccga caagaacaag 540
accgccacca accccctgac catcgaggtg ccctacgtgt gcaccgaggg cgaggaccag 600
atcaccgtgt ggggcttcca ctccgacnnn gagacccaga tggccaagct gtacggcgac 660
tccaagcccc agaagttcac ctcctccgcc aacggcgtga ccacccacta cgtgtcccag 720
atcggcggct tccccaacca gaccgaggac ggcggcctgc cccagtccgg ccgcatcgtg 780
gtggactaca tggtgcagaa gtccggcaag accggcacca tcacctacca gcgcggcatc 840
ctgctgcccc agaaggtgtg gtgcgcctcc ggccgctcca aggtgatcaa gggctccctg 900
cccctgatcg gcgaggccga ctgcctgcac gagaagtacg gcggcctgaa caagtccaag 960
ccctactaca ccggcgagca cgccaaggcc atcggcaact gccccatctg ggtgaagacc 1020
cccctgaagc tggccaacgg caccaagtac cgcccccccg ccaagctgct gaaggagcgc 1080
ggcttcttcg gcgccatcgc cggcttcctg gagggcggct gggagggcat gatcgccggc 1140
tggcacggct acacctccca cggcgcccac ggcgtggccg tggccgccga cctgaagtcc 1200
acccaggagg ccatcaacaa gatcaccaag aacctgaact ccctgtccga gctggaggtg 1260
aagaacctgc agcgcctgtc cggcgccatg gacgagctgc acaacgagat cctggagctg 1320
gacgagaagg tggacgacct gcgcgccgac accatctcct cccagatcga gctggccgtg 1380
ctgctgtcca acgagggcat catcaactcc gaggacgagc acctgctggc cctggagcgc 1440
aagctgaaga agatgctggg cccctccgcc gtggagatcg gcaacggctg cttcgagacc 1500
aagcacaagt gcaaccagac ctgcctggac aagatcgccg ccggcacctt cgacgccggc 1560
gagttctccc tgcccacctt cgactccctg aacatcaccg ccgcctccct gaacgacgac 1620
ggcctggaca accacaccat cctgctgtac tactccaccg ccgcctcctc cctggccgtg 1680
accctgatga tcgccatctt cgtggtgtac atggtgtccc gcgacaacgt gtcctgctcc 1740
atctgcctg 1749
<210> 19
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
HA antigen Amino Acid sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (213)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 19
Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp
1 5 10 15
Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys
20 25 30
Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr
35 40 45
Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg Thr
50 55 60
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val
65 70 75 80
Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile
100 105 110
Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu Lys Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn
145 150 155 160
Ala Thr Ser Lys Ile Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro
165 170 175
Lys Asp Asn Tyr Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro
180 185 190
Tyr Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His
195 200 205
Ser Asp Asn Lys Xaa Gln Met Lys Ser Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro
210 215 220
Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser
225 230 235 240
Gln Ile Gly Asp Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln
245 250 255
Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Met Gln Lys Pro Gly Lys Thr
260 265 270
Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Val Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp
275 280 285
Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile
290 295 300
Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Glu Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser
305 310 315 320
Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Lys His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro
325 330 335
Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg
340 345 350
Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala
355 360 365
Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly
370 375 380
Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys
385 390 395 400
Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu
405 410 415
Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp
420 425 430
Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu
435 440 445
Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser
450 455 460
Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu
465 470 475 480
Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn
485 490 495
Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg
500 505 510
Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe
515 520 525
Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp
530 535 540
Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala
545 550 555 560
Val Thr Leu Met Leu Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp
565 570 575
Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580
<210> 20
<211> 1752
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid sequence
encoding HA antigen
<220>
<221> misc_feature
<222> (637)..(639)
<223> any nucleotide
<400> 20
atgaaggcca tcatcgtgct gctgatggtg gtgacctcca acgccgaccg catctgcacc 60
ggcatcacct cctccaactc cccccacgtg gtgaagaccg ccacccaggg cgaggtgaac 120
gtgaccggcg tgatccccct gaccaccacc cccaccaagt cctacttcgc caacctgaag 180
ggcacccgca cccgcggcaa gctgtgcccc gactgcctga actgcaccga cctggacgtg 240
gccctgggcc gccccatgtg cgtgggcacc accccctccg ccaaggcctc catcctgcac 300
gaggtgcgcc ccgtgacctc cggctgcttc cccatcatgc acgaccgcac caagatccgc 360
cagctgccca acctgctgcg cggctacgag aagatccgcc tgtccaccca gaacgtgatc 420
gacgccgaga aggcccccgg cggcccctac cgcctgggca cctccggctc ctgccccaac 480
gccacctcca agatcggctt cttcgccacc atggcctggg ccgtgcccaa ggacaactac 540
aagaacgcca ccaaccccct gaccgtggag gtgccctaca tctgcaccga gggcgaggac 600
cagatcaccg tgtggggctt ccactccgac aacaagnnnc agatgaagtc cctgtacggc 660
gactccaacc cccagaagtt cacctcctcc gccaacggcg tgaccaccca ctacgtgtcc 720
cagatcggcg acttccccga ccagaccgag gacggcggcc tgccccagtc cggccgcatc 780
gtggtggact acatgatgca gaagcccggc aagaccggca ccatcgtgta ccagcgcggc 840
gtgctgctgc cccagaaggt gtggtgcgcc tccggccgct ccaaggtgat caagggctcc 900
ctgcccctga tcggcgaggc cgactgcctg cacgaggagt acggcggcct gaacaagtcc 960
aagccctact acaccggcaa gcacgccaag gccatcggca actgccccat ctgggtgaag 1020
acccccctga agctggccaa cggcaccaag taccgccccc ccgccaagct gctgaaggag 1080
cgcggcttct tcggcgccat cgccggcttc ctggagggcg gctgggaggg catgatcgcc 1140
ggctggcacg gctacacctc ccacggcgcc cacggcgtgg ccgtggccgc cgacctgaag 1200
tccacccagg aggccatcaa caagatcacc aagaacctga actccctgtc cgagctggag 1260
gtgaagaacc tgcagcgcct gtccggcgcc atggacgagc tgcacaacga gatcctggag 1320
ctggacgaga aggtggacga cctgcgcgcc gacaccatct cctcccagat cgagctggcc 1380
gtgctgctgt ccaacgaggg catcatcaac tccgaggacg agcacctgct ggccctggag 1440
cgcaagctga agaagatgct gggcccctcc gccgtggaca tcggcaacgg ctgcttcgag 1500
accaagcaca agtgcaacca gacctgcctg gaccgcatcg ccgccggcac cttcaacgcc 1560
ggcgagttct ccctgcccac cttcgactcc ctgaacatca ccgccgcctc cctgaacgac 1620
gacggcctgg acaaccacac catcctgctg tactactcca ccgccgcctc ctccctggcc 1680
gtgaccctga tgctggccat cttcatcgtg tacatggtgt cccgcgacaa cgtgtcctgc 1740
tccatctgcc tg 1752
<210> 21
<211> 567
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - HA antigen Amino Acid sequence
<400> 21
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Thr Ile Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Trp Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Lys Gly Gly Ser Ala Ala Cys Ser Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Thr Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Lys Asp Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Lys Ala Glu Gln Ile Thr Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Ile Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Ile Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Arg Ser Glu Val Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Arg Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Lys Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu
370 375 380
Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile
385 390 395 400
Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn
405 410 415
Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly
420 425 430
Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu
435 440 445
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
450 455 460
Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Lys Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser
485 490 495
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg
500 505 510
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Val
515 520 525
Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu
530 535 540
Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser
545 550 555 560
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 22
<211> 1701
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 22
atggagaaga tcgtgctgct gttcgccacc atctccctgg tgaagtccga ccacatctgc 60
atcggctacc acgccaacaa ctccaccgag caggtggaca ccatcatgga gaagaacgtg 120
accgtgaccc acgcccagga catcctggag aagacccaca acggcaagct gtgcgacctg 180
aacggcgtga agcccctgat cctgaaggac tgctccgtgg ccggctggct gctgggcaac 240
ccctggtgcg acgagttcat caacgtgccc gagtggtcct acatcgtgga gaaggccaac 300
cccgtgaacg gcctgtgcta ccccggcaac ttcaacgact acgaggagct gaagcacctg 360
ctgtcccgca tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ccaaggactc ctggtccgac 420
cacgaggcct ccaagggcgg ctccgccgcc tgctcctacc agggcaagtc ctccttcttc 480
cgcaacgtgg tgtggctgat caagaagaac gacacctacc ccaccatcaa gaaggactac 540
aacaacacca accgcgagga cctgctggtg ctgtggggca tccaccaccc caacgacaag 600
gccgagcaga tcaccctgta ccagaacccc accacctaca tctccatcgg cacctccacc 660
ctgaaccagc gcctggtgcc caagatcgcc acccgctcca agatcaacgg ccagtccggc 720
cgcatcgact tcttctggac catcctgaag cccaacgacg ccatccactt cgagtccaac 780
ggcaacttca tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga ctccaccatc 840
atgcgctccg aggtggagta cggcaactgc aacacccgct gccagacccc cgtgggcgcc 900
atcaactcct ccatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag 960
tacgtgaagt ccaacaagct ggtgctggcc accggcctgc gcaactcccc ccagcgcgag 1020
cgccgccgca agcgcggcct gttcggcgcc aaggccggct tcatcgaggg cggctggcag 1080
ggcatggtgg acggctggta cggctaccac cactccaacg agcagggctc cggctacgcc 1140
gccgacaagg agtccaccca gaaggccatc gacggcgtga ccaacaaggt gaactccatc 1200
atcgacaaga tgaacaccca gttcgaggcc gtgggccgcg agttcaacaa cctggagcgc 1260
cgcatcgaga acctgaacaa gaagatggag gacggcttcc tggacgtgtg gacctacaac 1320
gccgagctgc tggtgctgat ggagaacgag cgcaccctgg acttccacga ctccaacgtg 1380
aagaacctgt acgacaaggt gcgcctgcag ctgaaggaca acgccaagga gctgggcaac 1440
ggctgcttcg agttctacca caagtgcaac aacgagtgca tggagtccgt gcgcaacggc 1500
acctacgact acccccagta ctccgaggag gcccgcctga agcgcgagga gatctccggc 1560
gtgaagctgg agtccatcgg cgtgtaccag atcctgtcca tctactccac cgtggcctcc 1620
tccctggtgc tggccatcat gatggccggc ctgtccctgt ggatgtgctc caacggctcc 1680
ctgcagtgcc gcatctgcat c 1701
<210> 23
<211> 560
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - HA antigen Amino Acid sequence
<400> 23
Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr
20 25 30
Lys Val Asp Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr
35 40 45
Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn Ile Pro Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys
50 55 60
Arg Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly
65 70 75 80
Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile
85 90 95
Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp Phe Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn
100 105 110
Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys
115 120 125
Glu Ala Met Gly Phe Thr Tyr Asn Gly Ile Arg Thr Asn Gly Val Thr
130 135 140
Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Thr Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Ser Pro Ala Ile Ile Val Trp Gly Ile His
180 185 190
His Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn
195 200 205
Lys Leu Val Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro
210 215 220
Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Leu Ser Gly Arg Ile Asp
225 230 235 240
Phe His Trp Leu Ile Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys
260 265 270
Ser Met Gly Ile Gln Ser Gly Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly
275 280 285
Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln
290 295 300
Asn Ile Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln
305 310 315 320
Arg Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro
325 330 335
Lys Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly
340 345 350
Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala
355 360 365
Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile
370 375 380
Asp Gln Ile Ala Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Ala Lys Thr Asn Gln
385 390 395 400
Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile
405 410 415
Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser
420 425 430
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
435 440 445
Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln
450 455 460
Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe
465 470 475 480
His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr
485 490 495
Asp His Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile
500 505 510
Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe
515 520 525
Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Val Val Met Gly Leu
530 535 540
Val Phe Ile Cys Val Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys Thr Ile Cys Ile
545 550 555 560
<210> 24
<211> 1680
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 24
atgaacaccc agatcctggt gttcgccctg atcgccatca tccccaccaa cgccgacaag 60
atctgcctgg gccaccacgc cgtgtccaac ggcaccaagg tggacaccct gaccgagcgc 120
ggcgtggagg tggtgaacgc caccgagacc gtggagcgca ccaacatccc ccgcatctgc 180
tccaagggca agcgcaccgt ggacctgggc cagtgcggcc tgctgggcac catcaccggc 240
cccccccagt gcgaccagtt cctggagttc tccgccgacc tgatcatcga gcgccgcgag 300
ggctccgact tctgctaccc cggcaagttc gtgaacgagg aggccctgcg ccagatcctg 360
cgcgagtccg gcggcatcga caaggaggcc atgggcttca cctacaacgg catccgcacc 420
aacggcgtga cctccgcctg ccgccgctcc ggctcctcct tctacgccga gatgaagtgg 480
ctgctgtcca acaccgacaa cgccaccttc ccccagatga ccaagtccta caagaacacc 540
cgcaagtccc ccgccatcat cgtgtggggc atccaccact ccgtgtccac cgccgagcag 600
accaagctgt acggctccgg caacaagctg gtgaccgtgg gctcctccaa ctaccagcag 660
tccttcgtgc cctcccccgg cgcccgcccc caggtgaacg gcctgtccgg ccgcatcgac 720
ttccactggc tgatcctgaa ccccaacgac accgtgacct tctccttcaa cggcgccttc 780
atcgcccccg accgcgcctc cttcctgcgc ggcaagtcca tgggcatcca gtccggcgtg 840
caggtggacg ccaactgcga gggcgactgc taccactccg gcggcaccat catctccaac 900
ctgcccttcc agaacatcga ctcccgcgcc gtgggcaagt gcccccgcta cgtgaagcag 960
cgctccctgc tgctggccac cggcatgaag aacgtgcccg agatccccaa gggccgcggc 1020
ctgttcggcg ccatcgccgg cttcatcgag aacggctggg agggcctgat cgacggctgg 1080
tacggcttcc gccaccagaa cgcccagggc gagggcaccg ccgccgacta caagtccacc 1140
cagtccgcca tcgaccagat cgccggcaag ctgaaccgcc tgatcgccaa gaccaaccag 1200
cagttcgagc tgatcgacaa cgagttcaac gaggtggaga agcagatcgg caacgtgatc 1260
aactggaccc gcgactccat caccgaggtg tggtcctaca acgccgagct gctgatcgcc 1320
atggagaacc agcacaccat cgacctggcc gactccgaga tggacaagct gtacgagcgc 1380
gtgaagcgcc agctgcgcga gaacgccgag gaggacggca ccggctgctt cgagatcttc 1440
cacaagtgcg acgacgactg catggcctcc atccgcaaca acacctacga ccaccgcaag 1500
taccgcgagg aggccatgca gaaccgcatc cagatcgacc ccgtgaagct gtcctccggc 1560
tacaaggacg tgatcctgtg gttctccttc ggcgcctcct gcttcatcct gctggccgtg 1620
gtgatgggcc tggtgttcat ctgcgtgaag aacggcaaca tgcgctgcac catctgcatc 1680
