CN113439118A - 自动化生物制造系统、设备和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于生产纯化的目标蛋白质的方法和自动化设备，所述方法和自动化设备使用一种以上一次性灌注生物反应器、一种以上一次性缓冲容器和一种以上色谱系统。目标蛋白质可以为重组的或天然存在的蛋白质和/或治疗性或其他医学上有用的蛋白质。例如，所公开的方法和自动化设备可用于生产纯化的蛋白质药物。

Description

自动化生物制造系统、设备和方法
相关申请
本申请要求于2019年2月15日向美国专利商标局提交的美国临时专利申请号62/806,448的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
1.发明领域
本发明涉及用于生产治疗性蛋白质的自动化制造设备和方法的领域。
背景技术
2.相关技术的讨论
生物制药行业正在经历重大变化，部分原因是：新生物治疗药物的批准激增、蛋白质表达率更高，以及来自生物仿制药市场的压力增加(Levine等，Efficient,flexiblefacilities for the 21st century，BioProcess International 10(11)：20-30(2012))。
生物制剂的医药市场份额预计将激增(2002年的11％至2017年的约20％)，再加上世界发展中地区对负担得起的药物获取的需求，需要开发快速、可持续和成本低廉的制造方法(Walsh，Biopharmaceutical benchmarks 2014，Nature biotechnology 32(10)：992-1002(2014))。
因此，需要找到替代传统批处理平台的生物制剂制造技术，以利用关键优势(例如更高的生产量、操作灵活性和成本节约，以及减少足迹)来减少对环境的影响。生物加工厂旨在包含具有集成上下游的连续制造方法，与分批培养加工相比，可实现快速的设备周转、产品和产能的灵活性以及更低的制造成本(参见，例如，Farid等，Evaluating theeconomic and operational feasibility of continuous processes for monoclonalantibodies，Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing，第433-456页(2015)；Kelley，Industrialization of mAb production technology:thebioprocessing industry at a crossroads，mAbs 1(5)：443-452(2009)；Croughan等，Thefuture of industrial bioprocessing:Batch或continuous，Biotechnology andBioengineering 112：648-651(2015)；Pollock等，Fed-batch and perfusion cultureprocesses:Economic,environmental,and operational feasibility underuncertainty，Biotechnology and Bioengineering 110(1)：206-219(2013))。
连续灌注技术的出现支持在连接上游方法设备以便以连续模式操作方面取得更大进展。在过去的25年中，此种加工策略对多家公司具有价值，帮助他们克服与其产品相关的稳定性问题(Konstantinov等，White paper on continuous bioprocessing，Journalof Pharmaceutical Sciences 104(3)：813-820(2015))。
现代细胞系和培养基已被设计成以更高的细胞密度为目标，特别是当与补料分批加工相比时，一些培养物实现了大于1亿个细胞/mL的活细胞密度(Clincke等，Very highdensity of chinese hamster ovary cells in perfusion by alternating tangentialflow或tangentialflow filtration in wave bioreactorTM—part ii:Applications forantibody production and cryopreservation，Biotechnology Progress 29(3)：768-777(2013)))。因此，典型的生物制剂制造设备瓶颈已从生产生物反应器(上游方法)转移至纯化系列(下游方法)，特别是色谱柱(由于其尺寸限制)。纯化由当前生产细胞系中蛋白质数量不断增加而产生的大批量产品并不是一项微不足道的挑战(Chon等，Advances in theproduction and downstream processing of antibodies，New Biotechnology 28(5)：458-463(2011))。因此，上游生物制剂制造方法与下游方法的整合问题，继续困扰着生物制剂制造行业。
Warikoo等报道了在生产生物反应器的下游集成连续捕获色谱步骤，导致柱尺寸和缓冲液利用率降低(Warikoo等，Integrated continuous production of recombinanttherapeutic proteins，Biotechnology and Bioengineering 109(12)：3018-3029.(2012))。
Godawat等证明了端到端(end-to-end)连续生物加工是可行的，但仍面临一些挑战，包括开发能确保产品高质量的稳健的病毒清除和自动化策略(Godawat等，End-to-endintegrated fully continuous production of recombinant monoclonal antibodies，Journal of Biotechnology 213：13-19(2015))。
本发明为这些挑战提供了解决方案，并满足了对替代传统批处理平台的自动化生物制剂制造技术的需求。
发明内容
本发明涉及可用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于治疗性或其他医学上有用的蛋白质)的自动化设备和方法。在持续捕获蛋白质产品的情况下维持长时间的灌注培养面临许多挑战。这些包括：消耗的大量培养基和在产品收集开始之前从渗透物中产生的大量液体废弃物，以及在产品回收过程中通过捕获柱的流动产生的大量液体废弃物。需要为废弃物管线保持无菌边界，由于耗材和劳动力成本高昂，因此在封闭的袋子系统中收集废弃物可能会存在困难。长时间灌注培养以及要维持更大的无菌边界会增加污染的风险，包括在连续捕获操作期间，所有这些均存在于丰富的生长培养基中。其他挑战包括长时间保持高活力培养以及管理连接的单元操作之间的差异流速，例如连接至第一色谱系统、连接至病毒灭活系统、连接至第二色谱系统、连接至可选的第三色谱系统的灌注生物反应器和/或连接至超滤/渗滤系统的病毒过滤系统等之间的差异流速。
用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于治疗性或其他医学上有用的蛋白质)的本发明的自动化设备和方法满足了这些和其他挑战。一方面，本发明包括：在允许细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物(permeate)或细胞渗出物(cellbleed)体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除的渗透物体积从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器(surge vessel)，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中。
在另一方面，本发明包括使用多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂，同时混合并视需要递送至灌注生物反应器。在另一方面，本发明包括使用伽马辐照或高压灭菌的即用型一次性用品、一次性无菌连接器、管焊机进行封闭处理，以及在柱子上使用化学冷灭菌剂。在另一方面，本发明包括流体连接且连续单元操作(例如病毒灭活和各种色谱系统)之间的有效自动化和协调的流速。
在一个实施方式中，本发明涉及用于生产纯化的目标蛋白质的自动化设备。纯化的蛋白质可以为重组的或天然存在的蛋白质。自动化设备由过程自动化系统(PAS，processautomation system)控制，该自动化设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；
(b)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；以及
(c)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSV1的无细胞渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中。
本发明的自动化设备可进一步包括：
(d)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；以及
(e)储存容器或第二一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池。
在一些实施方式中，自动化设备可进一步包括：
(f)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或第二一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(g)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(h)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化的目标蛋白质。
在一些实施方式中，用于生产纯化的目标蛋白质的自动化设备还包括多个贮存器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，每个贮存器直接或通过可选的混合容器间接地流体连接至灌注生物反应器，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至灌注生物反应器。
本发明还涉及生产纯化的目标蛋白质的方法，所述蛋白质可以为重组的或天然存在的蛋白质。该方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中。
本发明的方法还可包括以下步骤：
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池。
此外，该方法可包括进一步的抛光步骤：
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；将病毒灭活产物池引入第二色谱系统；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统中，得到包含纯化的目标蛋白质的组合物。
在一个更具体的方面，本发明涉及用于生产纯化的蛋白质药物(即用于治疗或其他医学目的(例如预防或诊断目的)的纯化的目标蛋白质)的自动化设备。该设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的哺乳动物细胞将目标蛋白质分泌至培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；多个贮存器直接或间接地通过可选的混合容器流体连接至灌注生物反应器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至灌注生物反应器；
(b)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物(不含细胞)从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；
(c)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSV1的无细胞渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中；
(d)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(e)储存容器或一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池；
(f)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(g)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(h)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化的蛋白质药物。自动化设备的操作由过程自动化系统(PAS)控制。
在另一个更具体的方面，本发明涉及生产纯化的蛋白质药物的方法，即用于治疗或其他医学目的(例如预防或诊断目的)的纯化的目标蛋白质。纯化的蛋白质药物可以为重组的或天然存在的蛋白质。该方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中；
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统中，得到包含目标蛋白质的纯化药物。
在用于生产纯化的蛋白质药物的方法的一些实施方式中，将新鲜的无菌液体培养基与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，然后加到一种以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。前述概述并非旨在定义本发明的每个方面，本文其他部分(例如具体实施方式)中描述了其他方面。全文旨在作为统一的公开内容而相关联，应理解，即使这些特征的组合没有一起出现在本文的同一句子、段落或部分，均应考虑本文所述特征的所有组合。
除上述之外，作为其他方面，本发明包括范围以任何方式比由以上特定段落所定义的变型更窄的本发明的所有实施方式。例如，被描述为属(应理解，一个属的每个成员)的本发明的某些方面单独地是本发明的一个方面。此外，描述为属或选择属的成员的方面应理解为包括该属的两个以上成员的组合。尽管申请人发明了在此描述的本发明的全部范围，但申请人并不打算要求保护在其他人的现有技术工作中描述的主题。因此，如果专利局或其他单位或个人提请申请人注意权利要求范围内的法定现有技术，申请人保留根据适用的专利法进行修改以重新限定此类权利要求的主题的权利，以明确将此类法定现有技术或法定现有技术的明显变型排除在此权利要求的范围之外。由这些修改的权利要求限定的本发明的变型也旨在作为本发明的方面。
附图说明
图1A显示了本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其显示了多个一次性贮存器流体地连接至500L规模的一次性灌注生物反应器(本文中生物反应器被简称为“500L SUB”)，每个贮存器均装有不同的无菌浓缩培养基组分(此处显示的贮存器以其内容物表示，分别为：“50％葡萄糖”；“Cys/Tyr储备溶液”；以及“600L托特7.5x浓缩”)或水性稀释剂(“1kL托特WFI”)。“AF”＝消泡剂，用于减少生物反应器中的泡沫；“碱”＝通过自动操作添加的碳酸钠，用于维持生物反应器的pH值。
图1B显示了本发明方法的半连续形式实施方式的示意性局部工艺流程图，从500L的一次性生物反应器(“SUB”和“批次单元(A)”)至灌注系统(“灌注滑架(Perfusion Skid)”和“批次单元(A1)”)，至一次性缓冲容器(SUSV；“非批次单元(B1)”，标有“200L便携式混合器”)，至模拟移动床(SMB)第一色谱系统(“批次单元(B)”，此处表示为在标有“SMB色谱系统”的推车上的一次性多柱色谱系统)，至洗脱收集容器(“非批次单元(B3)”和“非批次单元(B4)”，每个均标有“100L便携式混合器”)，用于收集蛋白质分离物级分。在图1B所示的实施方式中，在SUSV的上游，可选的过滤系统(“非批次单元(B2)”，标记为“过滤器组(FilterBank)”)保护第一色谱系统免受微粒的影响；在引入第一色谱系统之前，可选的热交换器将渗透物材料冷却至室温(RT)，或在一些实施方式中冷却至4℃或其他所需温度，这取决于色谱系统的组件和蛋白质分子的稳定性需要。在其他实施方式中(此处未在图1B中显示)，可将蛋白质分离物级分流体输送至第二一次性缓冲容器(SUSV2)或至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)，或直接连续地输送至病毒灭活系统(例如，低pH或去污剂病毒灭活系统)。在图1B所示的实施方式的示意图中，在第一色谱系统之前，在灌注操作开始时(SUB和灌注滑架的下游)，使用一次性气闸(air break)组件(也参见图2)将渗透物送至废弃物中，排出第一色谱系统下游的流通废弃物。可以可选地包括灌注组和过滤器组之间的附加单元操作(如图1B所示)，使得单程切向流过滤(SPTFF，single passtangential flow filtration)在灌注渗透物进一步向下游流向第一色谱系统之前对其进行浓缩。
图1C显示了本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其中，两个便携式混合器(此处各自显示为500L体积)分别用作交替的SUCV1和SUCV2，作为病毒灭活系统的一部分运行(“病毒灭活滑架”)，或向其流动，图20A、图20C和图20D中也示意性地表示了这些不同的实施方式。在图1C中，SUSV显示为500L的便携式混合器，其大小足以容纳整个池。或者，在连续或半连续操作的实施方式中，所示的任何SUSV(即，SUSV2、SUSV3或SUSV4)可改为不同的方便容积(例如，50L、75L或100L)，或任选的。例如，可选择取消在UF/DF系统滑架(即SUSV4)之前显示的一次性缓冲容器，以支持使用UF/DF滑架再循环罐作为缓冲容器(参见例如图20E)。在其他实施方式中，可取消第二色谱系统和第三色谱系统之间的一次性缓冲容器(即SUSV2)或第二色谱系统和病毒过滤系统之间的一次性缓冲容器(即SUSV2)，以便运行两个以上串联的纯化或“抛光”步骤(参见例如图20F)。
图1D显示了本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其中，两个便携式混合器(每个500L体积)分别用作交替的SUCV1和SUCV2，作为病毒灭活系统的一部分运行(“病毒灭活滑架”)，或向其流动。在图1D所示的实施方式中，在病毒灭活系统(例如，低pH病毒灭活系统和中和系统)和深度过滤的下游，该方法以分批方式进行，在步骤或操作之间具有储存容器(显示为HV1、HV2、HV3和HV4)。但是，在其他实施方式中，HV2、HV3或HV4中的任何一个均可由缓冲容器代替或完全取消，以便在自动控制下实现步骤或操作之间的不间断流。
图2示意性地显示了一次性气闸组件的实施方式。显示了：(A)至系统的废弃物出口管线的连接；(B)将气闸引入流动液体的通风过滤器；(C)保持气闸的较大和较小的管道部分；(D)至排放管的连接。在图2中用交叉影线绘制的管道(例如C)表示编织管，但可使用其他适当直径的非编织管代替。
图3显示了SUSV1(“SUSV”)体积控制的实施方式的示意图。图3中所示的体积限制(在其上采取控制动作)只是示例性的，可根据系统组件体积和流量容量而变化。
图4显示了色谱树脂和用合适的化学消毒剂(sanitant)消毒的柱外壳的示意性局部方法设置，化学消毒剂例如一个实施方式显示的过乙酸(图4中标为“PAA”)。在该实施方式中，一次性多柱连续色谱系统，例如模拟移动床(SMB)色谱系统在此称为“BioSMB”以代表CadenceTM
Figure BDA0003205347400000081
PD系统(Pall Life Sciences)，但可使用其他合适的一次性多柱连续捕获色谱系统代替。在该实施方式中，“无菌连接器A”可以为
Figure BDA0003205347400000082
G连接器(ColderProducts Company)等；“无菌连接器B”可以为
Figure BDA0003205347400000083
Genderless连接器(PallBiotech)等；管道可以为73号硅胶管等；用于废弃物的密闭袋可以为10L(或其他方便的体积)的一次性袋子。
图5示意性地显示了本发明自动化设备的实施方式的各种硬件和软件组件，用于生产纯化的目标蛋白质，例如能够在系统的不同组件之间进行数据通信的纯化的蛋白质药物。但是，灌注系统和连续色谱系统滑架的灰色框中显示的每个组件(即过滤器组、进料罐A和进料罐B以及收集罐A和收集罐B)作为此种滑架(批次单元)的组件是完全可选的。在本发明的其他实施方式中，根据特定制造目的的需要，这些组分中的任一个可以可选地存在于非批次单元配置中或不存在。
图6显示了500L生物反应器运行和相应的2L比较卫星生物反应器的活细胞密度。2L比较卫星生物反应器分别称为“运行1R17”、“运行2R14”和“运行3R21”。
图7显示了500L生物反应器运行和相应的2L卫星生物反应器的活力。
图8显示了500L生物反应器运行和相应的2L卫星生物反应器的细胞渗出率。
图9显示了500L生物反应器运行和相应的2L卫星生物反应器的渗透物产率。
图10显示了视需要使用注射用水(WFI)的500L一次性生物反应器(SUB)培养体积控制。SUB液位(右刻度，上图)以千克为单位显示；WFI时间流速(左刻度，下图和梯级)以mL/min显示。WFI流速的阶跃变化对应于灌注速率从0.5vvd增至1.0vvd，再增至2.0vvd。
图11显示了比较500L SUB与2L卫星中的渗透压的代表性数据(显示了运行3)。
图12显示了比较500L SUB与2L卫星中的CO2的代表性数据(显示了运行3)。
图13显示了比较500L SUB和2L卫星中的碱用量的代表性数据(运行3)。500L SUB数据被显示为以mL/天表示的碱用量，其被归一化为2L生物反应器的操作体积(1.5L培养体积)。
图14显示了比较500L SUB与2L卫星的乳酸盐比生产率的代表性数据(显示了运行3)。
图15显示了比较500L一次性灌注生物反应器与2L卫星的葡萄糖比消耗率的代表性数据(“运行3R21”和“运行3R22”)。
图16A-B显示了BioSMB(显示为一个洗脱循环/天，持续17天；分钟；图16A)上的3个单独的蛋白A柱(图16A-B中称为：“柱1”、“柱2”和“柱3”)中的每一个的蛋白A亲和色谱在280nm(A280；Y轴)处吸光度的代表性洗脱图，以及它们在每个洗脱循环的各自洗脱柱体积(CV；图16B)(显示了运行2)。在图16B中，粗实线表示柱1数据(第17天的中间图)；细实线表示柱3数据(第17天的顶部图)；阴影线表示柱2数据(第17天的底部图)。
图17显示了代表性的蛋白A步骤产率数据(洗脱产率)，其被显示为每日洗脱循环池的合计值(显示了运行2)。还显示了累积洗脱循环(“柱EL循环”)。
图18显示了合计的每日中和洗脱池中与代表性方法相关的杂质(显示了运行2)。HCP＝通过ELISA测定测得的宿主细胞蛋白质，DNA＝通过qPCR测定测得的宿主细胞DNA，LPrA＝通过ELISA测定测得的浸出蛋白A。
