CN113453669A - 用于免疫活性或用于预防或治疗癌症的药物组合物 - Google Patents

用于免疫活性或用于预防或治疗癌症的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于增强免疫活性的药物组合物和用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含：特定地平末端发夹RNA；以及在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒，其中多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为7至25nm，并且孔内部带正电，从而充分负载RNA并将负载的RNA稳定地递送至体内。

Description

用于免疫活性或用于预防或治疗癌症的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于免疫活性或用于预防或治疗癌症的药物组合物。
背景技术
基于诱导基于抗体的免疫应答的标准疫苗策略已经根除或几乎根除许多先前致命的传染病，例如天花、脊髓灰质炎和破伤风。然而，这些传统的人体疫苗在其他传染病如HIV和肝炎和非传染性疾病如癌症中的使用并不有效或安全。
旨在诱导细胞免疫应答的下一代免疫治疗产品可以通过识别和杀死癌细胞和感染细胞而不是病原体本身来克服传统疫苗的局限性。核酸疫苗，尤其是病毒载体已显示出巨大的临床转化潜力。
癌细胞和许多传染性病原体具有逃避免疫系统的能力，这使得制造有效的疫苗变得困难。经典疫苗通常需要佐剂，例如铝盐以获得最佳效果，但常规佐剂通常是细胞免疫应答的弱增强剂。已经提出几种策略来提高病毒载体诱导的细胞免疫应答的质量和程度。已经开发出一种新型遗传佐剂来提高由基于载体的免疫疗法诱导的细胞免疫应答。遗传佐剂由编码免疫调节分子的DNA序列组成。
Stone等人(WO 2014/039961)公开了使用遗传佐剂诱导干扰素α和β分泌以诱导干扰素刺激基因的表达。在该方法中，核酸疫苗任选地编码包括LMP1蛋白的跨膜部分的融合蛋白，其中除了编码标记蛋白或抗原的转基因外，胞质内结构域由免疫效应子或衔接蛋白如IPS1蛋白所取代。IFN-β启动子刺激物(IPS1；也称为MAVS、VISA或Cardif)的激活通过STING(干扰素基因的刺激物)途径产生强烈的T细胞应答。当在细胞中表达时，LMP1的跨膜结构域通过自发形成簇，使IPS1聚集成胞质内簇，来激活STING途径。与全长小鼠IPS1融合的LMP1的跨膜结构域已被证明诱导IFN-α、IFN-β和IL-6的分泌，并且还诱导小鼠巨噬细胞中成熟标志物(CD40和CCR7)和激活标志物(CD80和CD86)的表达。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供一种用于提高免疫活性的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
1.一种用于提高免疫活性的药物组合物，其包括：由下式(1)表示的平末端发夹RNA；和在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒，
其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为7至25nm，并且所述孔的内部带正电，
[式1]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a是2至5的整数，b是1至5的整数，
UUCG是形成发夹的环的碱基，
N1和N2是选自G或C的2至4个碱基，X1和X2是选自A或U的1至5个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
2.根据上述1所述的组合物，其中所述RNA由下式2表示：
[式2]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a和b各自是2至4的整数，
N1和N2是选自G或C的2至4个碱基，X1和X2为选自A或U的2至4个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
3.根据上述1所述的组合物，其中所述RNA的长度为14至100nt。
4.根据上述1所述的组合物，其中所述RNA包括SEQ ID NO:1至25中的任一个，以及与5’-末端结合的2至4个磷酸基团。
5.根据上述1所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为5至65mV。
6.根据上述1所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为35mV以下。
7.根据上述1所述的组合物，其中未携带RNA的颗粒的ζ电位为10至70mV。
8.根据上述1所述的组合物，其中所述颗粒与所述RNA的重量比为1:5至20。
9.根据上述1所述的组合物，其中所述颗粒具有多个孔，所述孔从所述颗粒的表面延伸至内部。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒的BET表面积为280至680m2/g，并且粒径为50至500nm。
11.根据上述1所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒是孔的平均孔径由小于5nm扩张至7至25nm的小孔颗粒。
12.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括：由下式(1)表示的平末端发夹RNA；和在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒，
其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为7至25nm，并且所述孔的内部带正电，
[式1]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a是2至5的整数，b是1至5的整数，
UUCG是形成发夹的环的碱基，
N1和N2为选自G或C的2至4个碱基，X1和X2为选自A或U的1至5个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
13.根据上述12所述的组合物，其中所述RNA由下式2表示：
[式2]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a和b各自是2至4的整数，
N1和N2为选自G或C的2至4个碱基，X1和X2为选自A或U的2至4个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
14.根据上述12所述的组合物，其中所述RNA的长度为15至100nt。
15.根据上述12所述的组合物，其中所述RNA包括SEQ ID NO:1至25的任一序列，以及与5’-末端结合的2至4个磷酸基团。
16.根据上述12所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为5至65mV。
17.根据上述12所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为35mV以下。
18.根据上述12所述的组合物，其中未携带RNA的颗粒的ζ电位为10至70mV。
19.根据上述12所述的组合物，其中所述颗粒与所述RNA的重量比为1:5至20。
20.根据上述12所述的组合物，其中所述颗粒具有多个孔，并且所述孔从所述颗粒的表面延伸至内部。
21.根据上述12所述的组合物，其中所述颗粒的BET表面积为280至680m2/g,，并且粒径为50至500nm。
22.根据上述12所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒是孔的平均孔径由小于5nm扩张至7至25nm的小孔颗粒。
23.根据上述12所述的组合物，其中所述癌症为以下的任一种：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、泌尿生殖道癌、睾丸肿瘤、食管癌、喉癌、胃癌、胃肠癌、皮肤癌、角质化细胞瘤、滤泡癌、黑色素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳头状癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、肾癌、骨癌、骨髓疾病、淋巴系统疾病、毛细胞癌、口腔和咽(口)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、中枢神经系统癌症、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈部癌、霍奇金病和白血病。
发明的效果
本发明的组合物可将所负载的RNA稳定地递送至体内并将其释放至靶标，从而激活RIG-I信号传导途径并促进诸如IFN-α、β和Viperin等因子的表达，从而表现出免疫激活作用。
本发明的组合物可通过激活干扰素信号传导途径和/或干扰素非依赖性细胞凋亡途径表现出优异的抗癌活性。
本发明的组合物可减少诸如在递送至细胞期间在细胞质中形成液泡的现象。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。
图2是根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。
图3是根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的制造过程中得到的小孔颗粒的显微照片。
图4是根据本发明的一个实施方案的小孔颗粒的显微照片。
图5是根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。
DDV(可降解递送载体)是根据一个实施方案的颗粒，其中括号中的数字是指颗粒的直径，下标的数值是指孔径。例如，根据一个实施方案，DDV(200)10是指具有200nm的粒径(即，粒径)和10nm的孔径的颗粒。
图6是用于鉴定根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性的显微照片。
图7是显示根据一个示例性实施例的具有圆筒状渗透膜的管的视图。
图8是显示根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图9是显示根据本发明的一个实施方案的各粒径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图10是显示根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图11是显示根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒针对各环境的pH值的吸光度随时间降低的结果的图。
图12是显示根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图13至图17是显示根据本发明实施方案的携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的特性分析结果的图，其中A显示DegradaBALL的电子显微镜图像和物理性质(表面积、微孔尺寸、表面电荷和平均粒径)；B显示合成RIG-I配体(5’-三磷酸发夹RNA，ppp-RNA)和对照发夹RNA(OH-RNA)的序列和结构；C显示通过以不同重量比混合DegradaBALL和ppp-RNA后离心得到的上清液的SDS-PAGE分析图像；D显示实时高分辨率荧光图像，其中当A549细胞用携带荧光标记的OH-RNA的DegradaBALL处理时，OH-RNA从A549细胞内部释放；E显示使用皮尔逊相关系数对细胞中DegradaBALL负载的OH-RNA的释放程度进行定量分析的结果。
图18是显示诱导根据本发明的实施方案的携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的干扰素β表达的结果的图。
图19是显示诱导根据本发明的实施方案的携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的Viperin表达的结果的图。