1680
<210> 25
<211> 561
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - HA antigen Amino Acid sequence
<400> 25
Met Tyr Lys Ile Val Val Ile Ile Ala Leu Leu Gly Ala Val Lys Gly
1 5 10 15
Leu Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ala Asn Gly Thr Ile
20 25 30
Val Lys Thr Leu Thr Asn Glu Gln Glu Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu
35 40 45
Thr Val Glu Ser Thr Gly Ile Asn Arg Leu Cys Met Lys Gly Arg Lys
50 55 60
His Lys Asp Leu Gly Asn Cys His Pro Ile Gly Met Leu Ile Gly Thr
65 70 75 80
Pro Ala Cys Asp Leu His Leu Thr Gly Met Trp Asp Thr Leu Ile Glu
85 90 95
Arg Glu Asn Ala Ile Ala Tyr Cys Tyr Pro Gly Ala Thr Val Asn Val
100 105 110
Glu Ala Leu Arg Gln Lys Ile Met Glu Ser Gly Gly Ile Asn Lys Ile
115 120 125
Ser Thr Gly Phe Thr Tyr Gly Ser Ser Ile Asn Ser Ala Gly Thr Thr
130 135 140
Arg Ala Cys Met Arg Asn Gly Gly Asn Ser Phe Tyr Ala Glu Leu Lys
145 150 155 160
Trp Leu Val Ser Lys Ser Lys Gly Gln Asn Phe Pro Gln Thr Thr Asn
165 170 175
Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Thr Ala Glu His Leu Ile Met Trp Gly Ile
180 185 190
His His Pro Ser Ser Thr Gln Glu Lys Asn Asp Leu Tyr Gly Thr Gln
195 200 205
Ser Leu Ser Ile Ser Val Gly Ser Ser Thr Tyr Arg Asn Asn Phe Val
210 215 220
Pro Val Val Gly Ala Gly Pro Gln Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile
225 230 235 240
Asp Phe His Trp Thr Leu Val Gln Pro Gly Asp Asn Ile Thr Phe Ser
245 250 255
His Asn Gly Gly Leu Ile Ala Pro Ser Arg Val Ser Lys Leu Ile Gly
260 265 270
Arg Gly Leu Gly Ile Gln Ser Asp Ala Pro Ile Asp Asn Asn Cys Glu
275 280 285
Ser Lys Cys Phe Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asn Thr Arg Leu Pro Phe
290 295 300
Gln Asn Leu Ser Pro Arg Thr Val Gly Gln Cys Pro Lys Tyr Val Asn
305 310 315 320
Arg Arg Ser Leu Met Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Leu
325 330 335
Ile Gln Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Asn
340 345 350
Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn
355 360 365
Ala Gln Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ala Ala
370 375 380
Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Glu Lys Thr Asn
385 390 395 400
Thr Glu Phe Glu Ser Ile Glu Ser Glu Phe Ser Glu Ile Glu His Gln
405 410 415
Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Lys Asp Ser Ile Thr Asp Ile Trp
420 425 430
Thr Tyr Gln Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile
435 440 445
Asp Met Ala Asp Ser Glu Met Leu Asn Leu Tyr Glu Arg Val Arg Lys
450 455 460
Gln Leu Arg Gln Asn Ala Glu Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Ile
465 470 475 480
Tyr His Ala Cys Asp Asp Ser Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Asn Thr
485 490 495
Tyr Asp His Ser Gln Tyr Arg Glu Glu Ala Leu Leu Asn Arg Leu Asn
500 505 510
Ile Asn Pro Val Thr Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Ile Ile Leu Trp
515 520 525
Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Val Leu Leu Ala Val Val Met Gly
530 535 540
Leu Phe Phe Phe Cys Leu Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys Thr Ile Cys
545 550 555 560
Ile
<210> 26
<211> 1683
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 26
atgtacaaga tcgtggtgat catcgccctg ctgggcgccg tgaagggcct ggacaagatc 60
tgcctgggcc accacgccgt ggccaacggc accatcgtga agaccctgac caacgagcag 120
gaggaggtga ccaacgccac cgagaccgtg gagtccaccg gcatcaaccg cctgtgcatg 180
aagggccgca agcacaagga cctgggcaac tgccacccca tcggcatgct gatcggcacc 240
cccgcctgcg acctgcacct gaccggcatg tgggacaccc tgatcgagcg cgagaacgcc 300
atcgcctact gctaccccgg cgccaccgtg aacgtggagg ccctgcgcca gaagatcatg 360
gagtccggcg gcatcaacaa gatctccacc ggcttcacct acggctcctc catcaactcc 420
gccggcacca cccgcgcctg catgcgcaac ggcggcaact ccttctacgc cgagctgaag 480
tggctggtgt ccaagtccaa gggccagaac ttcccccaga ccaccaacac ctaccgcaac 540
accgacaccg ccgagcacct gatcatgtgg ggcatccacc acccctcctc cacccaggag 600
aagaacgacc tgtacggcac ccagtccctg tccatctccg tgggctcctc cacctaccgc 660
aacaacttcg tgcccgtggt gggcgccggc ccccaggtga acggccagtc cggccgcatc 720
gacttccact ggaccctggt gcagcccggc gacaacatca ccttctccca caacggcggc 780
ctgatcgccc cctcccgcgt gtccaagctg atcggccgcg gcctgggcat ccagtccgac 840
gcccccatcg acaacaactg cgagtccaag tgcttctggc gcggcggctc catcaacacc 900
cgcctgccct tccagaacct gtccccccgc accgtgggcc agtgccccaa gtacgtgaac 960
cgccgctccc tgatgctggc caccggcatg cgcaacgtgc ccgagctgat ccagggccgc 1020
ggcctgttcg gcgccatcgc cggcttcctg gagaacggct gggagggcat ggtggacggc 1080
tggtacggct tccgccacca gaacgcccag ggcaccggcc aggccgccga ctacaagtcc 1140
acccaggccg ccatcgacca gatcaccggc aagctgaacc gcctggtgga gaagaccaac 1200
accgagttcg agtccatcga gtccgagttc tccgagatcg agcaccagat cggcaacgtg 1260
atcaactgga ccaaggactc catcaccgac atctggacct accaggccga gctgctggtg 1320
gccatggaga accagcacac catcgacatg gccgactccg agatgctgaa cctgtacgag 1380
cgcgtgcgca agcagctgcg ccagaacgcc gaggaggacg gcaagggctg cttcgagatc 1440
taccacgcct gcgacgactc ctgcatggag tccatccgca acaacaccta cgaccactcc 1500
cagtaccgcg aggaggccct gctgaaccgc ctgaacatca accccgtgac cctgtcctcc 1560
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gtggtgatgg gcctgttctt cttctgcctg aagaacggca acatgcgctg caccatctgc 1680
atc 1683
<210> 27
<211> 268
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mini HA domain - HA antigen Amino Acid sequence
<400> 27
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala
130 135 140
Ile Gly Cys Glu Tyr Asn Lys Ser Glu Arg Cys Met Lys Gln Ile Glu
145 150 155 160
Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
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Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Glu Gly Arg
260 265
<210> 28
<211> 804
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mini HA domain - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding HA antigen
<400> 28
atgaaggtga agctgctggt gctgctgtgc accttcaccg ccacctacgc cgacaccatc 60
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tactccgagg agtccaagct gaaccgcgag aagatcgacg gcgtgaagct ggagtccatg 780
ggcgtgtacc agatcgaggg ccgc 804
<210> 29
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 29
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val
1 5 10 15
Val Gly Ile Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln Asn His Pro Glu Thr
35 40 45
Cys Asn Gln Ser Ile Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln
50 55 60
Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Val Val Ala Gly Gln Asp Ala
65 70 75 80
Thr Ser Val Ile Leu Thr Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Ser Gly
85 90 95
Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro Val Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp Leu Thr
180 185 190
Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225 230 235 240
Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Leu
245 250 255
Lys Ile Glu Lys Gly Lys Val Thr Lys Ser Ile Glu Leu Asn Ala Pro
260 265 270
Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Thr Gly Lys Val
275 280 285
Met Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
Ser Phe Asp Gln Asn Leu Asp Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Ile Lys Gly Phe Ser Phe Arg
340 345 350
Tyr Asp Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Ser Ser Arg
355 360 365
Ser Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp
370 375 380
Ser Ser Phe Ser Val Arg Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys Met Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Gln Pro Lys
420 425 430
Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Phe Ser Ile Asp Lys
465
<210> 30
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 30
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccatct gcatggtggt gggcatcatc 60
tccctgatcc tgcagatcgg caacatcatc tccatctggg tgtcccactc catccagacc 120
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tccaaggaca acggcatccg catcggctcc aagggcgacg tgttcgtgat ccgcgagccc 360
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<210> 31
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 31
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Val Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln His Glu Cys Asp Ser Pro Ala Ser Asn
35 40 45
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50 55 60
Ile Val Tyr Leu Asn Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys
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Val Val Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly
85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Gly Lys
115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asp Asn Lys His
130 135 140
Ser Asn Asp Thr Ile His Asp Arg Ile Pro His Arg Thr Leu Leu Met
145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Arg Gln Val Cys Val
165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys Val Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asp
195 200 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Gln Asn Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe
245 250 255
Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Asp Val Arg
275 280 285
Cys Ile Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Asp
290 295 300
Ile Asn Met Glu Asp Tyr Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
305 310 315 320
Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Arg Ser Ser Asn Ser Asn
325 330 335
Cys Arg Asn Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys Gly Trp
340 345 350
Ala Phe Asp Asn Gly Asp Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Asp Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Gly Gly Trp Ser
370 375 380
Thr Pro Asn Ser Lys Ser Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Ser
385 390 395 400
Asn Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser
405 410 415
Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Gln Gln
420 425 430
Glu Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly
435 440 445
Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile
450 455 460
Asn Phe Met Pro Ile
465
<210> 32
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 32
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccgtgt ccctgatcat cgccaccgtg 60
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atgaccgacg gctccgcctc cggccgcgcc gacacccgca tcctgttcat cgaggagggc 780
aagatcgtgc acatctcccc cctgtccggc tccgcccagc acgtggagga gtgctcctgc 840
tacccccgct accccgacgt gcgctgcatc tgccgcgaca actggaaggg ctccaaccgc 900
cccgtgatcg acatcaacat ggaggactac tccatcgact cctcctacgt gtgctccggc 960
ctggtgggcg acaccccccg caacgacgac cgctcctcca actccaactg ccgcaacccc 1020
aacaacgagc gcggcaaccc cggcgtgaag ggctgggcct tcgacaacgg cgacgacgtg 1080
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ggcggctggt ccacccccaa ctccaagtcc cagatcaacc gccaggtgat cgtggactcc 1200
aacaactggt ccggctactc cggcatcttc tccgtggagg gcaagtcctg catcaaccgc 1260
tgcttctacg tggagctgat ccgcggccgc cagcaggaga cccgcgtgtg gtggacctcc 1320
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ggcgccaaca tcaacttcat gcccatc 1407
<210> 33
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1968 H3N2 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 33
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Val Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Cys Asp Ser Pro Ala Ser Asn
35 40 45
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50 55 60
Ile Val Tyr Leu Asn Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
Val Val Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly
85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp His Gly Lys
115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asp Asn Lys His
130 135 140
Ser Asn Asp Thr Ile His Asp Arg Ile Pro His Arg Thr Leu Leu Met
145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Arg Gln Val Cys Ile
165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asp
195 200 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Gln Asn Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe
245 250 255
Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg
275 280 285
Cys Ile Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Val Asp
290 295 300
Ile Asn Met Glu Asp Tyr Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
305 310 315 320
Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Arg Ser Ser Asn Ser Asn
325 330 335
Cys Arg Asn Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Gln Gly Val Lys Gly Trp
340 345 350
Ala Phe Asp Asn Gly Asp Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Asp Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Gly Gly Trp Ser
370 375 380
Thr Pro Asn Ser Lys Ser Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Ser
385 390 395 400
Asp Asn Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser
405 410 415
Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Gln
420 425 430
Glu Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly
435 440 445
Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile
450 455 460
Asn Phe Met Pro Ile
465
<210> 34
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1968 H3N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 34
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccgtgt ccctgaccat cgccaccgtg 60
tgcttcctga tgcagatcgc catcctggtg accaccgtga ccctgcactt caagcagtac 120
gagtgcgact cccccgcctc caaccaggtg atgccctgcg agcccatcat catcgagcgc 180
aacatcaccg agatcgtgta cctgaacaac accaccatcg agaaggagat ctgccccaag 240
gtggtggagt accgcaactg gtccaagccc cagtgccaga tcaccggctt cgcccccttc 300
tccaaggaca actccatccg cctgtccgcc ggcggcgaca tctgggtgac ccgcgagccc 360
tacgtgtcct gcgaccacgg caagtgctac cagttcgccc tgggccaggg caccaccctg 420
gacaacaagc actccaacga caccatccac gaccgcatcc cccaccgcac cctgctgatg 480
aacgagctgg gcgtgccctt ccacctgggc acccgccagg tgtgcatcgc ctggtcctcc 540
tcctcctgcc acgacggcaa ggcctggctg cacgtgtgca tcaccggcga cgacaagaac 600
gccaccgcct ccttcatcta cgacggccgc ctggtggact ccatcggctc ctggtcccag 660
aacatcctgc gcacccagga gtccgagtgc gtgtgcatca acggcacctg caccgtggtg 720
atgaccgacg gctccgcctc cggccgcgcc gacacccgca tcctgttcat cgaggagggc 780
aagatcgtgc acatctcccc cctgtccggc tccgcccagc acgtggagga gtgctcctgc 840
tacccccgct accccggcgt gcgctgcatc tgccgcgaca actggaaggg ctccaaccgc 900
cccgtggtgg acatcaacat ggaggactac tccatcgact cctcctacgt gtgctccggc 960
ctggtgggcg acaccccccg caacgacgac cgctcctcca actccaactg ccgcaacccc 1020
aacaacgagc gcggcaacca gggcgtgaag ggctgggcct tcgacaacgg cgacgacgtg 1080
tggatgggcc gcaccatctc caaggacctg cgctccggct acgagacctt caaggtgatc 1140
ggcggctggt ccacccccaa ctccaagtcc cagatcaacc gccaggtgat cgtggactcc 1200
gacaaccgct ccggctactc cggcatcttc tccgtggagg gcaagtcctg catcaaccgc 1260
tgcttctacg tggagctgat ccgcggccgc aagcaggaga cccgcgtgtg gtggacctcc 1320
aactccatcg tggtgttctg cggcacctcc ggcacctacg gcaccggctc ctggcccgac 1380
ggcgccaaca tcaacttcat gcccatc 1407
<210> 35
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1977 H1N1 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 35
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Ala
1 5 10 15
Ile Gly Ile Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Arg Ile Ile Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn Gln
50 55 60
Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Val Val Ala Gly Lys Asp Thr