图19A-B显示了代表性SUSV1培养物体积控制和多柱连续捕获模拟移动床(SMB)第一色谱系统(此处称为“BioSMB)上样流速(显示了运行2)。在图19A中，上样流速(右侧y轴刻度，L/h)显示在上部阶梯图中，而压力(左侧y轴刻度，巴)显示在锯齿状下部图中；流速变化±10％，保持SUSV控制范围。在图19B中，显示了一次性缓冲容器(SUSV)中包含的体积(以重量衡量，kg)；设定点为100kg，控制范围为70kg至130kg，其中假设密度为1kg/L。
图20A显示了本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其中，两个交替的一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)以交替的手动分批形式操作，作为进行病毒灭活(和视需要的中和)的结构。例如，酸化和中和可以在SUCV1和SUCV2中交替进行。
图20B显示了本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其中，一次性缓冲容器(显示为SUSV2)介于第一色谱系统(例如模拟移动床(SMB)色谱系统(称为“BioSMB”))和病毒灭活/中和滑架之间，该病毒灭活/中和滑架包含不间断流或连续形式的病毒灭活系统和中和系统。在另一个连续流动的实施方式中，SUSV2可以为病毒灭活(和视需要的中和)发生的容器。
图20C显示了本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其中，两个交替的一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)以分批形式送入病毒灭活/中和滑架，该病毒灭活/中和滑架含有病毒灭活(“VI”)系统和中和(“中和”)系统。病毒灭活/中和系统可配置为单个罐或两个交替罐。在图20C所示的实施方式中，在SUSV(SUSV1)上游，可选的(“可选”)过滤器组保护第一色谱系统免受微粒的影响；在引入第一色谱系统(称为“BioSMB”)之前，可选的热交换器(“热交换器(可选)”)将渗透物材料冷却至室温(RT)，或在一些实施方式中冷却至4℃或其他所需温度，这取决于色谱系统的组件和蛋白质分子的稳定性需要。
图20D显示了本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其中，两个交替的一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)作为病毒灭活/中和滑架的一部分运行，而不仅仅是输送至病毒灭活/中和滑架，该病毒灭活/中和滑架包含自动分批形式的病毒灭活系统和中和系统。酸化和中和过程在SUCV1和SUCV2的罐中交替进行。
图20E显示了不间断或连续流形式的本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图。在该实施方式中，一次性缓冲容器(显示为“容器”)位于方法步骤/操作之间，例如，在第二色谱系统(显示为“色谱2”)、可选的第三色谱系统(显示为“色谱3”)、病毒过滤系统(显示为“VF”)的上游，以及可选地(“*可选”)，在超滤/渗滤(“UF/DF”)系统之前，因为UF/DF滑架的循环罐可用作缓冲容器。如图20E所示，可视需要在自动进行下一次操作之前，可选(“可选”)在线调节每次操作的流出物的pH值和/或调节电导率负载(conductivityload)。在其他替代实施方式中，每次操作的流出物的pH值调节和/或电导率负载调节可以发生在一个以上“容器”或SUSV中(即，容器内调节)，如图20E中的操作之间所示。
图20F-G显示了不间断或连续流形式的本发明方法的一个实施方式的示意性局部方法流程图，其中，两个以上步骤/操作串联运行而中间不介入一次性缓冲容器，例如，在(图20F中)第二色谱系统(显示为“色谱2”)、可选的第三色谱系统(显示为“色谱3”)和/或病毒过滤系统(显示为“VF”)；或者，例如(图20G中)病毒过滤系统(显示为“VF”)、在线深度过滤(在图20G中显示为内联DF；也称为ILDF)和单程切向流过滤(显示为“SPTFF”)的上游。料流可从单程切向流过滤连续送至UF/DF，或者可收集在一个储存容器中用于UF/DF的批量应用。当本发明的方法涉及将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统中以得到包含纯化的目标蛋白质的组合物时，优选将SPTFF步骤的操作压力控制为约0.25psi至约60psi(或约0.25psi至约45psi；或约0.25psi至约30psi；或约0.25psi至约15psi；或约0.25psi至约5psi)，和/或将ILDF步骤的操作压力控制为约0.25psi至约60psi(或约0.25psi至约45psi；或约0.25psi至约30psi；或约0.25psi至约15psi；或约0.25psi至约5psi)。
图21显示了后-蛋白A色谱蛋白质分离物级分(“PrAEL HMW”)与低pH病毒灭活和中和病毒灭活产物池(“VI/中和池HMW”)的高分子量物质(HMW)的比较，通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)测量。
图22显示了本发明的用于生产纯化的目标蛋白质或纯化的蛋白质药物的方法的连续实施方式的示意图，从一次性灌注生物反应器(“SUB”)至最终配制步骤，包括两阶段的单程切向流过滤(“SPTFF”)和在线渗滤(“ILDF”)模块。第一色谱系统是使用CadenceTM
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PD系统(Pall；称为“BioSMB”)进行的蛋白A亲和色谱捕获步骤；该方法包括低pH病毒灭活系统(“2-罐VI”)；第二色谱系统包括离子交换色谱(“IEX”)。显示在单元操作之间使用了一次性缓冲容器(“SUSV”)。
图23显示了图22所示实例的深度过滤器推车及其使用后冲洗系统的示意图。本实施方式中的推车由两组过滤器组成，每组有一个深度过滤器(此处称为“DF-1”和“DF-2”)，每个深度过滤器后有一个无菌过滤器(此处分别称为“SF-1”和“SF-2”)。使用压力传感器(此处称为“P1”、“P2”、“P3”和“P4”)监测每个过滤器的压差。在指定的压差限制下，可使用自动阀切换过滤器系统(两个三角形相互指向且内部点的尖端相接代表二通阀)。在新过滤器运行时，可更换和冲洗污染的过滤器，以便以后重新使用。
图24显示了示例性连续形式实施方式中的SPTFF和ILDF系统的详细示意图，如实施例5中所述。用压力传感器(此处称为“P1”、“P2”、“P3”和“P4”)监测每个过滤器的压差。可选的“断流水箱(Break Tank)”表示可选的缓冲容器。在指定的压差限制下，过滤器组可使用自动阀进行切换(两个三角形相互指向且内部点的尖端相接表示二通阀；三个三角形相互指向且内部点的尖端相接代表三通阀)。在新过滤器运行时，可更换和冲洗污染的过滤器，以便以后重新使用。
具体实施方式
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
定义
除非本文另有定义，否则与本申请有关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。因此，如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数所指对象，除非上下文另有明确指示。例如，提及“一种蛋白质”包括一种蛋白质以上蛋白质；提及“一个生物反应器”包括一个生物反应器以上生物反应器。
本发明涉及用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于纯化的蛋白质药物)的集成、连续或半连续、且自动化的方法。本发明的方法在无菌操作条件下进行且涉及色谱系统流速的自动化控制调节(参见例如图5)。
该方法的各个步骤可在自动化设备内(在单个洁净室中或在多个单独的模块化洁净室中)进行，其可以可选地进行自动化控制。
与用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于蛋白质药物)的方法相关的术语“集成”表示：生产方法中的一个以上上游步骤和/或下游步骤在共同或协调控制下进行，基于编程命令，该命令由与设定点或流速相关的定义参数的当前传感器反馈修改。术语“协调”指两个以上操作、步骤、过程、组件或系统以某种关系受到控制、调节或安排，以确保它们朝着单一目的高效或协调运作。
“上游”过程包括但不限于：例如，培养重组宿主细胞；从渗透物中去除细胞；将来自一个以上灌注生物反应器的一定体积的无细胞渗透物流体地输送至一次性缓冲容器中。“下游”过程步骤包括但不限于：例如，第一色谱系统中的产物捕获和纯化；将蛋白质分离物级分转移至病毒灭活系统，其中，病毒灭活系统是低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要(例如在低pH病毒灭活系统实施方式中)的中和系统；将病毒灭活产物池引入第二色谱系统；将纯化产物池转移至第三色谱系统和/或病毒过滤系统；和/或将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统。
“病毒灭活产物池”包括通过操作病毒灭活系统(和中和系统，视需要)获得的含有蛋白质产物的材料。出于本发明的目的，“病毒灭活产物池”包括通过操作病毒灭活系统(和中和系统，视需要)而获得的材料，随后通过(可选的)深度过滤进行过滤以产生过滤的病毒灭活产物池(FVIP)，然后再进行进一步的下游处理。
制造方法或系统的“连续”形式指一种处理方式，其中，灌注生物反应器流体连接到连续捕获色谱步骤(例如，由第一色谱系统处理)以不间断流的方式从生物反应器(直接或通过中间单元操作间接地)流向第一色谱系统(例如通过第一色谱系统处理)，然后以不间断流的方式流体连接至下游病毒灭活步骤，并且可选地，以不间断流的方式流体连接至深度过滤。进一步的下游产品纯化步骤(例如，第二色谱系统、可选的第三层色谱系统、病毒过滤和超滤/渗滤处理)均以不间断流的方式流体连接至上述上游处理步骤，并依次彼此连接，带有可选的中间缓冲容器。
制造方法的“半连续”形式指一种处理方式，其中，灌注生物反应器以不间断流的方式流体连接至连续捕获色谱步骤(例如，通过第一色谱系统处理)，通过病毒灭活系统进行处理，可选地以不间断流的方式进行深度过滤，将病毒灭活产物池储存在储存容器(HV1)中。病毒灭活的产品池暂时储存在储存容器中，随后进行一个以上分批下游加工步骤，这些步骤可以不间断流的方式相继彼此流体连接，例如，第二色谱系统、可选的第三色谱系统以及通过超滤/渗滤进行处理，视情况可具有可选的中间缓冲容器或储存容器(即，如果有两个以上分批步骤或操作，则具有储存容器)。
“灌注生物反应器”是一种用于培养细胞的生物反应器，其中，可在细胞保留在生物反应器中的同时从反应器中添加和取出等体积的培养基。灌注生物反应器包括生物反应器和可操作连接的灌注系统，其提供新鲜营养培养基的稳定来源并去除细胞废弃物。灌注生物反应器的生物反应器和灌注系统可以为协调操作的独立机械单元。许多可商购的实例包括但不限于各种
Figure BDA0003205347400000121
品牌的一次性生物反应器(SUB；GE Healthcare LifeSciences)和
Figure BDA0003205347400000122
品牌的灌注流路组件和系统(Spectrum；Repligen)，这些生物反应器和灌注系统可由熟练的操作者适当地组合成灌注生物反应器。或者，生物反应器和灌注系统可组装成单个机械单元，例如但不限于3D Biotek品牌的灌注生物反应器(Sigma-Aldrich)。在通过灌注系统去除培养基的过程中，生物反应器中分泌的蛋白质产物可通过微滤连续收获，因此目标蛋白质在离开灌注系统的微滤器渗透物中被分离。
当含有目标蛋白质的材料通过管材、管道或其他封闭管路在步骤或系统之间流动而无需手动装载或卸载时，自动化制造设备内的制造方法或系统的步骤“流体地”进行，或“流体地连接”至或“流体地接收”来自制造方法的另一步骤或另一系统的材料。自动化制造设备内的制造方法或系统的一个步骤通常称为“单元操作”。配置为与OPC服务器通信(例如，通过硬接线或无线连接)的单元操作称为“批次单元”或“滑架”。一次性生物反应器、灌注系统、第一色谱系统、第二色谱系统、可选的第三色谱系统和超滤/渗滤系统通常但不一定被配置为“滑架”(参见例如图1B-D)。在一些实施方式中，病毒灭活系统和视需要的中和系统也可以为滑架(参见例如图20D)。不通过硬接线而是通过加密锁(dongle)和/或Profibus设备或类似的数字信息存储设备和电子硬件连接器控制的单元操作称为“非批次单元”。为方便和灵活起见，过滤器组、热交换器、缓冲容器、进料罐、贮存器、储存容器、收集容器或收集罐(例如洗脱收集罐)以及便携式混合器和其他混合容器(当可选存在时)通常配置为非批次单元，尽管在一些实施方式中，诸如这些的单元操作也可包括在“滑架”中，涉及通过硬接线或无线连接进行控制(参见例如图5和图20D)。
与制造方法或设备有关的术语“自动化”、“自动化控制”或“自动地”可互换使用，指计算机控制一个以上方法步骤的实施或执行或制造设备的组件或系统的操作，可选地伴随方法步骤或操作的反馈调节。通常，计算机化控制器从待控制的物理或化学参数的检测器接收数字信号并向系统或子系统发出响应数字指令。
术语“治疗性蛋白质”指适用于预防、治疗或治愈人类疾病或病症的药理学活性蛋白质。治疗性蛋白质的实例包括但不限于：单克隆抗体、天然蛋白质的重组形式(例如受体、配体、激素、酶或细胞因子)、融合蛋白、肽体和/或单体结构域结合蛋白，例如，基于选自以下的结构域：LDL受体A结构域、血小板反应蛋白结构域、甲状腺球蛋白结构域、三叶/PD结构域、VEGF结合结构域、EGF结构域、Anato结构域、Notch/LNR结构域、DSL结构域、整合素β结构域和Ca-EGF结构域。前述仅仅是示例性的，治疗性蛋白质可包含任何临床相关的多肽靶标部分或多肽配体。当与目标治疗性蛋白质结合使用时，术语“衍生物”指通过与治疗剂或诊断剂缀合、标记(例如用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接例如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)而共价修饰的蛋白质，以及天然或非天然氨基酸的插入或取代。
“药物”是一种活性药物成分(API)，旨在在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中提供药理活性或其他直接作用，或影响身体的结构或任何功能。药物可进一步与缓冲剂、载体和/或赋形剂一起配制或重新配制，药物可进一步以适合和/或批准用于临床使用的药品配置给药。
术语“纯化”或“纯化的”所需蛋白质指通过从组合物或溶液中(完全或部分)去除至少一种污染物，来增加组合物或溶液中所需蛋白质的程度或纯度，该组合物或溶液包含目标蛋白质(即“POI”，例如治疗性蛋白质或其他医学上有用的蛋白质)和一种以上污染物。“分离的”蛋白质是经鉴定并从其天然环境或由生产细胞分泌它的培养基的一种以上组分中分离的蛋白质。在一些实施方式中，分离的蛋白质基本上不含在其天然或培养基环境中发现的会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他污染物。其自然环境或培养基的“污染物”成分是会干扰目标蛋白质的工业、研究、治疗、预防或诊断或用途的材料，可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质(例如，多核苷酸、脂质、碳水化合物)溶质。通常，“分离的蛋白质”或可互换地“蛋白质分离物”构成给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。在一些实施方式中，分离的目标蛋白质将被“纯化”：(1)至大于95％重量的蛋白质，最优选地大于99％重量；或(2)通过SDS-PAGE或其他合适的技术达到同质性，在还原或非还原条件下，可选地使用染色剂(例如考马斯蓝或银染色剂)。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为蛋白质天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离或纯化的目标蛋白质(例如纯化的蛋白质药物)。
出于本发明的目的，目标蛋白质(例如治疗性或其他医学上有用的蛋白质)，无论其包括变体或亲本抗体氨基酸序列，通常通过重组表达技术产生，尽管它也可以为天然存在的蛋白质。
“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，且包括通过肽键共价连接的两个以上氨基酸的分子链。这些术语不指产品的特定长度。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，蛋白质片段、类似物、突变或变体蛋白质、融合蛋白等也包括在多肽的含义内。该术语还包括其中包括一种以上氨基酸类似物或非常规或非天然氨基酸的分子，它们可使用已知的蛋白质工程技术重组表达。此外，蛋白质可如本文所述和通过其他公知的有机化学技术进行衍生。
术语肽或蛋白质“类似物”指通过至少一个氨基酸残基取代、内部添加或至少一个氨基酸的内部缺失和/或氨基末端或羧基末端截短或添加，具有与自然界中存在的肽序列不同的序列的多肽。“内部缺失”指天然存在的序列在除N末端或C末端以外的位置缺失氨基酸。同样，“内部添加”指在天然存在的序列在除N末端或C末端以外的位置添加氨基酸。
多肽(例如免疫球蛋白、抗体或融合蛋白)的“变体”包含如下的氨基酸序列：相对于另一个多肽参考序列，该氨基酸序列中插入、缺失和/或取代了一个以上氨基酸残基。变体可包括融合蛋白的变体。
术语“融合蛋白”表示该蛋白质包括源自超过一种亲本蛋白质或多肽的多肽成分。通常，融合蛋白由“融合基因”表达，其中，编码来自一种蛋白质的多肽序列的核苷酸序列与编码来自不同蛋白质的多肽序列的核苷酸序列在读框内附加，可选地由接头分开。然后融合基因可作为单一蛋白质由重组宿主细胞表达。掺入抗体或其抗原结合部分的融合蛋白是已知的。
本发明的方法涉及培养能够产生目标分泌蛋白的哺乳动物细胞，例如重组宿主细胞。“分泌的”蛋白质指那些由于分泌信号肽序列而能够被定向至内质网(ER)、分泌囊泡或细胞外间隙的蛋白质，以及那些释放至细胞外间隙中的蛋白质，而不必包含一个信号序列。如果分泌的蛋白质被释放至细胞外空间，分泌的蛋白质可进行细胞外加工以产生“成熟”的蛋白质。释放至细胞外空间可通过多种机制发生，包括胞吐作用和蛋白水解裂解。在一些其他实施方式中，目标抗体蛋白可由宿主细胞合成为分泌蛋白，然后可从细胞外空间和/或培养基中进一步纯化。
当提及在宿主细胞中通过重组DNA技术产生的蛋白质时，如本文所用，“可溶性”指存在于水溶液中的蛋白质；如果蛋白质含有双精氨酸信号氨基酸序列，则可溶性蛋白质被输出到革兰氏阴性细菌宿主的周质空间，或由能够分泌的真核宿主细胞(即“蛋白质分泌”细胞，例如分泌蛋白质的哺乳动物细胞)或由具有适当基因(例如kil基因)的细菌宿主分泌到培养基中。因此，可溶性蛋白质是在宿主细胞内的包涵体中未发现的蛋白质。或者，根据上下文，可溶性蛋白质是未发现整合至细胞膜中的蛋白质，或者当可溶性蛋白质在生理条件下在没有其他蛋白质的情况下悬浮在目标水性缓冲液中时，可溶性蛋白质在体外在生理条件下溶解或能够溶解在水性缓冲液中而不会形成大量不溶性聚集物(即，形成的聚集体小于总蛋白质的10％、通常小于约5％)，此类缓冲液不含离子去污剂或离液剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、盐酸胍或高氯酸锂。相比之下，不溶性蛋白质是以变性形式存在于宿主细胞的细胞质颗粒(称为包涵体)内的蛋白质，或者再次根据上下文，不溶性蛋白质是一种存在于细胞膜(包括但不限于细胞质膜、线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜等)或在生理条件下存在于体外水性缓冲液中的蛋白质，当它在生理条件下(在生理相容的温度下)与其他蛋白质一起悬浮在目标水性缓冲液中时，会形成大量的不溶性聚集体(即形成的聚集体等于或大于总蛋白质的约10％)，此种缓冲液不含离子去污剂或离液剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、盐酸胍或高氯酸锂。
蛋白质的“稳定”制剂是蛋白质在抗体药物和/或药物产品的加工(例如超滤、渗滤、其他过滤步骤、小瓶填充)、运输和/或储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。总之，制剂中蛋白质的物理、化学和生物稳定性体现了蛋白质制剂的“稳定性”，这特定于配制药品(DP)的储存条件。例如，预计在零度以下储存的药品在化学、物理或生物活性方面不会发生显著变化，而在40℃下储存的药品预计其物理、化学和生物活性会发生变化的变化程度取决于药物或制剂的储存时间。蛋白质制剂的配置也会影响变化率。例如，聚集体的形成受蛋白质浓度的影响很大，在较高的蛋白质浓度下观察到较高的聚集率。还已知赋形剂会影响药物产品的稳定性，例如，添加盐会增加某些蛋白质的聚集速率，而已知其他赋形剂(例如蔗糖)会降低储存过程中的聚集速率。不稳定性也受到pH值的极大影响，根据改性类型和pH值依赖性，会产生更高和更低的降解速率。
用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域已知的，例如Wang，W.(1999)，Instability,stabilization and formulation of liquid protein pharmaceuticals，Int JPharm 185：129-188对其进行了综述。可在选定的温度下在选定的时间段内测量稳定性。例如，对于快速筛选，制剂可在40℃下保持2周至1个月，在此期间测量稳定性。如果制剂要在2℃至8℃下储存，通常制剂应在30℃下稳定至少1个月，或在40℃下至少稳定一周，和/或在2℃至8℃下稳定至少两年。
如果经目视检查颜色和/或透明度，或通过紫外光散射或尺寸排阻色谱法或其他合适的方法进行测量时，蛋白质显示出二级和/或三级结构(即内在结构)、聚集、和/或沉淀和/或变性的最小变化迹象，则该蛋白质在制剂中“保持其物理稳定性”。蛋白质的物理不稳定性(即物理稳定性的丧失)可由寡聚化导致二聚体和更高阶聚集体、亚可见和可见颗粒形成以及沉淀引起。物理降解的程度可根据目标降解物的类型使用不同的技术来确定。二聚体和更高级的可溶性聚集体可使用尺寸排阻色谱法进行量化，而亚可见粒子可使用光散射、光遮蔽或其他合适的技术进行量化。
如果在给定时间的化学稳定性使得共价键不会形成或断裂从而导致蛋白质组分的一级结构发生变化，则蛋白质在配方中“保持其化学稳定性”。一级结构的改变可能导致蛋白质二级和/或三级和/或四级结构的改变，可能导致聚集体的形成或已形成的聚集体的逆转。典型的化学修饰可包括异构化、脱酰胺、N-末端环化、骨架水解、甲硫氨酸氧化、色氨酸氧化、组氨酸氧化、β-消除、二硫键形成、二硫键乱序、二硫键裂解和其他导致一级结构变化(包括D-氨基酸形成)的变化。化学不稳定性(即化学稳定性的丧失)可通过多种技术进行研究，包括离子交换色谱、毛细管等电聚焦、肽消化物分析和多种类型的质谱技术。化学稳定性可通过检测和量化蛋白质的化学改变形式来评估。化学改变可能涉及大小改变(例如剪切)，其可使用例如大小排阻色谱、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)进行评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如由于脱酰胺而发生)，其可通过基于电荷的方法进行评估，例如但不限于离子交换色谱、毛细管等电聚焦或肽图。