图20是显示诱导根据本发明的实施方案的携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的干扰素α表达的结果的图。
图21至图26是显示诱导根据本发明实施方案的携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的干扰素依赖性或非依赖性肿瘤细胞凋亡的结果的图，其中：A是表示LEM-S403通过瘤内注射而递送的示意图；B显示荧光图像，使用FITC标记的OH-RNA和TAMRA标记的DegradaBALL，根据DegradaBALL混合的存在或不存在，确认OH-RNA的缓释趋势，这在对已植入肿瘤的C57BL/6小鼠施用、然后在1、3、和5天后分离肿瘤后进行分析；C为显示通过LEM-S403注射黑色素瘤的抗肿瘤治疗过程的示意图，其中LEM-S403的治疗策略为1)干扰素依赖性免疫应答，和2)干扰素非依赖性肿瘤细胞死亡反应；D显示使用其中形成肿瘤(B16F10)的C57B6小鼠进行LEM-S403机理研究的施用方案，其中在接种肿瘤后3天(第0天)和5天(第2天)(每组5只小鼠)和接种肿瘤后6天(第3天)向小鼠施用缓冲液、载体(70μg)、ppp-RNA(7μg)或LEM-S403(7μg)，处死所有小鼠并分离肿瘤，然后进一步分析；E显示肿瘤中磷-STAT1的免疫荧光染色的结果；F是通过苏木精和伊红染色和TUNNEL染色的代表性肿瘤组织片段的图像。
图27至图31是显示诱导根据本发明的实施方案的携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的干扰素非依赖性肿瘤细胞凋亡的结果的图，其中在对黑色素瘤小鼠模型瘤内注射缓冲液、载体、ppp-RNA或LEM-S403两次(第0天和第2天)后，在第3天(第3天)分离肿瘤细胞，用膜联蛋白V-PI染色，其中：A显示各实验组中通过流式细胞术分析肿瘤细胞获得的代表性图像；B显示各实验组的存活细胞、经历凋亡的细胞或死亡细胞的比例；C显示通过蛋白质免疫印迹测量的肿瘤中半胱天冬酶-3裂解的确认；D显示LEM-S403处理后Noxa基因表达的RT-PCR分析的结果，使用B16F10细胞，其中在用缓冲液、ppp-RNA、载体、LEM-S403或Lipofectamine 2000+ppp RNA处理来处理细胞后24小时确定mRNA表达；和E显示通过RT-PCR测定的小鼠肿瘤中的Noxa基因表达。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，与其他组相比(ANOVA)。
图32至35是显示根据本发明的实施方案的携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的肿瘤浸润NK细胞和CD8+T细胞的数量和活性的增加的评价结果的图，其中，在3天(第0天)和5天(第2天)(每组五(5)只小鼠)，通过施用黑色素瘤、缓冲液、载体(70μg)、ppp-RNA(7μg)或LEM-S403(7μg)接种小鼠后，其中，6天(第3天)后处死所有小鼠并分离肿瘤，随后进一步分析，其中：A通过肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术确认NK细胞和表达CD69的NK细胞的分布；B显示指示NK 1.1(绿色)和CD69(红色)表达细胞的B16F10肿瘤的代表性免疫荧光图像；C通过肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术证实CD8+T细胞和表达CD69的CD8+T细胞的分布；D显示指示CD8a(绿色)和CD69(红色)表达细胞的B16F10肿瘤的代表性免疫荧光图像。**p<0.01；***p<0.001，与其他组相比(ANOVA)。
图36至39是显示根据本发明的实施方案的在单独或与抗体组合施用携带RNA的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)中的抗肿瘤评价结果的图，其中：A是LEM-S403单独和与抗PD-1组合在小鼠黑色素瘤(B16F10)模型中的实验设计的示意图，其中在C57B/6小鼠中接种肿瘤后，肿瘤体积成为约100mm3的时间点作为第0天，在第0、3、7和10天，施用缓冲液(1×PBS，50μL，瘤内施用)、载体(70μg，瘤内施用)、ppp-RNA(7μg，瘤内施用)、LEM-S403(7μg，瘤内施用)或LEM-S403(7μg，瘤内施用)和抗PD-1抗体(10mg/kg，腹膜内施用)；B显示以2天和3天间隔测定的肿瘤体积的变化；C显示所有观察组的存活率随时间的变化(**p<0.01；***p<0.001与缓冲液相比，#p<0.05与LEM-S403相比，通过对数秩Mantel-Cox检验)；D是显示所有组中各受试者的肿瘤体积的图。
图40是其中颗粒递送至细胞中的实施方案的示意图。
图41是说明根据本发明的实施方案在不同地调整多孔二氧化硅颗粒和RNA的含量比时确认流入细胞(B16F10)是否顺畅的照片。
图42是根据本发明的实施方案的多孔二氧化硅颗粒的示意图。
具体实施方式
以下，将详细描述本发明。
本发明涉及用于提高免疫活性的药物组合物。
本发明的用于提高免疫活性的药物组合物可以包括由下式(1)表示的平末端发夹RNA；和在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒。
[式1]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a是2至5的整数，b是1至5的整数，
UUCG是形成发夹的环的碱基，
N1和N2是选自G或C的2至4个碱基，X1和X2是选自A或U的1至5个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
式1表示的RNA是平末端发夹结构RNA，其中双链多核苷酸彼此互补结合，中间接头部分的碱基UUCG形成环，其中包括平末端5'-三磷酸作为RIG-I激动剂。
本发明的组合物可以表现出免疫活性、免疫应答刺激或促进功效，这些作用是通过将所负载的RNA稳定地递送至体内并将其释放至靶标以激活RIG-I信号传导途径，以及通过促进诸如IFN-α、β、viperin等因子的表达来完成。因此，可以激活免疫力，从而对传染病、癌症和其他免疫相关疾病表现出优异的药效。
具体地，“免疫应答”是指对抗原、抗原(多种)、过敏原(一种或多种)、药物或生物制剂特异性的抗体和/或免疫细胞介导的应答的诱导。免疫应答的诱导取决于许多因素，包括，例如，受攻击生物体的免疫原性构型，抗原、过敏原、药物或生物制剂的化学组成和三维排列，以及抗原、过敏原、药物或生物制剂的施用的方法和持续时间。免疫应答有很多方面，其中一些由免疫系统的细胞(例如，B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞)表现。免疫系统的细胞可以通过与抗原、过敏原或免疫系统的其他细胞的相互作用、细胞因子的释放、以及对这些细胞因子的响应性来参与免疫应答。免疫应答一般分为两大类，即体液和细胞介导的应答。体液免疫应答可涉及对抗原、过敏原、药物或生物制剂具有特异性的抗体的产生。细胞介导的应答可涉及对抗原或过敏原的延迟超敏反应以及细胞毒性效应细胞的产生。
免疫系统的激活或刺激可通过激活免疫效应细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来介导。此外，免疫系统激活或刺激可以通过抗原呈递细胞如树突细胞的激活和成熟来介导。此外，免疫系统激活或刺激可以通过阻断抑制途径如抑制免疫检查点抑制剂来介导。
传染病是由致病抗原感染引起的疾病，致病抗原可以包括源自与传染病有关的病原体的肽或蛋白质抗原，其中病原体可以包括例如细菌、病毒等，特别是鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、无形体属(Anaplasma genus)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、巴西钩虫(Ancylostoma braziliense)、钩虫(十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale))、溶血隐秘杆菌(hemolytic Akanobacteriumhaemolyticum)、蛔虫(Ascaris lumbricoides)、曲霉属(Aspergillus genus)、曲霉属、星状病毒科(Astroviridae)、焦虫属(Babesia genus)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、汉氏巴尔通氏体(bartonellahenselae)、BK病毒、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、疏螺旋体属(Borreliagenus)、疏螺旋体属某种(Borrelia spp)、布鲁氏菌属(Brucella genus)、马来丝虫(Brugia malayi)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae family)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)和其他伯克霍尔德菌种(Burkholderia species)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomalei)、杯状病毒科(Caliciviridae family)、弯曲菌属(Campylobacter genus)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、假丝酵母菌属某种(Candida spp)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、CJD朊病毒、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、梭菌属某种(Clostridium spp)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、球孢子菌属某种(Coccidioides spp)、冠状病毒(coronaviruses)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、隐孢子虫属(Cryptosporidium genus)、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、埃博拉病毒(EBOV)、棘球绦虫属(Echinococcus genus)、查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、伊文吉埃立克体(Ehrlichia ewingii)、埃立克体属(Ehrlichia genus)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、肠球菌属(Enterococcus genus)、肠道病毒属(Enterovirus genus)、肠道病毒(Enteroviruses)，主要是柯萨奇A病毒和肠道病毒71(EV71)、表皮癣菌属某种(Epidermophyton spp)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7、Ol11和O104:H4、癫痫(肝片吸虫(Fasciola hepatica))和巨癫痫(giant epilepsy)(大片吸虫(Fasciola gigantica))、FFI朊病毒、丝虫目相家族(丝虫目(Filarioidea)超家族)、黄病毒(Flaviviruses)、土拉菌病(Tularemia)(土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis))、梭杆菌属(Fusobacterium genus)、白地霉(Geotrichumcandidum)、肠贾第虫(Giardia intestinalis)、颚口虫属某种(Gnathostoma