65 70 75 80
Thr Ser Met Thr Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg Gly
85 90 95
Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Ala Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro Ile Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp Leu Thr
180 185 190
Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asp Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly Ile Ile Thr Glu Thr Ile Lys Ser Trp Arg Lys Gln Ile Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225 230 235 240
Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Pro Ala Ser Tyr Arg Ile Phe
245 250 255
Lys Ile Glu Lys Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ile Glu Leu Asp Ala Pro
260 265 270
Asn Ser His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Thr Gly Thr Val
275 280 285
Met Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Asp Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Lys Asp Gly Lys Gly Ser Cys Asp
325 330 335
Pro Val Asn Val Asp Gly Ala Asp Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Arg
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Asn Ser Ser Arg
355 360 365
Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Asp Thr Asp
370 375 380
Ser Asn Phe Leu Val Lys Gln Asp Val Val Ala Met Thr Asp Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys Met Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Arg
420 425 430
Glu Lys Thr Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly
435 440 445
Val Asn Ser Asp Thr Val Asn Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu
450 455 460
Pro Phe Thr Ile Asp Lys
465 470
<210> 36
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1977 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 36
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccatct gcatggccat cggcatcatc 60
tccctgatcc tgcagatcgg caacatcatc tccatctggg tgtcccactc catccagacc 120
ggctcccaga accacaccgg catctgcaac cagcgcatca tcacctacga gaactccacc 180
tgggtgaacc agacctacgt gaacatctcc aacaccaacg tggtggccgg caaggacacc 240
acctccatga ccctggccgg caactcctcc ctgtgcccca tccgcggctg ggccatctac 300
tccaaggaca actccatccg catcggctcc aagggcgacg tgttcgtgat ccgcgagccc 360
ttcatctcct gctcccacct ggagtgccgc accttcttcc tgacccaggg cgccctgctg 420
aacgacaagc actccaacgg caccgtgaag gaccgctccc cctaccgcgc cctgatgtcc 480
tgccccatcg gcgaggcccc ctccccctac aactcccgct tcgagtccgt ggcctggtcc 540
gcctccgcct gccacgacgg catgggctgg ctgaccatcg gcatctccgg ccccgacgac 600
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg agaccatcaa gtcctggcgc 660
aagcagatcc tgcgcaccca ggagtccgag tgcgtgtgcg tgaacggctc ctgcttcacc 720
atcatgaccg acggcccctc cgacggcccc gcctcctacc gcatcttcaa gatcgagaag 780
ggcaagatca ccaagtccat cgagctggac gcccccaact cccactacga ggagtgctcc 840
tgctaccccg acaccggcac cgtgatgtgc gtgtgccgcg acaactggca cggctccaac 900
cgcccctggg tgtccttcaa ccagaacctg gactaccaga tcggctacat ctgctccggc 960
gtgttcggcg acaacccccg ccccaaggac ggcaagggct cctgcgaccc cgtgaacgtg 1020
gacggcgccg acggcgtgaa gggcttctcc taccgctacg gcaacggcgt gtggatcggc 1080
cgcaccaagt ccaactcctc ccgcaagggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1140
accgacaccg actccaactt cctggtgaag caggacgtgg tggccatgac cgactggtcc 1200
ggctactccg gctccttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catgcgcccc 1260
tgcttctggg tggagctgat ccgcggccgc ccccgcgaga agaccaccat ctggacctcc 1320
ggctcctcca tctccttctg cggcgtgaac tccgacaccg tgaactggtc ctggcccgac 1380
ggcgccgagc tgcccttcac catcgacaag 1410
<210> 37
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2007 H1N1 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 37
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Ser Ile Ala
1 5 10 15
Ile Gly Ile Ile Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ala Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn Asn Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Arg Ile Ile Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn His
50 55 60
Thr Tyr Val Asn Ile Asn Asn Thr Asn Val Val Ala Gly Glu Asp Lys
65 70 75 80
Thr Ser Val Thr Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Ser Ile Ser Gly
85 90 95
Trp Ala Ile Tyr Thr Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Ala Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro Leu Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Lys Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp Leu Thr
180 185 190
Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly Ile Ile Thr Gly Thr Ile Lys Ser Trp Lys Lys Gln Ile Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Met Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225 230 235 240
Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Lys Ala Ala Ser Tyr Lys Ile Phe
245 250 255
Lys Ile Glu Lys Gly Lys Val Thr Lys Ser Ile Glu Leu Asn Ala Pro
260 265 270
Asn Phe His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Thr Gly Ile Val
275 280 285
Met Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Asp Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Glu Asp Gly Glu Gly Ser Cys Asn
325 330 335
Pro Val Thr Val Asp Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Lys
340 345 350
Tyr Asp Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Asn Arg Leu Arg
355 360 365
Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Asn Thr Asp
370 375 380
Ser Asp Phe Ser Val Lys Gln Asp Val Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Val Arg Gly Leu Pro Arg
420 425 430
Glu Asn Thr Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly
435 440 445
Val Asn Ser Asp Thr Ala Asn Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu
450 455 460
Pro Phe Thr Ile Asp Lys
465 470
<210> 38
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2007 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 38
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccatct ccatcgccat cggcatcatc 60
tccctgatgc tgcagatcgg caacatcatc tccatctggg cctcccactc catccagacc 120
ggctcccaga acaacaccgg catctgcaac cagcgcatca tcacctacga gaactccacc 180
tgggtgaacc acacctacgt gaacatcaac aacaccaacg tggtggccgg cgaggacaag 240
acctccgtga ccctggccgg caactcctcc ctgtgctcca tctccggctg ggccatctac 300
accaaggaca actccatccg catcggctcc aagggcgacg tgttcgtgat ccgcgagccc 360
ttcatctcct gctcccacct ggagtgccgc accttcttcc tgacccaggg cgccctgctg 420
aacgacaagc actccaacgg caccgtgaag gaccgctccc cctaccgcgc cctgatgtcc 480
tgccccctgg gcgaggcccc ctccccctac aactccaagt tcgagtccgt ggcctggtcc 540
gcctccgcct gccacgacgg catgggctgg ctgaccatcg gcatctccgg ccccgacaac 600
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg gcaccatcaa gtcctggaag 660
aagcagatcc tgcgcaccca ggagtccgag tgcgtgtgca tgaacggctc ctgcttcacc 720
atcatgaccg acggcccctc caacaaggcc gcctcctaca agatcttcaa gatcgagaag 780
ggcaaggtga ccaagtccat cgagctgaac gcccccaact tccactacga ggagtgctcc 840
tgctaccccg acaccggcat cgtgatgtgc gtgtgccgcg acaactggca cggctccaac 900
cgcccctggg tgtccttcaa ccagaacctg gactaccaga tcggctacat ctgctccggc 960
gtgttcggcg acaacccccg ccccgaggac ggcgagggct cctgcaaccc cgtgaccgtg 1020
gacggcgcca acggcgtgaa gggcttctcc tacaagtacg acaacggcgt gtggatcggc 1080
cgcaccaagt ccaaccgcct gcgcaagggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1140
accaacaccg actccgactt ctccgtgaag caggacgtgg tggccatcac cgactggtcc 1200
ggctactccg gctccttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catccgcccc 1260
tgcttctggg tggagctggt gcgcggcctg ccccgcgaga acaccaccat ctggacctcc 1320
ggctcctcca tctccttctg cggcgtgaac tccgacaccg ccaactggtc ctggcccgac 1380
ggcgccgagc tgcccttcac catcgacaag 1410
<210> 39
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2009 H1N1 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 39
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Cys Met Thr
1 5 10 15
Ile Gly Met Ala Asn Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Leu Gly Asn Gln Asn Gln Ile Glu Thr
35 40 45
Cys Asn Gln Ser Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln
50 55 60
Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gln Ser Val
65 70 75 80
Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly
85 90 95
Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr
180 185 190
Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225 230 235 240
Val Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe
245 250 255
Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Val Lys Ser Val Glu Met Asn Ala Pro
260 265 270
Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile
275 280 285
Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
305 310 315 320
Ile Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg
355 360 365
Asn Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
370 375 380
Asn Asn Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Phe Thr Ile Asp Lys
465
<210> 40
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2009 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 40
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccgtgt gcatgaccat cggcatggcc 60
aacctgatcc tgcagatcgg caacatcatc tccatctgga tctcccactc catccagctg 120
ggcaaccaga accagatcga gacctgcaac cagtccgtga tcacctacga gaacaacacc 180
tgggtgaacc agacctacgt gaacatctcc aacaccaact tcgccgccgg ccagtccgtg 240
gtgtccgtga agctggccgg caactcctcc ctgtgccccg tgtccggctg ggccatctac 300
tccaaggaca actccgtgcg catcggctcc aagggcgacg tgttcgtgat ccgcgagccc 360
ttcatctcct gctcccccct ggagtgccgc accttcttcc tgacccaggg cgccctgctg 420
aacgacaagc actccaacgg caccatcaag gaccgctccc cctaccgcac cctgatgtcc 480
tgccccatcg gcgaggtgcc ctccccctac aactcccgct tcgagtccgt ggcctggtcc 540
gcctccgcct gccacgacgg catcaactgg ctgaccatcg gcatctccgg ccccgacaac 600
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg acaccatcaa gtcctggcgc 660
aacaacatcc tgcgcaccca ggagtccgag tgcgcctgcg tgaacggctc ctgcttcacc 720
gtgatgaccg acggcccctc caacggccag gcctcctaca agatcttccg catcgagaag 780
ggcaagatcg tgaagtccgt ggagatgaac gcccccaact accactacga ggagtgctcc 840
tgctaccccg actcctccga gatcacctgc gtgtgccgcg acaactggca cggctccaac 900
cgcccctggg tgtccttcaa ccagaacctg gagtaccaga tcggctacat ctgctccggc 960
atcttcggcg acaacccccg ccccaacgac aagaccggct cctgcggccc cgtgtcctcc 1020
aacggcgcca acggcgtgaa gggcttctcc ttcaagtacg gcaacggcgt gtggatcggc 1080
cgcaccaagt ccatctcctc ccgcaacggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1140
accggcaccg acaacaactt ctccatcaag caggacatcg tgggcatcaa cgagtggtcc 1200
ggctactccg gctccttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catccgcccc 1260
tgcttctggg tggagctgat ccgcggccgc cccaaggaga acaccatctg gacctccggc 1320
tcctccatct ccttctgcgg cgtgaactcc gacaccgtgg gctggtcctg gcccgacggc 1380
gccgagctgc ccttcaccat cgacaag 1407
<210> 41
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H1N1 - NA antigen Amino Acid sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 41
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Thr
1 5 10 15
Ile Gly Met Ala Asn Leu Ile Leu Gln Ile Gly Xaa Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Val Ser His Ser Ile Gln Ile Gly Asn Gln Ser Gln Ile Glu Thr
35 40 45
Cys Asn Gln Ser Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln
50 55 60
Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gln Ser Val
65 70 75 80
Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly
85 90 95
Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr
180 185 190
Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225 230 235 240
Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe
245 250 255
Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro
260 265 270
Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile
275 280 285
Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg
355 360 365
Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
370 375 380
Asn Lys Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu
420 425 430
Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Phe Thr Ile Asp Lys
465
<210> 42
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(84)
<223> any nucleotide
<400> 42
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccatct gcatgaccat cggcatggcc 60
aacctgatcc tgcagatcgg cnnnatcatc tccatctggg tgtcccactc catccagatc 120
ggcaaccagt cccagatcga gacctgcaac cagtccgtga tcacctacga gaacaacacc 180
tgggtgaacc agacctacgt gaacatctcc aacaccaact tcgccgccgg ccagtccgtg 240
gtgtccgtga agctggccgg caactcctcc ctgtgccccg tgtccggctg ggccatctac 300
tccaaggaca actccgtgcg catcggctcc aagggcgacg tgttcgtgat ccgcgagccc 360
ttcatctcct gctcccccct ggagtgccgc accttcttcc tgacccaggg cgccctgctg 420
aacgacaagc actccaacgg caccatcaag gaccgctccc cctaccgcac cctgatgtcc 480
tgccccatcg gcgaggtgcc ctccccctac aactcccgct tcgagtccgt ggcctggtcc 540
gcctccgcct gccacgacgg catcaactgg ctgaccatcg gcatctccgg ccccgactcc 600
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg acaccatcaa gtcctggcgc 660
aacaacatcc tgcgcaccca ggagtccgag tgcgcctgcg tgaacggctc ctgcttcacc 720
atcatgaccg acggcccctc cgacggccag gcctcctaca agatcttccg catcgagaag 780
ggcaagatca tcaagtccgt ggagatgaag gcccccaact accactacga ggagtgctcc 840
tgctaccccg actcctccga gatcacctgc gtgtgccgcg acaactggca cggctccaac 900
cgcccctggg tgtccttcaa ccagaacctg gagtaccaga tgggctacat ctgctccggc 960
gtgttcggcg acaacccccg ccccaacgac aagaccggct cctgcggccc cgtgtcctcc 1020
aacggcgcca acggcgtgaa gggcttctcc ttcaagtacg gcaacggcgt gtggatcggc 1080
cgcaccaagt ccatctcctc ccgcaagggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1140
accggcaccg acaacaagtt ctccatcaag caggacatcg tgggcatcaa cgagtggtcc 1200
ggctactccg gctccttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catccgcccc 1260
tgcttctggg tggagctgat ccgcggccgc cccgaggaga acaccatctg gacctccggc 1320
tcctccatct ccttctgcgg cgtgaactcc gacaccgtgg gctggtcctg gcccgacggc 1380
gccgagctgc ccttcaccat cgacaag 1407
<210> 43
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 43
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ile Cys Phe Phe Met Gln Ile Ala Ile Leu Ile Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn
35 40 45
Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu
50 55 60
Ile Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Arg Glu Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
Pro Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gly Ile Thr Gly
85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys
115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Ile Asn Asn Val His
130 135 140
Ser Asn Asn Thr Ala Arg Asp Arg Thr Pro His Arg Thr Leu Leu Met
145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile
165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn
195 200 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser Val Val Ser Trp Ser Lys Asp Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Asn Ala Thr Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe
245 250 255
Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg
275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp
290 295 300
Ile Asn Ile Lys Asp His Ser Ile Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
305 310 315 320
Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Thr Asp Ser Ser Ser Ser Ser His
325 330 335
Cys Leu Asn Pro Asn Asn Glu Lys Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp
340 345 350
Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Asn Glu