物理和/或化学稳定性的丧失可能导致生物活性的变化，目标生物活性的增加或减少，这取决于修饰和被修饰的蛋白质。如果蛋白质在给定时间的生物活性是制剂制备时表现出的生物活性的约30％以内，则蛋白质在制剂中“保持其生物活性”。如果活性低于其起始值的70％，则认为活性减少。生物测定可包括基于体内和体外的测定，例如配体结合、效价强度、细胞增殖或其生物药物活性的其他替代测量。
当出现在说明书中与生物材料(例如多肽、核酸、宿主细胞等)有关时，术语“天然存在”指在自然界中发现的材料。
术语“重组”表示材料(例如核酸或多肽)已通过人为干预人工地或合成地(即非天然地)改变。可在其自然环境或状态内或从其自然环境或状态中移除材料上进行更改。例如，“重组核酸”通过重组核酸制备，例如在克隆、DNA改组或其他公知的分子生物学程序期间。Maniatis等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，纽约(1982)中可找到此种分子生物学程序的实例。“重组DNA分子”由通过此种分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成。
本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”指使用重组DNA分子表达的蛋白分子，例如目标蛋白质。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸的细胞。
术语“控制序列”或“控制信号”指在特定宿主细胞中可影响与其连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此种控制序列的性质可能取决于宿主生物。在特定实施方式中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。真核生物的控制序列可包括包含一个以上转录因子识别位点、转录增强子序列或元件、聚腺苷酸化位点和转录终止序列的启动子。控制序列可包括前导序列和/或融合伴侣序列。启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白质特异性相互作用的短DNA阵列组成(Maniatis等，Science236：1237(1987))。启动子和增强子元件已从多种真核来源中分离出来，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白质的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而另一些在有限的细胞类型子集中起作用(参见综述：Voss等，TrendsBiochem.Sci.，11：287(1986)和Maniatis等，Science 236：1237(1987))。
“启动子”是包括RNA聚合酶结合位点的DNA区域，以启动一个以上的下游结构基因对信使RNA的转录。启动子位于基因转录起始位点附近，在同一条链上，在DNA上游(朝向有义链的5’区域)。启动子的长度通常为约100-1000bp。
“增强子”是DNA的短(50-1500bp)区域，其可与一种以上激活蛋白(转录因子)结合以激活基因的转录。
如本文所用，术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”指核酸序列的连接方式使得核酸分子能够指导给定基因的转录和/或合成所需的蛋白质分子。该术语还指以产生功能性蛋白质的方式连接氨基酸序列。例如，载体中与蛋白质编码序列“可操作地连接”的控制序列的连接使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括含有两个以上核苷酸残基的单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸残基可以为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括：碱基修饰(例如溴尿苷和肌苷衍生物)、核糖修饰(例如2',3'-双脱氧核糖)和核苷酸间键合修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯)。
术语“寡核苷酸”指包含200个以下核苷酸残基的多核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其他实施方式中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以为单链或双链，例如用于构建突变基因。寡核苷酸可以为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
本文可互换使用的“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”或“核酸序列”是多核苷酸中核苷酸残基的一级序列，包括寡核苷酸、DNA和RNA、核酸或代表核苷酸残基一级序列的字符串，具体取决于上下文。由任何指定的多核苷酸序列可确定给定的核酸或互补的多核苷酸序列。包括基因组或合成来源的DNA或RNA，它们可以为单链或双链，代表有义或反义链。除非另有说明，本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录本5'至3'添加的方向称为转录方向；DNA链上与RNA转录物具有相同序列的序列区域的5'端至RNA转录物的5'端被称为“上游序列”；DNA链上与RNA转录物具有相同序列的序列区域的3'端至RNA转录物的3'端被称为“下游序列”。
如本文所用，“分离的核酸分子”或“分离的核酸序列”是核酸分子，所述核酸分子：(1)从通常与该核酸的天然来源相关的至少一种污染物核酸分子中鉴定并分离；或(2)被克隆、扩增、标记或以其他方式与背景核酸区分开，从而可确定目标核酸序列。分离的核酸分子与其在自然界中发现的形式或环境不同。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达免疫球蛋白(例如抗体)的细胞中的核酸分子，其中，例如核酸分子位于不同于天然细胞的染色体位置的染色体位置。
如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了核糖核苷酸沿mRNA链的顺序，也决定了氨基酸沿多肽(蛋白质)链的顺序。DNA序列因此编码RNA序列和氨基酸序列。
术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何核酸。基因通常包括编码序列和/或表达此类编码序列所需的调控序列。术语“基因”适用于特定的基因组或重组序列，以及由该序列编码的cDNA或mRNA。基因还包括未表达的核酸片段，例如形成其他蛋白质的识别序列。未表达的调控序列(包括转录控制元件)，调控蛋白(例如转录因子)与其结合，导致相邻或附近序列的转录。
“基因的表达”或“核酸的表达”指DNA转录成RNA(可选地包括RNA的修饰，例如剪接)、RNA翻译成多肽(可能包括多肽的后续翻译后修饰)或转录和翻译，如上下文所示。
表达盒是重组表达技术的典型特征。表达盒包括编码目标蛋白质的基因，例如编码抗体序列的基因，例如免疫球蛋白轻链和/或重链序列。真核“表达盒”指能够在真核细胞例如哺乳动物细胞中产生蛋白质的表达载体的一部分。它包括可在真核细胞中操作的用于mRNA转录的启动子、一个以上编码目标蛋白质的基因以及mRNA终止和处理信号。表达盒可有用地包括在编码序列中用作选择标记的基因。在表达盒中，启动子在5'端与编码外源目的蛋白的开放阅读框可操作地连接；并且聚腺苷酸化位点可操作地连接到开放阅读框的3'端。只要表达盒保持可操作性，表达盒还可以包括其他合适的控制序列。开放阅读框架可以可选地包含一种以上目标蛋白质的编码序列。
当用于指结构基因时，本文所用的术语“编码区”或“编码序列”指编码在新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸是mRNA分子翻译的结果。在真核生物中，编码区在5'侧由编码起始蛋氨酸的核苷酸三联体“ATG”限定，在3'侧由指定终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的三个三联体之一限定。
重组表达技术通常涉及使用包含表达盒的重组表达载体和包含具有表达盒的重组表达载体的哺乳动物宿主细胞或至少表达盒，其可例如整合至宿主中细胞基因组。
术语“载体”指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
本文所用的术语“表达载体”或“表达构建体”指重组DNA分子，其包含所需编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的合适的核酸控制序列。表达载体可包括但不限于影响或控制转录、翻译，如果存在内含子，影响与其可操作连接的编码区的RNA剪接的序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、可选的操纵基因序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。分泌信号肽序列也可以可选地由表达载体编码，与目标编码序列可操作地连接，使得表达的多肽可由重组宿主细胞分泌，以更容易地将目标多肽从细胞中分离(视需要)。此种技术在本领域中是公知的(参见，例如，Goodey，Andrew R.等，Peptide and DNAsequences，美国专利号5,302,697；Weiner等，Compositions and methods for proteinsecretion，美国专利号6,022,952和美国专利号6,335,178；Uemura等，Proteinexpression vector and utilization thereof，美国专利号7,029,909；Ruben等，27humansecreted proteins，US2003/0104400A1)。为了表达目标多亚基蛋白质，可使用合适数量和比例的单独表达载体来转化宿主细胞，每个表达载体包含每个不同亚基单体的编码序列。在其他实施方式中，可使用单一表达载体来表达目标蛋白质的不同亚基。
术语“宿主细胞”指已被核酸转化或能够被核酸转化从而表达目的基因或编码序列的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代在形态上或基因组成上与原始亲本细胞是否相同，只要存在目标基因即可。尽管优选能够翻译后糖基化抗体的哺乳动物宿主细胞，但是在实施本发明时可使用大量可用的和公知的宿主细胞中的任何一种来获得抗体变体。具体宿主的选择取决于本领域公认的许多因素。这些包括：例如，与所选表达载体的相容性、DNA分子编码的肽的毒性、转化率、肽回收的难易程度、表达特性、生物安全性和成本。在理解对于特定DNA序列的表达可能并非所有宿主都同样有效的前提下，必须取得这些因素之间的平衡。也可在DNA水平上进行修饰。可将编码肽的DNA序列更改为与所选宿主细胞更相容的密码子。可替换密码子以消除限制性位点或包括沉默限制性位点，这可能有助于所选宿主细胞中的DNA加工。接下来，转化的宿主被培养和纯化。宿主细胞可在常规发酵条件下培养，从而表达所需的化合物。此种发酵条件是本领域公知的。
在这些一般指南中，培养中的微生物宿主细胞，例如细菌(例如大肠杆菌)和酵母细胞系(例如，酵母菌、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母)和其他真菌细胞、藻类或藻样细胞、昆虫细胞、植物细胞，经修饰以纳入人源化糖基化途径，也可用于生产功能齐全的糖基化抗体。然而，哺乳动物(包括人)宿主细胞(例如CHO细胞和HEK-293细胞)在本发明方法中特别有用。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是：中国仓鼠卵巢细胞，包括CHO-K1细胞(例如ATCC CCL61)、CHO-S、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293或293细胞亚克隆用于悬浮培养(Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals NYAcad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞或FS4细胞；或哺乳动物骨髓瘤细胞，例如NS0或sp2/0小鼠骨髓瘤细胞。
“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”通常可互换使用，本文中的所有此类名称均包括细胞后代。例如，由CHO细胞“衍生”的细胞是中国仓鼠卵巢细胞的细胞后代，其可从最初的原代细胞亲本中分离出任何世代，还可包括转化体后代细胞。转化体和转化细胞包括原代目的细胞和由其衍生的培养物，不考虑转化次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能并不完全相同。包括与在最初转化的细胞中筛选出的具有相同功能或生物活性的突变后代。
宿主细胞用上述核酸或载体转化或转染以产生多肽(包括抗原结合蛋白，例如抗体)，并且在常规营养培养基(经过适当改良以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因)中培养。此外，具有由选择标记分隔的多拷贝转录单位的新型载体和转染细胞系对于多肽例如抗体的表达特别有用。
术语“转染”指细胞摄取外来或外源DNA，当外源DNA已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知且在本文中公开。参见，例如，Graham等，1973，Virology 52：456；Sambrook等，2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，同上；Davis等，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等，1981，Gene13：197。此类技术可用于将一种以上外源DNA部分引入合适的宿主细胞。
术语“转化”指细胞遗传特征的改变，当细胞被修饰为含有新的DNA或RNA时，细胞就被转化。例如，通过转染、转导或其他技术引入新的遗传物质，将细胞从其天然状态进行遗传修饰，从而对细胞进行转化。在转染或转导之后，转化DNA可通过物理整合至细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可作为游离元件暂时保持而不被复制，或者可作为质粒独立复制。当转化DNA随着细胞分裂而复制时，细胞被认为已“稳定转化”。
本发明的方法包括：在允许细胞将目标蛋白质分泌至培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期。
哺乳动物细胞(例如CHO和BHK细胞)通常作为悬浮培养物进行培养。换言之，细胞悬浮物在液体细胞培养基中，而不是粘附在固体支持物上。另一种有用的生产模式是带有贴壁细胞系的中空纤维生物反应器。多孔微载体可以适用且可商购获得，例如品牌
Figure BDA0003205347400000211
或
Figure BDA0003205347400000212
(GE Healthcare Biosciences)。
“细胞培养物”指细胞外培养基(新鲜或条件)和在其中培养的哺乳动物细胞。
在本文中可互换使用的“细胞培养基”或“培养基”是适用于体外细胞培养中的细胞、优选动物细胞、更优选哺乳动物细胞(例如CHO细胞)生长的无菌水性培养基。“补料培养基”是在将细胞接种至细胞培养基中且细胞生长已开始之后添加至细胞培养物中的新鲜细胞培养基。
术语“生产培养期”指将分泌蛋白质的哺乳动物细胞保持在生物反应器中的孵育条件下的时期，该孵育条件在生理学上允许持续生产目标蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质的表达可以为组成型的；在其他实施方式中，可将蛋白质的表达工程化为可诱导的(例如，TetO调节的表达)。对于此种诱导型表达，生产培养期仅包括当诱导剂分子(例如，四环素、多西霉素或其他四环素类似物)以足够的量存在于培养基中以诱导目标蛋白质的表达时在生物反应器中的培养期。出于要求保护的方法的目的，生产培养期为至少10天或更长，或至少20天或更长，例如10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更长；或10至20天或更长，或20至30天或更长，或30至45天或更长，或45至60天或更长，或60至75天或更长。
在生产培养期间，新鲜的无菌液体培养基被自动添加至一个以上灌注生物反应器中，与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合。短语“同时混合”指将浓缩培养基组分和稀释剂混合在一起制成新鲜培养基，仅在需要更换从每个灌注生物反应器中取出的培养基体积(作为渗透物或细胞渗出物体积)的几秒钟或几分钟内(≤2分钟)。基于生物反应器和叶轮设计以及搅拌速率，生物反应器具有特征混合时间。例如，
Figure BDA0003205347400000221
XDR 500L SUB在95-150rpm的搅拌速率下的混合时间为30至55秒。通过增加搅拌也可缩短混合时间。“渗透物”是一定体积的条件细胞培养基，其已通过微孔过滤去除所有细胞并包含目标蛋白质。去除细胞的微过滤器上游的条件培养基称为“滞留物(retentate)”；微过滤器下游的条件培养基称为“渗透物”，它从灌注生物反应器的灌注系统中流出，准备用于进一步处理(例如通过第一色谱系统)。“细胞渗出物”是一定体积的细胞培养物，包括一些细胞和培养基，从生物反应器中排出至废弃物和/或用于分析。新鲜培养基周期性地或连续地添加至生物反应器中，这取决于从生物反应器中取出一定体积的细胞培养物是间歇地(即“周期性地”)还是连续地发生。
在本发明的方法(和设备)的一些实施方式中，通过以彼此固定的比例将多种不同的浓缩组分溶液直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，同时还相对于多种不同的浓缩培养基组分溶液以不同比例添加水性稀释剂(合适的缓冲液或水)，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积(即，考虑从每个灌注生物反应器中取出的渗透物或细胞渗出物的体积)。在其他实施方式中，通过将多种不同的浓缩组分溶液和水性稀释剂(合适的缓冲液或水)以相对于彼此的固定比例直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。在其他实施方式中，通过将多种不同的浓缩组分溶液和水性稀释剂(合适的缓冲液或水)以相对于彼此固定的比例注入混合室，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，其中，新鲜的无菌液体培养基在添加至每个灌注生物反应器之前同时进行混合(在与生物反应器流体连接的无菌混合容器中)，保持恒定的培养体积。
培养基组分和稀释剂适当混合的具体比例将根据所使用的培养基配方和所用的浓缩培养基组分储备溶液的浓度而变化，适当的比例可由技术人员方便地计算。
根据本发明，优选避免不同浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂的表面下添加。视需要，通过单独的端口输送所有培养基组分溶液和水性稀释剂，可手动完成(例如，通过预设泵流速，视需要周期性调整)或自动完成(例如，通过使用比例控制泵滑架和自动操作，保持灌注生物反应器中的培养体积)。
术语“缓冲液”或“缓冲溶液”指通过其共轭酸碱的范围的作用抵抗pH变化的溶液。有用的缓冲剂的实例包括乙酸盐、MES、柠檬酸盐、Tris、bis-tris、组氨酸、精氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐和乳酸盐，或这些中两种以上种的组合，或其他无机酸或有机酸缓冲剂；磷酸盐是有用的缓冲液的另一个实例。含有钠、铵和钾阳离子的盐通常用于制备缓冲溶液。
多核苷酸的“结构域”或“区域”(在本文中可互换使用)是整个多核苷酸的任何部分，直至并包括完整的多核苷酸，但通常包含少于完整的多核苷酸。结构域可以但不一定独立于多核苷酸链的其余部分折叠(例如，DNA发夹折叠)和/或与特定的生物、生化或结构功能或位置相关，例如编码区或调控区。
蛋白质的“结构域”或“区域”(本文可互换使用)是整个蛋白质的任何部分，直至并包括完整蛋白质，但通常包含少于完整蛋白质。结构域可以但不一定独立于蛋白质链的其余部分折叠和/或与特定的生物学、生化或结构功能或位置相关(例如，配体结合结构域，或细胞溶质、跨膜结构域或胞外域)。
目标蛋白质的量化对于跟踪生产和产量或适当地配制蛋白质或药物用于进一步加工或储存通常是有用或必要的。因此，特异性结合目标蛋白质的结构域的抗体(特别是特异性单克隆抗体)可用于这些目的。
术语“抗体”或可互换的“Ab”以最广泛的意义使用，包括完全组装的抗体、单克隆抗体(包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和可结合抗原的抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、单链抗体、双抗体)，包含上述的互补决定区(CDR)，只要它们表现出所需的生物学特性活性。涵盖完整分子和/或片段的多聚体或聚集体，包括化学衍生的抗体。涵盖任何同种型或亚类的抗体，包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或任何同种异型。不同的同种型具有不同的效应子功能；例如，IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除可能以少量存在的天然发生的突变之外，构成该群体的个体抗体相同。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，作为抗原结合蛋白的单克隆抗体是针对单个抗原位点或表位的高度特异性的结合物。单克隆抗体的非限制性实例包括：鼠、兔、大鼠、鸡、嵌合、人源化或人抗体、完全组装的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(包括Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体)、大抗体、纳米抗体和包含上述抗体的CDR的重组肽或其变体或衍生物，只要它们表现出所需的生物活性。
修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可通过Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
