KR20240111822A - 노로바이러스 백신 및 사용 방법 - Google Patents

노로바이러스 백신 및 사용 방법 Download PDF

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KR20240111822A
KR20240111822A KR1020247017131A KR20247017131A KR20240111822A KR 20240111822 A KR20240111822 A KR 20240111822A KR 1020247017131 A KR1020247017131 A KR 1020247017131A KR 20247017131 A KR20247017131 A KR 20247017131A KR 20240111822 A KR20240111822 A KR 20240111822A
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KR1020247017131A
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엘레나 아토치나-바쎄르만
드류 와이스먼
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

노로바이러스 VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 노로바이러스 백신 및 노로바이러스 감염과 관련된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 백신의 사용 방법이 제공된다.

Description

노로바이러스 백신 및 사용 방법
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2021년 10월 27일에 출원된 미국 가출원 제63/272,439호에 대한 우선권을 주장하며, 그 출원은 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
인간 노로바이러스(HuNoV)는 전 세계적으로 급성 위장염(acute gastroenteritis)의 가장 흔한 바이러스성 원인으로, 매년 약 2억 건으로 추정되는 사례와 약 200,000명의 어린이 사망을 유발한다. 노로바이러스는 10개의 유전자군으로 분류되며 그 중 5개가 인간을 감염시키고, 인간 감염의 >90%는 유전자군 I 또는 II의 스트레인에 의해 유발되며, 유전자군 II, 유전자형 4가 HuNoV 감염의 대부분 및 몇 년마다 주기적인 질환의 팬데믹 물결을 유발한다.
노로바이러스는 칼리시비리다에(Caliciviridae) 과의 비외피 단일 가닥 포지티브 센스 RNA 바이러스이다. 그것의 게놈은 대략 7.5 kb 내지 7.7 kb 크기이며 3개의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하고; ORF2는 바이러스의 항원성을 결정하는 주요 캡시드 단백질(VP1)을 암호화하며 캡시드의 기저부에 위치한 쉘 도메인으로 이루어진다.
노로바이러스(NoV)는 완전한 주요 캡시드 단백질 VP1 서열을 바탕으로 10개의 유전자군(GI 내지 GX)으로 분류된다. 그러나, GI, GII 및 GIV만이 인간을 감염시킨다.
전 세계적으로 GII.4는 지난 20년 동안 대부분의 국가에서 모든 NoV 발병의 약 70-80%를 차지하는 가장 우세한 유전자형이다.
노로바이러스 질환을 치료하기 위해 승인된 백신이나 특정 치료법은 없다. 그러므로, 개선된 노로바이러스 백신이 기술분야에 필요하다. 본 발명은 이러한 필요를 해결한다.
한 구현예에서, 발명은 적어도 하나의 NoV 항원을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하는 노로바이러스(NoV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, NoV 항원은 p48, 뉴클레오사이드-트라이포스파타제(NTPase), p22, VPg, 프로테아제, 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp), VP1, VP2, 그것의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합이다.
한 구현예에서, NoV 항원은 GI, GII, GIV, GVIII 또는 GIX 유전자군으로부터 유래된다.
한 구현예에서, 조성물은 적어도 2개의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 GI VP1 항원 및 GII VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GI.1 항원, GI.3 VP1 항원, GI.5 VP1 항원, GII.3 VP1 항원 및 GII.4 VP1 항원 중 적어도 2개를 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 NoV VP1 GI.1 항원을 암호화하는 mRNA 분자 및 NoV VP1 GII.4 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 NoV VP1 GI.1 항원, NoV VP1 GII.4 항원, NoV VP1 GI.3 항원 및 NoV VP1 GII.3 항원의 각각을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9 또는 서열 번호:10의 아미노산 서열을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 보조제(adjuvant)를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, mRNA 분자는 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화된다.
한 구현예에서, 조성물은 NoV VP1 항원을 암호화하는 2개 이상의 mRNA 분자를 캡슐화하는 2개 이상의 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, mRNA 분자는 적어도 하나의 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘, 또는 5-메틸-우리딘 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자이다.
한 구현예에서, 발명은 적어도 하나의 NoV 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 노로바이러스(NoV)의 적어도 하나의 스트레인에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, NoV 항원은 p48, 뉴클레오사이드-트라이포스파타제(NTPase), p22, VPg, 프로테아제, 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp), VP1, VP2, 그것의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합이다. 한 구현예에서, NoV 항원은 GI, GII, GIV, GVIII 또는 GIX 유전자군으로부터 유래된다.
한 구현예에서, 방법은 적어도 2개의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 GI VP1 항원 및 GII VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 GI.1 항원, GI.3 VP1 항원, GI.5 VP1 항원, GII.3 VP1 항원 및 GII.4 VP1 항원 중 적어도 2개를 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 NoV VP1 GI.1 항원을 암호화하는 mRNA 분자 및 NoV VP1 GII.4 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 NoV VP1 GI.1 항원, NoV VP1 GII.4 항원, NoV VP1 GI.3 항원 및 NoV VP1 GII.3 항원의 각각을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9 또는 서열 번호:10의 아미노산 서열을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 보조제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화된 적어도 하나의 mRNA 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 NoV VP1 항원을 암호화하는 2개 이상의 mRNA 분자를 캡슐화하는 2개 이상의 LNP의 조합을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘, 또는 5-메틸-우리딘 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 피내, 피하, 흡입, 비강내, 또는 근육내 전달 경로에 의해 투여된다.
한 구현예에서, 방법은 조성물의 단일 투여를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 다중 투여를 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 NoV 감염과 관련된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방한다. 한 구현예에서, NoV 감염과 관련된 질환 또는 장애는 위장염, 식중독(food poisoning), 구토(vomiting) 또는 설사(diarrhea)이다.
발명의 구현예의 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽힐 때 더 잘 이해될 것이다. 발명은 도면으로 도시된 구현예의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다.
도 1은 GI.1/노르워크1968, GII.4/케이프타운2012, GI.3/스웨덴2008, GI.3/아르헨티나2016, GI.3/내슈빌2019, GII.3/캐나다2019, GII.2/UK2015, GII.3/USA2011 및 GII.3/일본2009 바이러스의 캡시드 단백질 VP1 서열을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA가 올바른 단백질을 발현하는 것을 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다. 환원 조건이 사용되었다. 웰당 로딩 - 10 ug; GI.1- 항-노로바이러스(VP1 GI.1 캡시드 단백질), 토끼 다클론성 Rb G1; GII.4 - 항-노로바이러스(VP1 GII.4 캡시드 단백질), 토끼 다클론성 Rb 428, GI.3 - 항-노로바이러스(VP1 GI.3 캡시드 단백질), 토끼 다클론성 Rb 402, GII.3 - 항-노로바이러스(VP1 GII.3 캡시드 단백질), 토끼 다클론성 Rb 397, GAPDH(14C10) - 토끼 mAb(Cell Signaling, # 2118S); o/n +4℃ 인큐베이션, 희석 1:2,500; 이차 GAR-HRP, 1시간 실온, 희석 1:10,000; ECL+.
도 2는 이가 mRNA 백신(GI.1 및 GII.4)을 사용하는 예시의 면역화 도식을 도시한다.
도 3은 최대 180일까지 높은 수준으로 지속되는 차단 항체의 역가를 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
도 4는 백신이 양호하지만, 유전형 특이적 차단 항체 반응을 유도하는 것을 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
도 5는 T 세포 자극 검정을 위한 예시의 면역화 도식을 도시한다.
도 6은 VLP(GI.1, GI.3, GII,3, GII.4)를 사용하는 T 세포 자극 검정의 결과를 도시한다.
도 7은 인간 노로바이러스 이가 mRNA 백신 용량 반응을 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
도 8은 저용량 mRNA 백신이 강력한 Th1 반응을 유도하는 것을 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
도 9는 4가 노로바이러스 mRNA 백신에 대한 예시의 면역화 도식을 도시한다.
도 10은 인간 노로바이러스 4가 백신 용량 반응을 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
도 11은 살아있는 HNoV의 줄기 세포 유래 인간 3D 엔테로이드의 감염을 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
도 12는 살아있는 HNoV의 줄기 세포 유래 인간 3D 엔테로이드의 감염을 입증하는 예시의 이미지를 도시한다.
도 13은 피내(i.d.) 주사에 의해 마우스당 10 μg 백신으로 백신 접종된 mRNA-LNP 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 의한 GII.4 감염에 대한 인간 장 엔테로이드의 보호를 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
도 14는 근육내(i.m.) 주사에 의해 마우스당 0.25 μg 백신으로 백신 접종된 mRNA-LNP 백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 의한 GII.4 감염에 대한 인간 장 엔테로이드의 보호를 입증하는 예시의 실험 데이터를 도시한다.
본 발명은 대상체에서 노로바이러스(NoV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 발명은 하나 이상의 노로바이러스 유전자군으로부터의 적어도 하나의 노로바이러스 주요 캡시드 단백질(VP1)을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 발명은 GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII, GVIII, GIX 또는 GX 유전자군으로부터의 적어도 하나의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 발명은 적어도 2개의 NoV 주요 캡시드 단백질(VP1)을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자(LNP)의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 20개 이상의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자를 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 2개의 VP1은 동일한 NoV 유전자군으로부터 유래된다. 한 구현예에서, 적어도 2개의 VP1은 2개 이상의 상이한 NoV 유전자군으로부터 유래된다.
한 구현예에서, 조성물은 GII로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP 및 GI으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, GI으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, 및 GIV로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII.4로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP 및 GI.1로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII.4로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, GI.1로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, GI.3으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, 및 GII.3으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
발명은 또한 발명의 조성물을 사용하여 노로바이러스 감염을 치료하는 방법 또는 노로바이러스 감염과 관련된 질환 또는 장애, 예컨대 구토 및 설사를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 바, 다음의 각 용어는 본 단락에서 그것과 관련된 의미를 가진다.
단수를 나타내는 단어의 관사("a" 및 "an")은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 "약"은 양, 시간적 기간, 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때, 명시된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, 또는 ±0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미하는데, 그러한 편차는 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다.
용어 "항체"는, 본원에서 사용되는 바, 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 다클론성 항체, 단클론성 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2, 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 및 인간화된 항체를 포함한 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 부분을 지칭하며 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 단편을 들 수 있다.
"항체 중쇄"는, 본원에서 사용되는 바, 자연적으로 발생하는 형태의 모든 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩타이드 중 더 큰 것을 지칭한다.
"항체 경쇄"는, 본원에서 사용되는 바, 자연적으로 발생하는 형태의 모든 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩타이드 중 더 작은 것을 지칭한다. κ 및 λ 경쇄는 두 가지 주요 항체 경쇄 아이소타입을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "합성 항체"라는 용어는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되었고 DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 것인 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 기술분야에서 이용 가능하고 잘 알려져 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 얻어졌다. 용어는 또한 항체를 암호화하는 RNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다. RNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 RNA는 DNA(합성 또는 클로닝된)를 전사하거나, RNA를 합성하거나, 또는 기술분야에서 이용 가능하고 잘 알려져 있는 다른 기술에 의해 얻어졌다.
항체와 관련하여 본원에서 사용되는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 특정 항원을 인식하지만, 실질적으로는 샘플 중의 다른 분자를 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 다른 종으로부터의 그 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 교차 종 반응성은 그 자체로는 항체의 분류를 특정한 것으로 변경시키지는 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 교차 반응성은 그 자체로는 항체의 분류를 특이한 것으로 변경시키지는 않는다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"은 항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학 종과의 상호 작용을 참조하여 사용될 수 있으며, 이것은 그 상호 작용이 화학 종 상의 특정 구조(예컨대, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존하는 것을 의미한다; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 만약 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적이면, 에피토프 A(또는 유리, 미표지 A)를 함유하는 분자의 존재는 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원"은 개체에서 적응성 면역 반응을 유도할 수 있는 문제의 물질을 나타내기 위해 의도되며, 상기 적응성 면역 반응은 병원체와 상당히 관련되는 면역 반응을 유도할 수 있고, 이것은 면역원과 면역학적 특징을 공유한다. "면역원"은 면역 반응을 생성하기 위하여 신체에 도입되는 임의의 물질을 지칭한다. 그 물질은 물리적 분자, 예컨대 단백질이거나, 또는 벡터, 예컨대 DNA, mRNA, 또는 바이러스에 의해 암호화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원" 또는 "Ag"는 적응성 면역 반응을 촉발시키는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역학적으로 유능한 세포의 활성화, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 전문가는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있는 것을 이해할 것이다. 나아가, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA 또는 RNA로부터 유래될 수 있다. 숙련된 전문가는 적응성 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA 또는 RNA가 따라서 본원에서 사용되는 용어인 "항원"을 암호화한다는 것을 이해할 것이다. 나아가, 기술분야에 숙련된 사람은 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 암호화될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은, 한정하는 것은 아니지만, 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오타이드 서열의 사용을 포함하고 이들 뉴클레오타이드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하기 위하여 다양한 조합으로 배열되는 것이 쉽게 나타난다. 더욱이, 숙련된 전문가는 항원이 "유전자"에 의해 전혀 암호화될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 합성으로 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것이 쉽게 나타난다. 그러한 생물학적 샘플에는, 한정하는 것은 아니지만 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체가 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어로서, "면역 반응"은 비제한적인 예로서 T 세포, B 세포, 천연 살해(NK) 세포, 및/또는 항원 제공 세포(APC)에서 이펙터 기능의 활성화 및/또는 유도를 포함한 과정을 의미한다. 그러므로, 면역 반응에는, 숙련된 전문가에 의해 이해되는 것과 같이, 한정하는 것은 아니지만, 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포 활성 또는 반응, 항체의 생성, 항원 제공 세포 활성 또는 침윤, 대식세포 활성 또는 침윤, 호중구 활성 또는 침윤, 등의 임의의 검출 가능한 항원 특이적 활성화 및/또는 유도가 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "면역원성 조성물"은 항원(예컨대, 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 항원을 암호화하는 핵산, 항원 또는 세포 구성요소를 발현하거나 제공하는 세포, 항원 또는 세포 구성요소를 발현하거나 제공하는 바이러스, 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 임의의 펩타이드 항원의 전부 또는 일부, 또는 그것의 면역원적으로 기능적인 동등물을 포함하거나 암호화한다. 다른 구현예에서, 조성물은 추가의 면역자극제 또는 그러한 작용제를 암호화하는 핵산을 포함하는 혼합물로 존재한다. 면역자극제에는 한정하는 것은 아니지만 추가 항원, 면역조절제, 항원 제공 세포, 지질 나노입자, 또는 보조제가 포함된다. 다른 구현예에서, 추가 작용제(들)의 하나 이상은 임의의 조합으로 항원 또는 면역자극제에 공유 결합된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "백신"은 대상체에 접종될 때 면역 반응을 유도하는 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유도된 면역 반응은 보호 면역을 제공한다.
"암호화"는 생물학적 과정에서 규정된 서열의 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 서열의 아미노산 및 그것으로부터 유발된 생물학적 특성을 갖는 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 특정 서열, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 고유한 특성을 지칭한다. 그러므로, 유전자는 만약 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성한다면 단백질을 암호화한다. 그것의 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열에 동일하고 일반적으로 서열 목록으로 제공되는 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비코딩 가닥 모두는 단백질 또는 그 유전자 또는 cDNA의 다른 생성물을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다.
"벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 분리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 한정하는 것은 아니지만 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함한 수많은 벡터가 기술분야에 알려져 있다. 그러므로, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 또한 핵산의 세포로의 전달을 용이하게 하는 비플라스미드 및 비바이러스 화합물, 예컨대, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜, 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 등을 들 수 있다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스 작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터에는 기술분야에 알려져 있는 모든 벡터, 예컨대 재조합 폴리뉴클레오타이드를 통합시키는 코스미드, 플라스미드(예컨대, 네이키드 또는 리포솜에 함유되어 있는), RNA, 및 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 관련 바이러스)가 포함된다.
"상동성"은 두 폴리펩타이드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 비교된 두 서열 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 하위단위에 의해 차지될 때, 예컨대, 만약 두 DNA 분자의 각각의 위치가 아데닌에 의해 차지되면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 사이의 상동성 퍼센트는 두 서열에 의해 공유된 매칭 또는 상동성 위치의 수를 비교 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 만약 두 서열의 위치 10개 중 6개가 매칭되거나 상동성이면 두 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 두 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬될 때 이루어진다.
본원에서 사용되는 바, 뉴클레오타이드 서열은 본원에 기술된 임의의 뉴클레오타이드 서열에 대해 그것의 뉴클레오타이드 서열이 원래의 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성 정도를 가질 때 "실질적으로 상동성"이다.
본원에서 사용되는 바, 아미노산 서열은 본원에 기술된 임의의 아미노산 서열에 대해 그것의 아미노산 서열이 원래의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성 정도를 가질 때 "실질적으로 상동성"이다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성은 BLASTN 알고리즘을 사용함으로써 결정될 수 있다(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)).
핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 그것의 일부의 보체; (iii) 참조된 핵산 또는 그것의 보체에 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 또는 그것의 보체, 또는 그것에 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산을 지칭한다. 변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 그것의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 그것의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용된 용어 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존성 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭할 수 있다. 아미노산의 보존성 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예컨대, 친수성, 대전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 기술분야에서 전형적으로 미미한 변화를 포함하는 것으로 인식된다. 이들 미미한 변화는 부분적으로, 기술분야에서 이해되는 것과 같이, 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 확인될 수 있다(Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132). 아미노산의 소수성 지수는 아미노산의 소수성(hydrophobicity) 및 전하를 고려하는 것을 토대로 한다. 유사한 소수성 지수의 아미노산은 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 유지하는 것이 기술분야에 알려져 있다. 한 측면으로, ±2의 소수성 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 초래할 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성의 고려는, 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 그 펩타이드의 가장 큰 국지성 평균 친수성의 계산을 허용한다. 미국 특허 제4,554,101호의 전체 내용이 완전히 본원에 포함된다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은, 기술분야에서 이해되는 것과 같이, 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 유지하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 모두는 그 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그런 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 부합하는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 밝혀지는 것과 같이, 아미노산의 상대적인 유사성, 특히 그런 아미노산의 측쇄에 따라 달라지는 것으로 이해된다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 그것의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 그것의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "단편" 또는 "기능적 단편"은 대상체에게 투여될 때 증가된 면역 반응을 제공하는 항원 단편 또는 항원을 암호화하는 핵산 서열의 단편을 지칭한다. 단편은 일반적으로 10개 이상의 아미노산 또는 핵산이다. "단편"은 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 항원의 단편은 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있거나 없는 각각의 경우에, N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산이 누락된 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 첨가된 임의의 이종성 신호 펩타이드를 배제하고, 특정 전장 항원의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 퍼센트의 길이를 포함할 수 있다. 단편은 항원에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드의 단편을 포함할 수 있고 추가적으로 퍼센트 동일성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 포함한다.
항원을 암호화하는 핵산 서열의 단편은 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 암호화하는 서열이 있거나 없는 각각의 경우에, 5' 및/또는 3' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 생략된 것을 제외하고 전장에 대해 100% 동일할 수 있다. 단편은 첨가된 임의의 이종성 신호 펩타이드를 배제하고, 특정 전장 코딩 서열의 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있다. 단편은 항원에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 단편을 포함할 수 있고 추가적으로 퍼센트 동일성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 선택적으로 포함한다.
"분리된"은 천연 상태로부터 변경된 또는 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 대상체에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 분리된 것이 아니지만, 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "분리된" 것이다. 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비천연 환경에서 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 뉴클레오사이드(N-글리코시드 연결을 통해 리보스 또는 데옥시리보스 당에 결합된 핵염기)에 대한 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시티딘을 지칭하며, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하며, "U"는 우리딘을 지칭한다.
다르게 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"에는 서로의 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이란 구절은 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 버전에서는 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다. 더불어, 뉴클레오타이드 서열은 세포에서 번역 기계에 의해 번역될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드를 함유할 수 있다. 예시의 변형된 뉴클레오사이드는 본원의 다른 곳에서 기술된다. 예를 들어, 예컨대 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이, 우리딘의 일부 또는 전부가 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘, 5-메틸-우리딘 또는 또 다른 변형된 뉴클레오사이드로 대체된 mRNA. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이, 일부 또는 모든 시티딘이 메틸화된 시티딘, 또는 또 다른 변형된 뉴클레오사이드로 대체된 서열을 함유할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종성 핵산 서열 사이의 기능적 연결이 후자의 발현을 초래하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 또는 RNA 서열은 연속적이고, 두 단백질 코딩 영역을 연결시키는 것이 필요한 경우에 동일한 리딩 프레임에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 사슬로서 정의된다. 나아가, 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 그러므로, 본원에서 사용되는 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 상호교환이 가능하다. 기술분야에 숙련된 사람은 핵산이 가수분해되어 단량체 "뉴클레오타이드"로 될 수 있는 폴리뉴클레오타이드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오타이드에는, 한정하는 것은 아니지만, 제한 없이, 재조합 수단, 즉, 통상적인 클로닝 기술 및 PCRTM 등을 사용하여 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열을 클로닝하는 것을 포함하여, 기술분야에서 이용 가능한 임의의 수단에 의해, 그리고 합성 수단에 의해 얻어진 모든 핵산 서열이 포함된다.
일부 경우에, 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 "뉴클레오사이드 변형 핵산"으로, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 핵산을 지칭한다. "변형된 뉴클레오사이드"는 변형이 있는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 예를 들어, 100개를 넘는 상이한 뉴클레오사이드 변형이 RNA에서 확인되었다(Rozenski, et al., 1999, The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197).
본원에서 사용되는 바, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 서열 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 폴리펩타이드에는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질이 포함된다. 본원에서 사용되는 바, 용어는 예를 들어 기술분야에서 또한 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로서 지칭되는 짧은 사슬, 및 일반적으로 기술분야에서 단백질로서 지칭되며 많은 유형이 있는 더 긴 사슬 모두를 지칭한다. "폴리펩타이드"에는, 예를 들어, 다른 것들 중에서도 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종 이량체, 이종 이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질이 포함된다. 폴리펩타이드애는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이것들의 조합이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오타이드 서열의 특정 전사를 개시하기 위해 필요한, 세포의 합성 기계에 의해 인식되거나, 또는 합성 기계에 도입된 DNA 서열로서 정의된다. 하나의 비제한적인 예로서, 박테리오파지 RNA 중합효소에 의해 인식되며 시험관내 전사에 의해 mRNA를 생성하기 위해 사용되는 프로모터가 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보조제"는 항원 특이적 적응성 면역 반응을 향상시키기 위한 임의의 분자로서 정의된다.
일부 구현예에서, "슈도우리딘"은 m1acp3Ψ(1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필) 슈도우리딘)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 m1Ψ(1-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 Ψm(2'-O-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 m5D(5-메틸다이하이드로우리딘)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 m3Ψ(3-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 추가로 변형되지 않은 슈도우리딘 모이어티를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 위의 슈도우리딘 중 임의의 것의 모노포스페이트, 다이포스페이트, 또는 트라이포스페이트를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 슈도우리딘을 지칭한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
용어 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질을 포함하고, 나노미터(예컨대, 1-1,000 nm) 정도의 적어도 하나의 크기를 갖는 입자를 지칭한다.
용어 "지질"은 지방산(예컨대, 에스테르)의 유도체이며 일반적으로 물에 불용성이지만 많은 유기 용매에 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물의 그룹을 지칭한다. 지질은 일반적으로 적어도 3개 부류로 나누어진다: (1) 지방 및 오일뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질".
본원에서 사용되는 바, 용어 "양이온성 지질"은 양이온성이거나 또는 pH가 지질의 이온화 기의 pK 미만으로 낮아짐에 따라 양이온이 되지만(양성자화됨), 더 높은 pH 값에서 점진적으로 더 중성인 지질을 지칭한다. pK 미만의 pH 값에서, 지질은 음전하 핵산과 회합될 수 있게 된다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 pH가 감소할 때 양전하를 가정하는 양쪽성 이온성 지질을 포함한다.
용어 "중성 지질"은 생리적 pH에서 비전하 또는 중성 양쪽성 이온성 형태로 존재하는 다양한 지질 종 중 임의의 하나를 지칭한다. 대표적인 중성 지질에는 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 다이하이드로 스핑고미엘린, 세팔린, 및 세레브로사이드가 포함된다.
용어 "음이온성 지질"은 생리적 pH에서 음전하인 임의의 지질을 지칭한다.
용어 "중합체 콘쥬게이션된 지질"은 지질 부분 및 중합체 부분 모두를 포함하는 분자를 지칭한다. 중합체 콘쥬게이션된 지질의 예는 페길화된 지질이다.
용어 "페길화된 지질"은 지질 부분 및 폴리에틸렌 글리콜 부분 모두를 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화된 지질은 기술분야에 알려져 있고 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-s-DMG) 등이 포함된다.
"리포솜"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 멤브레인과 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 가지는 것으로 특성화될 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리되는 다수의 지질 층을 가진다. 그것은 인지질이 과잉의 수성 용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성요소는 닫힌 구조가 형성되기 전에 자가 재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상적인 소포 구조보다는 용액에 상이한 구조를 가지는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셸 구조를 가정하거나 또는 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
용어 "대상체", "환자", "개체", 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 본원에 기술된 방법을 따를 수 있는 임의의 동물, 또는 시험관내에 있거나 제자리에 있는 그것의 세포를 지칭한다. 일부 비제한적인 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 포유류, 조류, 가금류, 소, 돼지, 말, 양, 흰족제비, 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 박쥐, 또는 인간이다.
"질환"은 대상체가 항상성을 유지할 수 없고, 만약 질환이 개선되지 않는다면 대상체의 건강이 계속해서 악화되는 대상체의 건강 상태이다.
대조적으로, 대상체에서 "장애"는 대상체가 항상성을 유지할 수는 있지만, 대상체의 건강 상태는 장애가 없을 때보다는 좋지 않은 건강 상태이다. 치료되지 않는 상태로 놓아둔다면, 장애는 반드시 대상체의 건강 상태의 추가 감소를 유발하지는 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "조절하는"은 치료 또는 화합물이 없을 때 대상체의 반응 수준과 비교되고/거나, 다른 것은 동일하지만 치료되지 않은 대상체의 반응 수준과 비교된 대상체의 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 용어는 대상체, 예컨대 인간에서 유익한 치료 반응을 매개함으로써 고유 신호 또는 반응을 교란하고/거나 영향을 미치는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 용어로서 질환을 "치료"하는 것은 대상체가 겪고 있는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 신호 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "유효량"은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료적 효과는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 신호 또는 증상의 억제, 감소, 관해, 예방, 또는 근절에 의해 얻어진다.
용어 "치료적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 대상 화합물의 양을 지칭한다. 용어 "치료적 유효량"은 투여될 때, 치료되는 장애 또는 질환의 신호 또는 증상 중 하나 이상의 발병을 예방하기에 충분하거나 어느 정도 완화시키는 화합물의 양을 포함한다. 치료적 유효량은 화합물, 질환 및 그것의 중증도 및 치료되는 대상체의 연령, 체중, 등에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 숙주 세포에 전달되거나 도입된 외인성 핵산에 의한 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산에 의해 형질감염되었거나, 형질전환되었거나 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 그것의 자손을 포함한다.
본원에서 사용되는 구절 "전사 제어 하에" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터가 RNA 중합효소의 전사의 개시 및 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어하기 위하여 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 정확한 위치와 방향에 있는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "추가 성분"에는, 한정하는 것은 아니지만, 다음 중 하나 이상이 포함된다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 비활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 젤라틴과 같은 생리적으로 분해 가능한 조성물; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생물질; 항진균제; 안정화제; 및 약학적으로 허용 가능한 중합체 또는 소수성 물질. 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)]에 기술되어 있다.
범위: 본 명세서 전체에서, 발명의 다양한 측면은 범위 방식으로 제시될 수 있다. 범위 방식의 기술은 단지 편리성 및 간결성을 위한 것임이 이해되어야 하고 발명의 범주에 대한 완고한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기술은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수치 값을 가지는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같이 구체적으로 개시된 하위단위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 가지는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
설명
본 발명은 대상체에서 노로바이러스의 하나 이상의 스트레인에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 발명은 GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII, GVIII, GIX 또는 GX 유전자군으로부터의 적어도 하나의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자이다.
일부 구현예에서, 발명은 적어도 2개의 NoV 주요 캡시드 단백질(VP1)을 암호화하는 mRNA 분자(예컨대, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자)의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 20개 이상의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자(예컨대, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자)를 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 2개의 VP1은 동일한 NoV 유전자군 내의 상이한 스트레인으로부터 유래된다. 한 구현예에서, 적어도 2개의 VP1은 2개 이상의 상이한 NoV 유전자군으로부터 유래된다.
한 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 GII 스트레인으로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자 및 적어도 하나의 GI 스트레인으로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자, GI으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, 및 GIV로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII.4로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자 및 GI.1로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII.4로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자, GI.1로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자, GI.3으로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자, 및 GII.3으로부터의 VP1을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 20개 이상의 추가 바이러스 항원을 암호화하는 mRNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 바이러스 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 치쿤구니야열 바이러스(CHIKV), 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV), 폴리오 바이러스, 간염 바이러스, 예를 들어, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), 및 E형 간염 바이러스(HEV), 천연두 바이러스(천연두창 메이저 및 마이너), 백시니아 바이러스, 리노바이러스, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스, 황색열 바이러스, 노르워크 바이러스, A형 간염 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV-I), 털세포 백혈병 바이러스(HTLV-II), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 한타 바이러스(출혈열), 광견병 바이러스, 에볼라열 바이러스, 마르부르크 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 1(구강 포진), 단순 포진 2(생식기 포진), 대상포진(수두-대상포진, 일명 수두), 사이토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어 인간 CMV, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 플라비바이러스, 수족구 바이러스, 라사바이러스, 아레나바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MCV), 인플루엔자 바이러스, 한정하는 것은 아니지만 중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스 2를 포함한 코로나바이러스, 암 유발 바이러스, 또는 이것들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 추가 바이러스 항원은 NoV 항원이다. 예시의 추가 NoV 항원에는, 한정하는 것은 아니지만, p48, 뉴클레오사이드-트라이포스파타제(NTPase), p22, VPg, 프로테아제, 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp), VP1, VP2, 그것의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합이 포함된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자(예컨대, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자)는 하나 이상의 LNP에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII, GVIII, GIX 또는 GX 유전자군으로부터의 적어도 하나의 VP1 항원을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 변형 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII, GVIII, GIX 또는 GX 유전자군으로부터의 적어도 2개의 VP1 항원의 조합을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 RNA 분자를 포함하는 LNP의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 20개 이상의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 GII 스트레인으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP 및 적어도 하나의 GI 스트레인으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, GI으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, 및 GIV로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII.4로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP 및 GI.1로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 GII.4로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, GI.1로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, GI.3으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP, 및 GII.3으로부터의 VP1을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 LNP의 조합을 포함한다.
백신
한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 노로바이러스(NoV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신이다. 조성물이 백신으로서 유용하기 위해, 조성물은 세포, 조직 또는 대상체에서 노로바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하여야 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포, 조직 또는 대상체에서 NoV의 다수의 스트레인에 대해 광범위한 면역 반응을 유도한다. 일부 경우에, 백신은 대상체에서 보호 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 백신은 핵산 및/또는 세포 구성요소의 조성이 달라질 수 있다. 한 구현예에서, 백신은 NoV VP1 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 백신은 2개 이상의 NoV 유전자군으로부터의 NoV VP1 항원을 암호화하는 핵산 분자의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 백신은 NoV GII의 하나 이상의 스트레인 및 NoV GI의 하나 이상의 스트레인으로부터의 NoV VP1 항원을 암호화하는 핵산 분자의 조합을 포함한다.
비제한적인 예에서, NoV VP1 항원을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자는 또한 보조제와 함께 제형화될 것이다. 또 다른 비제한적인 예에서, 백신은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신, 및 그것의 다양한 구성요소는, 본 개시의 측면에서, 본원에 개시된 또는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조되고/거나 투여될 수 있다.
다양한 구현예에서, NoV VP1 항원의 발현에 의한 면역의 유도는 생체내 또는 시험관내에서 하나 이상의 NoV VP1 항원에 대해 숙주의 면역 체계의 전부 또는 임의의 일부의 반응을 관찰함으로써 검출될 수 있다.
예를 들어, 세포독성 T 림프구의 유도를 검출하는 방법이 잘 알려져 있다. 살아있는 체내에 진입하는 외래 물질은 항원 제공 세포(APC)의 작용에 의해 T 세포 및 B 세포에 제공된다. 항원 특이적 방식으로 APC에 의해 제공된 항원에 반응하는 일부 T 세포는 항원에 의한 자극으로 인해 세포독성 T 세포(또한 세포독성 T 림프구 또는 CTL로도 언급됨)로 분화한다. 그런 후 이들 항원 자극된 세포는 증식한다. 이 과정은 본원에서 T 세포의 "활성화"로서 언급된다. 그러므로, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 이것들의 조합의 에피토프에 의한 CTL 유도는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 이것들의 조합의 에피토프를 APC에 의해 T 세포에 제공하고, CTL의 유도를 검출함으로써 평가될 수 있다. 나아가, APC는 B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포, 호산구 및 NK 세포를 활성화하는 효과를 가진다.