355 360 365
Thr Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Val Glu Gly Trp Ser
370 375 380
Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Arg
385 390 395 400
Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser
405 410 415
Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Glu
420 425 430
Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly
435 440 445
Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp Leu
450 455 460
Asn Leu Met His Ile
465
<210> 44
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 44
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccgtgt ccctgaccat ctccaccatc 60
tgcttcttca tgcagatcgc catcctgatc accaccgtga ccctgcactt caagcagtac 120
gagttcaact ccccccccaa caaccaggtg atgctgtgcg agcccaccat catcgagcgc 180
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cccgccgagt accgcaactg gtccaagccc cagtgcggca tcaccggctt cgcccccttc 300
tccaaggaca actccatccg cctgtccgcc ggcggcgaca tctgggtgac ccgcgagccc 360
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aacaacgtgc actccaacaa caccgcccgc gaccgcaccc cccaccgcac cctgctgatg 480
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atgaccgacg gcaacgccac cggcaaggcc gacaccaaga tcctgttcat cgaggagggc 780
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tacccccgct accccggcgt gcgctgcgtg tgccgcgaca actggaaggg ctccaaccgc 900
cccatcgtgg acatcaacat caaggaccac tccatcgtgt cctcctacgt gtgctccggc 960
ctggtgggcg acaccccccg caagaccgac tcctcctcct cctcccactg cctgaacccc 1020
aacaacgaga agggcggcca cggcgtgaag ggctgggcct tcgacgacgg caacgacgtg 1080
tggatgggcc gcaccatcaa cgagacctcc cgcctgggct acgagacctt caaggtggtg 1140
gagggctggt ccaaccccaa gtccaagctg cagatcaacc gccaggtgat cgtggaccgc 1200
ggcgaccgct ccggctactc cggcatcttc tccgtggagg gcaagtcctg catcaaccgc 1260
tgcttctacg tggagctgat ccgcggccgc aaggaggaga ccgaggtgct gtggacctcc 1320
aactccatcg tggtgttctg cggcacctcc ggcacctacg gcaccggctc ctggcccgac 1380
ggcgccgacc tgaacctgat gcacatc 1407
<210> 45
<211> 466
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - NA antigen Amino Acid
sequence
<400> 45
Met Leu Pro Ser Thr Ile Gln Thr Leu Thr Leu Phe Leu Thr Ser Gly
1 5 10 15
Gly Val Leu Leu Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Asp Ile Leu Leu Lys Phe Ser Pro Thr Glu Ile Thr Ala Pro
35 40 45
Thr Met Pro Leu Asp Cys Ala Asn Ala Ser Asn Val Gln Ala Val Asn
50 55 60
Arg Ser Ala Thr Lys Gly Val Thr Leu Leu Leu Pro Glu Pro Glu Trp
65 70 75 80
Thr Tyr Pro Arg Leu Ser Cys Pro Gly Ser Thr Phe Gln Lys Ala Leu
85 90 95
Leu Ile Ser Pro His Arg Phe Gly Glu Thr Lys Gly Asn Ser Ala Pro
100 105 110
Leu Ile Ile Arg Glu Pro Phe Val Ala Cys Gly Pro Asn Glu Cys Lys
115 120 125
His Phe Ala Leu Thr His Tyr Ala Ala Gln Pro Gly Gly Tyr Tyr Asn
130 135 140
Gly Thr Arg Gly Asp Arg Asn Lys Leu Arg His Leu Ile Ser Val Lys
145 150 155 160
Leu Gly Lys Ile Pro Thr Val Glu Asn Ser Ile Phe His Met Ala Ala
165 170 175
Trp Ser Gly Ser Ala Cys His Asp Gly Lys Glu Trp Thr Tyr Ile Gly
180 185 190
Val Asp Gly Pro Asp Asn Asn Ala Leu Leu Lys Val Lys Tyr Gly Glu
195 200 205
Ala Tyr Thr Asp Thr Tyr His Ser Tyr Ala Asn Asn Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Ala Cys Asn Cys Ile Gly Gly Asn Cys Tyr Leu Met Ile
225 230 235 240
Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Val Ser Glu Cys Arg Phe Leu Lys Ile
245 250 255
Arg Glu Gly Arg Ile Ile Lys Glu Ile Phe Pro Thr Gly Arg Val Lys
260 265 270
His Thr Glu Glu Cys Thr Cys Gly Phe Ala Ser Asn Lys Thr Ile Glu
275 280 285
Cys Ala Cys Arg Asp Asn Arg Tyr Thr Ala Lys Arg Pro Phe Val Lys
290 295 300
Leu Asn Val Glu Thr Asp Thr Ala Glu Ile Arg Leu Met Cys Thr Asp
305 310 315 320
Thr Tyr Leu Asp Thr Pro Arg Pro Asn Asp Gly Ser Ile Thr Gly Pro
325 330 335
Cys Glu Ser Asp Gly Asp Lys Gly Ser Gly Gly Ile Lys Gly Gly Phe
340 345 350
Val His Gln Arg Met Lys Ser Lys Ile Gly Arg Trp Tyr Ser Arg Thr
355 360 365
Met Ser Gln Thr Glu Arg Met Gly Met Gly Leu Tyr Val Lys Tyr Gly
370 375 380
Gly Asp Pro Trp Ala Asp Ser Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Val Met
385 390 395 400
Val Ser Met Lys Glu Pro Gly Trp Tyr Ser Phe Gly Phe Glu Ile Lys
405 410 415
Asp Lys Lys Cys Asp Val Pro Cys Ile Gly Ile Glu Met Val His Asp
420 425 430
Gly Gly Lys Glu Thr Trp His Ser Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Cys Leu
435 440 445
Met Gly Ser Gly Gln Leu Leu Trp Asp Thr Val Thr Gly Val Asp Met
450 455 460
Ala Leu
465
<210> 46
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - Optimized DNA sequence
encoding the nucleic acid sequence encoding NA antigen
<400> 46
atgctgccct ccaccatcca gaccctgacc ctgttcctga cctccggcgg cgtgctgctg 60
tccctgtacg tgtccgcctc cctgtcctac ctgctgtact ccgacatcct gctgaagttc 120
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caggccgtga accgctccgc caccaagggc gtgaccctgc tgctgcccga gcccgagtgg 240
acctaccccc gcctgtcctg ccccggctcc accttccaga aggccctgct gatctccccc 300
caccgcttcg gcgagaccaa gggcaactcc gcccccctga tcatccgcga gcccttcgtg 360
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ggcgacaagg gctccggcgg catcaagggc ggcttcgtgc accagcgcat gaagtccaag 1080
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gccgccaccg ccatctactg cctgatgggc tccggccagc tgctgtggga caccgtgacc 1380
ggcgtggaca tggccctg 1398
<210> 47
<211> 466
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
NA antigen Amino Acid sequence
<400> 47
Met Leu Pro Ser Thr Ile Gln Thr Leu Thr Leu Phe Leu Thr Ser Gly
1 5 10 15
Gly Val Leu Leu Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Asp Ile Leu Leu Lys Phe Ser Arg Thr Glu Val Thr Ala Pro
35 40 45
Ile Met Pro Leu Asp Cys Ala Asn Ala Ser Asn Val Gln Ala Val Asn
50 55 60
Arg Ser Ala Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Leu Pro Glu Pro Glu Trp
65 70 75 80
Thr Tyr Pro Arg Leu Ser Cys Pro Gly Ser Thr Phe Gln Lys Ala Leu
85 90 95
Leu Ile Ser Pro His Arg Phe Gly Glu Thr Lys Gly Asn Ser Ala Pro
100 105 110
Leu Ile Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ala Cys Gly Pro Lys Glu Cys Lys
115 120 125
His Phe Ala Leu Thr His Tyr Ala Ala Gln Pro Gly Gly Tyr Tyr Asn
130 135 140
Gly Thr Arg Glu Asp Arg Asn Lys Leu Arg His Leu Ile Ser Val Lys
145 150 155 160
Leu Gly Lys Ile Pro Thr Val Glu Asn Ser Ile Phe His Met Ala Ala
165 170 175
Trp Ser Gly Ser Ala Cys His Asp Gly Arg Glu Trp Thr Tyr Ile Gly
180 185 190
Val Asp Gly Pro Asp Ser Asn Ala Leu Leu Lys Ile Lys Tyr Gly Glu
195 200 205
Ala Tyr Thr Asp Thr Tyr His Ser Tyr Ala Lys Asn Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Ala Cys Asn Cys Ile Gly Gly Asp Cys Tyr Leu Met Ile
225 230 235 240
Thr Asp Gly Pro Ala Ser Gly Ile Ser Glu Cys Arg Phe Leu Lys Ile
245 250 255
Arg Glu Gly Arg Ile Ile Lys Glu Ile Phe Pro Thr Gly Arg Val Lys
260 265 270
His Thr Glu Glu Cys Thr Cys Gly Phe Ala Ser Asn Lys Thr Ile Glu
275 280 285
Cys Ala Cys Arg Asp Asn Ser Tyr Thr Ala Lys Arg Pro Phe Val Lys
290 295 300
Leu Asn Val Glu Thr Asp Thr Ala Glu Ile Arg Leu Met Cys Thr Lys
305 310 315 320
Thr Tyr Leu Asp Thr Pro Arg Pro Asn Asp Gly Ser Ile Thr Gly Pro
325 330 335
Cys Glu Ser Asp Gly Asp Glu Gly Ser Gly Gly Ile Lys Gly Gly Phe
340 345 350
Val His Gln Arg Met Ala Ser Lys Ile Gly Arg Trp Tyr Ser Arg Thr
355 360 365
Met Ser Lys Thr Lys Arg Met Gly Met Gly Leu Tyr Val Lys Tyr Asp
370 375 380
Gly Asp Pro Trp Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Leu Ser Gly Val Met
385 390 395 400
Val Ser Met Glu Glu Pro Gly Trp Tyr Ser Phe Gly Phe Glu Ile Lys
405 410 415
Asp Lys Lys Cys Asp Val Pro Cys Ile Gly Ile Glu Met Val His Asp
420 425 430
Gly Gly Lys Thr Thr Trp His Ser Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Cys Leu
435 440 445
Met Gly Ser Gly Gln Leu Leu Trp Asp Thr Val Thr Gly Val Asn Met
450 455 460
Thr Leu
465
<210> 48
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid sequence
encoding NA antigen
<400> 48
atgctgccct ccaccatcca gaccctgacc ctgttcctga cctccggcgg cgtgctgctg 60
tccctgtacg tgtccgcctc cctgtcctac ctgctgtact ccgacatcct gctgaagttc 120
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caggccgtga accgctccgc caccaagggc gtgacccccc tgctgcccga gcccgagtgg 240
acctaccccc gcctgtcctg ccccggctcc accttccaga aggccctgct gatctccccc 300
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gcctgccacg acggccgcga gtggacctac atcggcgtgg acggccccga ctccaacgcc 600
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accgacggcc ccgcctccgg catctccgag tgccgcttcc tgaagatccg cgagggccgc 780
atcatcaagg agatcttccc caccggccgc gtgaagcaca ccgaggagtg cacctgcggc 840
ttcgcctcca acaagaccat cgagtgcgcc tgccgcgaca actcctacac cgccaagcgc 900
cccttcgtga agctgaacgt ggagaccgac accgccgaga tccgcctgat gtgcaccaag 960
acctacctgg acaccccccg ccccaacgac ggctccatca ccggcccctg cgagtccgac 1020
ggcgacgagg gctccggcgg catcaagggc ggcttcgtgc accagcgcat ggcctccaag 1080
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gtgtccatgg aggagcccgg ctggtactcc ttcggcttcg agatcaagga caagaagtgc 1260
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gccgccaccg ccatctactg cctgatgggc tccggccagc tgctgtggga caccgtgacc 1380
ggcgtgaaca tgaccctg 1398
<210> 49
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 49
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Ile
1 5 10 15
Ile Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile
20 25 30
Leu Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln His Gln Ala Glu Pro
35 40 45
Ile Arg Asn Thr Asn Phe Leu Thr Glu Asn Ala Val Ala Ser Ile Thr
50 55 60
Leu Thr Gly Ser Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg Gly Trp Ala Val His
65 70 75 80
Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
85 90 95
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Met Glu Cys Arg Thr Phe
100 105 110
Phe Leu Thr His Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
115 120 125
Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly
130 135 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
145 150 155 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
165 170 175
Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
180 185 190
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
195 200 205
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp
210 215 220
Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Lys Ile Glu Lys
225 230 235 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asn Ala Pro Asn Tyr His Tyr
245 250 255
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Gly Glu Ile Met Cys Val Cys
260 265 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Thr Phe Asn Gln
275 280 285
Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
290 295 300
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Met Ser Leu
305 310 315 320
Asn Gly Ala Tyr Gly Ile Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
325 330 335
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu
340 345 350
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Ser Glu Phe Ser
355 360 365
Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
370 375 380
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro
385 390 395 400
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile
405 410 415
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
420 425 430
Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
435 440 445
Lys
<210> 50
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 50
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccatct gcatgatcat cggcatcgtg 60
tccctgatgc tgcagatcgg caacatgatc tccatcctgg tgtcccactc catccagacc 120
ggcaaccagc accaggccga gcccatccgc aacaccaact tcctgaccga gaacgccgtg 180
gcctccatca ccctgaccgg ctcctcctcc ctgtgcccca tccgcggctg ggccgtgcac 240
tccaaggaca actccatccg catcggctcc aagggcgacg tgttcgtgat ccgcgagccc 300
ttcatctcct gctcccacat ggagtgccgc accttcttcc tgacccacgg cgccctgctg 360
aacgacaagc actccaacgg caccgtgaag gaccgctccc cccaccgcac cctgatgtcc 420
tgccccgtgg gcgaggcccc ctccccctac aactcccgct tcgagtccgt ggcctggtcc 480
gcctccgcct gccacgacgg cacctcctgg ctgaccatcg gcatctccgg ccccgacaac 540
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg acaccatcaa gtcctggcgc 600
aacaacatcc tgcgcaccca ggagtccgag tgcgcctgcg tgaacggctc ctgcttcacc 660
gtgatgaccg acggcccctc caacggccag gcctcctaca agatcttcaa gatcgagaag 720
ggcaaggtgg tgaagtccgt ggagctgaac gcccccaact accactacga ggagtgctcc 780
tgctaccccg actccggcga gatcatgtgc gtgtgccgcg acaactggca cggctccaac 840
cgcccctggg tgaccttcaa ccagaacctg gagtaccaga tcggctacat ctgctccggc 900
gtgttcggcg acaacccccg ccccaacgac ggcaccggct cctgcggccc catgtccctg 960
aacggcgcct acggcatcaa gggcttctcc ttcaagtacg gcaacggcgt gtggatcggc 1020
cgcaccaagt ccaccaactc ccgctccggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1080
accggcaccg actccgagtt ctccgtgaag caggacatcg tggccatcac cgactggtcc 1140
ggctactccg gctccttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catccgcccc 1200
tgcttctggg tggagctgat ccgcggccgc cccaaggagt ccaccatctg gacctccggc 1260
tcctccatct ccttctgcgg cgtgaactcc gacaccgtgt cctggtcctg gcccgacggc 1320
gccgagctgc ccttcaccat cgacaag 1347
<210> 51
<211> 465
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 51
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Leu Cys Thr Ser Ala Thr Ala Ile Thr
1 5 10 15
Ile Gly Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Ile Ala Asn Leu Gly Leu Asn
20 25 30
Ile Gly Leu His Leu Lys Pro Gly Cys Asn Cys Ser His Ser Gln Pro
35 40 45
Glu Ile Thr Asn Thr Ser Gln Thr Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Ser Glu
50 55 60
Thr Asn Ile Thr Asn Ile Gln Met Glu Glu Arg Thr Ser Lys Asn Phe
65 70 75 80
Asn Asn Leu Thr Lys Gly Leu Cys Thr Ile Asn Ser Trp His Ile Tyr
85 90 95
Gly Lys Asp Asn Ala Val Arg Ile Gly Glu Ser Ser Asp Val Leu Val
100 105 110
Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Glu Cys Arg Phe Tyr
115 120 125
Ala Leu Ser Gln Gly Thr Thr Ile Arg Gly Lys His Ser Asn Gly Thr
130 135 140
Ile His Asp Arg Ser Gln Tyr Arg Ala Leu Ile Ser Trp Pro Leu Ser
145 150 155 160
Ser Pro Pro Thr Val Tyr Asn Ser Arg Val Glu Cys Ile Gly Trp Ser
165 170 175
Ser Thr Ser Cys His Asp Gly Lys Ser Arg Met Ser Ile Cys Ile Ser
180 185 190
Gly Pro Asn Asn Asn Ala Ser Ala Val Val Trp Tyr Asn Arg Arg Pro
195 200 205
Val Ala Glu Ile Asn Thr Trp Ala Arg Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
210 215 220
Ser Glu Cys Val Cys His Asn Gly Ile Cys Pro Val Val Phe Thr Asp
225 230 235 240
Gly Ser Ala Thr Gly Pro Ala Asp Thr Arg Ile Tyr Tyr Phe Lys Glu
245 250 255
Gly Lys Ile Leu Lys Trp Glu Ser Leu Thr Gly Thr Ala Lys His Val
260 265 270
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly Glu Arg Thr Gly Ile Thr Cys Thr Cys
275 280 285
Arg Asp Asn Trp Gln Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Gln Ile Asp Pro
290 295 300
Val Ala Met Thr His Thr Ser Gln Tyr Ile Cys Ser Pro Val Leu Thr
305 310 315 320
Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ile Gly Lys Cys Asn Asp Pro
325 330 335
Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Asn Gly Ile Lys Gly Phe Ser Tyr Leu Asp
340 345 350
Gly Asp Asn Thr Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Thr Ala Ser Arg Ser
355 360 365
Gly Tyr Glu Val Leu Lys Val Pro Asn Ala Leu Thr Asp Asp Arg Ser
370 375 380