术语“免疫球蛋白”包括：包含两条二聚化重链(HC)的全部或部分抗体，每条重链与轻链(LC)共价连接；单个未二聚化免疫球蛋白重链和共价连接的轻链(HC+LC)，或嵌合免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异源三聚体(所谓的“半体”)，或包含二聚化或未二聚化Fc域的融合蛋白，例如肽体(peptibody)。“免疫球蛋白”是蛋白质，但不一定是抗原结合蛋白，例如共价连接至临床相关靶结合部分的载体抗体。另一方面，免疫球蛋白可设计为多个临床相关靶标的双特异性或多特异性结合剂。术语“肽体”指包含不包括抗体CH1、CL、VH和VL结构域以及Fab和F(ab)2的抗体Fc结构域(即，至少CH2和CH3抗体结构域)的融合蛋白分子，其中，Fc结构域连接至一种以上肽，优选药理学活性肽。肽体的生产一般性地描述于PCT公开WO00/24782中。
在“抗体”中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个约220个氨基酸(约25kDa)的“轻”链和一个约440个氨基酸的“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的“可变”(“V”)区。每条链的羧基末端部分定义了一个主要负责效应子功能的恒定区。不同抗体的可变区不同。不同抗体的恒定区相同。在每个重链或轻链的可变区内，存在三个高变亚区，在抗体是抗原结合蛋白的情况下，它们有助于确定抗体对抗原的特异性。高变区之间的可变结构域残基称为框架残基，通常在不同的抗体之间有些同源。免疫球蛋白可根据其重链恒定域的氨基酸序列分为不同的类别。人类轻链分为κ(.kappa.)和λ(.lamda.)轻链。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个以上氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。总体上参见，Fundamental Immunology，第7章(Paul，W主编，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))。“抗体”还包括重组制备的抗体，以及糖基化或缺乏糖基化的抗体。
术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”包括具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基末端，CH结构域在羧基末端，CH3最靠近多肽的羧基末端。重链分为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链可以为任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。其中，一些可进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的IgG同种型可能具有不同的效应子功能(由Fc区介导)，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区与免疫效应细胞(如自然杀伤细胞和巨噬细胞)表面的Fc受体(Fc.γ.Rs)结合，导致靶细胞的吞噬或裂解。在CDC中，抗体通过在细胞表面触发补体级联反应来杀死靶细胞。
“Fc区”或本文可互换使用的“Fc结构域”或“免疫球蛋白Fc结构域”包含两个重链片段，其在完整抗体中包含抗体的CH1和CH2结构域。两个重链片段通过两个以上二硫键和CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
术语“补救受体结合表位(salvage receptor binding epitope)”指负责增加IgG的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位分子。
关于抗体的结构和产生的详细描述，参见Roth，D.B.和Craig，N.L.，Cell，94：411-414(1998)，其全部内容通过引用并入本文。简言之，产生编码重链和轻链免疫球蛋白序列的DNA的过程主要发生在发育中的B细胞中。在重排和连接各种免疫球蛋白基因片段之前，发现V、D、J和恒定(C)基因片段通常在单个染色体上相对靠近。在B细胞分化过程中，V、D、J(或在轻链基因的情况下仅V和J)基因片段的每个合适家族成员中的一个被重组，以形成重免疫球蛋白基因和轻免疫球蛋白基因的功能性重排可变区。此种基因片段重排过程似乎是连续的。首先制作重链D-至-J接头，然后是重链V-至-DJ接头和轻链V-至-J接头。除V、D和J片段的重排之外，通过在轻链中的V和J片段连接的位置以及重链的D和J片段连接的位置处的可变重组，在免疫球蛋白重链和轻链的主要库中产生了进一步的多样性。轻链中的此种变异通常发生在V基因片段的最后一个密码子和J片段的第一个密码子内。类似的连接不精确发生在D和JH片段之间的重链染色体上，可能延伸多达10个核苷酸。此外，可在D和JH之间以及在VH和D基因片段之间插入几个不由基因组DNA编码的核苷酸。这些核苷酸的添加被称为N区多样性。此类连接期间可能发生的可变区基因片段中的此类重排和可变重组的净效应是产生第一抗体库。
术语“高变”区指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基(即，如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)所述，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3))。即使单个CDR也可识别和结合抗原，尽管其亲和力低于包含所有CDR的整个抗原结合位点。
Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述了来自高变“环”的残基的替代定义，为轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。
“框架”或“FR”残基是除高变区残基之外的那些可变区残基。
目标蛋白质还可以为或包括一种以上抗体片段。“抗体片段”包含完整全长抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段；双体；线性抗体(Zapata等，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)(每个片段具有单个抗原结合位点)，以及包含恒定区的残留“Fc”片段。Fab片段包含所有的可变结构域，以及轻链的恒定域和重链的第一个恒定域(CH1)。Fc片段显示碳水化合物并负责许多抗体效应子功能(例如结合补体和细胞受体)，将一类抗体与另一类抗体区分开来。
胃蛋白酶处理产生具有两个“单链Fv”或“scFv”抗体片段的F(ab’)2片段，所述抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端包含一些额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个以上半胱氨酸。优选地，Fv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得Fv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab'片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，该重链的一部分包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含两条轻链和两条重链，其包含CH1和CH2结构域之间的一部分恒定区，从而在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键结合在一起的两个Fab'片段组成。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密非共价结合的二聚体组成。正是在此种配置中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以定义VH VL二聚体表面上的抗原结合位点。尽管亲和力低于整个结合位点，但单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力。
“单链抗体”是Fv分子，其中，重链和轻链可变区已通过柔性接头连接以形成多肽单链，其形成抗原结合区。国际专利申请公开号WO 88/01649以及美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了单链抗体，其公开内容通过引用整体并入本文。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中，这些结构域存在于多肽单链中，可选地在VH和VL结构域之间包含多肽接头，其使Fv能够形成抗原结合所需的结构(Bird等，Science 242：423-426，1988和Huston等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA85：5879-5883，1988)。“Fd”片段由VH和CH1域组成。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接至同一多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。例如，EP 404,097、WO 93/11161以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中更全面地描述了双抗体。
“结构域抗体”是仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个以上VH区与肽接头共价连接以产生二价域抗体。二价域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
术语“抗原结合蛋白”(ABP)包括如本文所定义的特异性结合目标配体或目标抗原的抗体或抗体片段。
通常，在类似的结合测定条件下，当与对其他无关蛋白质的亲和力相比，抗原结合蛋白(例如目标蛋白质，例如免疫球蛋白或抗体片段)对目标配体或抗原具有显著更高的结合亲和力从而能够区分该目标配体或抗原时，该抗原结合蛋白(例如目标蛋白质，例如免疫球蛋白或抗体片段)“特异性结合”至靶配体或目标抗原。通常，当解离常数(KD)为10-8M以下时，认为抗原结合蛋白“特异性结合”靶抗原。当KD为10-9M以下时，抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性结合抗原，而当KD为10-10M以下时，抗原结合蛋白以“非常高的亲和力”特异性结合抗原。
“抗原结合区”或“抗原结合位点”指特异性结合特定靶配体或抗原的蛋白质的一部分。例如，包含与靶配体或抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗原结合蛋白的部分被称为“抗原结合区”。在抗体中，抗原结合区通常包括一个以上“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个以上“框架”区(“FR”)。“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区可帮助维持CDR的正确构象以促进抗原结合区与抗原之间的结合。在传统抗体中，CDR嵌入在重链和轻链可变区的框架内，在那里它们构成负责抗原结合和识别的区域。免疫球蛋白抗原结合蛋白的可变区包含至少三个重链或轻链CDR，参见上文(Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Public Health Service N.I.H.，Bethesda，Md.；也参见Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等，1989，Nature 342：877-883)，在框架区内(指定的框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4，Kabat等，1991，同上；也参见Chothia和Lesk，1987，同上)。
术语“靶标”或“抗原”指能够被选择性结合剂例如抗原结合蛋白(包括例如抗体或抗体的免疫学功能片段)结合的分子或分子的一部分，还能用于动物以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可具有一个以上能够与不同抗原结合蛋白(例如，与抗体)相互作用的表位。
术语“表位”是被抗原结合蛋白(例如，抗体或抗体片段)结合的靶分子的部分。该术语包括能够与抗原结合蛋白(例如抗体或T细胞受体)特异性结合的任何决定簇。表位可以为连续的或不连续的(例如，在单链多肽中，氨基酸残基在多肽序列中彼此不连续但在分子的情况下与抗原结合蛋白结合)。在某些实施方式中，表位可以为模拟的，因为它们包含与用于产生抗原结合蛋白的表位相似的三维结构，但不包含该用于产生抗原结合蛋白的表位中发现的氨基酸残基或仅包含一些。大多数情况下，表位存在于蛋白质上，但在某些情况下可能存在于其他种类的分子(例如核酸)上。表位决定簇可包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶标特异的抗原结合蛋白将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶标上的表位。
术语“同一性”指通过比对和比较序列确定的两个以上多肽分子或两个以上核酸分子的序列之间的关系。“同一性百分比”指所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，基于被比较分子中最小分子的大小计算。对于这些计算，对齐中的空位(gap)(如果有)必须通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。可用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.主编)，1988，纽约：牛津大学出版社；Biocomputing Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.主编)，1993，纽约：学术出版社；Computer Analysis of Sequence Data，第一部分(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.主编)，1994，新泽西州：胡马纳出版社；von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis in Molecular Biology，纽约：学术出版社；Sequence AnalysisPrimer,(Gribskov，M.和Devereux，J.主编)，1991，纽约：M.Stockton Press；以及Carillo等，1988，SIAM J.Applied Math.48：1073中描述的那些。例如，序列同一性可通过通常用于比较两种多肽的氨基酸的位置相似性的标准方法来确定。使用计算机程序(例如BLAST或FASTA)，将两个多肽或两个多核苷酸序列比对以实现其各自残基的最佳匹配(沿一个或两个序列的全长，或沿一个或两个序列的预定部分)。这些程序提供了默认的开放罚分和默认的空位罚分，评分矩阵例如PAM 250(标准评分矩阵；参见Dayhoff等，in Atlas of ProteinSequence and Structure，第5卷，增刊3(1978)))可以与计算机程序结合使用。例如，则可将百分比同一性计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配跨度内较长序列的长度与为了对齐两个序列而引入较长序列的空位数之和。在计算同一性百分比时，被比较的序列以给出序列之间最大匹配的方式进行比对。
GCG程序包是可用于确定同一性百分比的计算机程序，该程序包包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)。计算机算法GAP用于比对待确定序列同一性百分比的两个多肽或两个多核苷酸。序列比对它们各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，由算法确定)。空位开放罚分(计算为平均对角线的3倍，其中，“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位扩展罚分(通常是空位开放罚分的1/10)，以及与该算法结合使用的比较矩阵(例如PAM250或BLOSUM 62)。在某些实施方式中，标准比较矩阵(参见Dayhoff等，1978，Atlas ofProtein Sequence and Structure 5：345-352，用于PAM 250比较矩阵；Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，用于BLOSUM 62比较矩阵)也被算法使用。
使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的百分比同一性的推荐参数包括以下：
算法：Needleman等，1970，J.Mol.Biol.48：443-453；
比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff等，1992，同上；
空位罚分：12(但没有对末端空位的罚分)；
空位长度罚分：4；
相似性阈值：0。
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可能导致两个序列中仅一个短区域的匹配，这个小的对齐区域可能具有非常高的序列同一性，即使两个全长之间没有显著关系序列。因此，视需要，可调整所选择的比对方法(GAP程序)以产生跨越目标多肽的至少50个连续氨基酸的对齐。
当与目标蛋白质结合使用时，术语“修饰”包括但不限于：一种以上氨基酸变化(包括取代、插入或缺失)；化学修饰；通过与治疗剂或诊断剂缀合进行共价修饰；标记(例如用放射性核素或各种酶)；共价聚合物连接，例如聚乙二醇化(聚乙二醇衍生化)和非天然氨基酸的化学合成导致的插入或取代。通过技术人员已知的方法，在将“工程化”蛋白质的编码序列包含在表达盒中之前，可“工程化”或修饰蛋白质以提高目标亲和力、选择性、稳定性和/或可制造性。
关于来自工艺步骤或设施组件的蛋白质分离物级分、纯化产物池、无病毒过滤物或另一个池、级分、洗脱液或所得液体流出物，术语“转换”或“转移”(在本文中可互换使用)指引导、分流、引导、流动或将流出物流体地输送至后续工艺步骤或设备组件中。此种转移可在计算机和/或机器人机构(例如阀门或泵)的自动控制和调节下，或者可手动控制和调节。
与液体可以流入或流出或通过其流动的收集容器、缓冲容器、储存容器、混合容器、罐、袋、导管、管道、管线或其他运输工具相关的术语“可切换”指此种流动可被转移、引导、分流、转向、流动或流体输送至不同的容器、罐、导管、管道、管线或运输工具。此种转移可在计算机和/或机器人机构(例如阀门或泵)的自动控制和调节下，或者可手动控制和调节。
术语“缓冲容器”指在导管、供给器、坝、管道或管线的下游端处的储存容器、混合容器、进料罐或收集容器(或可互换地，“收集罐”)，以吸收两个流体连接的单元操作之间的差异流速，例如在本发明的连续或半连续形式的方法的实施方式中，在自动控制下，来自生物反应器的渗透物的流速和第一色谱系统的流速。缓冲容器通过允许体积在流体连接的单元操作之间的预设体积范围限制内波动来吸收流速的变化或差异(参见例如图3)。出于本发明的目的，缓冲容器通常包含高达50L至650L的体积；在半连续方法的实施方式中，100L至650L容器最有用，而在连续方法的实施方式中，50L至200L容器通常就足够了。在本发明的一些实施方式中，病毒灭活系统/中和系统下游的操作涉及病毒灭活产物池(其也可以可选地通过深度过滤进行过滤以产生经过滤的病毒灭活产物池(FVIP))的分批处理；在这样的实施方式中，病毒灭活产物池被收集在收集容器中，在随后的分批步骤或操作中，纯化的产物池或无病毒过滤物可以可选地被收集在步骤之间的其他收集容器中。在这样的离散操作、分批或分批模式中，从一个步骤中处理收集容器或可互换的“收集罐”(在某些实施方式中，其也可被视为后续步骤的“进料罐”)缺乏对缓冲容器的自动控制，尽管收集容器(或进料罐)可能在物理上类似于缓冲容器，但出于本发明的目的，此种收集容器(或可互换地，“收集罐”)或进料罐称为“储存容器”或可互换地称为“HV”(例如，HV1、HV2、HV3、HV4或HV5)。“储存容器”可以为一次性储存容器(SUHV)，与制造方法步骤或操作的连续或半连续形式集合中的一次性收集容器(SUCV，例如SUCV1或SUCV2)不同。
“色谱系统”是至少一个封闭色谱基质的布置，具有用于流体进出至少一个色谱基质的封闭导管硬件(例如，管道或管线)。色谱系统包括一个以上泵和/或阀以自动或手动控制流体流速和压力。本发明的方法和设备的第一、第二和第三色谱系统可结合各种色谱基质，本领域技术人员知道如何根据目标蛋白质的需要按顺序选择和使用这些色谱基质。术语“基质”包括树脂、珠子、纳米颗粒、纳米纤维、水凝胶、膜(例如膜吸附器(MA))和整料或任何其他物理基质，带有相关的共价结合色谱配体(例如蛋白A、蛋白质G或其他亲和色谱配体，例如目标配体、带电部分或疏水部分等)用于本发明方法的目的。亲和目标配体所连接的基质通常是琼脂糖，但也可使用其他基质。例如，与琼脂糖相比，机械稳定的基质，例如可控的孔玻璃、甲基丙烯酸酯(例如，在AmsphereTM A3树脂中；JRS Life Sciences)或聚(苯乙烯二乙烯基)苯具有更高的稳定性、更快的流速和更短的处理时间。当蛋白质包含CH3免疫球蛋白结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。亲和色谱基质可放置或填充至用于纯化蛋白质的柱中。将无细胞细胞培养级分装载至(例如在第一色谱系统中的)亲和色谱基质优选在约中性pH下发生。
术语分子“结合”或“使结合”至蛋白A或蛋白A基质或另一种(不同的)亲和色谱基质指：在适当的条件下(例如pH和选定的盐/缓冲液组合物)，将分子暴露于与固体基质(例如树脂)共价结合的亲和色谱配体，使得目标分子凭借其在这些条件下的结合亲和力可逆地固定在亲和色谱配体之中或之上，无论可能涉及的亲和力的物理机制(参见，例如，Jendeberg，L.等，The Mechanism of Binding Staphylococcal Protein A toImmunoglobin G Does Not Involve Helix Unwinding，Biochemistry 35(1)：22-31(1996)；Nelson，J.T.等，Mechanism of Immobilized Protein A Binding toImmunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces，Anal.Chem.，87(16)：8186-8193(2015))。
术语分子“结合”或“使结合”至离子交换基质(例如，CEX基质，例如CEX树脂或膜吸附器；或AEX基质，例如AEX树脂或膜吸附器)指：在适当的条件下(例如pH和选定的盐/缓冲液组合物)，将分子暴露于离子交换基质，使得通过分子与离子交换基质的带电基团(即带电配体)之间的离子相互作用，分子被可逆地固定在离子交换基质之中或之上。
术语“上样缓冲液”或“平衡缓冲液”指与蛋白质制剂(例如，批次或灌注细胞培养物渗透物或过滤物，或含有目标蛋白质的洗脱液池)混合的缓冲液和盐，用于将蛋白质制剂装载至蛋白A基质或其他亲和色谱基质或离子交换基质(例如CEX基质或AEX基质)或疏水相互作用色谱(HIC)基质上，具体视情况而定。该缓冲液还用于在装载之前平衡色谱基质、在装载蛋白质之后进行洗涤。