spp)、GSS朊病毒、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)、杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、亨尼帕病毒(Henipavirus)(亨德拉病毒(Hendra virus)、尼帕病毒(Nipah virus))、甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、人博卡病毒(Humanbocavirus)(HBoV)、人疱疹病毒6(HHV-6)和人疱疹病毒7(HHV-7)、人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus)(hMPV)、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)(HPV)、人副流感病毒(HPIV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、JC病毒、胡宁病毒(Juninvirus)、金格杆菌(Kingella kingae)、肉芽肿杆菌(Klebsiella granulomatis)、库鲁朊病毒(Kuru prion)、拉沙病毒(Lassa virus)、嗜肺性军团病杆菌(Legionellapneumophila)、利什曼原虫属(Leishmania genus)、钩端螺旋体属(Leptospira genus)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)(LCMV)、马丘坡病毒(Machupo virus)、马拉色霉菌属某些种(Malassezia spp)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒(Measles virus)、横川后殖吸虫(Metagonimus yokagawai)、微孢子虫门(Microsporidia phylum)、接触传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus)(MCV)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、美洲板口线虫(Necator americanus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、诺卡氏菌属某种(Nocardia spp)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)(流感病毒)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、并殖吸虫属某种(Paragonimus spp)、卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)、细小病毒B19(Parvovirus B19)、巴斯德菌属(Pasteurellagenus)、疟原虫属(Plasmodium genus)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、呼吸道合胞体病毒(Respiratorysyncytial virus)(RSV)、鼻病毒(Rhinovirus)、小蛛立克次氏体(Rickettsia akari)、立克次体属(Rickettsia genus)、伤寒立克次体(Typhoid rickettsia)(普氏立克次体(Rickettsia prowazekii))、落基山斑疹热立克次体(Rocky Mountain spotted feverRickettsia)(立氏立克次体(Rickettsia rickettsia))、伤寒立克次体(Rickettsiatyphi)、皮疹立克次体病毒(伤寒立克次体(Rickettsia typhi))裂谷热病毒(Rift Valleyfever virus)、轮状病毒(Rotavirus)、风疹病毒(Rubella virus)、萨比亚病毒(Sabiavirus)、沙门氏菌属(Salmonella genus)、疥螨(Sarcoptes scabiei)、SARS冠状病毒、血吸虫属(Schistosoma genus)、志贺氏菌属(Shigella genus)、辛诺柏病毒(Sin Nombrevirus)、汉坦病毒(Hantavirus)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、葡萄球菌属(Staphylococcus genus)、葡萄球菌属(Staphylococcus genus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、绦虫属(Taeniagenus)、有钩绦虫(Taenia solium)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)(TBEV)、犬弓蛔虫(Toxocara canis)或猫弓蛔线虫(Toxocara cati)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、旋毛虫(Trichinellaspiralis)、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)、毛癣菌属某种(Trichophyton spp)、毛首鞭虫(Trichuris trichiura)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)、水痘-带状疱疹病毒(Varicella zostervirus)(VZV)、水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus)(VZV)、重型小疹(small poxmajor)(重型天花(Variola major))或轻型小疹(small pox major)(轻型天花(Variolaminor))、vCJD朊病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、西尼罗病毒(West Nile virus)、西方马脑炎病毒(Westernequine encephalitis virus)、班氏线虫(Wuchereria bancrofti)、黄热病病毒(Yellowfever virus)、结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)和假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
免疫相关疾病可包括例如败血症、褥疮、足部溃疡、糖尿病、糖尿病性神经病、阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆等，但不限于此。
RNA的长度可以是例如14至100nt。在上述范围内，例如，14至100nt、14至90nt、14至80nt、14至70nt、14至60nt、20至80nt、20至60nt、20至50nt、20至40nt、20至35nt、25至50nt、25至45nt、25至35nt等，但不限于此。当长度在上述范围内时，可以表现出以下将要描述的优异的免疫活性和抗癌活性，并且当负载在具有适当电荷的颗粒上时，颗粒可以显示适当的电荷。
具体地，所述RNA可以由下式2表示，更具体地，可以包括选自由SEQ ID NO:1至25组成的组的序列和与其5'-末端结合的2至4个磷酸基团，并且进一步具体地，可以包括选自由SEQ ID NO:1至25组成的组的序列和与其5'-末端结合的2至4个磷酸基团，更具体地，可以包括SEQ ID NO:1的序列和与其5'-末端结合的3个磷酸基团。
[式2]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a和b各自是2至4的整数，
N1和N2是选自G或C的2至4个碱基，X1和X2是选自A或U的2至4个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
多孔二氧化硅颗粒可在其孔中携带RNA。
本发明的多孔二氧化硅颗粒是基于二氧化硅(SiO2)材料的颗粒，并且具有纳米级粒径。
本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒是多孔颗粒，各自具有纳米级的孔，并且可以在其外表面和/或孔的内部携带RNA。
多孔二氧化硅颗粒可具有7至25nm的平均孔径，并且孔的内部可带正电。
平均孔径在上述范围内，例如，7至25nm。在上述范围内，可以是例如7至25nm、7至23nm、10至25nm、13至25nm、7至20nm、7至18nm、10至20nm、和10至18nm，但不限于此。
RNA在其5’-末端具有磷酸基团，与其对应的pppRNA通常在负载于如脂质体等运载体(carrier)的状态下使用，但已知RNA递送效率非常低。然而，根据本发明的多孔二氧化硅颗粒可以具有平均孔径，并且孔的内部可以带正电荷，从而RNA可以被充分地负载在孔内并递送。
多孔二氧化硅颗粒在孔内带正电，并且可具有10至70mV的ζ电位。在上述范围内，ζ电位可以是例如10至70mV、10至60mV、10至50mV、10至40mV、10至30mV、20至70mV、20至60mV、20至50mV、30至60mV、15至35mV等，但不限于此。
RNA带负电荷，能够轻松携带RNA的颗粒应带正电荷。当带电颗粒被吸收到靶细胞中时(例如，通过诸如图40中所示的内吞作用等过程)，由于内体中的低pH，进入细胞的颗粒可具有强正电荷，这由于水通过内体的膜的扩散而引起渗透，从而引起液泡的形成。此外，当颗粒具有强正电荷时，细胞膜比其包裹颗粒时更宽，从而颗粒以外的细胞外液或其中包含的诸如各种蛋白质等的异物可一起引入靶细胞。在这种情况下，由于异物的流入会出现意想不到的效果，或者与没有异物流入的情况相比，颗粒可相对较少地流入。因此，难以通过充分递送颗粒来产生药物作用。然而，本发明可以通过优化携带RNA的颗粒的电荷来防止上述问题。
多孔二氧化硅颗粒在携带RNA的状态下可具有例如5至65mV的电荷。在上述范围内，电荷可以是例如5至65mV、5至60mV、5至55mV、5至50mV、5至45mV、5至40mV、5至35mV、5至30mV、10至60mV、10至55mV、10至50mV、10至45mV、10至40mV、10至35mV、10至30mV、20至50mV、20至45mV、20至40mV、20至35mV、20至30mV、25至40mV、25至35mV等，但不限于此。具体地，电荷上限可以是40mV，具体是35mV，更具体是30mV，并且电荷下限可以是10mV，具体是15mV，更具体是20mV，但不限于此。
携带RNA状态下的颗粒的电荷可以根据例如不携带RNA的颗粒的电荷(例如，控制为仅具有表面修饰)、RNA与颗粒的负载比等来控制，但不限于此。
RNA与颗粒的负载比可以是例如多孔二氧化硅颗粒和RNA的重量比为1:5至20。当含量比在上述范围内时，可以防止不负载RNA的空多孔二氧化硅颗粒的产生，而充分携带RNA，从而防止具有强正电荷的颗粒递送至细胞。在上述范围内，负载比可以是，例如，1:5至20、1:5至18、1:7至20、1:7至18、1:7至15、1:8至12、1:9至11等，但不限于此。
具体地，为了向受试者施用本发明的组合物，可以将携带RNA的多孔二氧化硅颗粒分散在分散介质中，这可以通过在分散介质中加入并搅拌多孔二氧化硅颗粒和RNA而获得。在这方面，如果相对于RNA的颗粒的量太大，则可出现不充分携带RNA的空颗粒，如果相对于RNA的颗粒的量太小，则可产生不被颗粒负载的残留RNA。
在本发明的一个实施方案中，多孔二氧化硅颗粒在克服诸如在引入细胞期间形成液泡和异物流入的问题方面可以具有以下规格。例如，孔径可以是7至25nm，具体是7至20nm，更具体是7至15nm。粒径可为50至500nm，具体地，200至500nm，更具体地，250至350nm。表面积可以是280至680m2/g，具体地，280至480m2/g。在RNA负载之前，ζ电位可大于40mV，具体地，40mV至70mV。所述颗粒可以以1:5至20、具体地1:5至15的重量比携带RNA。RNA负载后颗粒的ζ电位可以是40mV以下，具体地35mV以下，更具体地30mV以下。