APC로서 수지상 세포(DC)를 사용하여 CTL의 유도 작용을 평가하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. DC는 APC 중에서 왕성한 CTL 유도 작용을 가지는 대표적인 APC이다. 발명의 방법에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 이것들의 조합의 에피토프는 초기에 DC에 의해 발현된 후 이 DC가 T 세포와 접촉된다. DC와 접촉된 후 관심 있는 세포에 대한 세포독성 효과를 가진 T 세포의 검출은 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 이것들의 조합의 에피토프가 세포독성 T 세포를 유도하는 활성을 가진다. 나아가, 유도된 면역 반응은 또한 항-IFN-감마 항체를 사용하여 가시화함으로써, 예컨대 ELISPOT 검정에 의해 고정된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합을 운반하는 항원 제공 세포의 존재 하에 CTL에 의해 생성되고 방출된 IFN-감마를 측정함으로써 조사될 수 있다.
DC와 별도로, 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 또한 APC로서 사용될 수 있다. CTL의 유도는 PBMC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 배양함으로써 향상되는 것으로 보고된다. 유사하게, CTL은 PBMC를 키호울 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 IL-7의 존재 하에 배양함으로써 유도되는 것으로 나타났다.
이들 방법에 의해 CTL 유도 활성을 가지는 것으로 확인된 항원은 DC 활성화 효과 및 후속하는 CTL 유도 활성을 가지는 항원이다. 나아가, APC에 의한 항원의 제공으로 인한 획득된 세포독성을 가지는 CTL은 또한 항원 관련 장애에 대한 백신으로서 사용될 수 있다.
NoV 항원의 발현에 의한 면역의 유도는 NoV 항원에 대한 항체 생성의 유도를 관찰함으로써 추가로 확인될 수 있다. 예를 들어, 항원에 대한 항체가 항원을 암호화하는 조성물로 면역화된 실험실 대상체에서 유도될 때, 그리고 항원 관련 병리가 그런 항체에 의해 억제될 때, 조성물은 면역을 유도하는 것으로 결정된다.
대상체에서 유도된 항체 반응의 특이성에는 전달된 항원의 많은 영역에 대한 결합뿐만 아니라 감염을 예방하거나 질환 중증도를 감소시키는 중화 가능 항체의 유도가 포함될 수 있다.
NoV 항원의 발현에 의한 면역의 유도는 T 세포, 예컨대 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합의 유도를 관찰함으로써 추가로 확인될 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 또한 표적 세포를 용해할 수 있지만, 주로 CTL 및 항체 생성을 포함하여 다른 유형의 면역 반응의 유도에 도움을 제공한다. CD4+ T 세포 도움의 유형은 Th1, Th2, Th9, Th17, T조절(Treg), 또는 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포로서 특성화될 수 있다. CD4+ T 세포의 각 하위유형은 특정 유형의 면역 반응에 대한 도움을 공급한다. 한 구현예에서, 조성물은 강력한 항체 반응을 구동시키는 T 여포 헬퍼 세포를 선택적으로 유도한다.
발명의 치료 화합물 또는 조성물은 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는(또는 민감한) 대상체에게 예방적으로(즉, 질환 또는 장애를 예방하기 위해) 또는 치료적으로(즉, 질환 또는 장애를 치료하기 위해) 투여될 수 있다. 그러한 대상체는 표준 임상 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예방적 투여는 질환의 명백한 임상 증상이 나타나기 전에 발생함으로서, 질환 또는 장애가 진행이 방지되거나 또는 대안적으로 지연된다. 의학 분야의 맥락에서, 용어 "예방한다"는 질환으로부터 사망률 또는 이병률의 부담을 감소시키는 임의의 활성을 포함한다. 예방은 일차, 이차 및 삼차 예방 수준에서 발생할 수 있다. 일차 예방이 질환의 발생을 피하는 것인 한편, 이차 및 삼차 수준의 예방은 질환의 진행 및 증상의 출현을 예방하는 것뿐만 아니라 기능을 복원시키고 질환 관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적 영향을 감소시키는 것을 목표로 하는 활성을 포함한다.
항원
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 노로바이러스(NoV) 항원을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함한다. 발명의 조성물에 포함될 수 있는 노로바이러스 항원에는, 한정하는 것은 아니지만 p48, 뉴클레오사이드-트라이포스파타제(NTPase), p22, VPg, 프로테아제, 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp), VP1, VP2, 그것의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합이 포함된다.
한 구현예에서, 항원은 VP1 항원이다. 한 구현예에서, VP1 항원은 GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII, GVIII, GIX 또는 GX 유전자군으로부터 유래된다. 한 구현예에서, VP1 항원은 GI, GII, GIV, GVIII 또는 GIX 유전자군으로부터 유래된다. 한 구현예에서, VP1 항원은 GII.3, GII.4, GI.1, GI.3, GI.5 또는 이것들의 임의의 조합으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 백신은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 20개 이상의 추가 바이러스 항원을 암호화하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 바이러스 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 치쿤구니야열 바이러스(CHIKV), 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV), 폴리오 바이러스, 간염 바이러스, 예를 들어, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), 및 E형 간염 바이러스(HEV), 천연두 바이러스(천연두창 메이저 및 마이너), 백시니아 바이러스, 리노바이러스, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스, 황색열 바이러스, 노르워크 바이러스, A형 간염 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV-I), 털세포 백혈병 바이러스(HTLV-II), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 한타 바이러스(출혈열), 광견병 바이러스, 에볼라열 바이러스, 마르부르크 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 1(구강 포진), 단순 포진 2(생식기 포진), 대상포진(수두-대상포진, 일명 수두), 사이토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어 인간 CMV, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 플라비바이러스, 수족구 바이러스, 라사바이러스, 아레나바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MCV), 인플루엔자 바이러스, 한정하는 것은 아니지만 중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스 2를 포함한 코로나바이러스, 암 유발 바이러스, 또는 이것들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 추가 바이러스 항원은 NoV 항원이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물은 NoV GI, GII 및 GIV 유전자군으로부터의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 이상의 NoV VP1 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체의 조합을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, NoV VP1 항원은 전장 VP1 항원, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다.
한 구현예에서, NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자는 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9 또는 서열번호:10을 암호화한다.
한 구현예에서, NoV VP1 항원을 암호화하는 핵산 분자는 태그 또는 신호 펩타이드(SP)를 암호화하는 서열을 포함하다. 사용될 수 있는 다른 신호 펩타이드에는, 한정하는 것은 아니지만, IL-2, tPA, 마우스 및 인간 IgG로부터 유래된 신호 서열, 및 합성 최적화된 신호 서열이 포함된다. 일부 경우에, 핵산 서열은 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결되는 링커 또는 태그 서열을 암호화하는 추가 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, NoV VP1 항원은 본원에 기술된 NoV VP1 항원의 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이고 원래의 아미노산 서열의 면역원성 기능을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, NoV VP1 항원을 암호화하는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9 또는 서열번호:10의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성 정도를 가진다.
보조제
한 구현예에서, 조성물은 보조제를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 보조제를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 보조제 암호화 핵산 분자는 IVT RNA이다. 한 구현예에서, 보조제 암호화 핵산 분자는 뉴클레오사이드 변형 RNA이다. 한 구현예에서, 보조제 암호화 핵산 분자는 뉴클레오사이드 변형 mRNA이다.
예시의 보조제로는, 한정하는 것은 아니지만, 알파 인터페론, 감마 인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포 유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선 발현 케모카인(TECK), 점막 관련 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86을 들 수 있다. 유용한 보조제일 수 있는 다른 작용제로는 다음을 암호화하는 것들을 들 수 있다: MCP-I, MIP-Ia, MIP-Ip, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-I, VLA-I, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-I, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-I, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-I, Ap-I, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2, 항-CTLA4-sc, 항-LAG3-Ig, 항-TIM3-Ig, 및 이것들의 기능적 단편.
일부 구현예에서, 조성물은 LNP를 포함하며, LNP는 보조제로서 작용한다.
핵산
한 구현예에서, 발명은 적어도 하나의 NoV 항원을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자(예컨대, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자)를 포함한다. 발명의 mRNA 분자에 의해 암호화될 수 있는 노로바이러스 항원에는, 한정하는 것은 아니지만 p48, 뉴클레오사이드-트라이포스파타제(NTPase), p22, VPg, 프로테아제, 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp), VP1, VP2, 그것의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합이 포함된다.
한 구현예에서, mRNA 분자는 VP1 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, VP1 항원은 GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII, GVIII, GIX 또는 GX 유전자군으로부터 유래된다. 한 구현예에서, VP1 항원은 GI, GII, GIV, GVIII 또는 GIX 유전자군으로부터 유래된다. 한 구현예에서, VP1 항원은 GII.3, GII.4, GI.1, GI.3 또는 GI.5 또는 이것들의 임의의 조합으로부터 유래된다.
핵산 분자는, 한정하는 것은 아니지만, 시험관내 전사, 화학적 합성, 등을 포함하는 기술분야의 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 기술된 적어도 하나의 NoV 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 결과적으로 생성된 폴리뉴클레오타이드가 발명에 따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 조건 하에 원래의 뉴클레오타이드 서열과 관련된 서열 변이, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입 및/또는 결실을 대안적으로 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 범주는 본원에서 인용된 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상동성이거나 실질적으로 동일하며 발명의 NoV 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상동성인 뉴클레오타이드 서열은 전형적으로, 예를 들어 보존성 또는 비보존성 치환을 도입함으로써 뉴클레오타이드 서열에 함유된 정보를 바탕으로 하여 항원을 생산하는 유기체로부터 분리될 수 있다. 가능한 변형의 다른 예로는 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 서열의 말단 중 임의의 말단에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 또는 서열의 임의의 말단에 또는 내부에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 들 수 있다. 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 동일성 정도는 기술분야에 숙련된 사람들에게 광범위하게 알려져 있는 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 결정된다.
추가로, 발명의 범주는 본원에 인용된 아미노산에 대해 실질적으로 상동성이고 원래의 아미노산 서열의 면역원성 기능을 보존하는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 발명은 NoV VP1 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 발명은 복수의 NoV 항원을 암호화하는 복수의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 발명은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 NoV VP1 항원을 암호화하는 복수의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 발명은 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 발명은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 NoV VP1 항원을 암호화하는 복수의 뉴클레오타이드 서열 및 보조제의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 복수의 구성물을 포함하며, 각각의 구성물은 NoV VP1 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, 복수의 NoV VP1 항원은 NoV 유전자군 GI, GII, GIV, GVIII 또는 GIX 또는 이것들의 임의의 조합으로부터 유래된다. 한 구현예에서, 조성물은 NoV GII.4 VP1 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 구성물; 및 NoV GI.1 VP1 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 구성물을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 NoV GII.4 VP1 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 구성물; NoV GI.1 VP1 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 구성물, NoV GII.3 VP1 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 구성물, 및 NoV GI.3 VP1 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 구성물을 포함한다. 한 구현예에서, NoV GI.1 항원을 암호화하는 mRNA 분자는 서열번호:1 또는 서열번호:2의 아미노산 서열을 암호화한다. 한 구현예에서, NoV GII.4 항원을 암호화하는 mRNA 분자는 서열번호:3 또는 서열번호:4의 아미노산 서열을 암호화한다. 한 구현예에서, NoV GI.3 항원을 암호화하는 mRNA 분자는 서열번호:5 또는 서열번호:6의 아미노산 서열을 암호화한다. 한 구현예에서, NoV GII.3 항원을 암호화하는 mRNA 분자는 서열번호:7 또는 서열번호:8의 아미노산 서열을 암호화한다. 한 구현예에서, NoV GI 항원을 암호화하는 mRNA 분자는 서열번호:9 또는 서열번호:10의 아미노산 서열을 암호화한다.
또 다른 특정 구현예에서, 구성물은 번역 제어 요소에 작동 가능하게 결합된다. 구성물은 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해 작동 가능하게 결합된 조절 서열을 통합함으로써 발현 카세트를 형성한다.
벡터
발명의 NoV 항원(들)을 코딩하는 핵산 서열(들)은 기술분야에 알려져 있는 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 표준 기법을 사용하여, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 핵산 서열을 포함하는 것으로 알려져 있는 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 핵산 서열을 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 분리함으로써 얻어질 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 유전자는 합성에 의해 제조될 수 있다.
핵산 분자는 다양한 유형의 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은, 한정하는 것은 아니지만 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, PCR 생성된 선형 DNA 서열, 및 코스미드를 포함한 벡터에 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 서열분석 벡터 및 시험관내 전사에 최적화된 벡터가 포함된다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단에는 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 에멀젼을 포함한 지질 기반 시스템, 미셸, 혼합 미셸, 탄수화물, 펩타이드, 양이온성 중합체, 및 리포솜이 포함된다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시의 콜로이드 시스템은 리포솜(예컨대, 인공 막 소포)이다.
비바이러스 전달 시스템이 활용되는 경우에, 예시의 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제형의 사용은 핵산의 숙주 세포로의 도입(시험관내, 생체외 또는 생체내)에 대해 고려된다. 또 다른 측면으로, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 이중층 내에 분산되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 회합되는 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 갇히거나, 리포솜과 복합체를 형성하거나, 지질을 함유한 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 현탁액으로서 함유되거나, 미셸에 함유되거나 복합체를 형성하거나, 또는 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/RNA 또는 지질/발현 벡터 회합된 조성물은 용액에서 임의의 특정 구조로 한정되지 않는다. 예를 들어, 그것은 이중층 구조로, "붕괴된" 구조와 함께 존재할 수 있다. 그것은 또한 단순하게 용액에 산재되어, 크기나 모양이 균일하지 않은 집합체를 형성할 가능성이 있을 수 있다. 지질은 자연적으로 발생하는 지질이거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질에는 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 긴 사슬 지방족 탄화수소를 함유하는 화합물 부류 및 그것의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드가 포함된다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 다이미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma사(St. Louis, MO)로부터 얻을 수 있고; 다이세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories사(Plainview, NY)로부터 얻을 수 있으며; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring사로부터 얻을 수 있고; 다이미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.사(Birmingham, AL)로부터 얻을 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 쉽게 증발되기 때문에 사용된다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위해 또는 달리 본 발명의 조성물에 세포를 노출시키기 위해 사용된 방법과 관계없이, 숙주 세포의 mRNA 서열의 존재를 확인하기 위하여 다양한 검정이 수행될 수 있다. 그러한 검정에는, 예를 들어, 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 노던 블롯팅 및 RT-PCR; "생화학적" 검정, 예컨대 면역원성 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 또는 발명의 범주 내에 속하는 작용제를 확인하기 위해 본원에서 기술된 검정에 의한, 예컨대 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출이 포함된다.
시험관내 전사된 RNA
한 구현예에서, 발명의 조성물은 발명의 NoV 항원을 암호화하는 시험관내 전사된(IVT) RNA 분자의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, IVT RNA는 일시적 형질감염의 형태로 세포에 도입될 수 있다. RNA는 합성에 의해 생성된 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 있는 DNA는 PCR에 의해 적절한 프라이머 및 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다. 한 구현예에서, 시험관내 전사를 위한 원하는 주형은 적응성 면역 반응을 유도할 수 있는 NoV 항원이다. 한 구현예에서, 시험관내 전사를 위한 원하는 주형은 적응성 면역 반응을 향상시킬 수 있는 보조제이다.
한 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터 자연적으로 발생하는 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, DNA는 유전자 일부의 관심 있는 전장 유전자이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 미번역 영역(UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 진균을 포함한 병원성 또는 공생 유기체로부터의 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하여, 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 진균을 포함한 병원성 또는 공생 유기체로부터 유래된다. DNA는 대안적으로 자연적으로 발생하는 유기체에서 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시의 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 결찰되는 DNA 부분은 단일 유기체로부터 또는 하나 이상의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR을 위한 DNA의 공급원으로서 사용될 수 있는 유전자에는 유기체에서 적응성 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자가 포함된다. 일부 경우에, 유전자는 단기 치료에 유용하다. 일부 경우에, 유전자는 발현된 유전자의 투여량과 관련하여 제한된 안전성 문제를 가진다.
다양한 구현예에서, 형질감염에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 플라스미드가 사용된다.
안전성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 가진 화학적 구조가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 5' 및 3' UTR을 가지고 있다. 한 구현예에서, 5' UTR은 0 내지 3000개 뉴클레오타이드 길이이다. 코딩 영역에 첨가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 한정하는 것은 아니지만, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR을 위한 프라이머를 설계하는 것을 포함한 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하면, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 전사된 RNA의 형질감염 후에 최적의 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형할 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 있는 유전자에 대한 자연적으로 발생하는 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머에 통합시키거나 또는 임의의 다른 주형 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열에서 AU 풍부한 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 3' UTR은 기술분야에 잘 알려져 있는 UTR의 특성을 토대로 전사된 RNA의 안정성을 증가시키기 위해 선택되거나 설계될 수 있다.
한 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 5' UTR이 위에서 기술된 것과 같이 PCR에 의해 첨가될 때, 공통 Kozak 서열은 5' UTR 서열을 첨가함으로써 재설계될 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사체의 번역의 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효과적인 번역을 가능하게 하기 위해 필요한 것으로 나타나지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 Kozak 서열에 대한 필요조건은 기술분야에 알려져 있다. 다른 구현예에서 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서 다양한 뉴클레오타이드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 3' 또는 5' UTR에서 사용될 수 있다.
DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해, 전사 프로모터가 전사될 서열의 상류에서 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 중합효소에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 첨가될 때, RNA 중합효소 프로모터는 전사될 오픈 리딩 프레임의 상류에서 PCR 생성물에 통합하게 된다. 한 구현예에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같이 T7 RNA 중합효소 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터에는, 한정하는 것은 아니지만, T3 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터가 포함된다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오타이드 서열은 기술분야에 알려져 있다.
한 구현예에서, mRNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 상의 캡 및 3' 폴리(A) 꼬리 모두를 가지고 있다. 예를 들어 플라스미드 DNA와 같은 원형 DNA 주형 상에서, RNA 중합효소는 긴 콘카테머 생성물을 생성하는데, 그것은 진핵 세포에서 발현에 적합하지 않다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 정상적인 크기의 mRNA를 초래하며, 그것은 전사 후 폴리아데닐화될 때 진핵세포의 형질감염에 효과적이다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 중합효소는 전사체의 3' 단부를 주형의 마지막 염기를 지나 연장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36(1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65(2003)).
폴리A/T 구간을 DNA 주형으로 통합시키는 종래 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 그것은 플라스미드 증식을 위해 재조합 무능 박테리아 세포의 사용을 통해 개선될 수 있다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 시험관내 전사 후에 폴리(A) 중합효소, 예컨대 대장균(E. coli) 폴리A 중합효소(E-PAP) 또는 효모 폴리A 중합효소의 사용으로 추가로 연장될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리를 100개 뉴클레오타이드로부터 300개 내지 400개 뉴클레오타이드의 길이로 증가시키는 것은 RNA의 번역 효율의 약 2배의 증가를 초래한다. 추가적으로, 3' 말단에 상이한 화합물 기의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공적 뉴클레오타이드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 통합될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 mRNA 분자에 안정성을 제공한다. 한 구현예에서, RNA는 5' 캡1 구조를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 이러한 캡1 구조는 백시니아 캡핑 효소 및 2'-O-메틸트랜스퍼라제 효소(CellScript, Madison, WI)를 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 5' 캡은 기술분야에 알려져 있고 본원에 기술된 기법을 사용하여 제공된다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444(2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95(2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966(2005)).
RNA는 많은 상이한 방법, 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 유전자 펄서 II(BioRad, Denver, Colo.), 멀티포레이터(Eppendort, Hamburg Germany), 리포펙션을 사용하는 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩타이드 매개 형질감염, 또는 "유전자 총"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템(예를 들어, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70(2001) 참고)을 포함한 상업적으로 이용 가능한 방법 중 임의의 방법을 사용하여 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서 발명의 RNA는, 일부 경우에 높은 효율, 낮은 독성, 형질감염을 제공하는 트랜스IT®-mRNA 형질감염 키트(Mirus, Madison WI)의 사용을 포함하는 방법으로 세포에 도입된다.
뉴클레오사이드 변형 RNA
한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 NoV 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 복수의 NoV 항원을 암호화하는 복수의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 보조제를 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 NoV 항원 및 하나 이상의 보조제를 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 핵산을 포함한다.
예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 뉴클레오사이드 변형 mRNA를 포함한다. 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 예를 들어 증가된 안정성, 낮거나 없는 선천적 면역원성, 및 향상된 번역을 포함한, 비변형 mRNA를 넘는 특별한 장점을 가진다. 본 발명에 유용한 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 미국 특허 제8,278,036호, 제8,691,966호, 및 제8,835,108호에서 한층 더 기술되며, 이들 특허는 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 어떠한 병리생리적 경로도 활성화하지 않으며, 매우 효율적으로 그리고 전달 후 거의 즉시 번역하고, 생체내에서 수일 내지 수주 동안 지속적인 연속 단백질 생성을 위한 주형으로서 작용한다(Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953). 생리적 효과를 발휘하기 위해 필요한 mRNA의 양은 작아서, 인간 요법에 적용할 수 있게 된다. 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같이, NoV 항원을 암호화하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 항원 특이적 항체 생성을 유도하는 능력을 입증하였다. 예를 들어, 일부 경우에, 뉴클레오사이드 변형 mRNA에 의해 암호화된 항원은 비변형 mRNA에 의해 암호화된 항원과 비교하여 항원 특이적 항체 생성의 더 큰 생성을 유도한다.
일부 경우에, 암호화 mRNA를 전달함으로써 단백질을 발현하는 것은 단백질, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터를 사용하는 방법에 비해 많은 장점을 가진다. mRNA 형질감염 중에, 원하는 단백질의 코딩 서열은 세포에 전달된 유일한 물질이므로, 플라스미드 백본, 바이러스 유전자, 및 바이러스 단백질과 관련된 모든 부작용을 피하게 된다. 보다 중요한 것은, DNA- 및 바이러스 기반 벡터와 달리, mRNA는 게놈에 통합될 위험을 포함하지 않으며 단백질 생성은 mRNA 전달 직후 시작된다는 것이다. 예를 들어, 높은 수준의 순환 단백질은 암호화 mRNA의 생체내 주입 후 15분 내지 30분 내에 측정되었다. 일부 구현예에서, 단백질보다는 오히려 mRNA를 사용하는 것이 또한 많은 장점을 가진다. 순환 또는 조직에서 단백질의 반감기는 종종 짧아서 단백질 치료는 빈번한 투약을 필요로 할 것이지만, mRNA는 수일 내지 수주 동안 지속적인 단백질 생성을 위한 주형을 제공한다. 단백질의 정제는 문제가 많고 부작용을 유발하는 응집체 및 다른 불순물을 함유할 수 있다(Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265).
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 자연적으로 발생하는 변형된-뉴클레오사이드 슈도우리딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 슈도우리딘의 포함은 mRNA를 보다 안정적이고, 비면역원성이며, 고도로 번역 가능하게 만든다(Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892; Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338; Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953; Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175).
RNA에서 슈도우리딘을 포함한 변형된 뉴클레오사이드의 존재는 그것의 선천적 면역원성을 억제하는 것이 입증되었다(Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175). 추가로, 슈도우리딘을 함유하는, 단백질을 암호화하고 시험관내 전사된 RNA는 뉴클레오사이드를 함유하지 않았거나 다른 변형된 뉴클레오사이드를 함유한 RNA보다 더 효율적으로 번역될 수 있다(Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840). 후속해서, 슈도우리딘의 존재는 RNA의 안정성을 개선시키고(Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338) PKR의 활성화 및 번역의 억제 모두를 약화시키는(Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892) 것으로 나타난다.
슈도우리딘에 대해 기술된 것과 유사한 효과가 또한 1-메틸-슈도우리딘을 함유한 RNA에 대해서 관찰되었다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 정제된 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물은 이중 가닥 오염물을 제거하기 위해 정제된다. 일부 경우에, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제 과정이 우수한 번역 잠재력을 가지며 선천적 면역원성이 없는 슈도우리딘 함유 RNA를 얻기 위하여 사용된다(Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142). 에리트로포이에틴을 코딩하는, HPLC 정제, 슈도우리딘 함유 RNA를 마우스 및 마카크 원숭이에게 투여하는 것은 혈청 EPO 수준의 상당한 증가를 초래하였고(Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953), 그로써 슈도우리딘 함유 mRNA가 생체내 단백질 요법에 적합한 것을 확증해준다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 비-HPLC 방법을 사용하여 정제된다. 일부 경우에, 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자는 한정하는 것은 아니지만, HPLC 및 빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 포함한 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제된다. 예시의 FPLC 기반 정제 과정은 문헌에서 기술된다[Weissman et al., 2013, Methods Mol Biol, 969: 43-54]. 예시의 정제 과정은 또한 미국 특허 출원 공개 공보 US2016/0032316에서 기술되며, 이것의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 RNA, 올리고리보뉴클레오타이드, 및 폴리리보뉴클레오타이드 분자를 다 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 항원을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하며, 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 항원, 보조제, 또는 이것들의 조합을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하며, 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
한 구현예에서, 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 본원의 다른 곳에서 기술된 IVT RNA이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 T7 파지 RNA 중합효소에 의해 합성된다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 mRNA는 SP6 파지 RNA 중합효소에 의해 합성된다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 T3 파지 RNA 중합효소에 의해 합성된다.
한 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m1acp3Ψ(1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필) 슈도우리딘이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m1Ψ(1-메틸슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Ψm(2'-O-메틸슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m5D(5-메틸다이하이드로우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m3Ψ(3-메틸슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 추가로 변형되지 않는 슈도우리딘 모이어티이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 위의 슈도우리딘 중 임의의 것의 모노포스페이트, 다이포스페이트, 또는 트라이포스페이트이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 슈도우리딘 유사 뉴클레오사이드이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA에서 변형된 뉴클레오사이드는 우리딘(U)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 시티딘(C)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 아데노신(A)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 구아노신(G)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 뉴클레오사이드는 m5C(5-메틸시티딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m5U(5-메틸우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m6A(N6-메틸아데노신)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 s2U(2-티오우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Ψ(슈도우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Um(2'-O-메틸우리딘)이다.
다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m1A(1-메틸아데노신); m2A(2-메틸아데노신); Am(2'-O-메틸아데노신); ms2m6A(2-메틸티오-N6-메틸아데노신); i6A(N6-아이소펜테닐아데노신); ms2i6A(2-메틸티오-N6-아이소펜테닐아데노신); io6A(N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데노신); ms2io6A(2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데노신); g6A(N6-글리시닐카바모일아데노신); t6A(N6-트레오닐카바모일아데노신); ms2t6A(2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신); m6t6A(N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신); hn6A(N6-하이드록시노르발릴카바모일아데노신); ms2hn6A(2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴 카바모일아데노신); Ar(p)(2'-O-리보실아데노신(포스페이트)); I(이노신); m1I(1-메틸이노신); m1Im(1,2'-O-다이메틸이노신); m3C(3-메틸시티딘); Cm(2'-O-메틸시티딘); s2C(2-티오시티딘); ac4C(N4-아세틸시티딘); f5C(5-포르밀시티딘); m5Cm(5,2'-O-다이메틸시티딘); ac4Cm(N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘); k2C(리시딘); m1G(1-메틸구아노신); m2G(N2-메틸구아노신); m7G(7-메틸구아노신); Gm(2'-O-메틸구아노신); m2 2G(N2,N2-다이메틸구아노신); m2Gm(N2,2'-O-다이메틸구아노신); m2 2Gm(N2,N2,2'-O-트라이메틸구아노신); Gr(p)(2'-O-리보실구아노신(포스페이트)); yW(위부토신); o2yW(퍼옥시위부토신); OHyW(하이드록시위부토신); OHyW*(덜 변형된 하이드록시위부토신); imG(와이오신); mimG(메틸와이오신); Q(퀴오신); oQ(에폭시퀴오신); galQ(갈락토실-퀴오신); manQ(만노실-퀴오신); preQ0(7-시아노-7-데아자구아노신); preQ1(7-아미노메틸-7-데아자구아노신); G+(아케오신); D(다이하이드로우리딘); m5Um(5,2'-O-다이메틸우리딘); s4U(4-티오우리딘); m5s2U(5-메틸-2-티오우리딘); s2Um(2-티오-2'-O-메틸우리딘); acp3U(3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘); ho5U(5-하이드록시우리딘); mo5U(5-메톡시우리딘); cmo5U(우리딘 5-옥시아세트산); mcmo5U(우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르); chm5U(5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘)); mchm5U(5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르); mcm5U(5-메톡시카르보닐메틸우리딘); mcm5Um(5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘); mcm5s2U(5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘); nm5s2U(5-아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5U(5-메틸아미노메틸우리딘); mnm5s2U(5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5se2U(5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘); ncm5U(5-카바모일메틸우리딘); ncm5Um(5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5U(5-카르복시메틸아미노메틸우리딘); cmnm5Um(5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5s2U(5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘); m6 2A(N6,N6-다이메틸아데노신); Im(2'-O-메틸이노신); m4C(N4-메틸시티딘); m4Cm(N4,2'-O-다이메틸시티딘); hm5C(5-하이드록시메틸시티딘); m3U(3-메틸우리딘); cm5U(5-카르복시메틸우리딘); m6Am(N6,2'-O-다이메틸아데노신); m6 2Am(N6,N6,O-2'-트라이메틸아데노신); m2,7G(N2,7-다이메틸구아노신); m2,2,7G(N2,N2,7-트라이메틸구아노신); m3Um(3,2'-O-다이메틸우리딘); m5D(5-메틸다이하이드로우리딘); f5Cm(5-포르밀-2'-O-메틸시티딘); m1Gm(1,2'-O-다이메틸구아노신); m1Am(1,2'-O-다이메틸아데노신); τm5U(5-타우리노메틸우리딘); τm5s2U(5-타우리노메틸-2-티오우리딘)); imG-14(4-데메틸와이오신); imG2(아이소와이오신); 또는 ac6A(N6-아세틸아데노신)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 위의 변형 중 2개 이상의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 위의 변형 중 3개 이상의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 위의 변형 중 3개 이상의 조합을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA의 0.1% 내지 100%의 잔기가 변형된다(예컨대, 슈도우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 5-메틸-우리딘 또는 다른 변형된 뉴클레오사이드 염기의 존재에 의해 변형됨). 한 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.1%이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 55%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 65%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 75%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 85%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 91%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 92%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 93%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 94%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 95%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 96%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 97%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 98%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 99%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 100%이다.
또 다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
또 다른 구현예에서, 주어진 뉴클레오사이드(즉, 우리딘, 시티딘, 구아노신, 또는 아데노신)의 잔기의 0.1%가 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 7%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 9%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 55%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 65%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 75%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 85%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 91%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 92%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 93%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 94%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 95%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 96%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 97%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 98%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 99%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 100%이다. 또 다른 구현예에서, 변형되는 주어진 뉴클레오타이드의 분율은 8% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
일부 구현예에서, 조성물은 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA의 정제된 제제를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA의 정제된 제제는 실질적으로 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 없다. 일부 구현예에서, 정제된 제제는 모든 다른 핵산 분자(DNA, dsRNA, 등)에 비해 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93 % 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.9% 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 세포에서 동일한 서열을 가진 미변형 RNA 분자보다 더 효율적으로 번역된다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 표적 세포에 의해 번역될 능력이 향상된 것을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 번역은 미변형 대응물에 비해 2배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 3배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 4배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 5배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 6배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 7배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 8배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 9배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 10배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 15배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 20배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 50배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 100배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 200배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 500배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 1000배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 2000배 향상된다. 또 다른 구현예에서, 배수는 10-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 10-100배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 10-200배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 10-300배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 10-500배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 20-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 30-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 50-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 100-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 배수는 200-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 번역은 임의의 다른 상당한 양 또는 양의 범위만큼 향상된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 항원 암호화 RNA는 동일한 서열의 미변형 시험관내 합성 RNA 분자와 비교하여 상당히 더 활발한 적응성 면역 반응을 유도한다. 또 다른 구현예에서, 변형된 RNA 분자는 미변형 대응물보다 2배 더 큰 적응성 면역 반응을 유도한다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 3배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 4배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 5배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 6배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 7배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 8배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 9배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 10배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 15배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 20배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 50배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 100배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 200배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 500배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 1000배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 2000배 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응성 면역 반응은 또 다른 배수 차이만큼 증가된다.
또 다른 구현예에서, "상당히 더 활발한 적응성 면역 반응을 유도한다"는 적응성 면역 반응의 검출 가능한 증가를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 적응성 면역 반응의 배수 증가를 지칭한다(예컨대, 위에서 열거된 배수 증가 중 1). 또 다른 구현예에서, 용어는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 미변형 RNA 분자보다 더 적은 용량 또는 빈도로 투여될 수 있지만 여전히 유사하게 효과적인 적응성 면역 반응을 유도할 수 있는 증가를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 증가는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 단일 용량을 사용하여 투여되어 효과적인 적응성 면역 반응을 유도할 수 있도록 하는 정도이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 변형 RNA는 동일한 서열의 미변형 시험관내 합성 RNA 분자보다 상당히 더 적은 선천적 면역원성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 변형된 RNA 분자는 미변형 대응물보다 2배 더 적은 선천적 면역 반응을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 3배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 4배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 5배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 6배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 7배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 8배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 9배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 10배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 15배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 20배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 50배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 100배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 200배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 500배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 1000배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 2000배 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 또 다른 배수 차이만큼 감소된다.