在本文中，术语“洗涤缓冲液”指：在装载蛋白质制剂之后和洗脱之前或在目标蛋白质流过之后，通过蛋白A基质或其他亲和色谱基质或离子交换基质(例如CEX基质或AEX基质)或疏水相互作用色谱(HIC)基质(视情况而定)的缓冲液。洗涤缓冲液可用于去除一种以上污染物而不会大量洗脱所需蛋白质或可用于洗出非结合蛋白质。
术语“洗脱缓冲液”或“洗脱液”指用于洗脱可逆结合至基质上的目标蛋白质的缓冲液。如本文所用，术语“溶液”指缓冲溶液或非缓冲溶液，包括水。
术语“洗脱池”或“洗脱液池”指从基质中洗脱的材料，该材料包括目标重组蛋白。
对于蛋白A基质或其他亲和色谱基质或离子交换基质(例如CEX基质)或疏水相互作用色谱(HIC)基质，术语“装载”指将蛋白质制剂(例如，批次或灌注细胞培养物渗透物或过滤物，或含有目标蛋白质的洗脱液池)装载至蛋白A基质或其他亲和色谱基质或离子交换基质或HIC基质上。
对于蛋白A基质或其他亲和色谱基质或离子交换基质(例如CEX基质或AEX基质)或HIC基质，术语“洗涤”指使适当的缓冲液通过或经过蛋白A基质或离子交换基质或HIC基质或其他色谱基质，视情况而定。
术语从蛋白A基质或其他亲和色谱基质或离子交换基质(例如CEX基质或AEX基质)或HIC基质“洗脱”分子(例如所需的重组蛋白或污染物)指：从此种材料中去除分子，通常通过将洗脱缓冲液通过色谱基质。
可互换使用的术语“一次性”或“一次性使用”部件指用于本发明自动化设施或执行本发明方法的特定无菌生产线部件(即无菌设备)被构造或配置为用于单次的生产运行(但如果质量和无菌卫生可保证多次运行，则可重复使用)。然后，一次性部件可被丢弃并在随后的生产运行中由具有相同或修改配置的其他一次性部件替换，而无需在生产运行之间对部件进行清洁和消毒。可用于本发明的一次性组件的实例包括但不限于：灌注生物反应器、第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统。此类一次性组件可通过商业方式构建或获得，例如但不限于以下组件：
一次性生物反应器：
Figure BDA0003205347400000321
XDR一次性生物反应器袋(例如，500L、1000L或2000L体积；GE Healthcare Life Sciences)；BIOSTAT
Figure BDA0003205347400000322
搅拌罐一次性生物反应器系统(例如，500L至2000L体积；Sartorius Stedim Biotech)；HyPerforma一次性生物反应器(例如，50L、100L、200L、500L、1000L和2000L体积；Thermo Fisher Scientific)；AllegroTM一次性搅拌罐生物反应器(例如，500L至2000L体积；Pall)；Millipore
Figure BDA0003205347400000323
一次性生物反应器(例如，500L至2000L体积；MilliporeSigma)，50L摇摆生物反应器袋，包括但不限于Wave
Figure BDA0003205347400000324
袋(GE Healthcare Life Sciences)或RIM Bio摇臂袋；或Pall或Sartorius市售的混合袋(例如，100L、200L、650L、1000L或2000L体积)；
一次性灌注系统：Spectrum
Figure BDA0003205347400000331
中空纤维系统或Repligen交替切向流(ATF-6和10)系统；
一次性热交换器：带有Thermo ScientificTM ThermoFlexTM循环冷却器的ThermoScientificTM DHXTM热交换器和Thermo ScientificTM DHXTM袋组件；
一次性过滤器组件(filter assembly)系统，其包含过滤器(购自PMilliporeSigma或Sartorius Stedim Biotech的各种膜和孔径)、硅胶和/或c-flex管和无菌连接器(购自Pall、Colder、GE Healthcare Life Sciences、Sartorius StedimBiotech)；
使用一次性无菌连接器、硅胶和/或c-flex型管的各种尺寸、长度和配置的一次性传输管线可购自Thermo Fisher Scientific(ASI)或Advantapure；
一次性培养基组分溶液或水性稀释剂(例如缓冲液)溶液托特储存袋购自Advanced Scientifics，Inc.(ASI；Thermo Fisher Scientific)、MilliporeSigma、Sartorius或RIM Bio；
一次性病毒灭活系统：
Figure BDA0003205347400000332
病毒灭活系统歧管(Pall Life Sciences)、用于低pH病毒灭活的
Figure BDA0003205347400000333
(“VI”；Sartorius)；一次性色谱系统：CadenceTM
Figure BDA0003205347400000334
PD(Pall Life Sciences)；AllegroTM一次性色谱法(Pall Biotech)；
Figure BDA0003205347400000335
FlexReady色谱(MilliporeSigma)；
Figure BDA0003205347400000336
即用型一次性色谱(GE Healthcare Life Sciences)；或
Figure BDA0003205347400000337
IEX膜吸附器(Sartorius Stedim Biotech)；
一次性病毒过滤系统：AllegroTM MVP一次性系统歧管(Pall Biotech)；用于病毒过滤的
Figure BDA0003205347400000338
FlexReady(MilliporeSigma)；用于病毒过滤的
Figure BDA0003205347400000339
(Sartorius)、PlanovaTM一次性病毒过滤(SU-VFS；Asahi Kasei Bioprocess America，Inc.)或
Figure BDA00032053474000003310
Pro病毒过滤(MilliporeSigma)；
一次性UF/DF系统：AllegroTM一次性切向流过滤系统(Pall Biotech)；
Figure BDA00032053474000003311
FlexReady TFF系统(MilliporeSigma)；用于UF/DF的
Figure BDA00032053474000003312
(Sartorius)；
Figure BDA00032053474000003313
Readyflux一次性过滤(GE Healthcare Life Sciences)；以及
一次性无菌连接器：
Figure BDA00032053474000003314
连接器(Colder Products Company)、
Figure BDA00032053474000003315
Presto无菌连接器(Pall Biotech)；
Figure BDA00032053474000003316
ST连接器(MilliporeSigma)。
可互换使用的术语“过滤器组”或“过滤器组件系统”指包括多个过滤器组件的装置，其中每个过滤器组件包括至少一个过滤器。包含在过滤器组件中的过滤器可以为一次性过滤器且在一段时间和/或使用一定量后更换。过滤器组可以为便携式设备。例如，过滤器组可设置在过滤推车上，其可移动至自动化设备中的不同位置。过滤器组中包括的过滤器可包括过滤系统，该过滤系统包括深度过滤器、0.2μm过滤器、膜过滤器、20纳米(nm)过滤器、病毒过滤装置、超滤装置、渗滤装置或它们的组合。过滤器组可被配置为使得当材料流过过滤器组的至少一个过滤器时，过滤器组的另一个过滤器保持未使用。在各种实施方式中，过滤器组可连接至分流阀或其他流速控制装置，控制材料流向包括在过滤器组中的过滤器。分流阀或流速控制装置可气动控制。
上述仅仅是示例性的，而不是本发明的技术人员可用的一次性系统和连接器的详尽列表。
目标蛋白质
使用本发明制造的目标蛋白质可以为任何工业或医学上有用的蛋白质，例如但不限于药理学活性蛋白质或肽。
例如，目标蛋白质可以为模拟肽或激动剂肽。术语“模拟肽”、“肽模拟物”和“激动剂肽”指具有与天然存在的目标蛋白质相当的生物活性的肽或蛋白质。这些术语还包括通过例如增强天然存在的分子的作用间接模拟天然存在的肽分子的活性的肽。
目标蛋白质可以为拮抗肽或抑制肽。术语“拮抗剂肽”、“肽拮抗剂”和“抑制剂肽”指：阻断或以某种方式干扰目标受体的生物活性的肽或蛋白质，或具有与已知的目标受体(例如但不限于离子通道或G蛋白偶联受体(GPCR))拮抗剂或抑制剂相当的生物活性的肽或蛋白质。
可用本发明制造的药理活性蛋白的实例包括但不限于：IL-6结合肽、CD3结合蛋白、CD19结合蛋白、CD20结合蛋白、CD22结合蛋白、HER2结合蛋白、HER3结合蛋白、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)结合蛋白、TNF-α结合蛋白、EGFR结合蛋白、RANK配体结合蛋白、IL-1α结合蛋白，IL-1β结合蛋白、IL-17A结合蛋白、EPCAM(CD326)结合蛋白、CGRP肽拮抗剂、缓激肽B1受体肽拮抗剂、毒素肽、胎盘生长因子(PIGF)结合蛋白、甲状旁腺激素(PTH)激动剂肽、甲状旁腺激素(PTH)拮抗剂肽、ang-1结合肽、ang-2结合肽、肌生长抑制素结合肽、促红细胞生成素模拟(EPO-模拟)肽、FGF21肽，一种血小板生成素模拟物(TPO模拟物)肽(例如AMP2或AMPS)、神经生长因子(NGF)结合肽、B细胞激活因子(BAFF)结合肽和胰高血糖素样肽(GLP)-1或其肽模拟物或GLP-2或其肽模拟物。
蛋白质和此类蛋白质的编码序列(其中一些已获得监管批准)是本领域公知的。然而，本发明也可应用于尚未通过药物发现、研发和临床试验方法创新的药物的制造。
克隆DNA
DNA的克隆使用标准技术进行(参见，例如，Sambrook等(1989)，MolecularCloning：A Laboratory Guide，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press，其通过引用并入本文)。例如，可通过polyA+mRNA、优选膜相关mRNA的逆转录来构建cDNA文库，使用对人免疫球蛋白多肽基因序列特异的探针来筛选文库。然而，在一个实施方式中，使用聚合酶链反应(PCR)扩增编码目标免疫球蛋白基因片段(例如轻链或重链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的部分)。扩增的序列可容易地克隆至任何合适的载体中，例如表达载体、小基因载体或噬菌体展示载体。应理解，所用的具体克隆方法并不重要，只要能够确定目标蛋白质的某些部分的序列即可。
抗体核酸的一种来源为杂交瘤，其通过从用目标抗原免疫的动物获得B细胞并将其与永生细胞融合而产生。或者，可从免疫动物的B细胞(或整个脾脏)中分离核酸。编码抗体的核酸的另一种来源为通过例如噬菌体展示技术产生的此类核酸的文库。编码目标肽的多核苷酸(例如具有所需结合特性的可变区肽)可通过标准技术例如淘洗(panning)来鉴定。
使用标准技术进行DNA测序(参见，例如Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：ALaboratory Guide，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press；和Sanger，F.等(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467，其通过引用并入本文)。通过将克隆核酸的序列与公开的基因和cDNA序列进行比较，技术人员将能够根据测序的区域轻松确定。基因序列信息的一种来源是美国国立卫生研究院(马里兰州贝塞斯达)国家医学图书馆国家生物技术信息中心。例如，基因测序也可通过标准方法或在转染前通过工程化DNA构建体的所谓“下一代”测序来完成(参见，例如，Buerans，H.P.J.&den Dunnen，J.T.，Next generationsequencing technology:Advances and applications，Biochimica et BiophysicaActa-Molecular Basis of Disease 1842(10)：1932-1941(2014))。
通过限制性消化和连接片段的5'和3'末端或整个开放阅读框(ORF)(其包含通过限制酶消化产生的核苷酸突出端并且与目的载体相容)，可将包含反映所需蛋白质变化的密码子的部分或全部编码区的化学合成克隆到表达载体中。通常使用T4连接酶或其他常见酶将片段或插入片段连接至目标载体中。其他有用的方法与上述类似，只是限制酶的切割位点与识别序列的位置不同。或者，可采用等温拼接(即“Gibson Assembly”)，其中，在片段或ORF的合成过程中产生核苷酸突出端；采用外切核酸酶消化。或者，核苷酸突出端可通过连接酶或聚合酶离体连接，或通过细胞内过程在体内连接。
或者，可使用同源重组(类似于等温拼接)，不同之处在于T4 DNA连接酶的外切核酸酶活性可用于插入物和载体且连接可在体内进行。
另一种有用的克隆方法是所谓的“TOPO”方法，其中，存在包含3'腺苷突出端(由Taq聚合酶产生)的完整插入片段，拓扑异构酶I将插入片段连接至TOPO载体中。
另一种有用的克隆方法是利用简并引物和/或由聚合酶在某些反应条件下引起的热稳定低保真聚合酶的简并或易错PCR。然后将片段或插入片段克隆至表达载体中。
以上仅仅是已知克隆技术的实例，本领域技术人员知道如何使用任何其他合适的克隆技术。
分离的DNA可与控制序列可操作地连接或置于表达载体中，然后将其转染至否则不产生免疫球蛋白的宿主细胞中，以指导重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。抗体的重组生产是本领域公知的。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸被可操作地连接。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接意味着被连接的DNA序列是连续的，在分泌前导序列的情况下，被连接的DNA序列是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点连接来完成。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配子或接头。
许多载体是本领域已知的。载体成分可包括以下一种以上：信号序列(例如，其可指导重组宿主细胞分泌表达的蛋白质)；复制起点、一个以上选择性标记基因(例如，其可能赋予抗生素或其他药物抗性、补足营养缺陷或提供培养基中没有的关键营养物)、增强子元件、启动子和转录终止序列，所有这些均是本领域公知的。
蛋白质表达
用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于蛋白质药物)的本发明方法涉及培养分泌蛋白质的哺乳动物细胞。此种培养的哺乳动物细胞通常通过涉及瞬时或稳定转染的重组DNA技术来制造，例如，来自克隆步骤的混合质粒构建体(表达载体)可转染至多个宿主细胞(例如哺乳动物，例如HEK 293或CHO、细菌、昆虫、酵母细胞)中，以使用阳离子脂质、聚乙烯亚胺、LipofectamineTM TM或ExpiFectamineTM或电穿孔进行表达。技术人员知道许多合适的转染方法以实现重组抗体的表达。或者，可采用稳定基因组整合编码目标蛋白质的表达盒的方法来制备分泌蛋白质的哺乳动物细胞的生产细胞系(参见，例如，Zhang，Crispr-Cas Systems and Methods for Altering Expression Of Gene Products，WO2014093661A2；Frendewey等，Methods and Compositions for the TargetedModification of a Genome，US9228208B2；Church等，Multiplex Automated GenomeEngineering，WO2008052101A2，US8153432B2；Bradley等，Methods Cells and Organisms，US2015/0079680A1；Begemann等，Compositions and Methods for Modifying Genomes，WO2017141173A2；Gill等，Nucleic acid-guided nucleases，US9982279 B1；Minshull等，Enhanced nucleic acid constructs for eukaryotic gene expression，US9428767B2，US9580697B2，US9574209B2；Minshull等，DNA Vectors,Transposons And TransposasesFor Eukaryotic Genome Modification，US10041077B2)。
可选地，将向转染子或转化细胞提供用于选择标记的重组表达盒，例如但不限于以下中的一种以上：谷氨酰胺合酶、二氢叶酸还原酶、嘌呤霉素-N乙酰转移酶、杀稻瘟菌素-S脱氨酶、潮霉素磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、诺丝菌素(nourseothircin)N-乙酰转移酶或与博来霉素(zeocin)结合的蛋白质。
目标蛋白质通常通过在允许细胞表达重组蛋白质的生理条件下培养转染或转化的宿主细胞来获得。最方便的是，将表达的重组蛋白直接分泌到细胞外培养基中(通过使用适当的分泌引导信号肽)并从中收获；否则将需要额外的步骤来从细胞提取物中分离表达的抗体。
重组表达的所需规模将取决于表达系统的类型和蛋白质生产的所需数量。与一些早期的HEK293技术相比，某些表达系统(例如ExpiCHOTM)通常会产生更高的产量。与HEK293系统相比，较小规模的ExpiCHOTM可能就足够了。在选择合适的表达系统时，转染效率也是一个考虑因素。考虑到电穿孔的有效性、相对较低的成本以及该步骤中的高生产量并不重要这一事实，电穿孔可以是合适的方法。此外，免疫球蛋白轻链与重链的比例可在共转染过程中改变以提高某些变体的表达。给定变体的产物产量必须足以承受多次处理步骤，产生足够高的信号以被所选荧光检测器检测到。
通常，转染或转化的宿主细胞通常通过任何类型的常规培养进行培养，例如分批、补料分批、强化补料分批(intensified fed-batch)或连续。合适的连续培养包括保留产品和细胞或仅保留细胞的重复分批、恒化器(chemostat)、恒浊器(turbidostat)或灌注培养。然而，出于本发明的目的，在一个以上一次性灌注生物反应器中进行培养，视需要每个灌注生物反应器可含有约50L至约4000L(例如，50L、60L、75L、100L、250L、500L、650L、750L、1000L、1250L、1500L、1750L、2000L、2250L、2500L、2750L，3000L、3250L、3500L、3750L或4000L)体积的液体培养基。用于培养细胞的一次性生物反应器的数量是1个、2个、3个、4个、5个或6个所需体积的一次性灌注生物反应器。
可在多种培养基中培养用于产生本发明中目标蛋白质或“POI”(例如非糖基化或糖基化蛋白质)的宿主细胞。诸如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜氏改良Eagle培养基(DMEM)(Sigma)的市售培养基均适合培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO90103430；WO 87/00195；或美国专利号30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种均可视需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素TM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源，使得培养基中或培养基上细胞的生理条件促进宿主细胞表达目标蛋白质；也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。
预定培养条件，例如温度(对于哺乳动物细胞，通常但不一定为约37℃±1℃)，pH(细胞培养基通常但不一定保持在约pH 6.5-7.5)、氧化等，对于普通技术人员而言将是显而易见的。在预定培养条件下“培养”或“维持”指将过程控制系统设置为该条件的特定值，换言之，将预期体积、目标温度、pH、氧化水平等保持在每个参数的预定设定点，在最适合细胞系和目标蛋白质产物的狭窄范围内(即“窄死区(narrow deadband)”)。显然，温度、pH值或其他培养条件会随时间推移和培养容器(即生物反应器)中的位置而发生微小变化(也参见，例如，Oguchi等，pH Condition in temperature shift cultivation enhances celllongevity and specific hMab productivity in CHO culture，Cytotechnology.52(3)：199-207(2006)；Al-Fageeh等，The cold-shock response in cultured mammaliancells:Harnessing the response for the improvement of recombinant proteinproduction，Biotechnol.Bioeng.93：829-835(2006)；Marchant，R.J.等，Metabolicrates,growth phase,and mRNA levels influence cell-specific antibodyproduction levels from in vitro cultured mammalian cells at sub-physiologicaltemperatures，Mol.Biotechnol.39：69-77(2008))。
数字控制单元和传感监测器可商购或可由技术人员构建。替代数字控制单元(DCU)控制和监测细胞培养过程可商购，由B.Braun、New Brunswick、Sartorius或ThermoFisher Scientific等公司制造。表1A(下方)列出了一些可用于监测细胞培养条件的数字控制和传感设备实例。其他在线或离线分析可包括通过质谱法进行的废气测量、培养基成分(氨基酸、维生素、微量矿物质)的深入测定以及除CO2和乳酸之外的细胞代谢物的扩展检查。
表1A：市售细胞培养控制和传感设备的实例。
Figure BDA0003205347400000391
培养基可包括合适量的血清，例如胎牛血清(FBS)，或者优选地，宿主细胞可适用于在无血清培养基中培养。在一些实施方式中，水性培养基为液体，使得宿主细胞在液体培养基内的细胞悬浮液中培养。宿主细胞可在连续(灌注)细胞培养系统(优选设计为一次性)中有效生长。