如图42所示，多孔二氧化硅颗粒可以具有多个孔，并且孔可以从颗粒的表面延伸至内部。因此，孔的内部可以充分负载RNA。
本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的颗粒，其负载RNA并且在对身体施用时可以在体内生物降解的同时释放RNA。然而，本发明的多孔二氧化硅颗粒在体内缓慢地降解以使所负载的RNA可以以持续的方式释放。例如，在下式1的吸光度比为1/2时，t为24以上：
[式1]
At/A0
(其中A0为通过将5ml包含1mg/ml多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中来测量的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，
使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部和外部，
悬浮液的pH为7.4，和
At表示从测量A0开始经过“t”小时后测得的多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。
上式1意指多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境中降解的速率。
如图34中所示，例如，可以在将多孔二氧化硅颗粒和悬浮液置于圆筒状渗透膜中并且还将相同的悬浮液置于渗透膜的外部之后测量上式1中的吸光度A0和At。
本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的，并且可以在悬浮液中缓慢地降解。50kDa的直径相当于约5nm，其允许可生物降解的多孔二氧化硅颗粒通过直径为50kDa的渗透膜，并且以60rpm水平搅拌圆筒状渗透膜以将悬浮液均匀地混合，以使降解的多孔二氧化硅颗粒可以从渗透膜中出来。
可以例如在其中用新的悬浮液替换渗透膜外部的悬浮液的环境下测量上式1中的吸光度。悬浮液可以连续替换或者每周期替换，其中所述周期是定期的或不规律的。例如，可以在1小时至1周的范围内以1小时间隔、2小时间隔、3小时间隔、6小时间隔、12小时间隔、24小时间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、7天间隔等替换悬浮液，但是不限于此。
吸光度比为1/2意味着在t小时后吸光度为初始吸光度的一半，简言之，约一半的多孔二氧化硅颗粒被降解。
悬浮液可以是缓冲溶液，例如，选自由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和模拟体液(SBF)组成的组中的至少一种，并且更具体地为PBS。
在吸光度比达到1/2时，本发明的上式1中的“t”可以为24以上，例如，t可以为24至120。即，t可以为在上述范围内的24至96、24至72、30至70、40至70、50至65等，但不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/5时，t可以为70至140。例如，t可以为在上述范围内的80至140、80至120、80至110、70至140、70至120、70至110等，但不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/20时，t可以为130至220。例如，t可以为在上述范围内的130至200、140至200、140至180、150至180等，但不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到0.01以下时，t可以为250以上。例如，t可以为300以上、350以上、400以上、500以上、1000以上等，并且上限可以为2000，但不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，上式1中的吸光度比与t具有高的正相关性。例如，皮尔森相关系数可以为0.8以上，例如0.9以上和0.95以上。
上式1中的“t”意味着多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境下降解的速度。即，可以通过调整例如表面积、粒径、孔径、在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、和表面的致密性等来调节t。
例如，可以增加颗粒的表面积来使t减小，或者可以减小表面积来使t增大。可以通过调整颗粒的粒径和孔径来调节表面积。此外，如果通过使取代基处于颗粒的表面上和/或孔的内部来减少多孔二氧化硅颗粒对环境(例如溶剂)的直接暴露，则可以使t增大。此外，当多孔二氧化硅颗粒负载或携带RNA、并且当RNA与多孔二氧化硅颗粒之间的亲和性提高时，可以减少多孔二氧化硅颗粒对环境的直接暴露，从而使t增大。此外，可以通过制备具有更致密的表面的颗粒来使t增大。如上所述，已描述了调整上式1中的t的各种实例，但不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以具有球形形状，但不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒的平均直径可以为例如50至500nm。例如，平均直径可以为在上述范围内的50至500nm、50至400nm、50至300nm、100至450nm、100至400nm、100至350nm、100至300nm、150至400nm、150至350nm、200至400nm、200至350nm、250至400nm、180至300nm、150至250nm等，但不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒的BET表面积可以为例如280至680m2/g。例如，BET表面积可以为在上述范围内的280m2/g至680m2/g、280m2/g至600m2/g、280m2/g至500m2/g、280m2/g至400m2/g、300m2/g至650m2/g、300m2/g至600m2/g、300m2/g至550m2/g、300m2/g至500m2/g、300m2/g至450m2/g、350m2/g至450m2/g等，但不限于此。
本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒的每克的体积可以为例如0.7至2.2ml。例如，该体积可以为在上述范围内的0.7至2.0ml、0.8至2.2ml、0.8至2.0ml、0.9至2.0ml、1.0至2.0ml等，但不限于此。如果每克的体积过小，则降解速率会过高。此外，难以制造过大的颗粒或具有完整形状的颗粒。
多孔二氧化硅颗粒是孔的平均孔径由小于5nm扩张至7至25nm的小孔颗粒。因此，孔径大，以便在孔的内部携带大的RNA，而粒径本身与孔径相比并不大，以便易于递送和吸收到细胞中。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在其外表面和/或孔的内部带正电荷。例如，颗粒的表面和孔的内部都可以带正电，或者仅颗粒的表面或孔的内部可以带正电。例如，可以通过阳离子取代基的存在来进行带电荷。
阳离子物质可包括例如氨基或任何其他含氮基团。此外，阴离子取代基可包括例如羧基(-COOH)、磺酸基(-SO3H)、硫醇基(-SH)等作为酸性基团，但不限于此。
调节多孔二氧化硅颗粒与RNA释放环境的相互作用以调节纳米颗粒的降解速率，从而可以调节RNA的释放速率。此外，RNA可以从纳米颗粒中扩散和释放，其中调整取代基可以调节RNA与纳米颗粒的结合力，从而控制RNA的释放。
此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以包含取代基用于以下目的：在颗粒表面上和/或孔的内部负载RNA；将RNA递送至靶细胞中；负载其它物质用于其它目的；或者结合其它取代基。此外，多孔二氧化硅颗粒还可以包括与其结合的抗体、配体、细胞穿膜肽(cellpermeable peptide)或适体。
可以通过例如表面修饰来添加上述在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、电荷、粘合剂等。
可以例如通过使具有要引入的取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。烷氧基硅烷具有一个以上烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被其取代的取代基。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以例如通过小孔颗粒制备和孔扩张工序来制造，并且，如果需要，可以进一步通过煅烧或表面修饰工序等来制造。如果实施煅烧和表面修饰工序二者，则可以在煅烧后对颗粒进行表面修饰。
小孔颗粒可以为例如平均孔径为1至5nm的颗粒。
可以通过在溶剂中添加表面活性剂和二氧化硅前体、然后进行搅拌和均匀化来收获小孔颗粒。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但不限于此。
当使用水和有机溶剂的混合溶剂时，水与有机溶剂的相对比可以为例如以体积比计为1:0.7至1.5，例如，1:0.8至1.3，但不限于此。
表面活性剂可以包括例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基溴化铵(TMABr)、十六烷基三甲基氯化吡啶鎓(TMPrCl)、四甲基氯化铵(TMACl)等，并且具体地，可以使用CTAB。
可以例如以每1升溶剂1至10g，例如在上述范围内的1至8g、2至8g或3至8g的量添加表面活性剂，但不限于此。
在将表面活性剂添加至溶剂的情况下，可以在搅拌后添加二氧化硅前体。二氧化硅前体可以为例如原硅酸四甲酯(TMOS)，但不限于此。
搅拌可以进行例如10至30分钟，但不限于此。
可以以每1升溶剂0.5至5ml，例如，在上述范围内的0.5ml至4ml、0.5至3ml、0.5至2ml、1至2ml等的量添加二氧化硅前体，但不限于此。
如果需要，可以进一步使用氢氧化钠作为催化剂，具体地，可以在向溶剂中添加表面活性剂之后并且在向溶剂中添加二氧化硅前体之前在搅拌下添加。
可以基于1M氢氧化钠水溶液以每1升溶剂0.5至8ml，例如，在上述范围内的0.5至5ml、0.5至4ml、1至4ml、1至3ml、2至3ml等的量添加氢氧化钠，但不限于此。
在添加二氧化硅前体之后，可以使溶液在搅拌下反应。搅拌可以进行2至15小时，例如，在上述范围内的3至15小时、4至15小时、4至13小时、5至12小时、6至12小时、6至10小时等，但是不限于此。如果搅拌时间(反应时间)过短，则成核(nucleation)可能不充分。
搅拌后，可以使溶液老化。老化可以进行8至24小时，例如，在上述范围内的8至20小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至16小时、10至14小时等，但不限于此。
此后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获多孔二氧化硅颗粒，并且，如果需要，可以在清洗前进行未反应的材料的分离。
可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。例如，可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但不限于此。
可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。
可以在离心下进行清洗。例如，可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但不限于此。
可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。
在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
在通过上述方法制造的颗粒中，用于反应的残留有机物质(表面活性剂等)可能残留在表面和孔的内部，并且可以进行清洗以除去它们。通常，可以进行酸处理(或酸性有机溶剂处理)以除去这些有机物质，但是在本发明中，由于不进行这种酸处理，因此即使在清洗之后，残留的有机物质也可能残留在孔中。