또 다른 구현예에서, "상당히 더 적은 선천적 면역원성을 나타낸다"는 선천적 면역원성의 검출 가능한 감소를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어는 선천적 면역원성의 배수 감소를 지칭한다(예컨대, 위에서 열거된 배수 감소 중 1). 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 유효량의 뉴클레오사이드 변형 RNA가 검출 가능한 선천적 면역 반응을 촉발시키지 않으면서 투여될 수 있을 정도의 감소를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 변형된 RNA에 의해 암호화된 단백질의 생성을 검출 가능하게 감소시키기에 충분한 선천적 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복적으로 투여될 수 있을 정도의 감소를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 감소는 뉴클레오사이드 변형 RNA가 변형된 RNA에 의해 암호화된 단백질의 검출 가능한 생성을 제거하기에 충분한 선천적 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복적으로 투여될 수 있을 정도의 감소를 지칭한다.
지질 나노입자
한 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA의 전달은 본원의 다른 곳에서 기술된 예시의 RNA 형질감염 방법을 포함한 임의의 적합한 전달 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA의 대상체로의 전달은 뉴클레오사이드 변형 RNA를 접촉 단계 전에 형질감염 시약과 혼합하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 뉴클레오사이드 변형 RNA를 형질감염 시약과 함께 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 양이온성 지질 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 양이온성 중합체 시약이다.
또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 지질 기반 형질감염 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 단백질 기반 형질감염 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 탄수화물 기반 형질감염 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 양이온성 지질 기반 형질감염 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 양이온성 중합체 기반 형질감염 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 폴리에틸렌이민 기반 형질감염 시약이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 칼슘 포스페이트이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 리포펙틴®, 리포펙타민®, 또는 트랜스IT®이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 형질감염 시약이다.
또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 리포솜을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 세포내 안정성을 증가시키고, 흡수 효율을 증가시키며 생물학적 활성을 개선한다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 세포막을 구성하는 지질과 유사한 방식으로 배열된 지질로 구성된 중공 구형 소포이다. 또 다른 구현예에서, 그것은 수용성 화합물을 가두기 위한 내부 수성 공간을 가지며 0.05 마이크론 내지 수 마이크론 범위의 크기의 직경을 가진다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 RNA를 생물학적 활성 형태로 세포에 전달할 수 있다.
한 구현예에서, 조성물은 지질 나노입자(LNP) 및 본원에 기술된 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 LNP 및 하나 이상의 항원, 보조제, 또는 이것들의 조합을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 RNA 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 나노미터 정도(예컨대, 1-1,000nm)의 적어도 하나의 치수를 갖는 입자이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 지질을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 지질은 식 (I), (II) 또는 (III)의 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본원에 기술된 뉴클레오사이드 변형 RNA를 포함하는 제형으로 포함된다. 일부 구현예에서, 그러한 지질 나노입자는 양이온성 지질(예컨대, 식 (I), (II) 또는 (III)의 지질) 및 중성 지질, 대전된 지질, 스테로이드 및 중합체 콘쥬게이션된 지질(예컨대, 구조 (IV)의 페길화된 지질과 같은 페길화된 지질)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 지질 나노입자의 지질 부분 또는 지질 나노입자의 지질 부분의 일부 또는 전부에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화됨으로써, 효소적 분해 또는 숙주 유기체 또는 세포의 메커니즘에 의해 유도된 다른 바람직하지 못한 효과, 예컨대, 해로운 면역 반응으로부터 보호한다.
다양한 구현예에서, 지질 나노입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 무독성이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA는 지질 나노입자에 존재할 때 수성 용액에서 뉴클레아제로 인한 분해에 내성이 있다.
LNP는 하나 이상의 핵산 분자가 부착되거나, 또는 하나 이상의 핵산 분자가 캡슐화되는 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질에는 중성 지질 및 페길화된 지질이 포함된다.
한 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 선택적 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순수한 양성 전하를 운반하는 많은 지질 종 중 임의의 것을 포함한다. 그러한 지질에는, 한정하는 것은 아니지만, N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB); N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N―(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카르복시아미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA), 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-다이메틸-2,3-다이올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)가 포함된다. 추가적으로, 양이온성 지질의 많은 상업적 제제가 본 발명에서 이용 가능한다. 이것들에는, 예를 들어, 리포펙틴®(DOTMA 및 1,2-다이올레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜, GIBCO/BRL사(Grand Island, N.Y.) 제품); 리포펙타민®(N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N-(2-(스퍼민카르복시아미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및 (DOPE)를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜, GIBCO/BRL사); 및 트랜스FECTAM®(에탄올에 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질, Promega Corp.사(Madison, Wis.)) 제품)이 포함된다. 다음의 지질은 양이온성이고 생리적 pH 미만의 pH에서 양전하를 가진다: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLenDMA).
한 구현예에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다. 발명에 유용한 적합한 아미노 지질에는 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 WO 2012/016184에 기술된 것들이 포함된다. 대표적인 아미노 지질에는, 한정하는 것은 아니지만, 1,2-다이리놀레일옥시-3-(다이메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-다이리놀레일옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-다이리놀레오일-3-다이메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일티오-3-다이메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-다이리놀레오일-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-다이리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-다이리놀레일아미노)-1,2-프로판다이올(DLinAP), 3-(N,N-다이올레일아미노)-1,2-프로판다이올(DOAP), 1,2-다이리놀레일옥소-3-(2-N,N-다이메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 및 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA)이 포함된다.
적합한 아미노 지질에는 다음 식을 가지는 것이 포함된다:
식에서 R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 독립적으로 선택적으로 치환된 C10-C24 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C24 알케닐, 선택적으로 치환된 C10-C24 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 C10-C24 아실이고;
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐이거나 또는 R3 및 R4는 4 내지 6개의 탄소 원자 및 질소 및 산소로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자의 선택적으로 치환된 헤테로고리형 고리를 형성하기 위해 연결될 수 있고;
R5는 없거나 존재하며 존재할 때는 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
m, n, 및 p는 동일하거나 상이하며 독립적으로 0 또는 1이고 단 m, n, 및 p는 동시에 0이 아니며;
q는 0, 1, 2, 3, 또는 4이고; 그리고
Y 및 Z는 동일하거나 상이하며 독립적으로 O, S, 또는 NH이다.
한 구현예에서, R1 및 R2는 각각 리놀레일이고, 아미노 지질은 다이리놀레일 아미노 지질이다. 한 구현예에서, 아미노 지질은 다이리놀레일 아미노 지질이다.
대표적인 유용한 다이리놀레일 아미노 지질은 다음 식을 가진다:
식에서 n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이다.
한 구현예에서, 양이온성 지질은 DLin-K-DMA이다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 DLin-KC2-DMA(위의 DLin-K-DMA, n은 2임)이다.
한 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 구성요소는 식 (I)의 구조:
또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염, 호변 이성질체, 전구약물 또는 입체 이성질체를 가지며, 식에서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 탄소-탄소 이중 결합이고;
R1a 및 R1b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R2a 및 R2b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R3a 및 R3b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R4a 및 R4b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R5 및 R6는 각각 독립적으로 메틸 또는 사이클로알킬이고;
R7는, 각각의 발생시에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이며;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께 하나의 질소 원자를 포함하는 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성하고;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 24의 정수이며;
b 및 c는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고; 그리고
e는 1 또는 2이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, 또는 L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다. 다른 구현예에서, R1a 및 R1b는 a가 6일 때 아이소프로필이 아니거나 a가 8일 때 n-부틸이 아니다.
식 (I)의 여전히 추가의 구현예에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, 또는 L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이며; 그리고
R1a 및 R1b는 a가 6일 때 아이소프로필이 아니거나 a가 8일 때 n-부틸이 아니다.
식 (I)의 다른 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 비치환 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는, 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 하나의 질소 원자를 포함하는 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성한다.
식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 임의의 하나는 -O(C=O)- 또는 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다. L1 및 L2는 각각 -O(C=O)-이거나 또는 각각 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다.
식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2 모두는 -O(C=O)-이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2 모두는 -(C=O)O-이다.
식 (I)의 일부 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2 모두는 탄소-탄소 이중 결합이다.
식 (I)의 또 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고 L1 또는 L2의 다른 하나는 -(C=O)O-이다. 더 많은 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고 L1 또는 L2의 다른 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다. 또한 더 많은 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이고 L1 또는 L2의 다른 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다.
명세서 전체에서 사용되는 "탄소-탄소" 이중 결합은 다음 구조 중 하나를 지칭하는 것으로 이해된다:
또는 ,
식에서 Ra 및 Rb는, 각각의 발생시에, 독립적으로 H 또는 치환기이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 Ra 및 Rb는, 각각의 발생시에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬, 예를 들어 H 또는 C1-C12 알킬이다.
다른 구현예에서, 식 (I)의 지질 화합물은 다음 구조 (Ia)를 가진다:
다른 구현예에서, 식 (I)의 지질 화합물은 다음 구조 (Ib)를 가진다:
또 다른 구현예에서, 식 (I)의 지질 화합물은 다음 구조 (Ic)를 가진다:
식 (I)의 지질 화합물의 일부 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 구현예에서, a는 0이다. 일부 구현예에서, a는 1이다. 다른 구현예에서, a는 2이다. 더 많은 구현예에서, a는 3이다. 또 다른 구현예에서, a는 4이다. 일부 구현예에서, a는 5이다. 다른 구현예에서, a는 6이다. 더 많은 구현예에서, a는 7이다. 또 다른 구현예에서, a는 8이다. 일부 구현예에서, a는 9이다. 다른 구현예에서, a는 10이다. 더 많은 구현예에서, a는 11이다. 또 다른 구현예에서, a는 12이다. 일부 구현예에서, a는 13이다. 다른 구현예에서, a는 14이다. 더 많은 구현예에서, a는 15이다. 또 다른 구현예에서, a는 16이다.
식 (I)의 일부 다른 구현예에서, b는 1이다. 다른 구현예에서, b는 2이다. 더 많은 구현예에서, b는 3이다. 또 다른 구현예에서, b는 4이다. 일부 구현예에서, b는 5이다. 다른 구현예에서, b는 6이다. 더 많은 구현예에서, b는 7이다. 또 다른 구현예에서, b는 8이다. 일부 구현예에서, b는 9이다. 다른 구현예에서, b는 10이다. 더 많은 구현예에서, b는 11이다. 또 다른 구현예에서, b는 12이다. 일부 구현예에서, b는 13이다. 다른 구현예에서, b는 14이다. 더 많은 구현예에서, b는 15이다. 또 다른 구현예에서, b는 16이다.
식 (I)의 일부 더 많은 구현예에서, c는 1이다. 다른 구현예에서, c는 2이다. 더 많은 구현예에서, c는 3이다. 또 다른 구현예에서, c는 4이다. 일부 구현예에서, c는 5이다. 다른 구현예에서, c는 6이다. 더 많은 구현예에서, c는 7이다. 또 다른 구현예에서, c는 8이다. 일부 구현예에서, c는 9이다. 다른 구현예에서, c는 10이다. 더 많은 구현예에서, c는 11이다. 또 다른 구현예에서, c는 12이다. 일부 구현예에서, c는 13이다. 다른 구현예에서, c는 14이다. 더 많은 구현예에서, c는 15이다. 또 다른 구현예에서, c는 16이다.
식 (I)의 일부 다른 구현예에서, d는 0이다. 일부 구현예에서, d는 1이다. 다른 구현예에서, d는 2이다. 더 많은 구현예에서, d는 3이다. 또 다른 구현예에서, d는 4이다. 일부 구현예에서, d는 5이다. 다른 구현예에서, d는 6이다. 더 많은 구현예에서, d는 7이다. 또 다른 구현예에서, d는 8이다. 일부 구현예에서, d는 9이다. 다른 구현예에서, d는 10이다. 더 많은 구현예에서, d는 11이다. 또 다른 구현예에서, d는 12이다. 일부 구현예에서, d는 13이다. 다른 구현예에서, d는 14이다. 더 많은 구현예에서, d는 15이다. 또 다른 구현예에서, d는 16이다.
식 (I)의 일부 다른 다양한 구현예에서, a 및 d는 동일하다. 일부 다른 구현예에서, b 및 c는 동일하다. 일부 다른 특정 구현예에서, a 및 d는 동일하고 b 및 c는 동일하다.
식 (I)에서 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 원하는 특성을 갖는 식 (I)의 지질을 얻기 위해 달라질 수 있는 인자이다. 한 구현예에서, a 및 b는 이들의 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 다른 구현예에서, c 및 d는 이들의 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 추가의 구현예에서, a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 둘 다 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 여전히 더 많은 구현예에서, a, b, c 및 d는 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합이 12 이상이 되도록 선택된다.
식 (I)의 일부 구현예에서, e는 1이다. 다른 구현예에서, e는 2이다.
식 (I)의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서 치환기는 특히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각각의 발생시에 H이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 전술한 구현예 중 일부 구현예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각각의 발생시에 C1-C12 알킬이다.
식 (I)의 추가 구현예에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 또는 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각각의 발생시에 H이다.
식 (I)의 일부 구현예에서, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 전술한 설명의 다른 구현예에서 R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (I)의 R5 및 R6의 치환기는 전술한 구현예에서 특히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 메틸이다. 일부 다른 구현예에서 R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 사이클로알킬, 예를 들어 사이클로헥실이다. 이들 구현예에서 사이클로알킬은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 일부 다른 구현예에서 사이클로알킬은 C1-C12 알킬, 예를 들어 tert-부틸로 치환된다.
R7에서의 치환기는 식 (I)의 전술한 구현예에서 특히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 적어도 하나의 R7은 H이다. 일부 다른 구현예에서, R7은 각각의 발생시에 H이다. 일부 다른 구현예에서 R7은 C1-C12 알킬이다.
식 (I)의 전술한 구현예의 일부 다른 구현예에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서, R8 및 R9 모두 메틸이다.
식 (I)의 일부 상이한 구현예에서, R8 및 R9는, 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성한다. 전술한 설명의 일부 구현예에서, R8 및 R9는, 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5-원 헤테로고리형 고리, 예를 들어 피롤리디닐 고리를 형성한다.
다양한 상이한 구현예에서, 식 (I)의 지질은 아래의 표 1에 제시된 구조 중 하나를 가진다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (I)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서 식 (I)의 지질은 화합물 I-5이다. 일부 구현예에서 식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다.
일부 다른 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 구성요소는 식 (II)의 구조:
또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염, 호변 이성질체, 전구약물 또는 입체 이성질체를 가지며, 식에서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa,
-OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, 또는 직접 결합이고;
G1은 C1-C2 알킬렌, -(C=O)-, -O(C=O)-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)- 또는 직접 결합이며;
G2는 -C(=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)S-, -C(=O)NRa 또는 직접 결합이고;
G3은 C1-C6 알킬렌이며;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1a 및 R1b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R2a 및 R2b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R3a 및 R3b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R4a 및 R4b는, 각각의 발생시에, 독립적으로: (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며;
R5 및 R6는 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고;
R7는 C4-C20 알킬이며;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성하고;
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이며; 그리고
x는 0, 1 또는 2이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이다. 다른 구현예에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다. 일부 상이한 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이고; G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다.
식 (II)의 일부 상이한 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRa-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, -NRaS(O)xNRa-,
-NRaS(O)x- 또는 -S(O)xNRa-이다.
식 (II)의 전술한 구현예의 다른 구현예에서, 지질 화합물은 다음 구조 (IIA) 또는 (IIB) 중 하나를 가진다:
또는 .
식 (II)의 일부 구현예에서, 지질 화합물은 구조 (IIA)를 가진다. 다른 구현예에서, 지질 화합물은 구조 (IIB)를 가진다.
식 (II)의 전술한 구현예 중 임의의 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -O(C=O)-이다.
식 (II)의 일부 상이한 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -(C=O)O-이다.
식 (II)의 상이한 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 직접 결합이다. 본원에서 사용되는 바, "직접 결합"은 기(예컨대, L1 또는 L2)가 없는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 직접 결합이다.
식 (II)의 다른 상이한 구현예에서, R1a 및 R1b의 적어도 하나의 발생의 경우, R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 또 다른 상이한 구현예에서, R4a 및 R4b의 적어도 하나의 발생의 경우, R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 더 많은 구현예에서, R2a 및 R2b의 적어도 하나의 발생의 경우, R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 다른 상이한 구현예에서, R3a 및 R3b의 적어도 하나의 발생의 경우, R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 다양한 다른 구현예에서, 지질 화합물은 다음 구조 (IIC) 또는 (IID) 중 하나를 가지며:
또는
,
식에서 e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 1 내지 12의 정수이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, 지질 화합물은 구조 (IIC)를 가진다. 다른 구현예에서, 지질 화합물은 구조 (IID)를 가진다.