根据本发明，新鲜培养基由多种浓缩组分溶液和水性稀释剂同时进行混合。细胞培养基是复杂的混合物，其包含较宽范围浓度的各个成分和成分彼此间的独特比例。任何细胞培养基制剂可被浓缩的因素受其最难溶、最不稳定或最难过滤的组分的溶解度、稳定性或过滤性限制。通过将组分溶解为化学相容的亚组，可获得增加的浓缩系数，如果将所有组分一起溶解则难以实现。例如，某些组分在酸性pH值下更易溶解，而其他组分在碱性pH值下更易溶解。在这个实例中，在酸性pH下可溶的组分可组合在一个溶液中，而在碱性pH下可溶的组分可在另一种溶液中组合在一起，这样当它们重新组合时，它们就形成了一个完整的培养基。除了或代替pH分组以获得更高的浓度，还可使用其他溶剂，例如酒精或二甲亚砜(DMSO)；或者，可制备具有特殊溶解度或储存要求的单个组分的储备溶液，这些组分在将它们添加至生物反应器之前必须与其他组分分开。本领域技术人员很容易确定任何给定细胞培养基配方的相容组分的确切分组及其和最大浓度。
通常，可以使用的活细胞密度为约1.0×106至约2×108个细胞/mL，例如，1.0×106个细胞/mL至2.0×107个细胞/mL，或约4×107个细胞/mL至约5×107个细胞/mL，或约1×108个细胞/mL至约2×108个细胞/mL。已知向优选范围的较高端增加细胞浓度可提高体积产率。然而，设想了包括任何上述点值作为范围的下限或上限的细胞密度范围。重组表达和细胞培养的所需规模将取决于表达系统的类型和所需药物的数量。
为了要求保护的发明的目的，在培养转染或转化的宿主细胞后，重组多肽或蛋白质被直接分泌至培养基中。收获重组蛋白涉及将其与颗粒物质(可包括宿主细胞、细胞聚集体和/或裂解的细胞碎片)分离，形成不含宿主细胞和细胞碎片的无细胞部分，即无细胞“渗透物”。例如，通过离心和/或微滤从条件培养基中去除此类细胞和细胞碎片。例如，为获得渗透物，可使用中空纤维膜(孔径0.2μm)或一系列过滤步骤(例如深度过滤)，这些步骤可配置在移动、可互换和/或一次性“过滤推车”上。
本发明的一些实施方式具有第一一次性缓冲容器(SUSV1)，其适用于接收从灌注生物反应器中移除的一定体积的渗透物；一定体积的渗透物是无细胞的。这些渗透物体积从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至SUV1。在一些实施方式中，存在自动化控制器，其包括检测器(测量SUSV1中的流体体积)和处理器(改变第一色谱系统的泵速以维持SUSV1中的预设体积范围)。
在本发明的一些实施方式中，用于实施该方法的设备还包括中空纤维膜、一系列深度过滤器或过滤推车，以使渗透物在自动且流体地输送至SUSV1之前不含细胞。
蛋白质纯化和病毒灭活
通常，蛋白质(例如重组或天然存在的蛋白质)的纯化通常通过一系列可选的色谱步骤完成，例如阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、亲和色谱(使用蛋白A或蛋白质G或蛋白质L作为亲和配体或另一种不同的亲和配体)、疏水相互作用色谱(HIC)、羟基磷灰石色谱、反相HPLC和尺寸排阻色谱。前述为可包括在第一色谱系统、第二色谱系统和/或第三色谱系统中的任一个中的色谱模式的非限制性实例。第一色谱系统、第二色谱系统或第三色谱系统中的每一个可根据目标蛋白质的需要进行配置，优选具有连续流体连接的1个、2个、3个或更多个不同的色谱基质(例如色谱柱)，可选地可以布置在移动、可互换或用完即弃、一次性单元、滑架或“手推车”中。此外，纯化方法可包括一个以上超滤、纳滤或渗滤步骤。
取决于待回收的蛋白质，还可具有其他可选的用于蛋白质纯化的已知技术，例如乙醇沉淀、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在用于生产纯化的目标蛋白质(例如蛋白药物)的本发明方法中，无细胞渗透物中的目标蛋白质(例如但不限于蛋白药物)被可部分纯化和/或浓缩蛋白质的第一色谱系统的一个以上色谱捕获步骤捕获，该色谱步骤例如但不限于蛋白A或蛋白G或蛋白L亲和色谱或使用不同的亲和配体共价结合到固体基质上的亲和色谱(参见，例如，Frank，M.B.，“Antibody Binding to Protein A and Protein G beads”，来自：Frank，M.B.主编，Molecular Biology Protocols，Oklahoma City(1997))。第一色谱系统可以可选地包括：阴离子交换色谱(AEX)、阳离子交换色谱(CEX)、亲和色谱(使用蛋白A或蛋白G或蛋白L作为亲和配体或另一特定目标部分)、疏水相互作用色谱(HIC)、羟基磷灰石(HA)色谱和尺寸排阻色谱(SEC)。在涉及位于上游且流体连接至第一色谱系统的缓冲容器(例如第一一次性缓冲容器(SUSV1))的一些实施方式中，存在自动化控制器，其包括：检测器，用于测量缓冲容器(例如SUSV1)中的流体体积；以及处理器，用于改变第一色谱系统的泵速以维持缓冲容器(例如SUSV1)中的预设体积范围。SUSV1的体积通常为约200L，但可根据方法的流速和所需停留时间(其影响允许对方法扰动做出反应的时间范围)设置为更小或更大。操作第一色谱系统，将目标蛋白质收集或捕获在蛋白质分离物级分中。
根据目标蛋白质的需要，将第一色谱系统、第二色谱系统和/或可选的第三色谱系统优选配置为具有连续流体连接的1个、2个或3个或更多个不同色谱基质(例如色谱柱)，可选地，它们可以布置在移动、可互换或用完即弃、一次性单元、滑架或“手推车”中。
在本发明的一些实施方式中，第二色谱系统具有一次性膜吸附器(MA)，例如表面官能化膜。此类膜吸附器可包含阴离子交换基团，用于负模式下的mAb精制操作，去除痕量杂质而不结合目标蛋白质(所谓的“流通色谱”)。实例包括但不限于：
Figure BDA0003205347400000411
Q或Sartobind
Figure BDA0003205347400000412
(Sartorius Stedim Biotech)或
Figure BDA0003205347400000413
Q(Pall Life Sciences)或
Figure BDA0003205347400000414
HD-Q(Natrix Separations)。或者，膜吸附器可包含阳离子交换基团，例如
Figure BDA0003205347400000415
S(Sartorius Stedim Biotech)或
Figure BDA0003205347400000416
S(Pall Life Sciences)或
Figure BDA0003205347400000417
HD-Sb(Natrix Separations)。在一些实施方式中，具有其他官能团的膜可用于进行疏水相互作用色谱(HIC)。
本发明方法(和自动化设备)的实施方式随后涉及将从第一色谱系统获得或收集的蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和中和系统(即，如果在低pH灭活病毒后需要中和)，得到包含目标蛋白质(例如但不限于蛋白质药物)的病毒灭活的产物池。不过，可选地，在将蛋白质分离物级分流体输送至低pH或去污剂病毒灭活系统之前，可将蛋白质分离物级分从第一色谱系统流体输送至：
(i)第二一次性缓冲容器；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)。
(i)一次性缓冲容器或(ii)SUCV1和SUCV2适用于接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分并将所述蛋白质分离物级分流体输送至低pH或去污剂病毒灭活系统。
在一个替代实施方式中，低pH值或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统(即，如果在低pH值灭活病毒后需要中和)包括：
(i)(第三)一次性缓冲容器；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)。
(i)一次性缓冲容器或(ii)SUCV1和SUCV2包含在低pH值或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统中，其适用于接收来自第一次色谱系统的蛋白质分离物级分。
SUSV2以及SUCV1和SUCV2的体积通常分别为约100L，但是根据进一步处理池的频率，这可变得更小或更大。例如，对于约20-25L的洗脱池，50L容器有效地用作SUCV1和SUCV2。在使用低pH病毒灭活系统后，需要中和系统将溶液中的分离蛋白恢复至约中性pH值。术语“低pH”指约pH 3.7以下的pH值，在该pH值下保持蛋白质分离物级分(通常至少30至90分钟)以灭活任何污染病毒颗粒(参见，例如，Chinniah，S.等，Characterization ofoperating parameters for XMuLV inactivation by low pH treatment，BiotechnolProg.32(1)：89-97(2016)。如果使用去污剂(例如Triton-X-100和/或磷酸三(正丁基)酯(“TNBP”))病毒灭活系统，则通常不需要通过中和系统处理蛋白质分离物级分，除非使用低于中性的pH条件，其会干扰病毒灭活产物池的进一步有效纯化或稳定储存(参见，例如，Dichtelmüller等，Effective virus inactivation and removal by steps of BiotestPharmaceuticals，Results in Immunology 2：19-24(2012)；Ellgard等，Evaluation ofthe virus clearance capacity and robustness of the manufacturing process forthe recombinant factor VIII protein，turoctocog alfa IGIV production process，Protein Expression and Purification 129：94-100(2017))。
随后将所得病毒灭活产物池引入温度受控或冷却的储存容器(HV1)中的第二色谱系统(在一些实施方式中，在储存至少10天或至少20天或至少30天之后)，得到包含目标蛋白质的纯化产物池。视需要配置第二色谱系统以进一步纯化目标蛋白质，优选具有连续流体连接的1种、2种或3种或更多种不同的色谱基质(例如色谱柱)，可选地，其可布置在移动、可互换或用完即弃、一次性单元、滑架或“手推车”中。
根据关于培养和病毒灭活步骤的协调时间表，可选地控制将病毒灭活产物池引入第二色谱系统。计算协调时间表以最大化将病毒灭活产物池送至第二色谱系统的有效路径。根据协调时间表，通过自动(连续形式)或分批手动控制(半连续形式)将病毒灭活产物池送至第二色谱系统(参见Garcia，FA和Vandiver，MW，Throughput Optimization ofContinuous Biopharmaceutical Manufacturing Facilities，PDA J Pharm Sci Technol71(3)：189-205(2017))。
从第二色谱系统得到的包含目标蛋白质的纯化产物池被流体转移到可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物。通过自动或手动控制将纯化产物池转移至可选的色谱系统和/或病毒过滤系统。根据进一步纯化目标蛋白质的需要，将可选的第三色谱系统配置为优选具有连续流体连接的1种、2种或3种更多种不同的色谱基质(例如色谱柱)，可选地，其可布置在移动、可互换或用完即弃、一次性装置、滑架或“手推车”中。如果在本发明的方法(或设备)中不使用第三色谱系统，则将纯化产物池直接转移并流体地流向病毒过滤系统。可用的病毒系统可商购，包括一次性病毒过滤系统。
随后将所得的无病毒过滤物流体地转移至超滤/渗滤系统中，得到包含纯化的目标蛋白质(例如纯化的蛋白质药物)的组合物。通过自动或手动控制将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统。
超滤/渗滤系统的有用实例包括超滤盒，例如但不限于
Figure BDA0003205347400000431
3Ultracel30-kDa膜(Millipore Sigma)；
Figure BDA0003205347400000432
ECO
Figure BDA0003205347400000433
30-kDa再生纤维素膜(Sartorius)；Delta30-kDa再生纤维素膜(Pall Biotech)等。
在该方法结束时，纯化的蛋白质(例如蛋白质药物)可储存在无菌容器中，例如但不限于一次性无菌容器(例如，
Figure BDA0003205347400000434
系统、Sartorius)、即用型大瓶，或可直接加工成药品。
在本发明方法(和自动化设备)的一些实施方式中，第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统中的一个以上包括一次性组件。采用一次性组件提高了实施本发明方法的效率、安全性并降低了最终成本。
此外，在多个一次性灌注生物反应器用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于纯化的蛋白质药物)的设备中的情况下，可针对每个生物反应器执行多个操作同时进行。例如，当对从第一灌注生物反应器产生的无病毒过滤物进行超滤/渗滤操作时，可对病毒灭活系统(和中和系统，视需要)产生的病毒灭活产物池进行色谱操作，病毒灭活系统(和中和系统，视需要)处理在第二一次性灌注生物反应器中培养的无细胞渗透液的第一色谱系统处理后收到的蛋白质分离物级分。在另一个实例中，当对通过本发明的方法最终在第一一次性灌注生物反应器中培养产生的无病毒过滤物进行超滤/渗滤操作时，可对病毒过滤操作进行病毒过滤操作。通过在第二灌注生物反应器中培养，最终通过本发明的方法产生的灭活产物池。在其他实施方式中，根据本发明的方法，对由第一灌注生物反应器产生的无病毒滤液进行的至少一个色谱过程和/或病毒过滤过程可在对由第二一次性生物反应器产生的无细胞渗透体积进行的连续色谱捕获或病毒灭活过程期间进行。
水和其他成分的纯度。在本发明方法的步骤中用于表达、纯化和制备纯化的药物的制剂的水和所有其他成分具有满足相关司法管辖区内此类药物组合物和药物所需的适用法律或药典标准的纯度水平，例如美国药典(USP)、欧洲药典、日本药典或中国药典等。例如，根据USP，注射用水用作必须控制产品内毒素含量的注射剂和其他制剂的生产以及其他药物应用(例如清洁某些设备和肠胃外产品接触部件)中的赋形剂；用于产生注射用水的源水或给水的最低质量是美国环境保护署(EPA)、欧盟、日本或世界卫生组织定义的饮用水。
自动化和控制系统
传统的生产设备控制系统通常被设计成控制设备的预设配置。在这些场景中，设备之间的逻辑和硬件连接不会改变。因此，可针对每件设备执行的标识符(identifier)和控制操作是静态的。关于用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于蛋白质药物)的本发明的自动化设备和方法，本文所述生产设备控制系统的实施支持生产线中设备的可变配置。在这些情况下，一台设备可具有不同的功能、执行不同的操作和/或基于该设备在生产线上的位置使用不同的控制命令和/或变量集进行控制。因此，本文所述生产线和控制系统包括不同于常规系统的软件配置和物理硬件。使用同一组控制模块在生产线上配置不同设备的自动化设备内配置生产线的能力可实现所谓的“FlexTrain”自动化。
本文描述的实施可由一个以上系统执行，该系统可自动控制材料流过该方法的每个步骤以产生目标蛋白质(例如但不限于蛋白质药物)。或者，至少一部分控制功能可通过操作员干预来执行，可能存在可能需要操作员干预的情况(特别是方法中断)。控制功能可使用从传感器获得的过程数据来执行，这些传感器与用于生产纯化的目标蛋白质的各种设备相连。传感器可包括温度传感器、pH传感器、流速传感器、重量传感器(例如，称重传感器)、体积传感器(例如导波雷达传感器)、压力传感器、定时器、电容传感器、光密度传感器或它们的组合。传感器产生的数据可由设备在本地收集。在某些实施方式中，设备可将传感器数据转发至生产设备控制系统。生产设备控制系统可从用于制造目标纯化蛋白质(例如纯化蛋白质药物)的许多设备的传感器收集数据。生产设备控制系统可包括彼此电子通信的一个以上计算设备和/或一个以上数据存贮存器。在一些场景中，一个以上计算设备和/或一个以上数据存储的至少一部分可位于相同位置。此外，一个以上计算设备和/或一个以上数据存储的至少一部分可远离生产设备中包括的设备。在此种情况下，由生产设备控制系统执行的至少一部分操作可在云计算架构中实现。
从传感器收集的数据可存储在电子数据存储中，这里可称为“数据历史记录器”。在各种实施方式中，第一数据历史记录器可收集和存储在纯化蛋白质生产设备中操作的设备的至少一个子集的数据(例如，用于生产纯化的蛋白质药物或其他目标蛋白质)。第一历史数据库可将数据存储一段时间，然后将数据转发至第二数据历史数据库，第二数据历史数据库是收集的关于与生产设备控制系统连接的设备的操作的数据的储存库。DeltaV历史记录器和/或Pi历史记录器是蛋白质原料药的商业制造工厂中常用的冗余数据历史记录系统的实例。在某些情况下，然后可重置第一数据历史记录器并开始收集和存储来自纯化蛋白质生产设备的额外数据(例如用于生产纯化的蛋白质药物)一段额外的时间。生产设备控制系统还可包括一个以上批次的历史记录器，其收集和存储与生产设备中包括的用于生产特定批次的目的纯化蛋白质的设备的操作相关的数据(例如但不限于一种蛋白质药物)。数据历史记录器可被生产设备控制系统访问并且被分析以确定用于包括在生产设备控制系统的控制下的设备的操作的参数。
生产设备控制系统可分析从传感器获得的数据并且确定一个以上设备的操作条件。在一些情况下，操作员可将设定点和可接受的操作参数和/或用于操作一件设备的运行配方输入至系统中。在其他情况下，用于操作一台设备的设定点和可接受的操作参数和/或运行配方可自动发送至纯化蛋白质生产线中使用的一台以上设备(例如用于生产纯化的
蛋白质药物)。还可根据传感器数据生成预警和警报通知。例如，在传感器数据表明纯化蛋白质生产线中某台设备的操作条件超出阈值范围的情况下，系统可触发警报并向操作员发送通知。
用于生产纯化的目标蛋白质(例如纯化蛋白质药物)的各种设备可包括一个以上通信接口，其能够实现设备之间和/或与生产设备控制系统的通信。在一些实施方式中，生产设备控制系统可作为过程自动化系统(PAS)运行。通信接口可包括硬件设备、固件设备和/或软件实现的系统，其能够在纯化蛋白质生产线中使用的设备之间和/或与生产设备控制系统之间进行数据通信。通信接口可实现在多个网络上的数据通信，例如局域网有线网络、局域网无线网络、广域无线网络和/或广域有线网络。在特定实例中，通信接口可包括以太网网络通信接口、互联网协议网络通信接口、电气和电子工程师协会(IEEE)802.11无线网络通信接口、蓝牙通信接口或它们的组合。
用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于蛋白质药物)的设备可包括一个以上处理器和一个以上存储装置。一个以上处理器可以为中央处理单元，例如执行计算系统操作所需的算术和逻辑运算的标准可编程处理器。一个以上存贮存器设备可包括以任何类型的技术实现的易失性和非易失性存贮存器和/或可移动和不可移动培养基，用于存储信息，例如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据。此类计算机可读存储培养基可包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储技术、CD-ROM、数字多功能磁盘(DVD)或其他光存储、磁带、磁带、固态状态存储、磁盘存储、RAID存储系统、存储阵列、网络附加存储、存储区域网络、云存储、可移动存储培养基或任何其他可用于存储所需信息并可由生产人员访问的生产设备控制系统或纯化蛋白质生产线中包含的单独设备。
根据本发明的用于生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于蛋白质药物)的自动化设备和方法，纯化蛋白质生产线中包括的设备的至少一部分和生产设备控制系统可存储一个以上模块，这些模块可被执行，控制纯化蛋白质生产线中的设备的运行。模块可包括计算机可读指令，该指令可被执行以使包括在纯化蛋白质生产线中的设备采取一个以上动作。模块可以为框架的一部分，该框架使包括在纯化蛋白质生产线中的设备能够以连续或半连续方式生产纯化的蛋白质(例如，纯化的蛋白质药物)。纯化蛋白生产线中包括的各种设备执行的操作可能与启动过程、保持过程、关闭过程、进料过程或生产过程结束有关。
在特定实施方式中，本文所述的控制系统可用于控制具有灵活配置的生产线。换言之，这里描述的控制系统可适应多种配置，这些配置利用可连接至生产线的其他部件的便携式设备。在各种实施方式中，生产线可包括一个以上滑架，该滑架包括原始制造商的设备，例如一次性生物反应器系统、灌注系统或连续色谱系统。滑架还可包括流速控制装置，例如泵。此外，滑架可包括一个以上通信接口，在本文中也称为“分路(drop)”，其能够将便携式设备物理连接至滑架。便携式设备和滑架之间的物理连接可使用电缆实现。可配置电缆以启用以太网通信。在某些实例中，电缆可以为推荐的标准232(RS-232)电缆。
便携式设备可包括或以其他方式连接至网络网关硬件设备，该硬件设备能够在相应的便携式设备和生产设备控制系统之间进行通信。用于每个便携式设备的网络网关硬件设备可连接至相应滑架的通信接口。此外，至少一些滑架可在逻辑上被配置为连接至各种便携式设备。以此方式，可基于特定生产线的配置将多个便携式设备物理连接至特定滑架，可将滑架配置为基于连接至滑架的不同设备以不同配置操作。
此外，便携式设备可连接至至少一个信息通信和/或存储设备，例如加密锁。信息通信和/或存储设备可存储提供给与其连接的相应设备的信息，该信息能够通过生产设备控制系统控制相应设备。信息通信和/或存储设备可存储信息，该信息包括相应设备的一个以上标识符、相应设备的一个以上功能、对应于相应设备的一个以上控制信号、一个以上与相应设备或它们的组合相关的更多状态标志。在一些实例中，由信息通信和/或存储设备存储的数据可至少部分地基于相应设备的功能或类型。在便携式设备沿生产线放置在不同位置和/或具有不同功能的情况下，便携式设备的信息通信和/或存储设备可转移至附加信息通信和/或指示便携式设备的不同功能和不同标识符的存储设备。
此外，本文所述的控制系统可包括附加的逻辑层，其可在常规控制软件和系统之上使用。在特定实施方式中，本文描述的控制系统可包括额外的抽象层，该抽象层能够将便携式设备分配给对应于指定的各种标识符、标签、操作条件和标志，也称为“绑定”生产线特定位置的特定设备的一组功能。以此种方式，在知道该设备的位置和功能之前，该设备不会被逻辑地表示在控制系统中。因此，便携式设备可以多种组合方式与滑架连接，而无需改变用于控制滑架组件并控制便携式设备的底层控制软件。
在说明性实例中，根据本发明的用于制造目标纯化蛋白质(例如但不限于纯化蛋白质药物)的自动化设备的生产线可包括第一滑架、第二滑架和第三滑架，第一滑架包括一次性生物反应器系统、第二滑架包括灌注系统，第三滑架包括连续的第一色谱系统。滑架可配置为连接至多个便携式设备。例如，滑架可包括接口和物理硬件，以连接至便携式混合罐、过滤器组、储存容器、缓冲容器、储存容器、分流阀系统(用于转移可自动切换的交替双流路或多流路单元操作，例如SUCV1和SUCV2)和/或其他流速控制设备。一些混合罐(或可互换地称为“混合容器”)或储存容器可用作进料罐或收集容器，它们可在连续或半连续形式的制造方法中用作缓冲容器，或在连续或半连续形式的制造方法中用作储存容器。