Lys Pro Ile Gln Gly Gln Thr Ile Val Leu Asn Ala Asp Trp Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Ser Gly Ser Phe Met Asp Tyr Trp Ala Asp Gly Asp Cys Tyr Arg
405 410 415
Ala Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Asp Lys
420 425 430
Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Ser Met Cys Ser Ser Thr Glu
435 440 445
Phe Leu Gly Gln Trp Asn Trp Pro Asp Gly Ala Lys Ile Glu Tyr Phe
450 455 460
Leu
465
<210> 52
<211> 1395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 52
atgaacccca accagaagat cctgtgcacc tccgccaccg ccatcaccat cggcgccatc 60
gccgtgctga tcggcatcgc caacctgggc ctgaacatcg gcctgcacct gaagcccggc 120
tgcaactgct cccactccca gcccgagatc accaacacct cccagaccat catcaacaac 180
tactactccg agaccaacat caccaacatc cagatggagg agcgcacctc caagaacttc 240
aacaacctga ccaagggcct gtgcaccatc aactcctggc acatctacgg caaggacaac 300
gccgtgcgca tcggcgagtc ctccgacgtg ctggtgaccc gcgagcccta cgtgtcctgc 360
gaccccgacg agtgccgctt ctacgccctg tcccagggca ccaccatccg cggcaagcac 420
tccaacggca ccatccacga ccgctcccag taccgcgccc tgatctcctg gcccctgtcc 480
tcccccccca ccgtgtacaa ctcccgcgtg gagtgcatcg gctggtcctc cacctcctgc 540
cacgacggca agtcccgcat gtccatctgc atctccggcc ccaacaacaa cgcctccgcc 600
gtggtgtggt acaaccgccg ccccgtggcc gagatcaaca cctgggcccg caacatcctg 660
cgcacccagg agtccgagtg cgtgtgccac aacggcatct gccccgtggt gttcaccgac 720
ggctccgcca ccggccccgc cgacacccgc atctactact tcaaggaggg caagatcctg 780
aagtgggagt ccctgaccgg caccgccaag cacgtggagg agtgctcctg ctacggcgag 840
cgcaccggca tcacctgcac ctgccgcgac aactggcagg gctccaaccg ccccgtgatc 900
cagatcgacc ccgtggccat gacccacacc tcccagtaca tctgctcccc cgtgctgacc 960
gacaaccccc gccccaacga ccccaacatc ggcaagtgca acgaccccta ccccggcaac 1020
aacaacaacg gcatcaaggg cttctcctac ctggacggcg acaacacctg gctgggccgc 1080
accatctcca ccgcctcccg ctccggctac gaggtgctga aggtgcccaa cgccctgacc 1140
gacgaccgct ccaagcccat ccagggccag accatcgtgc tgaacgccga ctggtccggc 1200
tactccggct ccttcatgga ctactgggcc gacggcgact gctaccgcgc ctgcttctac 1260
gtggagctga tccgcggccg ccccaaggag gacaaggtgt ggtggacctc caactccatc 1320
gtgtccatgt gctcctccac cgagttcctg ggccagtgga actggcccga cggcgccaag 1380
atcgagtact tcctg 1395
<210> 53
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - NA antigen Amino Acid sequence
<400> 53
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Leu Val Ile Leu Asn Ile Leu Leu His Ile Val Ser Ile Thr Val Thr
20 25 30
Val Leu Val Leu Pro Gly Asn Gly Asn Asn Glu Ser Cys Asn Glu Thr
35 40 45
Val Ile Arg Glu Tyr Asn Glu Thr Val Arg Val Glu Lys Val Thr Gln
50 55 60
Trp His Asn Thr Asn Val Ile Glu Tyr Ile Glu Arg Pro Glu Asn Asp
65 70 75 80
His Phe Met Asn Asn Thr Glu Ala Leu Cys Asp Ala Lys Gly Phe Ala
85 90 95
Pro Phe Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Ile Gly Ser Arg Gly His Val
100 105 110
Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Thr Glu Cys Arg
115 120 125
Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn
130 135 140
Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Val Glu
145 150 155 160
Ile Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ala Val Ala
165 170 175
Trp Ser Ala Thr Ala Cys His Asp Gly Lys Lys Trp Met Thr Ile Gly
180 185 190
Val Thr Gly Pro Asp Ala Lys Ala Val Ala Val Val His Tyr Gly Gly
195 200 205
Ile Pro Thr Asp Val Ile Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Ser Cys Thr Cys Ile Gln Gly Glu Cys Phe Trp Val Met
225 230 235 240
Thr Asp Gly Pro Ala Asn Arg Gln Ala Gln Tyr Arg Ala Phe Lys Ala
245 250 255
Lys Gln Gly Lys Ile Val Gly Gln Ala Glu Ile Ser Phe Asn Gly Gly
260 265 270
His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asn Glu Gly Lys Val Glu Cys
275 280 285
Val Cys Lys Asp Asn Trp Thr Gly Thr Asn Arg Pro Val Leu Val Ile
290 295 300
Ser Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Leu Pro
305 310 315 320
Ser Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Ser Gln Phe Thr Gly Ser Cys Thr
325 330 335
Ser Pro Met Gly Asn Gln Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg
340 345 350
Gln Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser Arg
355 360 365
Ser Gly Phe Glu Ile Leu Lys Val Arg Asn Gly Trp Val Gln Asn Ser
370 375 380
Lys Glu Gln Ile Lys Arg Gln Val Val Val Asp Asn Leu Asn Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Ala Glu Leu Thr Lys Arg Asn
405 410 415
Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Asn Pro Glu
420 425 430
Glu Lys Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly Val
435 440 445
Asp His Glu Ile Ala Asp Trp Ser Trp His Asp Gly Ala Ile Leu Pro
450 455 460
Phe Asp Ile Asp Lys Met
465 470
<210> 54
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NA antigen
<400> 54
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggctccgtgt ccctgggcct ggtgatcctg 60
aacatcctgc tgcacatcgt gtccatcacc gtgaccgtgc tggtgctgcc cggcaacggc 120
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tcctgctccc ccaccgagtg ccgcaccttc ttcctgaccc agggctccct gctgaacgac 420
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accgacggcc ccgccaaccg ccaggcccag taccgcgcct tcaaggccaa gcagggcaag 780
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cccaacgagg gcaaggtgga gtgcgtgtgc aaggacaact ggaccggcac caaccgcccc 900
gtgctggtga tctcccccga cctgtcctac cgcgtgggct acctgtgcgc cggcctgccc 960
tccgacaccc cccgcggcga ggactcccag ttcaccggct cctgcacctc ccccatgggc 1020
aaccagggct acggcgtgaa gggcttcggc ttccgccagg gcaacgacgt gtggatgggc 1080
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ggctactccg gctccttcac cctgcccgcc gagctgacca agcgcaactg cctggtgccc 1260
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tcctccatcg tgatgtgcgg cgtggaccac gagatcgccg actggtcctg gcacgacggc 1380
gccatcctgc ccttcgacat cgacaagatg 1410
<210> 55
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - NP antigen Amino Acid sequence
<400> 55
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
20 25 30
Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Ile Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Val
340 345 350
Val Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Glu Thr Met Asp Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
<210> 56
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NP antigen
<400> 56
atggcctccc agggcaccaa gcgctcctac gagcagatgg agaccgacgg cgagcgccag 60
aacgccaccg agatccgcgc ctccgtgggc cgcatgatcg gcggcatcgg ccgcttctac 120
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gagcacccct ccgccggcaa ggaccccaag aagaccggcg gccccatcta ccgccgcatc 300
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atgtccaacg agggctccta cttcttcggc gacaacgccg aggagtacga caac 1494
<210> 57
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - NP antigen Amino Acid sequence
<400> 57
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Lys Arg Val Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Val Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Val Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys Asn Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val
340 345 350
Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Asp Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Ala Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Asp Lys Pro Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Ala Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Gly Ala Lys Pro Glu Glu Met Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
<210> 58
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NP antigen
<400> 58
atggcctccc agggcaccaa gcgctcctac gagcagatgg agaccgacgg cgagcgccag 60
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ctgaccatcg agcgcatggt gctgtccgcc ttcgacgagc gccgcaacaa gtacctggag 240
gagcacccct ccgccggcaa ggaccccaag aagaccggcg gccccatcta caagcgcgtg 300
gacggcaagt ggatgcgcga gctggtgctg tacgacaagg aggagatccg ccgcatctgg 360
cgccaggcca acaacggcga cgacgccacc gccggcctga cccacatgat gatctggcac 420
tccaacctga acgacaccac ctaccagcgc acccgcgccc tggtgcgcac cggcatggac 480
ccccgcatgt gctccctgat gcagggctcc accctgcccc gccgctccgg cgccgccggc 540
gccgccgtga agggcgtggg caccatggtg atggagctga tccgcatgat caagcgcggc 600
atcaacgacc gcaacttctg gcgcggcgag aacggccgca agacccgctc cgcctacgag 660
cgcatgtgca acatcctgaa gggcaagttc cagaccgccg cccagcgcgc catgatggac 720
caggtgcgcg agtcccgcaa ccccggcaac gccgagatcg aggacctgat cttcctggcc 780
cgctccgccc tgatcctgcg cggctccgtg gcccacaagt cctgcctgcc cgcctgcgtg 840
tacggccccg ccgtggcctc cggctacgtg ttcgagaagg agggctactc cctggtgggc 900
atcgacccct tcaagctgct gcagaactcc caggtgtact ccctgatccg ccccaacgag 960
aaccccgccc acaagtccca gctggtgtgg atggcctgca actccgccgc cttcgaggac 1020
ctgcgcgtgc tgtccttcat ccgcggcacc aaggtgtccc cccgcggcaa gctgtccacc 1080
cgcggcgtgc agatcgcctc caacgagaac atggacacca tggagtcctc caccctggag 1140
ctgcgctccc gctactgggc catccgcacc cgctccggcg gcaacaccaa ccagcagcgc 1200
gcctccgccg gccagatctc cgtgcagccc gccttctccg tgcagcgcaa cctgcccttc 1260
gacaagccca ccatcatggc cgccttcacc ggcaacaccg agggccgcac ctccgacatg 1320
cgcgccgaga tcatccgcat gatggagggc gccaagcccg aggagatgtc cttccagggc 1380
cgcggcgtgt tcgagctgtc cgacgagaag gccaccaacc ccatcgtgcc ctccttcgac 1440
atgtccaacg agggctccta cttcttcggc gacaacgccg aggagtacga caac 1494
<210> 59
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1968 H3N2 - NP antigen Amino Acid sequence
<400> 59
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Lys Arg Val Asp Arg Lys Trp Met Arg Glu Leu Val Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
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290 295 300
Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Val Ser Leu Met Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Lys Lys Val
340 345 350
Ile Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Val Glu Thr Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Lys
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Val Met Ala Ala Phe Ser Gly Asn
420 425 430
Asn Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Val Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Leu Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
<210> 68
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NP antigen
<400> 68
atggcctccc agggcaccaa gcgctcctac gagcagatgg agaccggcgg cgagcgccag 60
gacaccaccg agatccgcgc ctccgtgggc cgcatgatcg gcggcatcgg ccgcttctac 120
atccagatgt gcaccgagct gaagctgtcc gactacgacg gccgcctgat ccagaactcc 180
atcaccatcg agcgcatggt gctgtccgcc ttcgacgagc gccgcaacaa gtacctggag 240
gagcacccct ccgccggcaa ggaccccaag aagaccggcg gccccatcta ccgccgcatc 300
gacggcaagt ggacccgcga gctgatcctg tacgacaagg aggagatccg ccgcgtgtgg 360
cgccaggcca acaacggcga ggacgccacc gccggcctga cccacatcat gatctggcac 420
tccaacctga acgacgccac ctaccagcgc acccgcgccc tggtgcgcac cggcatggac 480
ccccgcatgt gctccctgat gcagggctcc accctgcccc gccgctccgg cgccgccggc 540
gccgccgtga agggcgtggg caccatcgcc atggagctga tccgcatgat caagcgcggc 600
atcaacgacc gcaacttctg gcgcggcgag aacggccgcc gcacccgcgt ggcctacgag 660
cgcatgtgca acatcctgaa gggcaagttc cagaccgccg cccagcgcgc catgatggac 720
caggtgcgcg agtcccgcaa ccccggcaac gccgagatcg aggacctgat cttcctggcc 780
cgctccgccc tgatcctgcg cggctccgtg gcccacaagt cctgcctgcc cgcctgcgtg 840
tacggcctgg ccgtggcctc cggccacgac ttcgagcgcg agggctactc cctggtgggc 900
atcgacccct tcaagctgct gcagaactcc caggtggtgt ccctgatgcg ccccaacgag 960
aaccccgccc acaagtccca gctggtgtgg atggcctgcc actccgccgc cttcgaggac 1020
ctgcgcgtgt cctccttcat ccgcggcaag aaggtgatcc cccgcggcaa gctgtccacc 1080
cgcggcgtgc agatcgcctc caacgagaac gtggagacca tggactccaa caccctggag 1140
ctgcgctccc gctactgggc catccgcacc cgctccggcg gcaacaccaa ccagcagaag 1200
gcctccgccg gccagatctc cgtgcagccc accttctccg tgcagcgcaa cctgcccttc 1260
gagcgcgcca ccgtgatggc cgccttctcc ggcaacaacg agggccgcac ctccgacatg 1320
cgcaccgagg tgatccgcat gatggagtcc gccaagcccg aggacctgtc cttccagggc 1380
cgcggcgtgt tcgagctgtc cgacgagaag gccaccaacc ccatcgtgcc ctccttcgac 1440
atgtccaacg agggctccta cttcttcggc gacaacgccg aggagtacga caac 1494
<210> 69
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - NP antigen Amino Acid sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (102)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 69
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Asp Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp His Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Lys Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Val Asp Xaa Lys Trp Met Arg Glu Leu Val Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ser Gly Leu Thr His Ile Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Val Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Val Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Ala Tyr Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ile Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Leu Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val
340 345 350
Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Asp Asn Met Gly Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Gly
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Thr Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Lys Ser Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Ala Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Gly Ala Lys Pro Glu Glu Val Ser Phe Arg Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
<210> 70
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NP antigen
<220>
<221> misc_feature
<222> (304)..(306)
<223> any nucleotide
<400> 70
atggcctccc agggcaccaa gcgctcctac gagcagatgg agaccgacgg cgaccgccag 60
aacgccaccg agatccgcgc ctccgtgggc aagatgatcg acggcatcgg ccgcttctac 120
atccagatgt gcaccgagct gaagctgtcc gaccacgagg gccgcctgat ccagaactcc 180
ctgaccatcg agaagatggt gctgtccgcc ttcgacgagc gccgcaacaa gtacctggag 240
gagcacccct ccgccggcaa ggaccccaag aagaccggcg gccccatcta ccgccgcgtg 300
gacnnnaagt ggatgcgcga gctggtgctg tacgacaagg aggagatccg ccgcatctgg 360
cgccaggcca acaacggcga ggacgccacc tccggcctga cccacatcat gatctggcac 420
tccaacctga acgacgccac ctaccagcgc acccgcgccc tggtgcgcac cggcatggac 480
ccccgcatgt gctccctgat gcagggctcc accctgcccc gccgctccgg cgccgccggc 540
gccgccgtga agggcatcgg caccatggtg atggagctga tccgcatggt gaagcgcggc 600
atcaacgacc gcaacttctg gcgcggcgag aacggccgca agacccgctc cgcctacgag 660
cgcatgtgca acatcctgaa gggcaagttc cagaccgccg cccagcgcgc catggtggac 720
caggtgcgcg agtcccgcaa ccccggcaac gccgagatcg aggacctgat cttcctggcc 780
cgctccgccc tgatcctgcg cggctccgtg gcccacaagt cctgcctgcc cgcctgcgcc 840
tacggccccg ccgtgtcctc cggctacgac ttcgagaagg agggctactc cctggtgggc 900
atcgacccct tcaagctgct gcagaactcc cagatctact ccctgatccg ccccaacgag 960
aaccccgccc acaagtccca gctggtgtgg atggcctgcc actccgccgc cttcgaggac 1020
ctgcgcctgc tgtccttcat ccgcggcacc aaggtgtccc cccgcggcaa gctgtccacc 1080
cgcggcgtgc agatcgcctc caacgagaac atggacaaca tgggctcctc caccctggag 1140
ctgcgctccg gctactgggc catccgcacc cgctccggcg gcaacaccaa ccagcagcgc 1200
gcctccgccg gccagacctc cgtgcagccc accttctccg tgcagcgcaa cctgcccttc 1260
gagaagtcca ccatcatggc cgccttcacc ggcaacaccg agggccgcac ctccgacatg 1320
cgcgccgaga tcatccgcat gatggagggc gccaagcccg aggaggtgtc cttccgcggc 1380
cgcggcgtgt tcgagctgtc cgacgagaag gccgccaacc ccatcgtgcc ctccttcgac 1440
atgtccaacg agggctccta cttcttcggc gacaacgccg aggagtacga caac 1494
<210> 71
<211> 560
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - NP antigen Amino Acid
sequence.