구조 (IIC) 또는 (IID)의 다양한 구현예에서, e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 4 내지 10의 정수이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 구현예에서, a는 0이다. 일부 구현예에서, a는 1이다. 다른 구현예에서, a는 2이다. 더 많은 구현예에서, a는 3이다. 또 다른 구현예에서, a는 4이다. 일부 구현예에서, a는 5이다. 다른 구현예에서, a는 6이다. 더 많은 구현예에서, a는 7이다. 또 다른 구현예에서, a는 8이다. 일부 구현예에서, a는 9이다. 다른 구현예에서, a는 10이다. 더 많은 구현예에서, a는 11이다. 또 다른 구현예에서, a는 12이다. 일부 구현예에서, a는 13이다. 다른 구현예에서, a는 14이다. 더 많은 구현예에서, a는 15이다. 또 다른 구현예에서, a는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, b는 1이다. 다른 구현예에서, b는 2이다. 더 많은 구현예에서, b는 3이다. 또 다른 구현예에서, b는 4이다. 일부 구현예에서, b는 5이다. 다른 구현예에서, b는 6이다. 더 많은 구현예에서, b는 7이다. 또 다른 구현예에서, b는 8이다. 일부 구현예에서, b는 9이다. 다른 구현예에서, b는 10이다. 더 많은 구현예에서, b는 11이다. 또 다른 구현예에서, b는 12이다. 일부 구현예에서, b는 13이다. 다른 구현예에서, b는 14이다. 더 많은 구현예에서, b는 15이다. 또 다른 구현예에서, b는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, c는 1이다. 다른 구현예에서, c는 2이다. 더 많은 구현예에서, c는 3이다. 또 다른 구현예에서, c는 4이다. 일부 구현예에서, c는 5이다. 다른 구현예에서, c는 6이다. 더 많은 구현예에서, c는 7이다. 또 다른 구현예에서, c는 8이다. 일부 구현예에서, c는 9이다. 다른 구현예에서, c는 10이다. 더 많은 구현예에서, c는 11이다. 또 다른 구현예에서, c는 12이다. 일부 구현예에서, c는 13이다. 다른 구현예에서, c는 14이다. 더 많은 구현예에서, c는 15이다. 또 다른 구현예에서, c는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, d는 0이다. 일부 구현예에서, d는 1이다. 다른 구현예에서, d는 2이다. 더 많은 구현예에서, d는 3이다. 또 다른 구현예에서, d는 4이다. 일부 구현예에서, d는 5이다. 다른 구현예에서, d는 6이다. 더 많은 구현예에서, d는 7이다. 또 다른 구현예에서, d는 8이다. 일부 구현예에서, d는 9이다. 다른 구현예에서, d는 10이다. 더 많은 구현예에서, d는 11이다. 또 다른 구현예에서, d는 12이다. 일부 구현예에서, d는 13이다. 다른 구현예에서, d는 14이다. 더 많은 구현예에서, d는 15이다. 또 다른 구현예에서, d는 16이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, e는 1이다. 다른 구현예에서, e는 2이다. 더 많은 구현예에서, e는 3이다. 또 다른 구현예에서, e는 4이다. 일부 구현예에서, e는 5이다. 다른 구현예에서, e는 6이다. 더 많은 구현예에서, e는 7이다. 또 다른 구현예에서, e는 8이다. 일부 구현예에서, e는 9이다. 다른 구현예에서, e는 10이다. 더 많은 구현예에서, e는 11이다. 또 다른 구현예에서, e는 12이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, f는 1이다. 다른 구현예에서, f는 2이다. 더 많은 구현예에서, f는 3이다. 또 다른 구현예에서, f는 4이다. 일부 구현예에서, f는 5이다. 다른 구현예에서, f는 6이다. 더 많은 구현예에서, f는 7이다. 또 다른 구현예에서, f는 8이다. 일부 구현예에서, f는 9이다. 다른 구현예에서, f는 10이다. 더 많은 구현예에서, f는 11이다. 또 다른 구현예에서, f는 12이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, g는 1이다. 다른 구현예에서, g는 2이다. 더 많은 구현예에서, g는 3이다. 또 다른 구현예에서, g는 4이다. 일부 구현예에서, g는 5이다. 다른 구현예에서, g는 6이다. 더 많은 구현예에서, g는 7이다. 또 다른 구현예에서, g는 8이다. 일부 구현예에서, g는 9이다. 다른 구현예에서, g는 10이다. 더 많은 구현예에서, g는 11이다. 또 다른 구현예에서, g는 12이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, h는 1이다. 다른 구현예에서, e는 2이다. 더 많은 구현예에서, h는 3이다. 또 다른 구현예에서, h는 4이다. 일부 구현예에서, e는 5이다. 다른 구현예에서, h는 6이다. 더 많은 구현예에서, h는 7이다. 또 다른 구현예에서, h는 8이다. 일부 구현예에서, h는 9이다. 다른 구현예에서, h는 10이다. 더 많은 구현예에서, h는 11이다. 또 다른 구현예에서, h는 12이다.
식 (II)의 일부 다른 다양한 구현예에서, a 및 d는 동일하다. 일부 다른 구현예에서, b 및 c는 동일하다. 일부 다른 특정 구현예에서 a 및 d는 동일하고 b 및 c는 동일하다.
식 (II)의 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 원하는 특성을 갖는 지질을 얻기 위해 달라질 수 있는 인자이다. 한 구현예에서, a 및 b는 이들의 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 다른 구현예에서, c 및 d는 이들의 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 추가의 구현예에서, a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합은 둘 다 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 여전히 더 많은 구현예에서, a, b, c 및 d는 a 및 b의 합 및 c 및 d의 합이 12 이상이 되도록 선택된다.
식 (II)의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서 치환기는 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 H이다. 일부 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각각의 발생시에 H이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 일부 다른 구현예에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 전술한 구현예 중 일부 구현예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각각의 발생시에 C1-C12 알킬이다.
식 (II)의 추가의 구현예에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 또는 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각각의 발생시에 H이다.
식 (II)의 일부 구현예에서, R1b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 전술한 설명의 다른 구현예에서 R4b는 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 그것이 결합되는 탄소 원자와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
식 (II)의 R5 및 R6에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R5 또는 R6 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서 R5 또는 R6의 각각은 메틸이다.
식 (II)의 R7에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 R7은 C6-C16 알킬이다. 일부 다른 구현예에서, R7은 C6-C9 알킬이다. 이들 구현예의 일부에서, R7은 -(C=O)ORb, -O(C=O)Rb, -C(=O)Rb, -ORb, -S(O)xRb, -S-SRb, -C(=O)SRb, -SC(=O)Rb, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -C(=O)NRaRb, -NRaC(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaS(O)xNRaRb, -NRaS(O)xRb 또는 -S(O)xNRaRb로 치환되며, 여기서: Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고; Rb는 C1-C15 알킬이며; x는 0, 1 또는 2이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 R7은 -(C=O)ORb 또는 -O(C=O)Rb로 치환된다.
식 (II)의 전술한 구현예의 다양한 구현예에서, Rb는 분지된 C1-C15 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 Rb는 다음 구조 중 하나를 가진다:
또는
.
식 (II)의 전술한 구현예 중 일부 다른 구현예에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서, R8 및 R9는 모두 메틸이다.
식 (II)의 일부 상이한 구현예에서, R8 및 R9는 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께 5, 6 또는 7-원 헤테로고리형 고리를 형성한다. 전술한 설명의 일부 구현예에서, R8 및 R9는 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께 5-원 헤테로고리형 고리, 예를 들어 피롤리디닐 고리를 형성한다. 전술한 설명의 일부 상이한 구현예에서, R8 및 R9는 이것들이 부착되는 질소 원자와 함께 6-원 헤테로고리형 고리, 예를 들어 피페라지닐 고리를 형성한다.
식 (II)의 전술한 지질의 또 다른 구현예에서, G3은 C2-C4 알킬렌, 예를 들어 C3 알킬렌이다.
다양한 상이한 구현예에서, 지질 화합물은 아래의 표 2에서 제시된 구조 중 하나를 가진다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (II)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-9이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-10이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-11이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-12이다. 일부 구현예에서 식 (II)의 지질은 화합물 II-32이다.
일부 다른 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 구성요소는 식 (III)의 구조:
(III)
또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염, 호변 이성질체, 전구약물 또는 입체 이성질체를 가지며, 식에서:
L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는
-NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2의 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-,
-S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이며;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 비치환 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고;
G3은 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, C3-C8 사이클로알케닐렌이며;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이며;
R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5C(=O)R4이고;
R4는 C1-C12 알킬이며;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고; 그리고
x는 0, 1 또는 2이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, 지질은 다음 구조 (IIIA) 또는 (IIIB) 중 하나를 가지며:
또는 ,
식에서:
A는 3 내지 8-원 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고;
R6은 각각의 발생시에 독립적으로 H, OH 또는 C1-C24 알킬이며;
n은 1 내지 15 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, 지질은 구조 (IIIA)를 가지며, 다른 구현예에서, 지질은 구조 (IIIB)를 가진다.
식 (III)의 다른 구현예에서, 지질은 다음의 구조 (IIIC) 또는 (IIID) 중 하나를 가지며:
또는 ,
여기서 y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 12 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 임의의 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -O(C=O)-이다. 전술한 임의의 설명의 일부 상이한 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2의 각각은 -(C=O)O-이다.
식 (III)의 일부 상이한 구현예에서, 지질은 다음 구조 (IIIE) 또는 (IIIF) 중 하나를 가진다:
또는 .
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, 지질은 다음 구조 (IIIG), (IIIH), (IIII), 또는 (IIIJ) 중 하나를 가진다:
또는 .
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, n은 2 내지 12, 예를 들어 2 내지 8 또는 2 내지 4 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, n은 5이다. 일부 구현예에서, n은 6이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부 다른 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 9 또는 4 내지 6 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, R6은 H이다. 전술한 구현예 중 다른 구현예에서, R6은 C1-C24 알킬이다. 다른 구현예에서, R6은 OH이다.
식 (III)의 일부 구현예에서, G3은 치환되지 않는다. 다른 구현예에서, G3은 치환된다. 다양한 상이한 구현예에서, G3은 선형 C1-C24 알킬렌 또는 선형 C1-C24 알케닐렌이다.
식 (III)의 일부 다른 전술한 구현예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 C6-C24 알케닐이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 다음 구조를 가진다:
,
식에서:
R7a 및 R7b는 각각의 발생시에 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이며; 그리고
a는 2 내지 12의 정수이고,
여기서 R7a, R7b 및 a는 각각 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, R7a의 적어도 하나의 발생은 H이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R7a는 각각의 발생시에 H이다. 전술한 설명의 다른 상이한 구현예에서, R7b의 적어도 하나의 발생은 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
식 (III)의 상이한 구현예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 다음 구조 중 하나를 가진다:
식 (III)의 전술한 구현예의 일부에서, R3은 OH, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R4이다. 일부 구현예에서, R4는 메틸 또는 에틸이다.
다양한 상이한 구현예에서, 식 (III)의 양이온성 지질은 아래의 표 3에 제시된 구조 중 하나를 가진다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (III)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서 식 (III)의 지질은 화합물 III-3이다. 일부 구현예에서 식 (III)의 지질은 화합물 III-7이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 약 30 내지 약 95 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 30 내지 약 70 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 40 내지 약 60 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 50 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, LNP는 양이온성 지질만을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 형성되는 동안 입자의 형성을 안정화시키는 하나 이상의 추가 지질을 포함한다.
적합한 안정화 지질에는 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다.
예시의 음이온성 지질에는, 한정하는 것은 아니지만, 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-석시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변형기가 포함된다.
예시의 중성 지질로는, 예를 들어, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE) 및 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티디에탄올 아민(SOPE), 및 1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(트랜스DOPE)을 들 수 있다. 한 구현예에서, 중성 지질은 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
일부 구현예에서, LNP는 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된 중성 지질을 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질(예컨대, 식 (I)의 지질) 대 중성 지질의 몰 비율은 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
다양한 구현예에서, LNP는 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 추가로 포함한다. "스테로이드"는 다음의 탄소 골격을 포함하는 화합물이다:
.
일부 구현예에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 이들 구현예의 일부에서, 양이온성 지질(예컨대, 식 (I)의 지질) 대 콜레스테롤의 몰 비율은 약 2:1 내지 1:1 범위이다.
일부 구현예에서, LNP는 당지질(예컨대, 모노시알로강글리오사이드 GM1)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 중합체 콘쥬게이션된 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜-지질(페길화된 지질)인 추가의 안정화 지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질에는 PEG 변형 포스파티딜에탄올아민, PEG 변형 포스파티드산, PEG 변형 세라마이드(예컨대, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG 변형 다이알킬아민, PEG 변형 다이아실글리세롤, PEG 변형 다이알킬글리세롤이 포함된다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질에는 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, 및 PEG-s-DMG가 포함된다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바밀]-1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-아민(PEG-c-DMA)이다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 구현예에서, LNP는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG)과 같은 페길화된 다이아실글리세롤(PEG-DAG), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), 4-O-(2',3'-다이(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄다이오에이트(PEG-S-DMG)와 같은 PEG 석시네이트 다이아실글리세롤(PEG-S-DAG), 페길화된 세라마이드(PEG-cer), 또는 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트 또는 2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트와 같은 PEG 다이알콕시프로필카바메이트를 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질 대 페길화된 지질의 몰 비율은 약 100:1 내지 약 25:1의 범위이다.
일부 구현예에서, LNP는 다음 구조 (IV):
또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염, 호변 이성질체 또는 입체 이성질체를 가지는 페길화된 지질을 포함하며, 식에서:
R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고, 알킬 사슬은 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 선택적으로 중단되며; z는 30 내지 60 범위의 평균값을 의미한다.
페길화된 지질 (IV)의 전술한 구현예의 일부에서, R10 및 R11은 z가 42일 때 둘 다 n-옥타데실이 아니다. 일부 다른 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12 내지 16개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 14개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 다른 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 16개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 여전히 더 많은 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 18개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 또 다른 구현예에서, R10은 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고 R11은 14개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다.
다양한 구현예에서, z는 (II)의 PEG 부분이 약 400 내지 약 6000 g/mol의 평균 분자량을 갖도록 선택되는 범위에 걸쳐있다. 일부 구현예에서, 평균 z는 약 45이다.
다른 구현예에서, 페길화된 지질은 다음 구조 중 하나를 가진다:
, ,
, ,
식에서 n은 페길화된 지질의 평균 분자량이 약 2500 g/mol이 되도록 선택된 정수이다.
일부 구현예에서, 추가 지질은 약 1 내지 약 10 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 약 1 내지 약 5 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 약 1 몰 퍼센트 또는 약 1.5 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (I)의 지질, 뉴클레오사이드 변형 RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서 식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다. 상이한 구현예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 다른 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 또한 상이한 구현예에서, 페길화된 지질은 화합물 IVa이다.
일부 구현예에서, LNP는 LNP를 세포 또는 세포 집단에 표적화할 수 있는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 표적화 모이어티는 LNP를 세포 표면에서 발견된 수용체로 향하게 하는 리간드이다.
일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 내부화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 LNP의 내부화를 유도하기 위해 세포에 결합하는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 하나 이상의 내부화 도메인은 세포 표면 상에서 발견되는 수용체에 결합하여 LNP의 수용체 매개 흡수를 유도한다. 일부 구현예에서, LNP는 생체내에서 생체분자에 결합할 수 있고, LNP 결합된 생체분자는 그런 후에 세포 표면 수용체에 의해 인식되어 내부화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 전신성 ApoE에 결합하고, 그것은 LNP 및 관련된 운반물의 흡수로 이어진다.
다른 예시의 LNP 및 그것의 제조는 기술분야에, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제US20120276209호, 문헌[Semple et al., 2010, Nat Biotechnol., 28(2):172-176; Akinc et al., 2010, Mol Ther., 18(7): 1357-1364; Basha et al., 2011, Mol Ther, 19(12): 2186-2200; Leung et al., 2012, J Phys Chem C Nanomater Interfaces, 116(34): 18440-18450; Lee et al., 2012, Int J Cancer., 131(5): E781-90; Belliveau et al., 2012, Mol Ther Nucleic Acids, 1: e37; Jayaraman et al., 2012, Angew Chem Int Ed Engl., 51(34): 8529-8533; Mui et al., 2013, Mol Ther Nucleic Acids. 2, e139; Maier et al., 2013, Mol Ther., 21(8): 1570-1578; 및 Tam et al., 2013, Nanomedicine, 9(5): 665-74]에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 각각은 전체 내용이 참조로 포함된다.
다음의 반응 도식은 식 (I), (II) 또는 (III)의 지질을 제조하기 위한 방법을 설명한다.
일반 반응 도식 1
식 (I)의 지질의 구현예(예컨대, 화합물 A-5)는 일반 반응 도식 1("방법 A")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이며 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응 도식 1을 참조하면, 구조 A-1의 화합물은 상업적 공급처로부터 구입되거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. A-1, A-2 및 DMAP의 혼합물은 DCC로 처리되어 브로마이드 A-3이 얻어진다. 브로마이드 A-3, 염기(예컨대, N,N-다이아이소프로필에틸아민) 및 N,N-다이메틸다이아민 A-4의 혼합물은 임의의 필요한 워크업 및 또는 정제 단계 후에 A-5가 생성되기에 충분한 온도와 시간으로 가열된다.