在将一台便携式设备连接至滑架之后，该台便携式设备可向生产设备控制系统注册。便携式设备可具有唯一地址，便携式设备可与生产设备控制系统通信。唯一地址可向生产设备控制系统指示一台便携式设备的类型和单元标识符。连接至该台便携式设备的加密锁可存储附加标识符，该附加标识符对应于该台便携式设备所连接至的滑架的位置以及该台便携式设备的一个以上功能角色。例如，基于便携式设备的位置和便携式设备所连接的分路的逻辑关联，混合罐可被识别为进料罐或收集罐。在另一个实例中，过滤器组可在生产线的第一配置中被识别为病毒过滤装置，然后在生产线的第二配置中被识别为渗滤装置。在这些情况下，第一加密锁可在生产线的第一配置中连接至过滤器组，第二加密锁可在生产线的第二配置中连接至过滤器组。此外，当过滤器组用于生产线的不同位置时，过滤器组中使用的过滤器类型可改变。
响应于在连接至滑架之后从便携式设备获得信息，生产设备控制系统可确定便携式设备的位置和功能，将相应的控制模板分配给便携式设备。例如，在混合罐用作收集罐的情况下，生产设备控制系统可将第一组标签、标志、标识符和设置点分配给混合罐，在混合罐用作进料罐的情况下，生产设备控制系统可将第二组标签、标志、标识符和设定点分配给混合罐。然后，生产设备控制系统可基于从便携式设备连接至滑架之后获得的信息，将一组特定的控制模块分配给便携式设备。
在各种实施方式中，不被认为是便携式设备(例如大型收集罐)也可连接至滑架上。在这些场景中，非便携式设备可能不包括硬件和/或通信和存储设备，这些设备使非便携式设备能够相对于生产设备控制系统进行动态配置。如果非便携式设备没有被配置为动态配置，则生产设备控制系统的操作员可手动建立用于控制非便携式设备的操作的模板和/或控制模块。
除对生产线中包括的设备的控制之外，生产设备控制系统还可以在生产纯化的目标蛋白质(例如但不限于纯化蛋白质药物)期间跟踪批次的衰减率。“衰减率”是可识别和跟踪用于生产子批次的材料的时间段。例如，用于最终色谱步骤洗脱池收集的材料(例如缓冲液、细胞培养基等)，这之中可能有很多可以通过“衰减率”以动态方式进行识别和跟踪。在连续分批生产过程中，生产设备控制系统可估计纯化蛋白质生产过程的衰减率。在各种实施方式中，生产设备控制系统可将批次标识符分配给批次生产的某些部分，启动衰减监控器，直至当前批次标识符更改为新的批次标识符，为新批次实施新的衰减监控器标识符。
在说明性实例中，生产设备控制系统可基于从连接至过滤器组的加密锁获得的信息确定，过滤器组连接在灌注生物反应器和第一色谱系统之间。在这些情况下，过滤器组可用作深度过滤器。生产设备控制系统可识别深度过滤器的一个以上控制模块、标志和/或状态标识符，在过滤器组在生产线中使用时执行一个以上控制模块。生产设备控制系统可基于从包括在过滤器组件中的压力传感器获得的压力值来监测过滤器组的过滤器组件内的压力。生产设备控制系统可确定材料流过的第一过滤器组件内的压力已达到至少阈值水平。压力的阈值水平可指示由于过滤器可处理的材料量的减少，包括在第一组件中的过滤器需要更换。生产设备控制系统然后可发送信号，控制连接至过滤器组的分流阀，使材料流过过滤器组的第二过滤器组件。然后可更换包含在第一过滤器组件中的过滤器。
通过进一步说明，列举本发明的以下实施方式：
实施方式1：用于生产纯化的目标蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中。
实施方式2：用于生产纯化的目标蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中。
实施方式3：根据实施方式1至2所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池。
实施方式4：根据实施方式1至3中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统中，得到包含纯化的目标蛋白质的组合物。
实施方式5：根据实施方式1至4中任一项所述的方法，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
实施方式6：根据实施方式1至5中任一项所述的方法，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质(或其他医学上有用的蛋白质)。
实施方式7：根据实施方式1至6中任一项所述的方法，其中，第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统中的一个以上包括一次性组件。
实施方式8：根据实施方式1至7中任一项所述的方法，其中，在2个、3个、4个、5个或6个一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞。
实施方式9：根据实施方式1至8中任一项所述的方法，其中，一个以上一次性生物反应器可包含约50L至约4000L体积的液体培养基。
实施方式10：根据实施方式2至9中任一项所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液以相对于彼此固定的比例直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，同时还以相对于多种不同的浓缩组分溶液的不同比例添加水性稀释剂，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
实施方式11：根据实施方式2至9中任一项所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂以相对于彼此固定的比例直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
实施方式12：根据实施方式2至9中任一项所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂以相对于彼此固定的比例注入混合室中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中；所述新鲜的无菌液体培养基在添加至每个灌注生物反应器之前同时进行混合，保持恒定的培养体积。
实施方式13：根据实施方式1至12中任一项所述的方法，其中，使用包括检测器的自动化控制器来测量一次性缓冲容器中的流体体积，并且处理器改变第一色谱系统的泵速，在一次性缓冲容器中保持预设的体积范围。
实施方式14：根据实施方式3至13中任一项所述的方法，其中，步骤(b)、(c)、(d)或(e)中的一个以上从前一步骤开始以不间断流的方式自动且流体地进行；在一个以上步骤之间采用缓冲容器，并且处理器在后续步骤中改变泵速，在后续步骤之前调节缓冲容器的预设体积范围。
实施方式15：根据实施方式3至14中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)、(c)、(d)或(e)中的一个以上之间进行pH和/或电导率负载的在线或容器内调节。
实施方式16：根据实施方式1至15中任一项所述的方法，其中：
(i)过程自动化系统至少与一个以上一次性灌注生物反应器、一次性缓冲容器和第一色谱系统进行电子通信；
(ii)所述过程自动化系统存储第一组控制模块，控制一个以上一次性灌注生物反应器的至少一个一次性灌注生物反应器的操作；
(iii)所述过程自动化系统存储第二组控制模块，控制进料罐的操作；
(iv)所述过程自动化系统存储第三组控制模块，控制收集罐的操作；以及
(v)至少一个一次性灌注生物反应器在逻辑上被配置为与一个以上进料罐、一个以上收集罐或过滤器组连接。
实施方式17：根据实施方式16所述的方法，其中，所述至少一个一次性灌注生物反应器设置在滑架上，所述滑架包括多个通信接口，将所述至少一个一次性灌注生物反应器电子连接至多个便携式设备。
实施方式18：根据实施方式17所述的方法，其中，所述方法还包括：
(vi)通过所述过程自动化系统，基于经由通信接口接收的数据，确定所述一次性缓冲容器已连接至多个通信接口中的一个通信接口，所述数据指示所述一次性缓冲容器的标识符和所述一次性缓冲容器的功能；以及
(vii)至少部分地基于所述一次性缓冲容器的标识符和功能，确定所述一次性缓冲容器是收集罐以及确定所述第三组控制模块用于控制所述一次性缓冲容器的操作。
实施方式19：根据实施方式18所述的方法，其中，所述方法还包括：
(viii)通过所述过程自动化系统，基于经由附加通信接口接收的附加数据，确定混合容器已连接至多个通信接口中的附加通信接口，所述附加数据指示所述混合容器的附加标识符和所述混合容器的附加功能；以及
(ix)至少部分地基于所述混合容器的附加标识符和附加功能，确定所述混合容器是进料罐以及确定所述第二组控制模块用于控制所述混合容器的操作。
实施方式20：根据实施方式18至19中任一项所述的方法，其中，所述一次性缓冲容器的标识符和所述一次性缓冲容器的功能存储在与所述一次性缓冲容器连接的加密锁上。
实施方式21：根据实施方式1至20中任一项所述的方法，其中，所述生产培养期为至少20天。
实施方式22：用于生产纯化的目标蛋白质的自动化设备，其中，所述自动化设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；
(b)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；以及
(c)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSV1的无细胞渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中；以及
其中，自动化设备由过程自动化系统(PAS)控制。
实施方式23：根据实施方式22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：多个贮存器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，所述多个贮存器直接或通过可选的混合容器间接地流体连接至所述灌注生物反应器，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至所述灌注生物反应器。
实施方式24：根据实施方式22至23所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：
(d)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；以及
(e)储存容器或第二一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池。
实施方式25：根据实施方式22至24的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：
(f)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或第二一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(g)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(h)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化的目标蛋白质。
实施方式26：根据实施方式22至25中任一项所述的自动化设备，其中，所述一个以上一次性灌注生物反应器可包含约50L至约4000L体积的液体培养基。
实施方式27：根据实施方式22至26中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括自动化控制器，所述自动化控制器包括检测器和处理器，所述检测器用于测量SUSVl中的流体体积，所述处理器用于改变第一色谱系统的泵速，保持SUSV1中的预设体积范围。
实施方式28：根据实施方式24至27中任一项所述的自动化设备，其中，第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统中的一个以上包括一次性组件。
实施方式29：根据实施方式24至28中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括并且在所述第一色谱系统下游直接流体连接有：
(i)第二一次性缓冲容器；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)，其适用于接收蛋白质分离物级分；
其中，(i)和(ii)适用于接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分并将所述蛋白质分离物级分流体输送至低pH或去污剂病毒灭活系统。
实施方式30：根据实施方式24至28中任一项所述的自动化设备，其中，低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统包括：
(i)第二一次性缓冲容器，其适用于接收蛋白质分离物级分；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)，其适用于接收蛋白质分离物级分；
其中，病毒灭活和视需要的中和在第二一次性缓冲容器内或在SUCV1和SUCV2内进行。
实施方式31：根据实施方式22至30中任一项所述的自动化设备，其中，在将渗透物自动且流体地输送至SUSV1之前，所述自动化设备还包括中空纤维膜、一系列深度过滤器或过滤推车。
实施方式32：根据实施方式22至31中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备在(e)中包括一次性缓冲容器，所述一次性缓冲容器适用于接收病毒灭活产物池。
实施方式33：根据实施方式22至32中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括位于SUSV1上游的热交换器。
实施方式34：根据实施方式22至33中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括位于SUSV1上游的过滤系统。
实施方式35：根据实施方式24至34中任一项所述的自动化设备，其中，将以下系统中的一个以上自动且流体地连接至先前的系统：
(i)第二色谱系统；
(ii)可选的第三色谱系统；
(iii)病毒过滤系统；以及
(iv)超滤/渗滤系统；
其中，可选地采用缓冲容器来调节连接系统之间的材料的不间断流。
实施方式36：根据实施方式22至35中任一项所述的自动化设备，其中：
至少一个以上一次性灌注生物反应器、SUSV1、第一色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、储存容器或一次性缓冲容器、第二色谱系统、可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统以及超滤/渗滤系统包括布置在生产线的第一配置中的第一设备，用于纯化目标蛋白质；以及
第一组(first plurality)控制模块被实施，控制所述第一设备的操作。
实施方式37：根据实施方式36的自动化设备，其中：
第二设备布置在生产线的第二配置中，用于其他纯化目标蛋白质；所述生产线的第二配置包括至少一个以上一次性灌注生物反应器、第一色谱系统、低pH值或去污剂病毒灭活系统、第二色谱系统、超滤/渗滤系统和多个混合容器；
生产线的所述第二配置不同于生产线的所述第一配置；
第二组(second plurality)控制模块被实施，控制所述第二设备的操作；
所述多个混合容器中的至少一个混合容器包括在所述第一配置和所述第二配置中；以及
所述至少一个混合容器在所述第一配置中具有第一功能并且在所述第二配置中具有第二功能，所述第二功能不同于所述第一功能。
实施方式38：根据实施方式22至37中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括便携式过滤器组，所述便携式过滤器组包括多个过滤器组件，其中：
所述多个过滤器组件中的第一过滤器组件包括第一过滤器，所述多个过滤器组件中的第二过滤器组件包括第二过滤器；以及
生产设备控制系统：
当材料流过第一过滤器组件时，监测所述第一过滤器组件内的压力；
确定第一过滤器组件内的压力至少为阈值；以及
发送信号，引起连接至第一过滤器组件和第二过滤器组件的分流阀运行，使材料流入第二过滤器组件。
实施方式39：根据实施方式38所述的自动化设备，其中，在第一时间段内，所述过滤器组连接在所述第一一次性缓冲容器(SUSVl)和一个以上一次性灌注生物反应器之间，所述材料包括渗透物，所述过滤器组连接至第一加密锁，所述第一加密锁指示所述过滤器组的第一标识符和所述过滤器组的第一功能。
实施方式40：根据实施方式39的自动化设备，其中，在第二时间段内，所述过滤器组被包括在所述低pH或去污剂病毒灭活系统中，所述材料是无病毒过滤物，所述过滤器组连接至第二加密锁，所述第二加密锁指示所述过滤器组的第二标识符和所述过滤器组的第二功能。
实施方式41：根据实施方式22至40中任一项所述的自动化设备，其中，所述一个以上一次性灌注生物反应器能够在允许培养的细胞将蛋白质分泌至培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少20天的生产培养期。
实施方式42：根据实施方式1至21中任一项所述的方法或实施方式22至41中任一项所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质和/或治疗性蛋白质。
实施方式43：用于制造包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中；
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将所述无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统，得到包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物。
实施方式44：根据实施方式42至43中任一项所述的方法，其中，将新鲜的无菌液体培养基与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，然后加到一种以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
实施方式45：用于生产纯化的蛋白质药物的自动化设备，其中，所述自动化设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的哺乳动物细胞将目标蛋白质分泌至培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；
(b)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；
(c)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSVl的渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中；
(d)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(e)储存容器或一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池；
(f)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(g)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(h)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化蛋白质药物；以及
其中，自动化设备由过程自动化系统(PAS)控制。
实施方式46：根据实施方式45的自动化设备，其中，多个贮存器直接或通过可选的混合容器间接地流体连接至灌注生物反应器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至所述灌注生物反应器。
实施方式47：根据实施方式42至44中任一项所述的方法或实施方式45至46中任一项所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质和/或治疗性蛋白质。
实施方式48：根据实施方式45至46中任一项所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质和/或治疗性蛋白质。
实施方式49：根据实施方式22至42或实施方式45至46或实施方式48至49中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备被配置为以连续形式操作。
实施方式50：根据实施方式1至21或实施方式42至44中任一项所述的方法，其中，所述方法以连续形式进行。
实施方式51：根据实施方式1至21或实施方式42至44中任一项所述的方法，其中，所述第一色谱系统在使用前用包含过乙酸的化学消毒剂溶液进行消毒。
实施方式52：根据实施方式4或实施方式43至44中任一项所述的方法，其中，所述超滤/渗滤系统包括单程切向流过滤(SPTFF)，将SPTFF的操作压力控制在约0.25psi至约60psi。
实施方式53：根据实施方式4或实施方式43至44中任一项所述的方法，其中，所述超滤/渗滤系统包括在线深度过滤(ILDF)，将ILDF的操作压力控制在约0.25psi至约60psi。
实施方式54：根据实施方式52-53中任一项所述的方法，其中，将SPTFF和/或ILDF的操作压力控制在选自下组的范围：约0.25psi至约45psi、约0.25psi约30psi、约0.25psi至约15psi和约0.25psi至约5psi。
以下工作实施例是说明性的，不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：用于延长生产培养期的连续灌注培养和蛋白质产物捕获色谱的展示
材料和方法
使用500L生物反应器规模进行一组三个工程运行来展示用于生产纯化的蛋白质(本实施例中为重组治疗性蛋白质药物)的本发明方法，包括使用同时混合的浓缩培养基组分。运行相应的2L卫星生物反应器，来通过比较产生使用1×递送的小规模培养基的数据。
目标蛋白质、宿主细胞、培养基。为展示目的而生产和分离的目标重组治疗性蛋白质是IgG1κ同种型单克隆抗体，由重组CHO-K1细胞系生产，在化学成分确定的细胞培养基中培养。
灌注生物反应器和第一色谱系统。灌注生物反应器采用
Figure BDA0003205347400000561
XDR 500L一次性(搅拌罐)生物反应器(SUB；GE Healthcare Life Sciences)，其连接至Spectrum
Figure BDA0003205347400000562
KPS-600灌注系统(Repligen Corporation)。
Figure BDA0003205347400000563
XDR 500L SUB在95-150rpm的搅拌速率下的混合时间为30-55秒。通过增加搅拌速率也可缩短混合时间；不过，没有对其进行表征。灌注系统安装有孔径为0.2μm的中空纤维过滤器，可将细胞保留在滞留物侧，同时允许渗透物侧的高产物通过。在灌注培养的初始启动过程中，通过一次性气闸组件将渗透物流废弃物直接送至排水管。当蛋白A色谱产物捕获操作开始时，渗透物流被转移至过滤器推车，一次性气闸组件存储在Minncare Sterilant过乙酸溶液(Mar CorPurification)中。过滤器推车(带有DeltaV自动化功能)具有初级备用灭菌级过滤器(