可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。
此后，可以使收获的多孔二氧化硅颗粒的孔扩张，并且此类孔扩张可以使用孔扩张剂来进行。
孔扩张剂可以包括例如三甲基苯、三乙基苯、三丙基苯、三丁基苯、三戊基苯、三己基苯、甲苯、苯等，并且具体地，可以使用三甲基苯，但不限于此。
此外，本文中使用的孔扩张剂可以为例如N,N-二甲基十六烷基胺(DMHA)，但不限于此。
可以例如通过使多孔二氧化硅颗粒与孔扩张剂在溶剂中混合并且加热混合物以诱导反应来进行孔扩张。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但不限于此。
可以以每1升溶剂10至200g，例如，在上述范围内的10至150g、10至100g、30至100g、40至100g、50至100g、50至80g、60至80g等的比例添加多孔二氧化硅颗粒，但不限于此。
可以将多孔二氧化硅颗粒均匀地分散在溶剂中。例如，可以将多孔二氧化硅颗粒添加至溶剂中并且进行超声分散。在使用混合溶剂的情况下，可以将多孔二氧化硅颗粒分散在第一溶剂中，然后向其中添加第二溶剂。
可以以相对于100体积份溶剂为10至200体积份(“体积.份”)，例如，在上述范围内的10至150体积份、10至100体积份、10至80体积.份、30至80体积份、30至70体积份等的比例添加孔扩张剂，但不限于此。
反应可以在120至190℃，例如，在上述范围内的120至190℃、120至180℃、120至170℃、130至170℃、130至160℃、130至150℃、130至140℃等下进行，但不限于此。
反应可以进行6至96小时，例如，在上述范围内的30至96小时、30至80小时、30至72小时、24至80小时、24至72小时、36至96小时、36至80小时、36至72小时、36至66小时、36至60小时、48至96小时、48至88小时、48至80小时、48至72小时、6至96小时、7至96小时、8至80小时、9至72小时、9至80小时、6至72小时、9至96小时、10至80小时、10至72小时、12至66小时、13至60小时、14至96小时、15至88小时、16至80小时、17至72小时等，但不限于此。
可以在以上示例的范围内根据期望调整时间和温度，从而可以使反应充分地进行但不会过度进行。例如，当使反应温度降低时，可以增加反应时间，并且当使反应温度升高时，可以缩短反应时间。如果反应没有充分地进行，则孔扩张可能不充分。另一方面，如果反应过度进行，则颗粒可能会由于孔的过度扩张而塌陷。
反应可以例如通过逐渐升高温度来进行。具体地，可以通过将温度以0.5至15℃/min的速率从室温逐渐升高至以上限定的温度来进行反应。例如，可以使温度以1至15℃/min、3至15℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率升高，但不限于此。
反应可以在搅拌下进行。例如，可以以100rpm以上的速度，具体地，以100至1000rpm的速度进行搅拌，但不限于此。
反应后，可以例如通过逐渐降低温度来使反应溶液缓慢地冷却。具体地，可以通过将温度以0.5至20℃/min的速率从以上限定的温度逐渐降低至室温来进行反应。例如，可以使温度以在上述范围内的1至20℃/min、3至20℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率降低，但不限于此。
如果在生产颗粒后不通过酸处理清洗颗粒，则孔内的残留物质也可以参与孔的扩张，从而使孔的扩张更加充分均匀。
冷却后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获具有扩张的孔的多孔二氧化硅颗粒。如果需要，可以在清洗前首先分离未反应的材料。
可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。本文中，可以例如以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3分钟至60分钟。例如，离心可以进行在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但不限于此。
可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次、4次、5次、6次、7次、8次等。
有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但不限于此。
可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但不限于此。
可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。
在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
如果在制备颗粒后不通过酸处理清洗颗粒，则残留物质即使在孔扩张后也可残留在孔的内部，因此即使在孔扩张后清洗时也可进行酸处理，但本发明不进行酸处理，相反，可以通过如下所述的煅烧除去残留材料。
可以例如在20至100℃下进行干燥，但不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。
此后，可以对收获的颗粒进行煅烧，其为加热颗粒以除去存在于颗粒的表面上和孔的内部的硅烷醇基从而降低颗粒的反应性、提供更致密的结构并且除去填充孔的有机物质的工序。例如，可以将颗粒加热至400℃以上的温度。温度的上限没有特别限制，但是可以为1000℃、900℃、800℃、700℃等。加热可以进行例如3小时以上。加热时间的上限没有特别限制，但是可以为24小时、12小时、10小时、8小时、6小时等。更具体地，加热可以在400至700℃下进行3至8小时或者在500至600℃下进行4至5小时，但不限于此。
除去填充孔的有机物质可以防止由残留的有机物质导致的细胞毒性或起泡的一些问题。
然后，可以对收获的多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰，并且可以在颗粒的表面上和/或孔的内部进行表面修饰。颗粒表面上和孔的内部二者可以以相同的方式进行表面修饰，或者可以以不同的方式进行表面修饰。
通过表面修饰可以使颗粒带电荷。
可以例如通过使具有要引入的阳离子取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但不限于此。
烷氧基硅烷具有一个以上烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被其取代的取代基。
当烷氧基硅烷与多孔二氧化硅颗粒反应时，在硅原子和氧原子之间形成共价键以使烷氧基硅烷可以键合至多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔的内部。由于烷氧基硅烷具有要引入的取代基，因此可以将相应的取代基引入至多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔的内部。
反应可以通过使分散在溶剂中的多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷反应来进行。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但不限于此。
带正电荷可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如含氮基团(例如，氨基或氨基烷基)等碱性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]苯胺、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷等，但不限于此。
此外，表面修饰可以组合进行。例如，可以在颗粒的外表面上或孔的内部进行表面修饰两次以上。作为具体实例，可以使含有羧基的化合物通过酰胺键结合至其中引入有氨基的二氧化硅颗粒，从而改变带正电荷的颗粒以具有不同的表面性质，但不限于此。
多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以例如在加热下进行。加热可以在80至180℃，例如，在上述范围内的80至160℃、80至150℃、100至160℃、100至150℃、110至150℃等下进行，但不限于此。
多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以进行4至20小时，例如，在上述范围内的4至18小时、4至16小时、6至18小时、6至16小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至14小时等，但不限于此。
可以根据表面修饰的程度根据期望来选择用于表面修饰的反应温度、时间和化合物的量。换句话说，反应条件将取决于关于RNA的电荷水平而变化。具体地，通过控制多孔二氧化硅颗粒的电荷水平，可以控制RNA的释放速率。例如，如果RNA在中性pH下具有强的负电荷，则可以提高反应温度、可以延长反应时间或者可以增加所处理的化合物的量，从而使多孔二氧化硅颗粒具有强的正电荷，但不限于此。
此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以通过例如小孔颗粒的制备、孔扩张、表面修饰和孔内部修饰来制造。
小孔颗粒的制备和孔扩张可以通过上述工序来进行，并且，在小孔颗粒的制备之后和在孔扩张之后，可以进行清洗工序和干燥工序。
如果需要，可以在清洗之前将未反应的材料分离，并且可以通过借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。
可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但不限于此。
小孔颗粒的制备之后的清洗可以通过在上述范围内的方法/条件来进行，但不限于此。
孔扩张之后的清洗可以在比上述实施方案更宽松的条件下进行。例如，清洗可以进行三次以下，但不限于此。
表面修饰和孔内部修饰可以分别通过上述工序来进行。本文中，表面修饰和随后的孔内部修饰可以依次进行，并且可以在上述两个工序之间进一步进行清洗工序。
当在小孔颗粒的制备和孔扩张之后在更宽松的条件下进行清洗时，例如用于颗粒制备和孔扩张的表面活性剂等反应溶液填充在孔中，以使在表面修饰期间不会使孔的内部被修饰，而是仅可以修饰颗粒的表面。此后，可以将在孔的内部的反应溶液洗去并除去。
表面修饰工序与孔内部修饰工序之间的颗粒清洗可以使用水和/或有机溶剂来进行。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但不限于此。
可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。
在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
可以例如在20至100℃下进行干燥，但不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。
RNA可以负载在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔的内部。本文中，可以例如通过将多孔二氧化硅颗粒与RNA在溶剂中混合来进行负载。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但不限于此。
此外，可以使用PBS(磷酸盐缓冲盐水溶液(phosphate buffered salinesolution))、SBF(模拟体液(simulated body fluid))、硼酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水作为溶剂。
负载在多孔二氧化硅颗粒上的RNA可以在延长的时间内逐渐释放。此类持续释放可以是连续或不连续的、或者线性或非线性的。此外，该释放可以取决于多孔二氧化硅颗粒的特性和/或多孔二氧化硅颗粒与RNA之间的相互作用而变化。
负载在多孔二氧化硅颗粒上的RNA在多孔二氧化硅颗粒被生物降解时释放。具体地，根据本发明的多孔二氧化硅颗粒缓慢地降解从而使得以持续的方式释放所负载的RNA。此类释放可以通过例如调整多孔二氧化硅颗粒的表面积、粒径、孔径、在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、表面致密性等来控制，但不限于此。