<400> 71
Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Met Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile
20 25 30
Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn
35 40 45
Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Asp Asp Val Gly Arg
50 55 60
Lys Ala Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr
65 70 75 80
Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys
85 90 95
Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala His
100 105 110
Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu
115 120 125
Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu
130 135 140
Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp
145 150 155 160
Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser
180 185 190
Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys
195 200 205
Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu
210 215 220
Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Val Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg
245 250 255
Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys
260 265 270
Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys
275 280 285
Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg
290 295 300
Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser
305 310 315 320
Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile
325 330 335
Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr
340 345 350
Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro
355 360 365
Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu
370 375 380
Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu
385 390 395 400
Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys
405 410 415
Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala
420 425 430
Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser
435 440 445
Gly Gly Asn Glu Val Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys
450 455 460
Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala
465 470 475 480
Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val
485 490 495
Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr
500 505 510
Ser Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys
515 520 525
Asn Lys Thr Asn Pro Ile Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn
530 535 540
Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr
545 550 555 560
<210> 72
<211> 1680
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - Optimized DNA sequence
encoding the nucleic acid sequence encoding NP antigen
<400> 72
atgtccaaca tggacatcga cggcatgaac accggcacca tcgacaagac ccccgaggag 60
atcacctccg gcacctccgg caccacccgc cccatcatcc gccccgccac cctggccccc 120
ccctccaaca agcgcacccg caacccctcc cccgagcgcg ccaccacctc ctccgaggac 180
gacgtgggcc gcaaggccca gaagaagcag acccccaccg agatcaagaa gtccgtgtac 240
aacatggtgg tgaagctggg cgagttctac aaccagatga tggtgaaggc cggcctgaac 300
gacgacatgg agcgcaacct gatccagaac gcccacgccg tggagcgcat cctgctggcc 360
gccaccgacg acaagaagac cgagttccag aagaagaaga acgcccgcga cgtgaaggag 420
ggcaaggagg agatcgacca caacaagacc ggcggcacct tctacaagat ggtgcgcgac 480
gacaagacca tctacttctc ccccatccgc atcaccttcc tgaaggagga ggtgaagacc 540
atgtacaaga ccaccatggg ctccgacggc ttctccggcc tgaaccacat catgatcggc 600
cactcccaga tgaacgacgt gtgcttccag cgctccaagg ccctgaagcg cgtgggcctg 660
gacccctccc tgatctccac cttcgccggc tccaccgtgc cccgccgctc cggcgccacc 720
ggcgtggcca tcaagggcgg cggcaccctg gtggccgagg ccatccgctt catcggccgc 780
gccatggccg accgcggcct gctgcgcgac atcaaggcca agaccgccta cgagaagatc 840
ctgctgaacc tgaagaacaa gtgctccgcc ccccagcaga aggccctggt ggaccaggtg 900
atcggctccc gcaaccccgg catcgccgac atcgaggacc tgaccctgct ggcccgctcc 960
atggtggtgg tgcgcccctc cgtggcctcc aaggtggtgc tgcccatctc catctacgcc 1020
aagatccccc agctgggctt caacgtggag gagtactcca tggtgggcta cgaggccatg 1080
gccctgtaca acatggccac ccccgtgtcc atcctgcgca tgggcgacga cgccaaggac 1140
aagtcccagc tgttcttcat gtcctgcttc ggcgccgcct acgaggacct gcgcgtgctg 1200
tccgccctga ccggcaccga gttcaagccc cgctccgccc tgaagtgcaa gggcttccac 1260
gtgcccgcca aggagcaggt ggagggcatg ggcgccgccc tgatgtccat caagctgcag 1320
ttctgggccc ccatgacccg ctccggcggc aacgaggtgg gcggcgacgg cggctccggc 1380
cagatctcct gctcccccgt gttcgccgtg gagcgcccca tcgccctgtc caagcaggcc 1440
gtgcgccgca tgctgtccat gaacatcgag ggccgcgacg ccgacgtgaa gggcaacctg 1500
ctgaagatga tgaacgactc catggccaag aagacctccg gcaacgcctt catcggcaag 1560
aagatgttcc agatctccga caagaacaag accaacccca tcgagatccc catcaagcag 1620
accatcccca acttcttctt cggccgcgac accgccgagg actacgacga cctggactac 1680
1680
<210> 73
<211> 560
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
NP antigen Amino Acid sequence
<400> 73
Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile
20 25 30
Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn
35 40 45
Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Asp Asp Val Gly Arg
50 55 60
Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr
65 70 75 80
Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys
85 90 95
Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala Tyr
100 105 110
Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu
115 120 125
Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu
130 135 140
Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp
145 150 155 160
Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser
180 185 190
Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys
195 200 205
Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu
210 215 220
Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Val Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg
245 250 255
Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys
260 265 270
Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys
275 280 285
Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg
290 295 300
Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser
305 310 315 320
Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile
325 330 335
Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr
340 345 350
Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro
355 360 365
Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu
370 375 380
Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu
385 390 395 400
Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys
405 410 415
Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala
420 425 430
Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser
435 440 445
Gly Gly Asn Glu Ala Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys
450 455 460
Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala
465 470 475 480
Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val
485 490 495
Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr
500 505 510
Ser Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys
515 520 525
Asn Lys Thr Asn Pro Ile Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn
530 535 540
Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr
545 550 555 560
<210> 74
<211> 1680
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid sequence
encoding NP antigen
<400> 74
atgtccaaca tggacatcga cggcatcaac accggcacca tcgacaagac ccccgaggag 60
atcacctccg gcacctccgg caccacccgc cccatcatcc gccccgccac cctggccccc 120
ccctccaaca agcgcacccg caacccctcc cccgagcgcg ccaccacctc ctccgaggac 180
gacgtgggcc gcaagaccca gaagaagcag acccccaccg agatcaagaa gtccgtgtac 240
aacatggtgg tgaagctggg cgagttctac aaccagatga tggtgaaggc cggcctgaac 300
gacgacatgg agcgcaacct gatccagaac gcctacgccg tggagcgcat cctgctggcc 360
gccaccgacg acaagaagac cgagttccag aagaagaaga acgcccgcga cgtgaaggag 420
ggcaaggagg agatcgacca caacaagacc ggcggcacct tctacaagat ggtgcgcgac 480
gacaagacca tctacttctc ccccatccgc atcaccttcc tgaaggagga ggtgaagacc 540
atgtacaaga ccaccatggg ctccgacggc ttctccggcc tgaaccacat catgatcggc 600
cactcccaga tgaacgacgt gtgcttccag cgctccaagg ccctgaagcg cgtgggcctg 660
gacccctccc tgatctccac cttcgccggc tccaccgtgc cccgccgctc cggcgccacc 720
ggcgtggcca tcaagggcgg cggcaccctg gtggccgagg ccatccgctt catcggccgc 780
gccatggccg accgcggcct gctgcgcgac atcaaggcca agaccgccta cgagaagatc 840
ctgctgaacc tgaagaacaa gtgctccgcc ccccagcaga aggccctggt ggaccaggtg 900
atcggctccc gcaaccccgg catcgccgac atcgaggacc tgaccctgct ggcccgctcc 960
atggtggtgg tgcgcccctc cgtggcctcc aaggtggtgc tgcccatctc catctacgcc 1020
aagatccccc agctgggctt caacgtggag gagtactcca tggtgggcta cgaggccatg 1080
gccctgtaca acatggccac ccccgtgtcc atcctgcgca tgggcgacga cgccaaggac 1140
aagtcccagc tgttcttcat gtcctgcttc ggcgccgcct acgaggacct gcgcgtgctg 1200
tccgccctga ccggcaccga gttcaagccc cgctccgccc tgaagtgcaa gggcttccac 1260
gtgcccgcca aggagcaggt ggagggcatg ggcgccgccc tgatgtccat caagctgcag 1320
ttctgggccc ccatgacccg ctccggcggc aacgaggccg gcggcgacgg cggctccggc 1380
cagatctcct gctcccccgt gttcgccgtg gagcgcccca tcgccctgtc caagcaggcc 1440
gtgcgccgca tgctgtccat gaacatcgag ggccgcgacg ccgacgtgaa gggcaacctg 1500
ctgaagatga tgaacgactc catggccaag aagacctccg gcaacgcctt catcggcaag 1560
aagatgttcc agatctccga caagaacaag accaacccca tcgagatccc catcaagcag 1620
accatcccca acttcttctt cggccgcgac accgccgagg actacgacga cctggactac 1680
1680
<210> 75
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - NP antigen Amino Acid sequence
<400> 75
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
20 25 30
Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Val
340 345 350
Ile Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
<210> 76
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NP antigen
<400> 76
atggcctccc agggcaccaa gcgctcctac gagcagatgg agaccggcgg cgagcgccag 60
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atcaccatcg agcgcatggt gctgtccgcc ttcgacgagc gccgcaaccg ctacctggag 240
gagcacccct ccgccggcaa ggaccccaag aagaccggcg gccccatcta ccgccgccgc 300
gacggcaagt gggtgcgcga gctgatcctg tacgacaagg aggagatccg ccgcatctgg 360
cgccaggcca acaacggcga ggacgccacc gccggcctga cccacctgat gatctggcac 420
tccaacctga acgacgccac ctaccagcgc acccgcgccc tggtgcgcac cggcatggac 480
ccccgcatgt gctccctgat gcagggctcc accctgcccc gccgctccgg cgccgccggc 540
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ctgcgctccc gctactgggc catccgcacc cgctccggcg gcaacaccaa ccagcagcgc 1200
gcctccgccg gccagatctc catccagccc accttctccg tgcagcgcaa cctgcccttc 1260
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cgcaccgaga tcatccgcat gatggagtcc gcccgccccg aggacgtgtc cttccagggc 1380
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<210> 77
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - NP antigen Amino Acid sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (272)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 77
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
20 25 30
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35 40 45
Leu Ser Asp Asn Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ser Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala Xaa
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Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
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Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
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Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Met
340 345 350
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355 360 365
Glu Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
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435 440 445
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450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
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Met Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
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<210> 78
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NP antigen
<220>
<221> misc_feature
<222> (814)..(816)
<223> any nucleotide
<400> 78
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gacggcaagt gggtgcgcga gctgatcctg tacgacaagg aggagatccg ccgcatctgg 360
cgccaggcca acaacggcga ggacgccacc gccggcctga cccacctgat gatctggcac 420
tccaacctga acgacgccac ctaccagcgc acccgcgccc tggtgcgcac cggcatggac 480
ccccgcatgt gctccctgat gcagggctcc accctgcccc gccgctccgg cgccgccggc 540
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cgcatgtgca acatcctgaa gggcaagttc cagaccgccg cccagcgcgc catgatggac 720
caggtgcgcg agtcccgcaa ccccggcaac gccgagatcg aggacctgat cttcctggcc 780
cgctccgccc tgatcctgcg cggctccgtg gccnnnaagt cctgcctgcc cgcctgcgtg 840
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atcgacccct tccgcctgct gcagaactcc caggtgttct ccctgatccg ccccaacgag 960
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<210> 79
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - NP antigen Amino Acid sequence
<400> 79
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
20 25 30
Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Asn Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Val Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Val Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
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325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Met
340 345 350
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355 360 365
Glu Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Lys Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
<210> 80
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding NP antigen
<400> 80
atggcctccc agggcaccaa gcgctcctac gagcagatgg agaccggcgg cgagcgccag 60
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atcaccatcg agcgcatggt gctgtccgcc ttcgacgagc gccgcaaccg ctacctggag 240
gagcacccct ccgccggcaa ggaccccaag aagaccggcg gccccatcta ccgccgccgc 300
gacggcaagt gggtgcgcga gctgatcctg tacgacaagg aggagatccg ccgcatctgg 360
cgccaggcca acaacggcga ggacgccacc gccggcctga cccacctgat gatctggcac 420
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ccccgcatgt gctccctgat gcagggctcc accctgcccc gccgctccgg cgccgccggc 540
gccgccgtga agggcatcgg caccatggtg atggagctga tccgcatggt gaagcgcggc 600
atcaacgacc gcaacttctg gcgcggcgag aacggccgcc gcacccgcgt ggcctacgag 660
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caggtgcgcg agtcccgcaa ccccggcaac gccgagatcg aggacctgat cttcctggcc 780
cgctccgccc tgatcctgcg cggctccgtg gcccacaagt cctgcctgcc cgcctgcgtg 840
tacggcctgg ccgtggcctc cggctacgac ttcgagcgcg agggctactc cctggtgggc 900
atcgacccct tccgcctgct gcagaactcc caggtgttct ccctgatccg ccccaacgag 960
aaccccgccc acaagtccca gctggtgtgg atggcctgcc actccgccgc cttcgaggac 1020
ctgcgcgtgt cctccttcat ccgcggcacc cgcatggtgc cccgcggcca gctgtccacc 1080
cgcggcgtgc agatcgcctc caacgagaac atggaggcca tggactccaa caccctggag 1140
ctgcgctccc gctactgggc catccgcacc cgctccggcg gcaacaccaa ccagcagcgc 1200
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<210> 81
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 81
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<210> 82
<211> 291
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1918 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 82
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<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 83
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Phe Phe Lys His Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 84
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1957 H2N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 84
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<210> 85
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1968 H3N2 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 85
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1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Phe Phe Glu His Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gln
65 70 75 80
Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 86
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1968 H3N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 86
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccccc atccgcaacg agtggggctg ccgctgcaac 60
gactcctccg accccctggt ggtggccgcc tccatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcctgg accgcctgtt cttcaagtgc atctaccgct tcttcgagca cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg cgtgcccgag tccatgcgcg aggagtaccg caaggagcag 240
cagtccgccg tggacgccga cgactcccac ttcgtgtcca tcgagctgga g 291
<210> 87
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1977 H1N1 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 87
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Leu Phe Lys His Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gln
65 70 75 80
Gln Asn Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Asn Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 88
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1977 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 88
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccccc atccgcaacg agtggggctg ccgctgcaac 60
gactcctccg accccctggt ggtggccgcc tccatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcctgg accgcctgtt cttcaagtgc atctaccgcc tgttcaagca cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg cgtgcccgag tccatgcgcg aggagtaccg caaggagcag 240
cagaacgccg tggacgccga cgactcccac ttcgtgaaca tcgagctgga g 291
<210> 89
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2007 H1N1 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 89
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Val His Leu Ile Leu Trp Ile Ile Asp Arg Leu Phe Ser
35 40 45
Lys Ser Ile Tyr Arg Ile Phe Lys His Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Gln Asn Ala Val Asp Ala Asp Asp Asp His Phe Val Ser Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 90
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2007 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 90
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccccc atccgcaacg agtggggctg ccgctgcaac 60
gactcctccg accccctggt ggtggccgcc tccatcatcg gcatcgtgca cctgatcctg 120
tggatcatcg accgcctgtt ctccaagtcc atctaccgca tcttcaagca cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg cgtgcccgag tccatgcgcg aggagtaccg cgaggagcag 240
cagaacgccg tggacgccga cgacgaccac ttcgtgtcca tcgagctgga g 291
<210> 91
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2009 H1N1 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 91
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu
1 5 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Ile Ala Ala Asn Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Thr Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Gln Gln Glu Gln
65 70 75 80
Gln Ser Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 92
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2009 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 92
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccccc acccgctccg agtgggagtg ccgctgctcc 60
gactcctccg accccctggt gatcgccgcc aacatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcaccg accgcctgtt cttcaagtgc atctaccgcc gcttcaagta cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg cgtgcccgag tccatgcgcg aggagtacca gcaggagcag 240
cagtccgccg tggacgtgga cgacggccac ttcgtgaaca tcgagctgga g 291
<210> 93
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H1N1 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 93
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu
1 5 10 15
Cys Arg Cys Ser Gly Ser Ser Asp Pro Leu Val Ile Ala Ala Asn Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Thr Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Gln Gln Glu Gln
65 70 75 80
Gln Ser Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 94
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H1N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 94
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccccc acccgctccg agtgggagtg ccgctgctcc 60