일반 반응 도식 2
식 (I)의 화합물의 다른 구현예(예컨대, 화합물 B-5)는 일반 반응 도식 2("방법 B")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이며 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응 도식 2에서 나타낸 것과 같이, 구조 B-1의 화합물은 상업적 공급처로부터 구입되거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. B-1(1 당량)의 용액은 산성 염화물 B-2(1 당량) 및 염기(예컨대, 트라이에틸아민)로 처리된다. 미정제 생성물은 산화제(예컨대, 피리디늄 클로로크로메이트)로 처리되고 중간체 생성물 B-3이 회수된다. 그런 후 미정제 B-3, 산(예컨대, 아세트산), 및 N,N-다이메틸아미노아민 B-4의 용액이 환원제(예컨대, 소듐 트라이아세톡시보로하이드라이드)로 처리되어 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 단계 후에 B-5가 얻어진다.
비록 출발 물질 A-1 및 B-1이 포화된 메틸렌 탄소만을 포함하는 것으로 위에서 설명되지만, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 출발 물질이 또한 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 화합물의 제조에 사용될 수 있다는 것이 주지되어야 한다.
일반 반응 도식 3
식 (I)의 지질의 상이한 구현예(예컨대, 화합물 C-7 또는 C9)는 일반 반응 도식 3("방법 C")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이며 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응 도식 3을 참조하면, 구조 C-1의 화합물은 상업적 공급처로부터 구입되거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다.
일반 반응 도식 4
식 (II)의 화합물의 구현예(예컨대, 화합물 D-5 및 D-7)는 일반 반응 도식 4("방법 D")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, R4b, R5, R6, R8, R9, L1, L2, G1, G2, G3, a, b, c 및 d는 본원에서 정의된 것과 같고, R7'는 R7 또는 C3-C19 알킬을 나타낸다. 일반 반응 도식 1을 참조하면, 구조 D-1 및 D-2의 화합물은 상업적 공급처로부터 구입되거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. D-1 및 D-2의 용액은 환원제(예컨대, 소듐 트라이아세톡시보로하이드라이드)로 처리되어 임의의 필요한 워크업 후에 D-3이 얻어진다. D-3과 염기(예컨대 트라이메틸아민, DMAP)의 용액은 아실 클로라이드 D-4(또는 카르복실산 및 DCC)로 처리되어 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 후에 D-5가 얻어진다. D-5는 LiAlH4 D-6으로 환원되어 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 후에 D-7이 얻어질 수 있다.
일반 반응 도식 5
식 (II)의 지질의 구현예(예컨대, 화합물 E-5)는 일반 반응 도식 5("방법 E")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, R4b, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2, G3, a, b, c 및 d는 본원에서 정의된 것과 같다. 일반 반응 도식 2를 참조하면, 구조 E-1 및 E-2의 화합물은 상업적 공급처로부터 구입되거나 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. E-1(과잉량), E-2 및 염기(예컨대, 탄산 칼륨)의 혼합물은 가열되어 임의의 필요한 워크업 후에 E-3이 얻어진다. E-3 및 염기(예컨대 트라이메틸아민, DMAP)의 용액은 아실 클로라이드 E-4(또는 카르복실산 및 DCC)로 처리되어 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 후에 E-5가 얻어진다.
일반 반응 도식 6
일반 반응 도식 6은 식 (III)의 지질의 제조를 위한 예시의 방법(방법 F)을 제공한다. 일반 반응 도식 6에서 G1, G3, R1 및 R3은 식 (III)에 대해 본원에서 정의된 것과 같고, G1'는 G1보다 탄소 하나가 더 짧은 상동체를 나타낸다. 구조 F-1의 화합물은 구입되거나 기술분야에 알려진 방법에 따라 제조된다. 적절한 축합 조건(예컨대, DCC) 하에서 F-1과 다이올 F-2의 반응으로 에스테르/알코올 F-3이 생성되며, 이것은 다음에 산화되어(예컨대, PCC) 알데하이드 F-4가 생성될 수 있다. 환원성 아민화 조건 하에서 F-4와 아민 F-5의 반응으로 식 (III)의 지질이 얻어진다.
식 (III)의 지질의 제조를 위한 다양한 대체 전략이 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에게 이용될 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 예를 들어, L1 및 L2가 에스테르 이외의 것인 다른 식 (III)의 지질이 적절한 출발 물질을 사용하여 유사한 방법에 따라 제조될 수 있다. 추가로, 일반 반응 도식 6은 G1 및 G2가 동일한 식 (III)의 지질의 제조를 도시한다; 그러나, 이것은 발명의 필요한 측면은 아니며 G1 및 G2가 상이한 화합물을 얻기 위해 위의 반응 도식에 대한 변형이 가능하다.
기술분야에 숙련된 사람들에게 본원에 기술된 방법에서 중간체 화합물의 작용기가 적합한 보호기에 의해 보호될 필요가 있을 수 있다는 것이 인정될 것이다. 그러한 작용기에는 하이드록시, 아미노, 머캡토 및 카르복실산이 포함된다. 하이드록시에 대해 적합한 보호기에는 트라이알킬실릴 또는 다이아릴알킬실릴(예를 들어, t-부틸다이메틸실릴, t-부틸다이페닐실릴 또는 트라이메틸실릴), 테트라하이드로피라닐, 벤질, 등이 포함된다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노에 대해 적합한 보호기에는 t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 등이 포함된다. 머캡토에 대해 적합한 보호기에는 -C(O)-R"(여기서 R"는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등이 포함된다. 카르복실산에 대해 적합한 보호기에는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르가 포함된다. 보호기는 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있고 본원에서 기술된 것과 같은 표준 기법에 따라 첨가되거나 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 문헌[Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis(1999), 3rd Ed., Wiley]에서 상세하게 기술된다. 기술분야에 숙련된 사람이 인정하게 되는 것과 같이, 보호기는 또한 Wang 수지, Rink 수지 또는 2-클로로트리틸클로라이드 수지와 같은 중합체 수지일 수 있다.
약학적 조성물
본원에 기술된 약학적 조성물의 제형은 약물학 기술분야에서 알려져 있거나 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 제조 방법에는 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 부속 성분과 회합시키는 단계, 및 그 후에, 필요하거나 바람직하다면, 생성물을 원하는 단일 또는 다중 용량 단위로 성형 또는 포장하는 단계가 포함된다.
비록 본원에 제공된 약학적 조성물의 설명이 원칙적으로는 인간에게 윤리적으로 투여하기에 적합한 약학적 조성물에 관련되지만, 숙련된 당업자는 그러한 조성물이 일반적으로 모든 부류의 대상체에게 투여하기에 적합한 것을 이해할 것이다. 조성물이 다양한 대상체에게 투여하기에 적합하게 되도록 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물의 변형은 잘 이해되며, 통상적인 지식을 가진 수의 약리학자는 단지 일반적인, 있다면, 실험으로 그러한 변형을 설계하고 수행할 수 있다. 발명의 약학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체에는, 한정하는 것은 아니지만, 인간 및 다른 영장류, 비인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 및 개와 같은 상업적으로 관련된 포유류를 포함한 포유류가 포함된다.
발명의 방법에 유용한 약학적 조성물은 안과, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 협측, 정맥내, 뇌실내, 피내, 근육내, 또는 다른 경로의 투여에 적합한 제형으로 제조되거나, 포장되거나, 또는 판매될 수 있다. 고려되는 다른 제형에는 투사된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유한 재밀봉 적혈구, 및 면역원성 기반 제형이 포함된다.
발명의 약학적 조성물은 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대용량으로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량과 같거나 또는, 예를 들어, 그러한 투여량의 절반 또는 1/3과 같은 투여량의 편리한 분획과 같다.
발명의 약학적 조성물 중의 활성 성분, 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 임의의 추가 성분의 상대적 양은 치료되는 대상체의 신원, 크기, 및 병태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여될 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 조성물은 0.1% 내지 100%(중량/중량)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성 성분 외에, 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
발명의 약학적 조성물의 제어된 또는 지속성 방출 제형은 종래 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 약학적 조성물의 "비경구 투여"에는 대상체 조직의 물리적인 침입 및 조직의 침입을 통한 약학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로가 포함된다. 그러므로 비경구 투여에는, 한정하는 것은 아니지만, 조성물의 주사에 의한, 수술적 절개를 통한 조성물의 적용에 의한, 조직을 침투하는 비수술적 상처를 통한 조성물의 적용, 및 그 외에 의한 약학적 조성물의 투여가 포함된다. 특히, 비경구 투여는 한정하는 것은 아니지만, 안내, 유리체내, 피하, 복강내, 근육내, 피내, 흉골내 주사, 종양내, 정맥내, 뇌실내 및 신장 투석 주입 기법을 포함하는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 약학적 조성물의 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균된 등장성 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속식 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 단위 투여 형태, 예컨대 보존제를 함유한 앰풀 또는 다중 용량 용기에 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형에는, 한정하는 것은 아니지만, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식 가능한 지속성 방출 또는 생분해 가능한 제형이 포함된다. 그러한 제형은 한정하는 것은 아니지만, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 한 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예컨대 발열원이 없는 멸균수)로 재구성되기 위한 건식(즉 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
약학적 조성물은 멸균된 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이런 현탁액 또는 용액은 기술분야에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 외에, 본원에 기술된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 그러한 멸균된 주사 가능한 제형은 무독성 비경구 허용 가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 다이올을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용 가능한 희석제 및 용매에는, 한정하는 것은 아니지만, 링거액, 등장성 염화 나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드와 같은 고정 오일이 포함된다. 유용한 다른 비경구 투여 가능한 제형에는 활성 성분을 미정질 형태로, 리포솜 제제로, 또는 생분해 가능한 중합체 시스템의 구성요소로서 포함하는 것들이 포함된다. 지속성 방출 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염과 같은 약학적으로 허용 가능한 중합체 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 그러한 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.5 내지 약 7 나노미터 범위의 직경을 가지는 건식 입자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 활성 성분을 포함하고 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 가지는 건식 입자를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 편리하게 추진제 스트림이 분말을 분산하도록 유도될 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 사용하거나 또는 밀봉된 용기에 저비점 추진제에 용해되거나 현탁된 활성 성분을 포함하고 있는 장치와 같은 자가 추진 용매/분말 분산 용기를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말 형태이다. 일부 구현예에서, 그러한 분말은 중량 기준으로 적어도 98%의 입자가 0.5 나노미터보다 큰 직경을 가지며 숫자 기준으로 적어도 95%의 입자가 7 나노미터 미만의 직경을 가지는 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중량 기준으로 적어도 95%의 입자는 1 나노미터보다 큰 직경을 가지며 숫자 기준으로 적어도 90%의 입자는 6 나노미터 미만의 직경을 가진다. 일부 구현예에서, 건조 분말 조성물은 당과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함하며 편리하게 단위 용량 형태로 제공된다.
저비점 추진제에는 일반적으로 대기압에서 65℉ 미만의 비등점을 갖는 액체 추진제가 포함된다. 일반적으로 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(중량/중량)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20%(중량/중량)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제(일부 경우에 활성 성분을 포함하는 입자와 같은 차수의 입자 크기를 가짐)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약학적 조성물의 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균된 등장성 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속식 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 단위 투여 형태, 예컨대 보존제를 함유한 앰풀 또는 다중 용량 용기에 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형에는, 한정하는 것은 아니지만, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식 가능한 지속성 방출 또는 생분해 가능한 제형이 포함된다. 그러한 제형은 한정하는 것은 아니지만, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 한 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예컨대 발열원이 없는 멸균수)로 재구성되기 위한 건식(즉 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
약학적 조성물은 멸균된 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이런 현탁액 또는 용액은 기술분야에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 외에, 본원에 기술된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 그러한 멸균된 주사 가능한 제형은 무독성 비경구 허용 가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 다이올을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용 가능한 희석제 및 용매에는, 한정하는 것은 아니지만, 링거액, 등장성 염화 나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드와 같은 고정 오일이 포함된다. 유용한 다른 비경구 투여 가능한 제형에는 활성 성분을 미정질 형태로, 리포솜 제제로, 또는 생분해 가능한 중합체 시스템의 구성요소로서 포함하는 것들이 포함된다. 지속성 방출 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염과 같은 약학적으로 허용 가능한 중합체 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법
본 발명은 NoV VP1 항원을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자(예컨대, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자) 또는 NoV VP1 항원을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자(예컨대, 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자)를 포함하는 조성물(예컨대, LNP)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 노로바이러스에 대한 적응성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 방법은 대상체에서 노로바이러스의 다중 스트레인, 노로바이러스 감염, 또는 한정하는 것은 아니지만, 위장염, 식중독, 구토 및 설사를 포함한 노로바이러스와 관련된 질환 또는 장애에 대한 면역을 제공한다. 그러므로 본 발명은 노로바이러스와 관련된 감염, 질환, 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 조성물은 노로바이러스와 관련된 감염, 질환, 또는 장애를 가진 대상체에게 투여된다. 한 구현예에서, 조성물은 노로바이러스와 관련된 감염, 질환, 또는 장애가 발병될 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 조성물은 노로바이러스와 접촉할 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 노로바이러스가 유행하는 지리상의 지역에 거주하거나, 여행했거나, 또는 여행할 것으로 예상되는 대상체에게 투여된다. 백신 투여에 관심이 있는 집단에는, 한정하는 것은 아니지만, 어린 아동(예컨대, 5세 미만), 군인, 유람선 직원 및 승객, 기관 장기 요양 시설 직원 및 거주자(노인 요양소, 보육원, 학교), 식품 취급자, 및 여행 중인 대상체가 포함된다. 한 구현예에서, 조성물은 노로바이러스가 유행하는 지리상의 지역에 거주하거나, 여행했거나, 또는 여행할 것으로 예상되는 또 다른 사람과 접촉하거나 접촉할 것으로 예상되는 대상체에게 투여된다. 한 구현예에서, 조성물은 직업, 또는 다른 접촉을 통해 노로바이러스에 고의로 노출된 대상체에게 투여된다.
한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 NoV 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 NoV 항원을 암호화하는 제1 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자 및 하나 이상의 NoV 항원을 암호화하는 제2 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 복수의 NoV 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 조성물은 하나 이상의 NoV 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 NoV 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 제1 조성물을 투여하는 단계 및 하나 이상의 NoV 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 복수의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 조성물은 본원에 기술된 하나 이상의 NoV 항원을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 조성물의 시차를 둔 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 복수의 NoV 항원, 보조제, 또는 이것들의 조합을 암호화하는 복수의 뉴클레오사이드 변형 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 발명의 방법은 투여 후 적어도 여러 날 동안 본원에 기술된 NoV 항원 또는 보조제의 지속적인 발현을 허용한다. 일부 구현예에서, 발명의 방법은 투여 후 적어도 2주 동안 본원에 기술된 NoV 항원 또는 보조제의 지속적인 발현을 허용한다. 일부 구현예에서, 발명의 방법은 투여 후 적어도 1개월 동안 본원에 기술된 NoV 항원 또는 보조제의 지속적인 발현을 허용한다. 그러나, 일부 구현예에서 방법은 또한, 일부 구현예에서는 핵산이 대상체 게놈에 통합되지 않기 때문에 일시적인 발현을 제공한다.
일부 구현예에서, 방법은 뉴클레오사이드 변형 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 이것은 본원에 기술된 NoV 항원 또는 보조제의 안정적인 발현을 제공한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 변형 RNA의 투여는 선천적 면역 반응을 거의 내지 전혀 초래하지 않지만, 효과적인 적응성 면역 반응을 유도한다.
일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 2주 이상 동안 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 1개월 이상 동안 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 2개월 이상 동안 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 3개월 이상 동안 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 4개월 이상 동안 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 5개월 이상 동안 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 6개월 이상 동안 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 NoV에 대한 지속적인 보호를 1년 이상 동안 제공한다.
한 구현예에서, 조성물의 단일 면역화는 NoV에 대한 지속적인 보호를 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상 동안 유도한다.
치료 방법에서 발명의 조성물의 투여는 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 많은 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 한 구현예에서, 발명의 방법은 예를 들어 장 또는 비경구 투여를 포함한 대상체의 전신성 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 조성물의 피내 전달을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 조성물의 정맥내 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 조성물의 근육내 전달을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 피하 전달을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 흡입을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 비강내 전달을 포함한다.
발명의 조성물은 대상체에게 단독으로, 또는 또 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다는 것이 인정될 것이다.
그러므로 발명의 치료 및 예방 방법은 발명의 방법을 실시하기 위하여 본원에 기술된 NoV 항원, 보조제, 또는 이것들의 조합을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자(예컨대 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자)를 포함하는 약학적 조성물의 사용을 포함한다. 발명을 실시하는데 유용한 약학적 조성물은 1 ng/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 용량을 전달하기 위해 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 발명은 포유류에서 10 nM 내지 10 μM의 본 발명의 화합물의 농도를 초래하는 용량의 투여를 구상한다.