负载在多孔二氧化硅颗粒上的RNA可以在从多孔二氧化硅颗粒分离并且扩散的同时释放。此类释放受到多孔二氧化硅颗粒、RNA及其释放环境之间的关系的影响。因此，调节该关系可以控制RNA的释放。例如，通过借助表面修饰来增强或减弱多孔二氧化硅颗粒与RNA的结合力，可以控制RNA的释放。
RNA可以释放例如7天至1年或更久的时间，这取决于所需处理的类型、释放环境和要使用的多孔二氧化硅颗粒的类型。
此外，如果本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的，则其可以100％降解。因此，其中所负载的RNA可以100％释放。
此外，本发明涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物。
本发明的药物组合物可包含式1表示的平端发夹RNA；以及在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒。
发夹RNA和多孔二氧化硅颗粒可以在上述范围内。
本发明的组合物具有抗癌功效，其可根据通过将所负载的RNA稳定递送至体内并将其释放至靶标来激活干扰素信号传导途径和/或干扰素非依赖性细胞凋亡途径而获得(图23)。
作为使用本发明的组合物预防或治疗的靶标的癌症可以是可以通过上述途径预防或治疗的任何癌症，并且可以包括例如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、泌尿生殖道癌、睾丸肿瘤、食管癌、喉癌、胃癌、胃肠癌、皮肤癌、角质化细胞瘤、滤泡癌、黑色素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳头状癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、肾癌、骨癌、骨髓疾病、淋巴系统疾病、毛细胞癌、口腔和咽(口)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、中枢神经系统癌症、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈部癌、霍奇金病和白血病等，但不限于此。
所述癌症可以是耐抗癌药物的癌症，但不限于此。
本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，并且可以与这样的载体一起配制。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激生物体并且不抑制所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。配制为液体溶液的组合物中可接受的药物载体是无菌且生物相容的，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、以及一种以上这些成分的混合物。此外，如果需要，可以添加其他典型的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。还可以加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以将药物组合物配制成注射剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，例如水溶液、悬浮液、和乳液等。
本发明的药物组合物适用于含有本发明核酸分子作为活性成分的任何制剂形式，并且可以制备成口服或肠胃外制剂。本发明的药物制剂可包括适用于口服、直肠、鼻腔、局部(包括面颊和舌下)、皮下、阴道或肠胃外(肌肉内、皮下)施用的形式。可选地，也可以包括适合通过吸入或吹入施用的形式。
本发明的药物组合物以药学有效量施用。有效剂量水平可以根据患者的疾病类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和释放速率、治疗持续时间、包括同时用药的因素以及在医疗领域其他众所周知的因素来确定。本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其他治疗剂组合施用，可以与常规治疗剂依次或同时施用，并且可以以单剂量或多剂量施用。综合考虑上述因素，重要的是以最小的量达到最大效果且无副作用的量施用药物组合物，这是本领域技术人员容易确定的。
根据本发明的药物组合物的剂量可以取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况或饮食、施用时间、施用方法、排泄率和疾病的严重程度而有很大变化，并且合适的剂量取决于例如蓄积在患者体内的药物量和/或所使用的本发明的运载体的特定功效。例如，该量可以是每kg体重0.01μg至1g。此外，本发明的药物组合物可以在诸如每天、每周、每月或每年等单位时间段内每单位时间施用一次或多次，或者可以使用输液泵长时间连续施用。考虑到药物在体内的保留时间、体内的药物浓度等来确定重复施用剂量的次数。根据疾病治疗的过程，即使在治疗后也可以进一步给予组合物以防止复发(recurrence)，即，疾病的复发(relapse)。
本发明的药物组合物还可以包含保持/增加一种以上活性成分的化合物，这些活性成分关于伤口治疗或至少一种活性成分的溶解度和/或吸收方面表现出相同或相似的功能。
此外，可以使用本领域已知的任何方法来配制本发明的药物组合物，以允许在对哺乳动物施用后活性成分的快速释放、持续释放或延迟释放。可以以散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射液、无菌粉末的形式来生产制剂。
在下文中，将参考以下实施例详细描述本发明。
实施例
实施例1.多孔二氧化硅颗粒(DDV或DegradaBALL)
1.多孔二氧化硅颗粒的制备
(1)多孔二氧化硅颗粒的制备
1)小孔颗粒的制备
将960ml蒸馏水(DW)和810ml MeOH置于2L圆底烧瓶中。将7.88g CTAB添加至烧瓶中，然后在搅拌下快速添加4.52ml 1M NaOH。在搅拌10分钟的同时添加均匀的混合物之后，进一步添加2.6ml TMOS。在搅拌6小时以均匀地混合之后，将反应溶液老化24小时。
然后，将反应溶液在8000rpm和25℃下离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。
此后，将所得产物在70℃中的烘箱中干燥以收获1.5g粉末状小孔多孔二氧化硅颗粒(孔平均直径为2nm并且粒径为200nm)。
2)孔扩张
将1.5g小孔多孔二氧化硅颗粒粉末添加至10ml乙醇中并且进行超声分散，并且进一步添加10ml水和10ml TMB(三甲基苯)，然后进行超声分散。
此后，将分散液置于高压釜中，并且在160℃下反应48小时。
反应在25℃下开始并且在使温度以10℃/min的速率升高的同时进行，然后在高压釜中以1至10℃/min的速率缓慢地冷却。
将冷却的反应溶液在25℃下以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在25℃下以8000rpm离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。
然后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获粉末状多孔二氧化硅颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。
3)煅烧
将在2)中制备的多孔二氧化硅颗粒放入玻璃小瓶中，在550℃下加热5小时，并且在反应完成之后缓慢地冷却至室温以制备颗粒。
(2)多孔二氧化硅颗粒的制备
除了将孔扩张时的反应条件改变为140℃和72小时以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(3)多孔二氧化硅颗粒的制备(10L规模)
除了使用大5倍的容器并且每种物质以5倍容量使用以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(4)多孔二氧化硅颗粒(粒径为300nm)的制备
除了使用920ml蒸馏水和850ml甲醇来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(5)多孔二氧化硅颗粒(粒径为500nm)的制备
除了使用800ml蒸馏水、1010ml甲醇和10.6g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(6)多孔二氧化硅颗粒(粒径为1000nm)的制备
除了使用620ml蒸馏水、1380ml甲醇和7.88g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(7)多孔二氧化硅颗粒(孔径为4nm)的制备
除了使用2.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(8)多孔二氧化硅颗粒(孔径为7nm)的制备
除了使用4.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(9)多孔二氧化硅颗粒(孔径为17nm)的制备
除了使用11ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(10)多孔二氧化硅颗粒(孔径为23nm)的制备
除了使用12.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(11)多孔二氧化硅颗粒的制备
除了将900ml蒸馏水、850mL甲醇和8g CTAB用于制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
2.多孔二氧化硅颗粒的表面修饰
(1)使实施例1-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应，以使其带正电荷。
具体地，用浴超声仪(bath sonicator)将100mg多孔二氧化硅颗粒分散在100ml圆底烧瓶中的10ml甲苯中。然后，添加1ml APTES并且在400rpm和130℃下搅拌12小时。
反应后，将产物缓慢地冷却至室温并且以8000rpm离心10分钟以除去上清液，进一步在8000rpm和25℃下离心10分钟，然后用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。
此后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获在颗粒的表面上和孔的内部具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。
(2)除了使用1.8mL APTES之外，通过与上述相同的方法对实施例1-1-(11)的产物进行表面修饰，从而获得在颗粒表面上和孔的内部具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。
3.颗粒形成和孔扩张的鉴定
在显微镜下观察在实施例1-1-(1)至(3)中制备的小孔颗粒和多孔二氧化硅颗粒，以确定小孔颗粒是否均匀形成或者孔是否充分扩张以均匀地形成多孔二氧化硅颗粒(图1至4)。
图1为实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，并且图2为实施例1-1-(2)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，并且从这些图可以看出，均匀地形成了具有充分扩张的孔的球形多孔二氧化硅颗粒。
图3为实施例1-1-(1)中的小孔颗粒的照片，并且图4为实施例1-1-(1)和1-1-(3)中的小孔颗粒的比较照片，并且从这些图可以看出，均匀地形成了球形小孔颗粒。
4.BET表面积和孔径的计算
计算实施例1-1-(1)中的小孔颗粒和实施例1-1-(1)、(7)、(8)、(10)和(11)的多孔二氧化硅颗粒的表面积和孔径。通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)法来计算表面积，并且通过Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法来计算孔径分布。