ggctcctccg accccctggt gatcgccgcc aacatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcaccg accgcctgtt cttcaagtgc atctaccgcc gcttcaagta cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg cgtgcccgag tccatgcgcg aggagtacca gcaggagcag 240
cagtccgccg tggacgtgga cgacggccac ttcgtgaaca tcgagctgga g 291
<210> 95
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 95
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Ile Val Ala Ala Asn Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Val Cys Arg Leu Phe Lys His Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gln
65 70 75 80
Gln Asn Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 96
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H3N2 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 96
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccccc atccgcaacg agtggggctg ccgctgcaac 60
gactcctccg accccctgat cgtggccgcc aacatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcctgg accgcctgtt cttcaagtgc gtgtgccgcc tgttcaagca cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg cgtgcccgag tccatgcgcg aggagtaccg caaggagcag 240
cagaacgccg tggacgccga cgactcccac ttcgtgtcca tcgagctgga g 291
<210> 97
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - M2 ion channel antigen
Amino Acid sequence
<400> 97
Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Thr Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser
1 5 10 15
Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Lys
20 25 30
Arg Gly Ile Asn Met Lys Ile Arg Ile Lys Gly Pro Asn Lys Glu Thr
35 40 45
Ile Thr Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile
50 55 60
Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Val
65 70 75 80
Leu Asn Asp His Ile Ile Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile
85 90 95
Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Ile Glu Glu Leu His
100 105
<210> 98
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 Influenza B (Victoria lineage) - Optimized DNA sequence
encoding the nucleic acid sequence encoding M2 ion channel
antigen
<400> 98
atgctggagc ccttccagat cctgaccatc tgctccttca tcctgtccgc cctgcacttc 60
atggcctgga ccatcggcca cctgaaccag atcaagcgcg gcatcaacat gaagatccgc 120
atcaagggcc ccaacaagga gaccatcacc cgcgaggtgt ccatcctgcg ccactcctac 180
cagaaggaga tccaggccaa ggagaccatg aaggaggtgc tgtccgacaa catggaggtg 240
ctgaacgacc acatcatcat cgagggcctg tccgccgagg agatcatcaa gatgggcgag 300
accgtgctgg agatcgagga gctgcac 327
<210> 99
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 99
Met Phe Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser
1 5 10 15
Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Lys
20 25 30
Arg Gly Val Asn Met Lys Ile Arg Ile Lys Gly Pro Asn Lys Glu Thr
35 40 45
Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile
50 55 60
Gln Ala Lys Glu Ala Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Val
65 70 75 80
Leu Ser Asp His Ile Val Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile
85 90 95
Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Val Glu Glu Ser His
100 105
<210> 100
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 Influenza B (Yamagata lineage) - Sequence only on GISAID -
Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid sequence
encoding M2 ion channel antigen
<400> 100
atgttcgagc ccttccagat cctgtccatc tgctccttca tcctgtccgc cctgcacttc 60
atggcctgga ccatcggcca cctgaaccag atcaagcgcg gcgtgaacat gaagatccgc 120
atcaagggcc ccaacaagga gaccatcaac cgcgaggtgt ccatcctgcg ccactcctac 180
cagaaggaga tccaggccaa ggaggccatg aaggaggtgc tgtccgacaa catggaggtg 240
ctgtccgacc acatcgtgat cgagggcctg tccgccgagg agatcatcaa gatgggcgag 300
accgtgctgg aggtggagga gtcccac 327
<210> 101
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 101
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Lys Thr Gly Trp Glu
1 5 10 15
Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp Pro Leu Gly Val Ala Ala Asn Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Arg Tyr Gly Leu Lys Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Ile Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln
65 70 75 80
Gln Asn Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu
85 90 95
Glu
<210> 102
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2015 H5N1 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 102
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccctg accaagaccg gctgggagtg caactgctcc 60
ggctcctccg accccctggg cgtggccgcc aacatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcctgg accgcctgtt cttcaagtgc atctaccgcc gcttccgcta cggcctgaag 180
ggcggcccct ccaccgaggg catccccgag tccatgcgcg aggagtaccg ccaggagcag 240
cagaacgccg tggacgtgga cgacggccac ttcgtgaaca tcgagctgga g 291
<210> 103
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 103
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu
1 5 10 15
Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp Pro Phe Val Val Ala Ala Asn Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Met Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln
65 70 75 80
Gln Asn Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu
85 90 95
Lys
<210> 104
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2017 H7N9 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 104
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccccc acccgcaccg gctgggagtg caactgctcc 60
ggctcctccg accccttcgt ggtggccgcc aacatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcctgg accgcctgtt cttcaagtgc atctaccgcc gcttcaagta cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg catgcccgag tccatgcgcg aggagtaccg ccaggagcag 240
cagaacgccg tggacgtgga cgacggccac ttcgtgaaca tcgagctgaa g 291
<210> 105
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - M2 ion channel antigen Amino Acid sequence
<400> 105
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Lys Thr Gly Trp Glu
1 5 10 15
Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Asn Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Met Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln
65 70 75 80
Gln Asn Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu
85 90 95
Lys
<210> 106
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2013 H10N8 - Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid
sequence encoding M2 ion channel antigen
<400> 106
atgtccctgc tgaccgaggt ggagaccctg accaagaccg gctgggagtg caactgctcc 60
ggctcctccg accccctggt ggtggccgcc aacatcatcg gcatcctgca cctgatcctg 120
tggatcctgg accgcctgtt cttcaagtgc atctaccgcc gcttcaagta cggcctgaag 180
cgcggcccct ccaccgaggg catgcccgag tccatgcgcg aggagtaccg ccaggagcag 240
cagaacgccg tggacgtgga cgacggccac ttcgtgaaca tcgagctgaa g 291
<210> 107
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1 antigen Amino Acid sequence
<400> 107
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Ser Val Phe
20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Ile
65 70 75 80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala
85 90 95
Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala
100 105 110
Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Ala Ala Phe
130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg
145 150 155 160
Ser His Arg Gln Met Ala Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Val
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Asn Lys
195 200 205
Thr Arg Gln Met Val His Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
245 250
<210> 108
<211> 756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Optimized DNA sequence encoding the nucleic acid sequence
encoding M1 antigen
<400> 108
atgtccctgc tgaccgaggt ggagacctac gtgctgtcca tcatcccctc cggccccctg 60
aaggccgaga tcgcccagcg cctggagtcc gtgttcgccg gcaagaacac cgacctggag 120
gccctgatgg agtggctgaa gacccgcccc atcctgtccc ccctgaccaa gggcatcctg 180
ggcttcgtgt tcaccctgac cgtgccctcc gagcgcggcc tgcagcgccg ccgcttcatc 240
cagaacgccc tgaacggcaa cggcgacccc aacaacatgg accgcgccgt gaagctgtac 300
aagaagctga agcgcgagat caccttccac ggcgccaagg aggtgtccct gtcctactcc 360
accggcgccc tggcctcctg catgggcctg atctacaacc gcatgggcac cgtgaccacc 420
gaggccgcct tcggcctggt gtgcgccacc tgcgagcaga tcgccgactc ccagcaccgc 480
tcccaccgcc agatggccac caccaccaac cccctgatcc gccacgagaa ccgcatggtg 540
ctggcctcca ccaccgccaa ggccatggag caggtggccg gctcctccga gcaggccgcc 600
gaggccatgg aggtggccaa caagacccgc cagatggtgc acgccatgcg caccatcggc 660
acccacccct cctcctccgc cggcctgcgc gacgacctgc tggagaacct gcaggcctac 720
cagaagcgca tgggcgtgca gatgcagcgg ttcaag 756
<210> 109
<211> 563
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA amino acid sequence
<400> 109
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
130 135 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asn Gln Arg Ala Leu Tyr
195 200 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225 230 235 240
Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile
245 250 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
340 345 350
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
420 425 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys Ile Asp Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg
515 520 525
Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser
530 535 540
Thr Phe Leu Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly His His His
545 550 555 560
His His His
<210> 110
<211> 332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gen1 HA SS amino acid sequence
<400> 110
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Gly Ser Gly Asp Ala Lys Cys
50 55 60
Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val
65 70 75 80
His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys
85 90 95
Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln Arg Glu Thr Arg
100 105 110
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly
115 120 125
Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser
130 135 140
Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile
145 150 155 160
Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr
165 170 175
Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu
180 185 190
Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala
195 200 205
Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp
210 215 220
Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn
225 230 235 240
Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
245 250 255
Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro
260 265 270
Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Pro Gly
275 280 285
Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg
290 295 300
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Ser Gly Arg Leu
305 310 315 320
Val Pro Arg Gly Ser Gly His His His His His His
325 330
<210> 111
<211> 379
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gen2 HA SS amino acid sequence
<400> 111
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Gly Ser Gly Asp Ala Lys Cys
50 55 60
Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val
65 70 75 80
His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys
85 90 95
Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln Arg Glu Thr Arg
100 105 110
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly
115 120 125
Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser
130 135 140
Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile
145 150 155 160
Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr
165 170 175
Ala Thr Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser
180 185 190
Ile Ile Tyr Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Asn Gly
195 200 205
Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg
210 215 220
Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile
225 230 235 240
Lys Gln Leu Gln Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu
245 250 255
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
260 265 270
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
275 280 285
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
290 295 300
Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Pro Gly Ser
325 330 335
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
340 345 350
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Ser Gly Arg Leu Val
355 360 365
Pro Arg Gly Ser Gly His His His His His His
370 375
<210> 112
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gen3 HA SS amino acid sequence
<400> 112
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Gly Trp Gly Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln
50 55 60
Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly
65 70 75 80
Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn
85 90 95
Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Gly
115 120 125
Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Ile Ile
130 135 140
Tyr Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Asn Gly Thr Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile
165 170 175
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
180 185 190
Leu Gln Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg
195 200 205
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val
210 215 220
Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe
225 230 235 240
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn
245 250 255
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg
260 265 270
Glu Lys Ile Asp Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp
275 280 285
Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr
290 295 300
Phe Leu Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly His His His His
305 310 315 320
His His
<210> 113
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gen4 HA SS amino acid sequence
<400> 113
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Gly Ser Gly Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln
50 55 60
Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly
65 70 75 80
Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn
85 90 95
Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Gly
115 120 125
Gly Asp Pro Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Ile Ile
130 135 140
Tyr Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Asn Gly Thr Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile
165 170 175
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln
180 185 190
Leu Gln Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg
195 200 205
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val
210 215 220
Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe
225 230 235 240
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn
245 250 255
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg
260 265 270
Glu Lys Ile Asp Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp
275 280 285
Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr
290 295 300
Phe Leu Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly His His His His
305 310 315 320
His His
<210> 114
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gen5 HA SS amino acid sequence
<400> 114
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Gly Ser Gly Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln
50 55 60
Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly
65 70 75 80
Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn
85 90 95
Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Ser Gly Thr Asp Leu Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu
130 135 140
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
145 150 155 160
Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn
165 170 175
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser
180 185 190
Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys
195 200 205
Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala
210 215 220
Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Ser Thr Phe Leu Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly His
245 250 255
His His His His His
260
<210> 115
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gen6 HA SS 1 amino acid sequence
<400> 115
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Gly Ser Gly Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln
50 55 60
Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly
65 70 75 80
Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn
85 90 95
Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Thr Asn Met Val Asn Ser Val Ile Glu Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Thr Asp Leu Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Leu Asn Gln
130 135 140
Trp Thr Leu Leu Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
145 150 155 160
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
165 170 175
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
180 185 190
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
195 200 205
Arg Glu Lys Ile Asp Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg
210 215 220
Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser
225 230 235 240
Thr Phe Leu Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly His His His
245 250 255
His His His
<210> 116
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gen6 HA SS 2 amino acid sequence
<400> 116
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Gly Ser Gly Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Gln
50 55 60
Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly
65 70 75 80
Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn
85 90 95
Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Thr Asn Met Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Ser Gly Thr Asp Leu Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Leu
130 135 140
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
145 150 155 160
Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn
165 170 175
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser
180 185 190
Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys
195 200 205
Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala
210 215 220
Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Ser Thr Phe Leu Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly His
245 250 255
His His His His His
260
<210> 117
<211> 565
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FL HA amino acid sequence
<400> 117
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
130 135 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Glu Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asp Gln Lys Ala Leu Tyr
195 200 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Lys Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225 230 235 240
Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile
245 250 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Asn Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Lys Cys Lys Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
340 345 350
Ile Glu Glu Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Ile
420 425 430
Asp Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
530 535 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 118
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA 2759 amino acid sequence
<400> 118
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Glu Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Ser Thr Ala
130 135 140
Thr Gly Lys Glu Gly Asn Lys Ser Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp
145 150 155 160
Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Glu Gly Arg His His His His
260 265 270
His His His
275
<210> 119
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA 4157 amino acid sequence
<400> 119
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Glu Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Ser Thr Ala
130 135 140
Thr Gly Lys Glu Gly Asn Lys Ser Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp
145 150 155 160
Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Arg Ser
245 250 255
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His