전형적으로, 발명의 방법에서 포유류, 예컨대 인간에게 투여될 수 있는 투여량은 포유류의 체중 kg당 0.01 μg 내지 약 50 mg의 범위이지만, 투여되는 정확한 투여량은, 한정하는 것은 아니지만, 포유류의 유형 및 치료되는 질환 상태의 유형, 포유류의 연령 및 투여 경로를 포함한 임의의 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 화합물의 투여량은 포유류의 체중 kg당 약 0.1 μg 내지 약 10 mg으로 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 투여량은 포유류의 체중 kg당 약 1 μg 내지 약 1 mg으로 달라질 것이다.
조성물은 포유류에게 1일에 여러 번 정도로 빈번하게 투여되거나, 또는 덜 빈번하게, 예컨대 1일 1회, 주 1회, 2주마다 1회, 월 1회, 또는 심지어 덜 빈번하게, 예컨대 몇 개월, 몇 년마다 1회, 또는 심지어 덜 빈번하게, 예컨대 10년 내지 20년, 15년 내지 30년마다 1회, 또는 심지어 덜 빈번하게, 예컨대 50년 내지 100년마다 1회 투여될 수 있다. 투여 빈도는 숙련된 당업자에게 쉽게 드러날 것이며 임의의 많은 요인, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 포유류의 유형 및 연령, 등에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 투여는 단일 투여에 의해 수행되거나 다중 투여에 의해 부스팅될 수 있다.
실험예
발명은 다음의 실험예를 참조로 한층 더 상세하게 기술된다. 이들 실시예는 예시의 목적만으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 그러므로, 발명은 어떤 방식으로든 다음의 실시예에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변화를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 선행 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명을 제작하고 활용하며 청구된 방법을 실시할 수 있다고 여겨진다. 따라서 다음의 작업예는 어떤 방식으로든 개시의 나머지 내용을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 노로바이러스에 대한 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신
지질 나노입자(LNP)와 복합체를 형성한 뉴클레오사이드 변형 mRNA의 백신 플랫폼을 사용하여 노로바이러스에 대한 백신을 개발하였다. 노로바이러스 백신은 다수의 유전자군(GI.1, GI.3, GII.3 및 GII.4)으로부터의 노로바이러스 캡시드 단백질 VP1을 암호화한다. LNP 캡슐화는 뉴클레오사이드 변형 mRNA의 생체내에서의 효율적인 전달 및 발현을 허용하며, 우리딘 대신 1-메틸슈도우리딘 뉴클레오사이드 변형은 Tfh 세포의 유도를 통해 mRNA 플랫폼에 의해 유도된 항체 반응의 효능에 중요하다. 뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 백신은 저용량(0.25 μg)에서도 높은 HBGA 차단 항체 역가를 입증하였고, 노로바이러스 감염에 대해 인간 엔테로이드를 보호하였으며 강력한 CD4+ 및 CD8+ 반응을 유도하였다. 이들 데이터는 노로바이러스 VP1 서열을 기반으로 한 변형된-뉴클레오사이드 mRNA-LNP 백신이 생체내에서 면역원성이고 시험관내에서 바이러스 감염을 차단하는 중화 항체를 생성한다는 개념의 증거를 제공한다. mRNA-LNP 백신은 저용량으로 매우 효과적이며 고도로 확장 가능한 제조가 가능한 비복제 벡터이다; 따라서, 노로바이러스에 대해 사람들을 면역시키기 위한 글로벌 공중 보건 캠페인에 사용하기에 이상적으로 적합하다.
뉴클레오사이드 변형 mRNA-LNP 노로바이러스 백신은 높은 차단 항체 역가, 노로바이러스 감염에 대한 인간 엔테로이드의 양호한 보호를 입증하였고 강력한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. 이들 데이터는 노로바이러스 VP1 서열을 기반으로 한 변형된-뉴클레오사이드 mRNA-LNP 백신이 생체내에서 면역원성이고 시험관내에서 바이러스 감염을 차단하는 중화 항체를 생성한다는 개념의 증거를 제공한다.
mRNA 분자가 정확한 단백질을 발현한 것을 확인하기 위하여, 293T 세포를 노르워크1968, 케이프타운2012, 스웨덴2008, 아르헨티나2016, 내슈빌2016, 캐나다2019, UK2015, USA2011 또는 일본2009를 암호화한 mRNA로 형질감염시켰다. 24시간 후 세포를 수득하고 GI.1, GII.4, GI.3 또는 GII.3 캡시드의 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다(도 1).
Balb/c 마우스(생후 6-8주령)를 10 μg의 빈 LNP 또는 mRNA 이가 백신: 유전자군 I 스트레인을 나타내는 노르워크/2011/GI.1 및 유전자군 II 스트레인을 나타내는 케이프타운/2012/GII.4의 피내 주사에 의해 0일 및 28일 째에 2회 면역화하였다. 유전자군 I 및 II 스트레인은 함께 인간 노로바이러스 감염의 >90%를 차지한다. 도 2는 면역화 도식을 상세하게 도시한다.
mRNA 이가 백신 후 HuNoV 차단 항체 반응
혈청을 노르워크1968/GI.1 및 시드니2012/GII.4 바이러스 유사 입자(VLP)에 대해 대리 중화 검정으로 VLP와 결합 리간드의 상호작용을 차단하는 능력에 대해 스크리닝하였다(도 3). 적어도 50% VLP-리간드 결합을 차단하지 않는 혈청에 0.5X LLD(ID50=25)의 역가에 할당하였고 마커는 검출 한계 아래에 배치되었다(점선).
mRNA 이가 백신 후 HuNoV 차단 항체 반응
도 4는 추가 VLP에 대한 차단 Ab 반응이 백신 반응이 유전자형 특이적이고, 테스트된 유전자군(GI.3, GI.5, GII.3) 내에서 또는 사이에서 교차 반응이 없는 것을 입증한 것을 입증한다. GII.4 유전자형 내에서, GII.4/2009 및 GII.4/2002에 대한 차단 Ab 역가는 각각 GII.4/2012의 역가의 약 20% 및 5%였고, 이것은 전 세계적으로 우세한 GII.4 팬데믹 유전자형 내에서 알려진 항원 드리프트와 일치한다.
T 세포 자극 검정
Balb/c 마우스(생후 6-8주령)를 마우스당 10 μg의 mRNA 이가 백신(GII.4/케이프타운2012, GI.1/노워크2012)으로, 또는 대조군으로서 mRNA-Luc로 0일 째에 근육내 주사에 의해 면역화하였다. n = 그룹당 5마리(도 5). T 세포 자극 검정을 VLP(GI.1, GI.3, GII.3, GII.4)로 수행하였다(도 6).
인간 노로 이가 mRNA 백신 용량 반응
이가 mRNA 백신의 최적량을 결정하기 위하여, 4가지 용량(마우스당 0.25, 0.5, 1 또는 3 μg의 각 백신) 또는 대조군으로서 mRNA-Luc(12 μg/마우스)를 28일 간격으로 2회 근육내(i.m.) 주사에 의해 마우스에 투여하였다(도 7). 혈청을 면역화 후 0, 28, 56, 150일 째에 수집하여 대리 중화 검정으로 평가하였다. n=표시된 시점에 그룹당 10마리. 차단 항체의 역가는 소량의 0.25 μg/마우스로도 높은 수준이다.
저용량 mRNA 백신이 강력한 Th1 반응을 유도한다
Th1 반응을 평가하기 위하여, Balb/c 마우스(생후 6-8주령)를 마우스당 0.25 μg의 mRNA 백신(GII.4)으로 또는 대조군으로서 mRNA-Luc로 근육내 주사에 의해 0일 및 28일 째에 2회 면역화하였다(도 8). 부스팅 후 2주 후에, 비장 단일 세포 현탁액을 GII.4 펩타이드 풀(pool)(15 AA 길이, 11 AA 중첩)로 5시간 동안 37℃, 5% CO2에서 자극하고, T 세포의 활성화에 대해 유세포분석에 의해 분석하였다. n = 각 그룹당 10마리. GII.4 mRNA-LNP로 백신접종되고 GII.4 펩타이드 풀로 자극된 마우스로부터 분리된 비장세포는 mRNA 백신이 강력한 CD4+ 및 CD8 T 세포 반응을 유도한 것을 입증하였다.
사가 노로바이러스 mRNA 백신
GI.3 및 GII.3 유전자형이 소아 NoV 급성 위장염의 NoV 발병에서 가장 널리 퍼진 GI 및 GII 유전자형이기 때문에 이것들을 포함하는 사가 노로바이러스 mRNA 백신을 개발하였다. GI.3/아르헨티나2016 및 GII.3/캐나다2019의 캡시드 단백질 VP1 서열을 GenBank에서 확인하고, 플라스미드를 설계하고, 뉴클레오사이드 변형 mRNA를 생성하였다. GI.1, GII.4, GI.3 및 GII.3을 암호화하는 mRNA를 내독소 수준 및 LNP 캡슐화 전 IFN-알파의 활성화에 대해 조사하였다.
Balb/c 및 C57BL/6 마우스(생후 6-8주령)을 마우스당 0.125, 0.25, 0.5, 1 μg의 mRNA 사가 백신(GII.4/케이프타운2012, GI.1/노워크2012, GI.3/아르헨티나2016, GII.3/캐나다2019)으로, 또는 대조군으로서 빈 LNP로 근육내 주사에 의해 0일 및 28일 째에 2회 면역화하였다(n = 그룹당 5마리)(도 9).
사가 mRNA 백신의 최적량을 결정하기 위하여, 4가지 용량(마우스당 0.125, 0.25, 0.5, 또는 1 μg의 각 백신) 또는 대조군으로서 빈 LNP(4 μg/마우스)를 28일 간격으로 2회 근육내 주사에 의해 마우스에 투여하였다(도 10). 빈 LNP는 검출 수준 미만이었다(미도시).
인간 장 엔테로이드
인간 노로바이러스에 대한 효과적인 개입의 개발에 대한 주요 장벽은 강력하고 재현 가능한 시험관내 배양 시스템의 부족이었다. 최근에 연구자들은 3차원 시험관내 배양물이 인간 위장관 생검 또는 수술 시편으로부터 분리된 크립트에서 줄기 세포를 증식시켜 유래된 인간 장 엔테로이드(HIE)를 개발하였다. HIE 배양물은 장 상피의 다세포 복잡성 및 조직을 가지고 있다. HIE는 생리학적으로 활성이며, 정상 GI 관의 모든 상피 세포 유형을 포함하고 분절 특이적 특성을 유지한다.
도 11 및 도 12는 GII.4로 감염된 환자 대변 샘플로부터 유래된 살아있는 HNoV로의 줄기 세포 유래 인간 3D 엔테로이드의 감염의 효과를 입증한다. HIE는 HNoV로 감염된 엔테로이드가 VP1 캡시드 단백질의 존재 및 긴밀한 접합 무결성에 대한 마커인 ZO1 염색의 손실을 나타내기 때문에 HNoV 감염을 검정하기 위해 사용될 수 있다(도 12).
C57BL/6 마우스(생후 6-8주령)를 마우스당 0.25 μg의 mRNA 백신(GII.4)으로 또는 대조군으로서 mRNA-Luc로 근육내 주사에 의해 0일 및 28일 째에 2회 면역화하였다. 부스팅 후 4주 후에, 혈청을 수집하여 표시된 희석으로 희석하고, HNoV 양성 대변 샘플과 사전 인큐베이션하고 생검 유래 인간 소장 오가노이드에서 HuNoV 감염을 중화하는 능력에 대해 분석하였다. 도 13 및 도 14는 GII.4 감염에 대해 mRNA-LNP 백신 접종 마우스로부터의 혈청에 의해 인간 장 엔테로이드가 보호되는 것을 입증한다.
이들 데이터는 프라임 후 30일 후 차단 항체 역가가 HNoV로 감염된 환자로부터의 차단 항체 역가보다 더 높거나(GI.1) 또는 비슷하였고(GII.4), 차단 단편은 적어도 240일까지는 고역가에서 지속적이었으며, 저용량 mRNA 백신(0.25 μg)이 강력한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하였고, 백신접종 마우스로부터의 혈청이 HNoV를 중화하고 GII.4 감염에 대해 인간 장 엔테로이드를 보호한 것을 입증한다. 그러므로, 데이터는 노로바이러스 VP1 서열을 토대로 한 변형된-뉴클레오사이드 mRNA-LNP 백신이 생체내에서 면역원성이고 시험관내에서 바이러스 감염을 차단하는 중화 항체를 생성한다는 것을 지지한다.
실시예 2: 서열
서열 번호:1
캡시드 단백질 VP1 [노로바이러스 Hu/GI.1/8FIIa/1968/USA]
서열 번호:2
[노로바이러스 Hu/GI.1/CHA9A004_20110419/2011/USA]
서열 번호:3
VP1 [노로바이러스 Hu/GII.4/시드니/NSW0514/2012/AU]
서열 번호:4
[노로바이러스 GII/Hu/ZAF/2012/GII.P4_GII.4/케이프타운/9772]
서열 번호:5
캡시드 단백질 [노로바이러스 GI.3](차이나 2015)
서열 번호:6
VP1 [노로바이러스 GI.3](Hu/USA/2016/GI.Pd-GI.3/내슈빌-0047)
서열 번호:7
VP1 [노로바이러스 GII.3] UK 2015
서열 번호:8
주요 캡시드 단백질 VP1 [노로바이러스 GII](Hu/GII.P16-GII.3/RUS/노보시비르스크/NS17-A996/2017)
서열 번호:9
VP1 [노로바이러스 GI](아르헨티나 2016)
서열 번호:10
VP1 [노로바이러스 GII](캐나다 2019)
본원에서 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원, 및 출판물의 개시내용은 본원에 그 전체 내용이 참조로 포함된다. 본 발명이 특정 구현예를 참조로 개시되었지만, 본 발명의 다른 구현예 및 변화가 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 구상될 수 있는 것이 분명하다. 첨부된 청구범위는 그러한 모든 구현예 및 동등한 변화를 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (27)

  1. 대상체에서 노로바이러스(NoV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 적어도 하나의 NoV 항원을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 NoV 항원은 p48, 뉴클레오사이드-트라이포스파타제(NTPase), p22, VPg, 프로테아제, 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp), VP1, VP2, 그것의 단편, 및 이것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 NoV 항원은 GI, GII, GIV, GVIII 및 GIX로 이루어지는 유전자군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 2개의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하고, 상기 VP1 항원은 GI 및 GII로 이루어지는 NoV 유전자군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 2개의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하고, 상기 VP1 항원은 GI.1, GI.3, GI.5, GII.3 및 GII.4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 NoV VP1 GI.1 항원을 암호화하는 mRNA 분자와 NoV VP1 GII.4 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 NoV VP1 GI.1 항원, NoV VP1 GII.4 항원, NoV VP1 GI.3 항원 및 NoV VP1 GII.3 항원 각각을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9 및 서열번호:10으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 보조제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 mRNA 분자는 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화되는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 mRNA 분자는 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘, 및 5-메틸-우리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자인 것인, 조성물.
  12. 대상체에서 노로바이러스(NoV)의 적어도 하나의 스트레인에 대해 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 적어도 하나의 NoV 항원 또는 그것의 단편을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 NoV 항원은 p48, 뉴클레오사이드-트라이포스파타제(NTPase), p22, VPg, 프로테아제, 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp), VP1, VP2, 그것의 단편, 및 이것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 NoV 항원은 GI, GII, GIV, GVIII 및 GIX로 이루어지는 유전자군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 적어도 2개의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하고, VP1 항원은 GI 및 GII로 이루어지는 NoV 유전자군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 적어도 2개의 NoV VP1 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하고, VP1 항원은 GI.1, GI.3, GI.5, GII.3 및 GII.4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, NoV VP1 GI.1 항원을 암호화하는 mRNA 분자와 NoV VP1 GII.4 항원을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  18. 제15항에 있어서, NoV VP1 GI.1 항원, NoV VP1 GII.4 항원, NoV VP1 GI.3 항원 및 NoV VP1 GII.3 항원 각각을 암호화하는 mRNA 분자의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9 및 서열번호:10으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 보조제를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  21. 제12항에 있어서, 상기 mRNA 분자는 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화되는 것인, 방법.
  22. 제12항에 있어서, 상기 mRNA 분자는 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘, 및 5-메틸-우리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA 분자인 것인, 방법.
  23. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 피내, 피하, 흡입, 비강내, 및 근육내로 이루어지는 군으로부터 선택된 전달 경로에 의해 투여되는 것인, 방법.
  24. 제12항에 있어서, 상기 방법은 조성물의 단일 투여를 포함하는 것인, 방법.
  25. 제12항에 있어서, 상기 방법은 조성물의 다중 투여를 포함하는 것인, 방법.
  26. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 NoV 감염과 관련된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 NoV 감염과 관련된 질환 또는 장애는 위장염, 식중독, 구토 및 설사로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
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