各颗粒的显微照片在图5中示出，并且计算结果在下表1中示出。
[表1]
Figure BDA0003219285700000361
5.生物降解性的鉴定
为了鉴定实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性，在0小时、120小时和360小时在显微镜下观察在37℃下在SBF(pH 7.4)中的生物降解性，并且其结果在图6中示出。
参照图6，可以看出多孔二氧化硅颗粒被生物降解并且在360小时之后几乎完全降解。
6.吸光度比的测量
根据下式1来测量随时间推移的吸光度比。
[式1]
At/A0
(其中A0为通过将5ml包含1mg/ml多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中来测量的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，
使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在60rpm和37℃下水平地搅拌渗透膜的内部和外部，和
At表示从测量A0开始经过“t”小时后测得的多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。
具体地，将5mg多孔二氧化硅颗粒粉末溶解于5ml SBF(pH 7.4)中。此后，将5ml多孔二氧化硅颗粒溶液置于图7中示出的具有孔径为50kDa的孔的渗透膜中。将15ml SBF添加至外膜，并且每12小时更换外膜的SBF。多孔二氧化硅颗粒的降解在37℃下、在60rpm的水平搅拌下来进行。
然后，吸光度通过UV-可见光谱法来测量并且在λ＝640nm处分析。
(1)吸光度比的测量
根据上述方法来测量实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度比，并且其结果在图8中示出。
参照图8，可以看出，在吸光度比达到1/2时，t为约58小时，以证明非常缓慢的降解。
(2)粒径
根据上式1来测量实施例1-1-(1)、(5)和(6)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图9中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。
参照图9，可以看出，t随粒径的增加而降低。
(3)平均孔径
根据上式1来测量实施例1-1-(1)和(9)中的多孔二氧化硅颗粒以及作为对照的实施例1-1-(1)中的小孔多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图10中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。
参照图10，可以看出，本发明实施例的多孔二氧化硅颗粒具有比对照显著更大的t。
(4)pH
测量实施例1-1-(4)中的多孔二氧化硅颗粒针对各pH的吸光度。在pH 2、5和7.4下在SBF和Tris中测量吸光度，并且其结果在图11中示出。
参照图11，可以看出，虽然针对pH，t存在差异，但是在所有吸光度比达到1/2时，t为24以上。
(5)带电荷
测量实施例1-2-(1)-1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图12中示出(Tris(pH 7.4)用作悬浮液和溶剂)。
参照图12，可以看出，在带正电荷的颗粒的吸光度比达到1/2时，t为24以上。
7.RNA的负载和释放
合成了合成的RIG-I配体(5'-三磷酸发夹RNA，ppp-RNA，SEQ ID NO:1)和对照发夹RNA(OH-RNA)(图14B)。分别将实施例1-1-(11)的40、30、20、10、5μg多孔二氧化硅颗粒(DegradaBALL)与1μg ppp-RNA混合并在室温下放置10分钟，然后离心并取上清液。作为通过SDS-PAGE检测上清液中的ppp-RNA的结果，确认在重量比为1:10(ppp-RNA:DegradaBALL)之前没有检测到ppp-RNA(图15C)。基于此结果，在后续实验中将DegradaBALL的负载能力设置为10％。在用FITC标记的DegradaBALL上加载用Cy5标记的OH-RNA后，用5nM浓度的OH-RNA处理A549细胞2小时。用新培养基更换培养基后，继续培养至规定时间点(处理后6、12、24小时)，接着通过高分辨显微镜观察。此后，对培养物进行定量分析(图16、17D和E)。由此确认DegradaBALL上负载的OH-RNA进入细胞内，然后在24小时内从DegradaBALL缓慢释放。
8.免疫激活作用
在24孔板的各孔中分装25000个细胞(A549细胞、培养基RPMI1640、10％FBS、1％P/S)并在CO2 5％、37℃培养箱中孵育过夜。第二天，如表所示，将各样品在预设条件下混合并放置30分钟以制备用于基因导入的混合物。通过在无血清培养液(RPMI1640，1％P/S)中混合制备的混合物来准备基因导入。
[表2]
对照 组1 组2 组3 组4 组5
ppp-RNA 850ng 850ng 850ng
DegradaBALL 15μg 15μg
LNP 0.5μl 0.5μl
从培养箱中取出培养细胞的24孔板后，除去培养基，用1×PBS清洗板以便除去残留的培养基。进一步除去1×PBS后，将转基因培养基分装到每个孔中，并在培养箱中孵育6小时，使转基因混合物进入细胞孔中。6小时后，将含有转基因混合物的培养液从培养箱中除去，加入含有血清的培养液(RPMI1640、10％FBS、1％P/S)继续培养(6小时/18小时/42小时)。
将完成基因导入和培养的24孔板从培养箱中取出，除去培养基。为了从贴附于板底的细胞中提取RNA，使用TRIzol试剂处理细胞，然后按照供应商推荐的方法提取RNA。
为了从提取的RNA合成cDNA，使用试剂M-MLV RT 5×master mix(Elpisbiotech，#EBT-1511)，根据供应商推荐的方法由RNA合成cDNA。
进行实时PCR分析以从cDNA定量分析靶基因的表达。使用Power SYBR Green PCRMaster Mix(#4367659)试剂，按照供应商推荐的方法从cDNA确认靶基因的表达水平。
(1)干扰素β
在没有添加ppp-RNA的情况下，对照组、组1和组2中的IFN-β几乎没有变化。这是因为LNP和DegradaBALL仅作为没有ppp-RNA的运载体而不会影响IFN-β的表达(图18)。
在添加无运载体的ppp-RNA的实验组的情况下，无论孵育时间如何，IFN-β的表达都没有变化。因此，可以解释为，由于即使存在ppp-RNA，ppp-RNA也无法进入细胞，因此不影响IFN-β的表达。
在加入ppp-RNA和LNP用作运载体的实验组中，无论孵育时间如何，IFN-β表达无显著变化。因此，可以解释为，ppp-RNA不能单独由LNP递送至细胞中，或者即使ppp-RNA通过LNP递送至细胞中，ppp-RNA也会在与RIG-I相互作用之前从细胞内环境中失去活性。
在添加ppp-RNA和DegradaBALL用作运载体的实验组的情况下，可以看出IFN-β表达根据培养时间发生显著变化。特别地，当孵育时间为24小时时，观察到IFN-β的最高表达。因此，DegradaBALL有效地将ppp-RNA递送至细胞中并有效地展示其生物活性。
(2)Viperin
未添加ppp-RNA的对照组和组1中的Viperin几乎没有变化。因此，可以解释为由于不存在ppp-RNA，所以不发生与RIG-I的相互作用，仅LNP作为运载体不影响Viperin的表达(图19)。
不添加ppp-RNA但单独添加DegradaBALL的组2的Viperin的变化不显著。
在添加ppp-RNA但没有运载体的组3的情况下，无论孵育时间如何，Viperin表达都没有变化。因此，可以解释为，由于即使存在ppp-RNA，ppp-RNA也不会进入细胞，因此Viperin的表达没有受到影响。
在添加ppp-RNA和LNP用作运载体的组4的情况下，Viperin表达仅在12小时的短孵育时间内略有增加。因此，可以解释为LNP对ppp-RNA的生物学作用不大，但作用有限。
在添加ppp-RNA和DegradaBALL用作运载体的组5的情况下，观察到Viperin表达根据孵育时间大大增加。特别是在孵育后24小时时，获得最高的Viperin表达。因此，可以解释为DegradaBALL有效地将ppp-RNA递送至细胞中并有效地表现出其生物活性。
(3)干扰素α
C57BL/6 8周龄小鼠被分成各实验组，总结如下表3所示。
[表3]
对照 组1 组2 组3
ppp-RNA - 10μg - 10μg
DegradaBALL - - 200μg 200μg
每个样品在1×PBS中混合形成复合物，放置30分钟以制备注射液，并调整注射液的终体积为100μl。每组小鼠静脉注射各注射液，注射后6小时、12小时和24小时取出小鼠脾脏。使用TRIzol从取出的脾脏中提取RNA。
为了由提取的RNA合成cDNA，使用试剂M-MLV RT 5×master mix(Elpisbiotech,#EBT-1511)，并制备RNA。此外，根据供应商推荐的方法，由RNA合成cDNA。
进行实时PCR分析以从cDNA定量分析靶基因的表达。使用Power SYBR Green PCRMaster Mix(#4367659)试剂。此外，根据供应商推荐的方法，从cDNA确定靶基因的表达水平。
在对照、组1和组2的情况下，未能观察到IFN-α表达的任何变化。特别是，可以看出单独注射ppp-RNA或单独注射DegradaBALL不影响IFN-α的表达(图20)。此外，即使通过静脉注射单独注射ppp-RNA，也不会侵入细胞。因此，上述事实的原因可以认为是ppp-RNA的活性在血流中迅速丧失。
在组3的情况下，IFN-α的表达被极大地诱导，并且可以看出根据时间持续表达长达24小时。因此，可以解释为通过静脉注射施用的DegradaBALL上负载的ppp-RNA在血流中保持稳定，并且ppp-RNA可以被递送至细胞中。
9.抗肿瘤作用
(1)瘤内注射LEM-S403诱导的干扰素依赖性或非依赖性肿瘤细胞死亡(图21至26)
为了确定将LEM-S403注射到肿瘤中时会保留多长时间，进行了实验。
当LEM-S403通过瘤内注射施用时，可以预期OH-RNA受到DegradaBALL(载体)的保护并在肿瘤中缓慢释放。当在OH-RNA上标记FITC荧光和在DegradaBALL上标记TRAMRA荧光，然后通过瘤内注射负载和施用OH-RNA时，在第1、3和5天中的第1天观察到最强的OH-RNA荧光。另外，可以看出随着时间的推移，上述荧光逐渐减弱。另一方面，在单独施用OH-RNA的组中，即使在第1天也无法确认OH-RNA的荧光。当LEMS-403被摄取到肿瘤细胞中时，ppp-RNA以持续的方式释放。此后，ppp-RNA可通过RIG-I介导的信号增加1型干扰素的分泌，从而激活CD 8T细胞和NK细胞，同时增强免疫力。此外，在RIG-I介导的信号传导过程中，肿瘤细胞凋亡因子独立于干扰素而增加，从而诱导肿瘤细胞死亡。在向小鼠皮下注射1×106个B16F10黑色素瘤肿瘤细胞(B16F10)后，在注射肿瘤细胞后3天(第0天)和5天(第2天)通过瘤内注射施用缓冲液、载体(70μg)、ppp-RNA(7μg)或LEM-S403(7μg)，然后在6天(第3天)分离肿瘤以确认治疗机理。在通过免疫荧光染色分析分离的肿瘤中，证实LEM-S403施用组中磷酸-STAT1的表达独特增加。因此，认为LEM-S403分泌的1型干扰素可对细胞周围或细胞内的受体产生反应，从而诱导TAT1的磷酸化。通过苏木精和伊红染色，证实LEM-S403施用组的肿瘤组织在组织病理学方面比其他治疗组具有更少的细胞数量和更松散的组织。此外，在通过免疫荧光染色的TUNNEL分析中，观察到的荧光部分比其他组多得多。从以上结果可以证实LEM-S403引起肿瘤细胞的凋亡。
(2)由于瘤内注射LEM-S403导致的干扰素非依赖性肿瘤细胞凋亡的诱导(图27至31)