260 265 270
<210> 120
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA 4454 amino acid sequence
<400> 120
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala
130 135 140
Ile Gly Lys Glu Tyr Asn Lys Ser Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp
145 150 155 160
Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Arg Ser
245 250 255
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His
260 265 270
<210> 121
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA 4650 amino acid sequence
<400> 121
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala
130 135 140
Ile Gly Lys Glu Tyr Asn Lys Ser Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu
145 150 155 160
Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Arg Ser
245 250 255
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His
260 265 270
<210> 122
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA 4900 amino acid sequence
<400> 122
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala
130 135 140
Ile Gly Cys Glu Tyr Asn Lys Ser Glu Arg Cys Met Lys Gln Ile Glu
145 150 155 160
Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Glu Gly Arg His His His His
260 265 270
His His His
275
<210> 123
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mini HA 4900 amino acid sequence
<400> 123
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala
130 135 140
Ile Gly Cys Glu Tyr Asn Lys Ser Glu Arg Cys Met Lys Gln Ile Glu
145 150 155 160
Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Glu Gly Arg His His His His
260 265 270
His His His
275
<210> 124
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A California 04 2009 H1N1 amino acid sequence
<400> 124
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu
50 55 60
Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala
130 135 140
Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn
145 150 155 160
Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp
210 215 220
Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val
260 265 270
Ala Ser Ser
275
<210> 125
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Brisbane 59 2007 H1N1 amino acid sequence
<400> 125
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala
130 135 140
Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn
145 150 155 160
Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Ile Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val
260 265 270
Ala Ser Ser
275
<210> 126
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A New Caledonia 20 1999 H1N1 amino acid sequence
<400> 126
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala
130 135 140
Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn
145 150 155 160
Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn
210 215 220
Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val
260 265 270
Ala Ser Ser
275
<210> 127
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Puerto Rico 8 1934 H1N1 amino acid sequence
<400> 127
Met Lys Ala Asn Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly
65 70 75 80
Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met
85 90 95
Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
115 120 125
Asn Lys Val Asn Thr Val Ile Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ala
130 135 140
Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn
145 150 155 160
Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu
165 170 175
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser
180 185 190
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp
210 215 220
Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys
245 250 255
Leu Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val
260 265 270
Ala Ser Ser
275
<210> 128
<211> 278
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Vietnam 1203 2004 H5N1
<400> 128
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Lys His Asn Gly Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val
50 55 60
Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys
65 70 75 80
Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
85 90 95
Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln
100 105 110
Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
115 120 125
Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln
130 135 140
Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu
145 150 155 160
Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr
165 170 175
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe
180 185 190
His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu
195 200 205
Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His
210 215 220
Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp
225 230 235 240
Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser
245 250 255
Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr
260 265 270
Ser Thr Val Ala Ser Ser
275
<210> 129
<211> 276
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Hong Kong 1073 1999 H9N2 amino acid sequence
<400> 129
Met Glu Thr Ile Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Ser
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly His Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Thr Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Tyr Val Arg Val Asn Ser
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Arg Ser Ser Arg
65 70 75 80
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly
85 90 95
Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val
100 105 110
Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Lys Ile
115 120 125
Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu
130 135 140
Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn Met Ile
145 150 155 160
Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Val Trp Ala Tyr Asn Ala
165 170 175
Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu His Asp
180 185 190
Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser
195 200 205
Asn Ala Met Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys
210 215 220
Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Arg Arg
225 230 235 240
Lys Tyr Arg Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val
245 250 255
Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr
260 265 270
Val Ala Ser Ser
275
<210> 130
<211> 283
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Wisconsin 67 2005 H3N2 amino acid sequence
<400> 130
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr
50 55 60
Gly Gly Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg
65 70 75 80
Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Gln Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly
85 90 95
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe
100 105 110
Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser
115 120 125
Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile
130 135 140
Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu
145 150 155 160
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys
165 170 175
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn
180 185 190
Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu
195 200 205
Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly
210 215 220
Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile
225 230 235 240
Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn
245 250 255
Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp
260 265 270
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys
275 280
<210> 131
<211> 283
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Brisbane 10 2007 H3N2 amino acid sequence
<400> 131
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Thr
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr
50 55 60
Gly Glu Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg
65 70 75 80
Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly
85 90 95
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe
100 105 110
Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser
115 120 125
Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile
130 135 140
Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu
145 150 155 160
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys
165 170 175
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn
180 185 190
Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu
195 200 205
Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly
210 215 220
Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile
225 230 235 240
Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn
245 250 255
Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp
260 265 270
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys
275 280
<210> 132
<211> 283
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Texas 50 2012 H3N2 amino acid sequence
<400> 132
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
50 55 60
Gly Glu Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg
65 70 75 80
Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly
85 90 95
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe
100 105 110
Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser
115 120 125
Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile
130 135 140
Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu
145 150 155 160
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys
165 170 175
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn
180 185 190
Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu
195 200 205
Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly
210 215 220
Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile
225 230 235 240
Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn
245 250 255
Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp
260 265 270
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys
275 280
<210> 133
<211> 278
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A Netherlands 219 03 H7N7 amino acid sequence
<400> 133
Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Val Ala Ser Ile Pro Thr
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr
20 25 30
Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr
35 40 45
Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn Val Pro Arg Tyr Val Lys Gln Glu Ser
50 55 60
Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys Arg
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly
85 90 95
Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala
100 105 110
Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile
115 120 125
Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln
130 135 140
Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Thr Glu Val Glu Arg Gln Ile
145 150 155 160
Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser
165 170 175
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
180 185 190
Leu Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln
195 200 205
Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe
210 215 220
His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr
225 230 235 240
Asp His Ser Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Ile Gln Asn Arg Ile Gln Ile
245 250 255
Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe
260 265 270
Ser Phe Gly Ala Ser Cys
275
Claims (55)
- 대상체에서 하나 이상의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물로서, 조성물은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 당단백질 또는 그것의 단편, 핵단백질(NP) 항원 또는 그것의 단편, 및 매트릭스-2(M2) 이온 채널 항원 또는 그것의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티닌(HA) 항원 또는 그것의 단편, 뉴라미니다제(NA) 항원 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, 매트릭스 단백질 1(M1) 항원 또는 그것의 단편, 및 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 전장 HA 항원 또는 그것의 단편, HA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, HA-헤드 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NA 항원 또는 그것의 단편, NA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, NA-헤드 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NP 항원 또는 그것의 단편, 전장 M1 항원 또는 그것의 단편, 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널-세포외 도메인 또는 그것의 단편, M2 이온 채널-세포내 도메인 또는 그것의 단편, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, HA 항원은: 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, NA 항원은: 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, NP 항원은: 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, M2 이온 채널 항원은: 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, M1 항원은 서열 번호: 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제4항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 HA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NA 항원 또는 그것의 단편, 전장 NP 항원 또는 그것의 단편, 및 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편의 조합인 것인 조성물.
- 제4항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HA-줄기 도메인, 서열 번호: 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NA 항원, 서열 번호: 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NP 항원, 및 서열 번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 M2 이온 채널 항원의 조합인 것인 조성물.
- 제2항에 있어서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 당단백질 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, 및 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 암호화하는 것인 조성물.
- 제2항에 있어서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 HA 항원 또는 그것의 단편, NA 항원 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, 및 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 암호화하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 24, 서열 번호: 26, 서열 번호: 28, 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 34, 서열 번호: 36, 서열 번호: 38, 서열 번호: 40, 서열 번호: 42, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 48, 서열 번호: 50, 서열 번호: 52, 서열 번호: 54, 서열 번호: 56, 서열 번호: 58, 서열 번호: 60, 서열 번호: 62, 서열 번호: 64, 서열 번호: 66, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 76, 서열 번호: 78, 서열 번호: 80, 서열 번호: 82, 서열 번호: 84, 서열 번호: 86, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 서열 번호: 92, 서열 번호: 94, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 서열 번호: 106, 및 서열 번호: 108로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제15항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 24, 서열 번호: 26, 및 서열 번호: 28로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제15항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는: 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 34, 서열 번호: 36, 서열 번호: 38, 서열 번호: 40, 서열 번호: 42, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 48, 서열 번호: 50, 서열 번호: 52, 및 서열 번호: 54로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제15항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는: 서열 번호: 56, 서열 번호: 58, 서열 번호: 60, 서열 번호: 62, 서열 번호: 64, 서열 번호: 66, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 76, 서열 번호: 78, 및 서열 번호: 80으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제15항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는: 서열 번호: 82, 서열 번호: 84, 서열 번호: 86, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 서열 번호: 92, 서열 번호: 94, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 및 서열 번호: 106으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제15항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 108에 제시된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제15항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 28에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 42에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 68에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 및 서열 번호: 94에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 적어도 하나의 보조제를 추가로 암호화하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제24항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 LNP 내에 캡슐화되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 슈도우리딘을 포함하는 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 1-메틸-슈도우리딘을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 분리된 뉴클레오사이드 변형 RNA는 정제된 뉴클레오사이드 변형 mRNA인 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 조성물은 백신인 것인 조성물.
- 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 당단백질 또는 그것의 단편, NA 항원 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 HA 항원 또는 그것의 단편, NA 항원 또는 그것의 단편, NP 항원 또는 그것의 단편, M1 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 전장 HA 항원 또는 그것의 단편, HA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, HA-헤드 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NA 항원 또는 그것의 단편, NA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, NA-헤드 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NP 항원 또는 그것의 단편, 전장 M1 항원 또는 그것의 단편, 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편, M2 이온 채널-세포외 도메인 또는 그것의 단편, M2 이온 채널-세포내 도메인 또는 그것의 단편, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은: 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 서열 번호: 33, 서열 번호: 35, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 45, 서열 번호: 47, 서열 번호: 49, 서열 번호: 51, 서열 번호: 53, 서열 번호: 55, 서열 번호: 57, 서열 번호: 59, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 67, 서열 번호: 69, 서열 번호: 71, 서열 번호: 73, 서열 번호: 75, 서열 번호: 77, 서열 번호: 79, 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 85, 서열 번호: 87, 서열 번호: 89, 서열 번호: 91, 서열 번호: 93, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 HA-줄기 도메인 또는 그것의 단편, 전장 NA 항원 또는 그것의 단편, 전장 NP 항원 또는 그것의 단편, 및 전장 M2 이온 채널 항원 또는 그것의 단편의 조합인 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 항원은 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HA-줄기 도메인, 서열 번호: 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NA 항원, 서열 번호: 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 NP 항원, 및 서열 번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 M2 이온 채널 항원의 조합인 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 24, 서열 번호: 26, 서열 번호: 28, 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 34, 서열 번호: 36, 서열 번호: 38, 서열 번호: 40, 서열 번호: 42, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 48, 서열 번호: 50, 서열 번호: 52, 서열 번호: 54, 서열 번호: 56, 서열 번호: 58, 서열 번호: 60, 서열 번호: 62, 서열 번호: 64, 서열 번호: 66, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 74, 서열 번호: 76, 서열 번호: 78, 서열 번호: 80, 서열 번호: 82, 서열 번호: 84, 서열 번호: 86, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 서열 번호: 92, 서열 번호: 94, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 서열 번호: 106, 및 서열 번호: 108로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 서열 번호: 28에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 42에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 68에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 및 서열 번호: 94에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 방법은 대상체에게 유효량의 보조제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 유효량의 적어도 하나의 보조제를 추가로 암호화하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 조성물은 LNP를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제41항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 LNP 내에 캡슐화되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 슈도우리딘을 포함하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 1-메틸-슈도우리딘을 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 정제된 뉴클레오사이드 변형 mRNA인 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 조성물은 백신인 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 인플루엔자 바이러스 D, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 HA 1군 바이러스, 인플루엔자 NA 1군 바이러스, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 인플루엔자 HA 1군 바이러스는 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 인플루엔자 NA 1군 바이러스는 N1, N4, N5, N8, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9, H6N1, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 조성물은 피내, 피하, 흡입, 비강내, 및 근육내로 이루어지는 군으로부터 선택된 전달 경로에 의해 투여되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 방법은 조성물의 단일 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 방법은 조성물의 다중 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 방법은 대상체에서 인플루엔자 바이러스와 관련된 감염, 질환, 장애, 또는 그것들의 임의의 조합을 치료 또는 예방하는 것인 방법.
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