通过向C57BL/6小鼠皮下注射1×106个B16F10细胞来制备黑色素瘤小鼠模型。当肿瘤达到约100mm3大小时，通过瘤内注射50μl 1×PBS(缓冲液)、70μgDegradaBALL(载体)、7μg ppp-RNA、或70μg DegradaBALL+7μg ppp-RNA(LEM-S403)处理各组的6只小鼠，注射两次，间隔为2天。最后一次施用后24小时，处死小鼠，将提取的肿瘤用膜联蛋白V(AnnexinV)-碘化丙啶(PI)染色，然后进行流式细胞术分析。与缓冲液、载体和ppp-RNA处理组相比，在LEM-S403处理组中证实，肿瘤中凋亡细胞(Annexin V+,PI-)和死细胞(Annexin V+,PI+)的细胞比例都显著增加。此外，确认活细胞(Annexin V-、PI-)的比例显著降低。在分子水平上，分别通过蛋白质免疫印迹和RT-PCR证实LEM-S403处理增加半胱天冬酶原(procaspase)-3的裂解和促凋亡基因Noxa的表达。这些现象也在体外实验中重现。具体地，分别用缓冲液、0.85μgppp-RNA、8.5μg DegradaBALL(载体)、ppp-RNA 0.85μg+DegradaBALL8.5μg(LEM-S403)或ppp-RNA 0.85μg+Lipofectamine 2000处理B16F10细胞，然后处理后24小时收集。对收集的细胞进行RT-PCR分析，结果证实当细胞用LEM-S403处理时，Noxa的表达增加。因此，可以验证LED-S403瘤内注射可根据诱导半胱天冬酶-3裂解的机理增加肿瘤细胞中Noxa的表达并诱导肿瘤细胞凋亡。
(3)由于瘤内注射LEM-S403而使肿瘤浸润NK细胞和CD8+T细胞数量和活性增加的评估(图32至35)
进行流式细胞术和免疫荧光染色分析以确定是否由于瘤内注射LEM-S403而增加了活化的免疫细胞或免疫细胞进入肿瘤。基于流式细胞术，LEM-S403施用组中，肿瘤中浸润免疫细胞中的NK细胞分布为10.51％，较载体组增加了67％，其中表达CD 69的NK细胞占肿瘤中浸润免疫细胞的约3.59％，表明与载体组相比增加了约152％。此外，LEM-S403施用组中，肿瘤中浸润免疫细胞中的CD 8T细胞的分布为8.57％，与其他载体组相比也增加了128％。其中，表达CD 69的CD 8T细胞为6.54％，表明与其他载体组相比增加了约141％。免疫荧光染色分析还表明，与其他施用组相比，LEM-S403施用组的NK细胞和CD 8T细胞更多地浸润到肿瘤中，同时显示出更高比例的CD 69阳性细胞。
(4)在黑色素瘤小鼠模型中单独和组合(+抗PD-1抗体)施用LEM-S403的抗肿瘤作用(图36至39)
在小鼠黑色素瘤模型中，进行了实验，以确定通过单独施用LEM-S403或与抗PD-1抗体联合施用来抑制肿瘤生长的效果。具体地，当分别用黑色素瘤细胞B16F10、缓冲液(1×PBS，50μL，瘤内施用)、载体(70μg，瘤内施用)、ppp-RNA(7μg，瘤内施用)、LEM-S403(7μg，瘤内施用)或LEM-S403(7μg，瘤内施用)和抗PD-1抗体(10mg/kg，腹腔施用)接种小鼠后体积达到约100mm3时，以2天和3天的间隔测量肿瘤体积。分别在缓冲液、载体和ppp-RNA施用组中，肿瘤迅速生长。另一方面，在LEM-S403单独施用组和抗PD-1抗体联合施用组中，从第2天开始，肿瘤生长缓慢增加。从第7天开始，与载体组相比，确认肿瘤体积显著小。此外，在完成施用后，证实即使在第11天，肿瘤生长与载体组相比也被显著抑制。跟踪所有小鼠的存活率，所有属于缓冲液、载体和ppp-RNA施用的小鼠组在第15天前死亡。然而，在单独施用LEM-S403或与抗PD-1抗体联合施用组中，平均存活时间显著增加。此外，当与抗PD-1联合施用时，与单独施用LEM-S403相比，未观察到肿瘤体积的显著差异。然而，已证实平均存活时间显著增加。
10.根据携带RNA颗粒的电荷确认细胞内递送
将实施例7中使用的SEQ ID NO:1的合成RIG-I配体(5'-三磷酸发夹RNA，ppp-RNA)和实施例1-1-(11)的多孔二氧化硅颗粒浓缩混合并递送至B16F10细胞。
每孔接种5×104个细胞，然后在4小时转染(无血清)+2小时(10％FBS)的条件下递送颗粒。
每个颗粒的电荷如下表4所示。
[表4]
颗粒(μg/ml) ppp-RNA(μg/ml) 运载体颗粒电荷
10 1 28.8
10 0.1 39.8
10 0 41.5
参照图41，可以看出，当用颗粒和ppp-RNA以10:0.1的比例处理细胞时，在细胞中形成了临时液泡(vacuoles)。然而，在10:1(颗粒:ppp-RNA)的比例下，没有观察到液泡的形成。
<110> 雷莫内克斯生物制药有限公司（LEMONEX INC）
<120> 用于免疫活性或用于治疗或预防癌症的药物组合物
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<220>
<223> RIG I激动剂
<400> 21
ccgauagcuu cguucgcgaa gcuaucgg 28
<210> 22
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RIG I激动剂
<400> 22
ccguaaggcu ucguucgcga agccuuacgg 30
<210> 23
<211> 58
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RIG I激动剂
<400> 23
gcgauacgcu uugcguaacg cuuugcguuc gcgcaaagcg uuacgcaaag cguaucgc 58
<210> 24
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RIG I激动剂
<400> 24
cgcguaagcc uaugcgaauc gguaugcguu cgcgcauagc cauucgcaua ggcuuacgcg 60
60
<210> 25
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RIG I激动剂
<400> 25
cgcgauaucg cauuggcaua cgcauugcgu ucgcgcaaug cguaugccaa ugcgauaucg 60
cg 62

Claims (23)

1.一种用于提高免疫活性的药物组合物，其包括：
由下式(1)表示的平末端发夹RNA；和
在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒，
其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为7至25nm，并且所述孔的内部带正电，
[式1]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a是2至5的整数，b是1至5的整数，
UUCG是形成所述发夹的环的碱基，
N1和N2是选自G或C的2至4个碱基，X1和X2是选自A或U的1至5个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA由下式2表示：
[式2]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a和b各自是2至4的整数，
N1和N2是选自G或C的2至4个碱基，X1和X2是选自A或U的2至4个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA的长度为14至100nt。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA包括SEQ ID NO:1至25中的任一个，以及与5’-末端结合的2至4个磷酸基团。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为5至65mV。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为35mV以下。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中未携带RNA的颗粒的ζ电位为10至70mV。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒与所述RNA的重量比为1:5至20。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒具有多个孔，所述孔从所述颗粒的表面延伸至内部。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒的BET表面积为280至680m2/g，并且粒径为50至500nm。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒是孔的平均孔径由小于5nm扩张至7至25nm的小孔颗粒。
12.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括：
由下式(1)表示的平末端发夹RNA；和
在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒，
其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为7至25nm，并且所述孔的内部带正电，
[式1]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a是2至5的整数，b是1至5的整数，
UUCG是形成所述发夹的环的碱基，
N1和N2为选自G或C的2至4个碱基，X1和X2为选自A或U的1至5个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述RNA由下式2表示：
[式2]
5’-Pa-((N1-X1)b-N2)-UUCG-(N3-(X2-N4)b)-3’
(其中P是磷酸基团，
a和b各自是2至4的整数，
N1和N2为选自G或C的2至4个碱基，X1和X2为选自A或U的2至4个碱基，且多个所选择的碱基彼此相同或不同，
N3与N2互补结合，X2与X1互补结合，N4与N1互补结合，和
重复b次的各碱基彼此相同或不同)。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述RNA的长度为15至100nt。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述RNA包括SEQ ID NO:1至25的任一序列，以及与5’-末端结合的2至4个磷酸基团。
16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为5至65mV。
17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述在孔中携带RNA的多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为35mV以下。
18.根据权利要求12所述的组合物，其中未携带RNA的颗粒的ζ电位为10至70mV。
19.根据权利要求12所述的组合物，其中所述颗粒与所述RNA的重量比为1:5至20。
20.根据权利要求12所述的组合物，其中所述颗粒具有多个孔，并且所述孔从所述颗粒的表面延伸至内部。
21.根据权利要求12所述的组合物，其中所述颗粒的BET表面积为280至680m2/g,，并且粒径为50至500nm。
22.根据权利要求12所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒是孔的平均孔径由小于5nm扩张至7至25nm的小孔颗粒。
23.根据权利要求12所述的组合物，其中所述癌症为以下的任一种：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、泌尿生殖道癌、睾丸肿瘤、食管癌、喉癌、胃癌、胃肠癌、皮肤癌、角质化细胞瘤、滤泡癌、黑色素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳头状癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、肾癌、骨癌、骨髓疾病、淋巴系统疾病、毛细胞癌、口腔和咽(口)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、中枢神经系统癌症、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈部癌、霍奇金病和白血病。
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