Figure BDA0003205347400000571
SHC，0.2μm；MilliporeSigma)，用作初级捕获色谱柱的保护过滤器。可用于过滤器推车的其他0.2μm过滤器包括
Figure BDA0003205347400000572
2(Sartorius)、
Figure BDA0003205347400000573
EX级EDF过滤器等。带有一次性袋组件的可选热交换器可有效控制色谱装载材料的温度，但它未用于这些运行。然而，在本方法和自动化设备的其他实施方式中，使用一次性热交换器(具有ThermoScientificTM ThermoFlexTM循环冷却器的Thermo ScientificTM DHXTM热交换器和ThermoScientificTM DHXTM袋组件)。
200L便携式混合器用作一次性缓冲容器(SUSV)，其用作灌注系统的泵和第一色谱系统的泵之间的压力中断器，并管理这两个流体连接的连续单元操作之间的差异流速。多柱捕获色谱系统采用连续的一次性多柱色谱系统(CadenceTM
Figure BDA0003205347400000574
PD，以下简称“BioSMB”；Pall Life Sciences)，这是一种设计具有完全一次性流路的多柱连续色谱(MCC)系统，在本方法中运行三个填充有蛋白A树脂的14cm-D×5cm-H丙烯酸柱。BioSMB系统的洗脱出口连接到两个交替的洗脱池收集容器，以允许在进一步进行低pH病毒灭活和中和步骤的同时收集洗脱池。该系统的示意性部分方法流程图如图1B所示。在图1B中，过滤器推车位于SUSV的上游(图1B中标为“非批次单元(B1)”或“200L便携式混合器”)并包含一个0.2μm过滤器(例如Millipore Express SHC；Sartorius Sartopore 2；Pall FluorodyneEDF)，在灌注渗透物装载至第一色谱系统中的蛋白A亲和色谱柱之前对其进行过滤；过滤器充当保护过滤器，保护第一色谱系统免受微粒的影响。图1B中还显示了一次性板框设计的可选热交换器，可用于将较热的灌注渗透物流体冷却至室温或SUSV和第一色谱系统所需的不同目标温度。
通过在整个连接的流动路径中使用伽马辐照的一次性部件或预组装的高压灭菌部件以提供生物负载控制，来确保本发明方法的无菌操作。伽马辐照组件的实例包括：
Figure BDA0003205347400000575
SUB袋、与SUB和灌注系统相关的组件、气闸组件(图2)、安装在过滤器推车中的灭菌级过滤器、SUSV混合袋、洗脱收集袋、BioSMB歧管，以及所有培养基和缓冲溶液的相关托特袋。预组装的高压灭菌组件的实例包括中空纤维过滤器和连接至色谱柱以执行树脂消毒程序的阀块。通过使用一次性无菌连接器，或通过使用化学冷灭菌剂使系统功能封闭，整个系统边界保持为一个完全封闭的系统。
500L一次性生物反应器(SUB)的操作和监测。下面的表1B中列出了500L SUB培养的控制参数、目标设定点和允许的操作范围。
表1B：一般生产操作和性能参数。SLPM＝每米标准升；rpm＝每分钟转数。
Figure BDA0003205347400000581
生产培养溶解氧(DO)控制和pCO2汽提策略显示在下表2中。当空气至T型分布器(Tee Sparger)增至10SLPM时，覆盖减少至0SLPM。当离线pCO2为152mmHg时，以5个SLPM增量(总共不超过10个SLPM)向T型分布器添加额外的空气。500L一次性生物反应器(SUB)分布器规格如下：
T型分布器：2mm钻孔；搅拌器底座：2μm烧结盘。
表2：使用一个空气质量流速控制器(MFC)和两个不同的氧气(O2)MFC的溶解氧(DO)控制策略的参数。SLPM＝每米标准升。
Figure BDA0003205347400000582
每天最少对500L(450L操作体积)培养物取样。测量并记录活细胞密度、培养活力、离线pH、离线pCO2、葡萄糖浓度、乳酸浓度和渗透物压。记录在线搅拌、温度、pH、溶解氧和背压，以及消泡剂添加、空气和氧气放气率、细胞渗出率和灌注速率。还从生物反应器和灌注渗透物中取出无菌样品用于滴度测定。调整细胞渗出物以维持每毫升约5000万个活细胞(MVC)的活细胞密度。这使用ExcelTM软件(Microsoft)开发的细胞渗出物计算器工具完成。随着细胞渗出率的调整，灌注速率也进行了调整，在以2.0操作体积/天灌注时保持总流出率不大于625mL/min。
将培养基浓缩物输送至一次性生物反应器(SUB)。将无菌灌注培养基设计为室温稳定的浓缩储备溶液。为了满足这些设计要求，在一个实施方式中，培养基被分成三种无菌浓缩培养基组分溶液和一种水性稀释剂组分，每种均储存在一次性贮存器中：
(浓缩培养基组分溶液#1)7.5×(w/w)浓缩培养基溶液(通常2×至10×是有用的，但高端点取决于培养基的组成和要添加的干成分的量，因此这取决于培养基配方)；
(浓缩培养基组分溶液#2)20×(w/w)浓缩补充储备溶液(CSSS；20×至100×浓缩补充储备溶液通常是有用的)，包含胱氨酸、酪氨酸和表面活性剂；
(浓缩培养基组分溶液#3)50％(w/v)葡萄糖；以及
(4)注射用水(WFI)作为水性稀释剂。
图1A显示了500L规模的培养基浓缩物递送策略的示意性局部方法流程图。上面列举的四种组分直接输送至生物反应器中，依靠生物反应器内部的搅拌使四种组分混合。7.5×培养基、20×CSSS和50％葡萄糖浓缩液的流速使用校准蠕动泵手动设置，使用在线Sonotec IL.52流量计监测流速并确保准确输送。视需要将水性稀释剂(注射用水(WFI))输送至生物反应器以维持生物反应器水平设定点。7.5×培养基和50％葡萄糖溶液被输送至生物反应器顶部的不同端口。WFI和20×CSSS溶液共同连接至另一个端口，以最大限度地减少CSSS溶液的沉淀。根据本发明，优选避免在表面下添加不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂。按需输送所有培养基组分溶液和水性稀释剂(例如，WFI、7.5×(w/w)浓缩培养基溶液、20×(w/w)胱氨酸/酪氨酸/表面活性剂(CSSS)储备溶液和50％(w/v)葡萄糖)，通过单独的端口，也可使用比例控制的泵滑架和自动操作来实现，保持灌注生物反应器中的培养体积。
对于展示运行，在生产的第2天以每天0.5个容器体积(vvd)开始灌注，在第4天逐渐增至1vvd，在第6天增至2vvd。下表3中显示了浓缩培养基组分溶液的入口流速以及WFI调整的估计流速(平均预期入口流速)。在表3中，还显示了开始细胞渗出之前的渗透物流速和几个实例细胞渗出率的流速。
表3：500L SUB规模下的培养基入口流速和细胞渗出物和渗透物出口流速。灌注速率和细胞渗出率以每天的容器体积(vvd)表示；WFI＝注射用水
Figure BDA0003205347400000601
第一色谱系统和色谱柱消毒的操作。第一色谱系统被配置为在三个示例性展示运行中将目标重组治疗性蛋白质捕获至蛋白质分离物级分中。CadenceTM BioSMB PD连续一次性多柱色谱系统(本文简称“BioSMB”；Pall Life Sciences)中的第一色谱系统包括三个蛋白A亲和捕获柱(14cm直径×5cm高度)。MabSELECTTM SuReTM蛋白A亲和基质的高度交联琼脂糖树脂(GE Healthcare Life Sciences)用于前两次运行，AmsphereTM A3蛋白A色谱树脂(JSR Life Sciences)用于第三次运行。渗透物中的滴度预计为约0.6g/L，因此MabSELECTTMSuReTM上样量设置为以50g/L上样83个柱体积(CV)，AmsphereTM A3上样量设置为以65g/L上样108个CV。方法参数总结在下表4中。洗脱收集使用基于280nm波长处基线至基线吸光度的动态峰值收集(峰值收集从0.1吸光度单位(AU)开始至峰值且在0.1AU结束)。
BioSMB方法被设计成允许上样流速在高流速、中流速和低流速之间切换。此种流速切换有助于管理连接的单元操作之间的差异流速，即来自灌注系统的渗透物流速和BioSMB系统的上样流速。这些展示运行以固定流速将入口培养基组分溶液添加至生物反应器，同时每天改变细胞渗出物和渗透物的出口流速。可能的细胞渗出率的范围如表3所示，从而将进入SUSV1的渗透物流速范围设置为531-609mL/min。BioSMB的上样中流速在展示运行之间略有不同，但高流速和低流速设置为中流速的±10％，设置得比渗透物流速的预期范围更宽。下面的表4和图3显示了SUSV体积控制的示意图，一个展示运行中使用了示例性流速。下一节描述了流速之间切换的自动操作。
在每次运行的BioSMB捕获步骤开始之前，将树脂填充在玻璃柱外壳中，以无菌方式对树脂和外壳进行化学消毒以使BioSMB流路在功能上封闭。将高压灭菌阀块组件连接至每个柱外壳的入口和出口，使用无菌连接器将色谱柱连接至BioSMB歧管、消毒溶液袋和废弃物袋。使用30mM过乙酸(PAA)溶液作为化学消毒剂，选择它是因为它作为杀孢子剂的有效性，但也足够温和，可最大限度地减少对树脂功能的任何损害(参见例如Jungbauer等，Method for sterilizing liquid chromatography resins highly resistant tooxidation and a sterilization solution for use therein，US5,676,837)。图4显示了一个实施方式的柱外壳的化学消毒设置示意图。
简言之，柱外壳填充有亲和色谱树脂(暴露于空气)。阀块被高压灭菌。参考图4，与BioSMB滑架离线的每根柱子均按以下方式处理：使用独立的蠕动泵将PAA灌注至连接至排气阀的一次性袋中(在图4中，V4至V3)。将3个柱体积(CV)的PAA通过PAA入口阀和出口阀冲洗至连接至无菌连接器A的一次性收集袋中(在图4中，V4至V2至V5至V7)。PAA在每个柱中保持≥15分钟，然后用3CV的平衡缓冲液(EQ)或储存缓冲液再次冲洗色谱柱(在图4中，V4至V2至V5至V7)。然后，通过无菌连接器B连接器通过方法入口(图4中的V1)和方法出口(图4中的V6)将每个色谱柱连接至色谱滑架。此后，滑架管线通过排气阀灌注至一次性袋子中(在图4中，V1至V3)，色谱柱准备好用于BioSMB运行，通过此消毒程序在功能上关闭。
或者，可如上所述离线进行填充色谱柱的PAA消毒，但是在模拟移动床(SMB)滑架上进行EQ或储存缓冲液的冲洗(在图4中，冲洗从V1至V2至V5至V6)。包含PAA溶液的一次性袋子可连接至色谱柱入口(在图4中，V2)，消毒和冲洗程序均可在色谱柱于SMB滑架上时完成。可使用除PAA以外的消毒剂，但这些必须是杀孢子的(参见例如Jungbauer等，Methodfor sanitizing liquid chromatography resins highly resistant to oxidation anda sterilization solution for use therein，US5676837；Monie等，Sanitizationmethod for affinity chromatography matrices，WO2016/139128A1和US2018/036445A1)。
展示运行期间的化学消毒程序仅在每次运行开始时进行一次。蛋白A亲和色谱方法本身使用0.1M NaOH再生清洁程序，但预计此种消毒剂的强度不足以具有杀菌和杀孢子的能力。对于展示运行，化学消毒程序离线于BioSMB滑架进行，但是，消毒程序可在带有BioSMB歧管的滑架上进行。
表4：目标重组治疗性蛋白质的蛋白A捕获的示例性第一色谱系统参数(显示了运行2)。在本实例中，上样流速为585mL/min，上样为83个CV，总停留时间为2.6分钟，循环时间为5.5小时。
步骤 溶液 体积(CV) 近似流速(mL/min) 切换时间
环回 从第一柱上样流出 83 585 1.0
进料 收获流体 83 585 1.0
洗涤1 EQ 2 156 0.09
洗涤2 高盐pH 7.5 2 156 0.09
洗涤3 EQ 3 156 0.14
洗脱 醋酸盐pH 3.6 4 156 0.18
浸提(Strip) 醋酸 3 156 0.14
冲洗 EQ 1 156 0.05
再生 氢氧化钠 3 156 0.14
平衡(EQ) EQ 4 156 0.17
自动化和一次性缓冲容器体积控制。采用过程自动化系统(PAS)为基于滑架装的便携式生产设备提供灵活的过程控制和管理，以支持可扩展的连续捕获生物生产活动。自动化还提供自主批次报告、数据收集和材料跟踪。它是一种可重用的基于类的设计和架构，可在相同类和配置的生产设备中快速部署。在本发明的一个实施方式的示意图中显示了描述设备类型之间通信的高级过程自动化概览(图5)。
图5显示了用于生产纯化的治疗性蛋白质药物的本发明自动化设备的示例性实施方式的各种硬件和软件组件的示意图，其能够在系统的不同组件之间进行数据通信。特别地，图5显示了包括在一次性生物反应器系统、灌注系统和连续第一色谱系统的滑架中的多个连接接口(例如Profibus分路)。连接接口可提供系统组件之间的逻辑连接和/或物理连接。在接口启用物理连接的情况下，连接接口可连接至硬件组件，例如以太网/互联网协议(IP)网关。可将一个以上加密锁连接至便携式设备，例如过滤器组、第一混合罐和第二混合罐。加密锁可存储和/或将与便携式设备的控制相关的信息传送到生产设施控制系统。在某些情况下，一个以上便携式设备可内部存储在加密锁上存储的信息并且可用作内部加密锁。
在图5的说明性实例中，各种设备可使用一种以上Profibus通信协议进行通信。在各种实施方式中，灌注系统和连续第一色谱系统的控制可被配置为基于与过滤器组、进料罐A、进料罐B、收集罐A和收集罐B中的至少一个可选单元的操作相关的信息进行设置和/或调整。在图5的说明性实例中，收集罐A可具有一个逻辑派生的软件，与连接至第一便携式混合罐的加密锁1连接。此外，连续色谱系统的滑架可通过网关设备物理连接至过滤器组和第一便携式混合罐。加密锁2可连接至过滤器组并提供关于过滤器组的操作和标识符的信息。在某些情况下，与过滤器组操作相关的数据可用于控制连续色谱系统。此外，加密锁3可连接至第二混合罐并提供与第二混合罐的操作和标识符相关的信息。例如，加密锁1可指示第一混合罐用作灌注系统的收集罐，而加密锁3可指示第二混合罐用作连续色谱系统的收集罐。
虽然图5的说明性实例显示了用于生产纯化的治疗性蛋白质药物的本发明自动化设备的组件之间的各种软件连接和物理连接，但应理解，物理连接可由软件连接替换，特别是纯化的治疗性蛋白质原料药生产线的附加实施方式，而在纯化的治疗性蛋白质原料药生产线的一些附加实施方式中，一些软件连接可实施为硬件连接。
简言之，SUSV1液位控制的自动化依赖于预设体积范围限制的规范，根据该限制上采取控制行动。例如，在图3中，当SUSV1或连续或半连续方法流程中的任何其他SUSV，例如SUSV2或SUSV3或SUSV4或SUSV5等(图3中的“SUSV”)中的体积达到低体积和高体积警报时，SMB(或其他方法滑架，例如病毒过滤或UF/DF滑架)分别自动转移至其低流速和高流速方法。由于SMB的低流速和高流速被选择在进入SUSV1的预期渗透物流速范围之外，结果是SUSV1体积被驱回中心点体积。一旦达到中心点体积，SMB流速将恢复至其中间流速方法。当SUSV1达到低低(“LL”)报警时，SMB流速停止；相反，当SUSV达到高高(“HH”)警报时，灌注渗透物流速停止。
用于与500L生物反应器比较的2L生物反应器卫星的运行。生物反应器卫星在使用BPS-i100灌注系统(Levitronix)的2L可高压灭菌玻璃生物反应器(Applikon)中进行。使用无菌袋将细胞培养物从500L SUB转移至2L生物反应器，以接种细胞密度为目标。所有浓缩培养基组分溶液和WFI均来自制造工厂并重新配制为1×配方。以8g/L和12g/L葡萄糖制备两种不同的1×配方，以适应生产过程中的细胞密度范围。卫星被控制至与SUB相同的目标设定点或相应地按比例缩小。使用转子流量计控制O2、CO2和空气流速，用于CO2汽提的覆盖层和空气喷射流速以每分钟容器体积(VVM)衡量。搅拌以每单位体积的功率(P/V)来衡量。使用±0.02死区控制pH。平行使用两个0.02m2中空纤维灌注过滤器(0.2μm孔径)，运行1通过将渗透物循环回生物反应器来匹配通过过滤器的渗透物通量。为便于操作，在后续运行中放弃了渗透物循环。使用细胞渗出物计算器控制大规模和小规模的细胞密度。该等式使用当前和前一天的离线细胞计数来计算表观生长率和控制在指定目标活细胞密度下所需的细胞渗出率。
结果与讨论
连续灌注培养的性能。显示了三个500L展示运行和一个相应的2L卫星运行的细胞培养性能结果：活细胞密度(VCD)如图6所示；活力如图7所示；细胞渗出率如图8所示；渗透物产率如图9所示。
细胞密度被成功地控制至约5000万个活细胞/mL(MVC/mL)的目标，在培养开始时使用较高渗出率，在培养持续时间内逐渐减少至更低渗出率。在运行1中使用了略有不同的细胞渗出策略，这导致了更多变的生长曲线。后来的运行移至基于前一天的增长率的细胞渗出策略，这导致了更严格控制的VCD。在长达26天的细胞培养期间，活力保持在70％以上。该细胞系和方法的渗透物产率达到约1g/L/天，灌注过滤器能够在整个运行期间保持产品高通过率(数据未显示)。
培养基浓缩物递送的性能。评估了多个性能指标，以评估500L规模的培养基浓缩物递送的准确性。首先，对各个培养基组分溶液进行了流速验证，以确保在线流量计提供准确的读数。其次，图10显示了SUB液位控制按预期运行，生物反应器中的培养体积保持在450L，WFI微调流速视需要打开以维持培养体积。除这些操作检查之外，图6、图7、图8和图9中显示的细胞培养数据表明，使用浓缩培养基组分溶液操作的500L规模和使用1×递送培养基操作的2L比较卫星在细胞生长、活力和产率方面的性能相似。
提供了其他代谢数据，将500L展示运行3与其2L比较卫星进行比较：图11中的渗透物压，图12中的CO2水平，图13中用于pH控制的碱用量，图13中的特定乳酸产量14，以及图15中的特定葡萄糖消耗。所有这些趋势均显示，使用浓缩培养基组分溶液操作的500L规模与使用1×递送培养基操作的2L卫星具有相似性能，特别是渗透物压曲线(参见图11)，这是向生物反应器中添加培养基组分浓缩物和细胞消耗的指标。
连续捕获模拟移动床(SMB)第一色谱系统的性能。显示了展示运行2的模拟移动床(SMB)第一色谱系统BioSMB连续捕获性能结果，在三个运行中，运行2的操作时间最长，在17天的连续操作中完成了每柱总共72个循环(总共216个完成的洗脱循环)。蛋白A洗脱紫外线(UV)吸光度(A280)曲线显示为每个柱的每日快照(图16A)和每个洗脱循环的洗脱柱体积(CV)(图16B)。三根色谱柱之间的洗脱峰宽相似，但所有色谱柱均在运行后期显示出一些峰变宽。这可能是由于在整个运行过程中渗透物滴度增加，因此洗脱质量增加，但也可能是因为柱性能随树脂老化而发生变化。本次运行中的树脂之前经历了60次循环，因此运行2结束时的总循环数为132。蛋白A步骤的产量(显示为图17中合并的每日洗脱循环池)在72个循环的过程中相似。合并的每日洗脱池(中和至pH5，0.2μm过滤)的方法相关杂质如图18所示。每日洗脱池之间的杂质水平相对一致，表明树脂在其整个生命周期内的性能一致。
SUSV液位控制和BioSMB上的上样流速的相应变化如图19A-B所示。遵循SUSV1体积和BioSMB上样流速的趋势，当SUSV1达到70L的低体积时，BioSMB流速切换至低流速设定点，而在130L的高体积时，BioSMB流速切换至高流速设定点。在较低或较高BioSMB流速将SUSV1体积驱回100L之后，流速恢复至中心点。
生物负载控制。在运行期间在多个样品位置进行生物负载和内毒素测试。展示运行2的结果显示在表5中。对于该运行，生产生物反应器运行25天，第一色谱系统(此处为BioSMB)运行总共17天。第2天开始灌注，第7天对蛋白A柱进行消毒，第8天开始BioSMB，第9天对第一中和的蛋白A池进行采样。生物反应器样品是来自生物反应器的整个液体培养基(whole broth)，PERM样品取自灌注过滤器的渗透物侧，SUSV1直接从容器采样，NPRA直接从每日中和的洗脱收集容器采样，2ndP从用于第二次流通的BioSMB出口采样。所有生物负载结果均为阴性(0CFU/10mL)。除第18天的第二次流通外，所有内毒素结果均为阴性，第18天的第二次流通在最低稀释度下显示出一些凝胶凝结。该系统在该样品之前和之后的几天内具有干净的内毒素结果，相应的生物负载样本是干净的，因此这可能是采样问题。
这些结果证实，从一次性生物反应器及其相关的多种不同浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂到BioSMB及其相关柱、缓冲溶液和洗脱容器，保持了封闭的无菌系统边界。此外，结果验证了对渗透物使用一次性气闸排放管以及使用色谱系统废液管线，以及使用过乙酸消毒剂对色谱柱和树脂进行的杀孢子消毒。
总而言之，上述展示运行显示了500L连续灌注方法的一致性能，证明了将目标活细胞密度(VCD)维持至少26天的能力，同时具有高活力和产物高水平通过灌注过滤器。证明了培养基浓缩物的准确递送，即，使用多种不同浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂操作的500L SUB与使用1×培养基递送操作的2L比较卫星生物反应器之间存在相当的性能。第一色谱系统(包括蛋白A亲和色谱捕获步骤)在洗脱产量和杂质水平方面的性能一致。展示了通过切换第一层色谱系统上样的流速转移来实现自动化SUSV1体积控制的操作和一次性气闸排放管。
采用本发明的方法和自动化设备使得可以维持无菌封闭系统。通过使用一次性组件(例如一次性生物反应器、一次性混合袋、一次性组件、一次性模拟移动床流动路径)，以及所证明的通过对色谱系统的色谱树脂和柱外壳使用杀孢子消毒方法可以使系统在功能上封闭和无菌，促进了本发明的实施。
表5：来自运行2的生物负载和内毒素结果。SUB的生产培养期为25天，从第8天开始通过BioSMB的连续捕获色谱17天；生物负载。第2天开始灌注，第7天对蛋白A柱进行消毒；第9天收集第一NPrA池。BRX＝生物反应器；PERM＝渗透物；SUSV＝一次性缓冲容器(SUSV1)；NPRA＝中和的蛋白A；2ndP＝第二次流通。*＝对色谱柱1、2和3分别测试第二次流通；所有值均<0.6EU/mL。
Figure BDA0003205347400000661
实施例2：病毒灭活、中和系统和进一步下游加工
在通过第一色谱系统进行蛋白A亲和色谱之后，下游单元操作可以以分批模式或连续或半连续方式进行。
在一个示例性实施方式中，将两罐自动病毒灭活系统连接至BioSMB系统的洗脱出口，以评估以连续入口流操作的分批低pH病毒灭活步骤。BioSMB蛋白A亲和色谱(第一色谱系统)的洗脱收集在两个50L一次性混合器容器之间交替。当一个容器中的体积达到其预定值时(在此种情况下，目标为约20L)，在该容器中开始用于低pH病毒灭活过程的酸滴定，并将洗脱收集转移至另一个容器。对于分批病毒灭活操作，将2M乙酸以逐步方式添加至目标pH值3.5，同时用底部搅拌器和再循环泵混合容器。将池孵育60分钟，然后以与酸滴定类似的方式将2M三(羟甲基)氨基甲烷(“Tris”)碱添加至目标pH值5.0。随后将中和的病毒灭活产物池移出系统。总共进行了6个循环，每个罐中三个，在目标pH±0.1范围内实现了低pH值和中和设定值。添加酸和碱的滴定持续时间各为约10分钟。
图21显示了通过SE-HPLC测量的后-蛋白A色谱蛋白质分离物级分与低pH病毒灭活和中和(VI/Neut)病毒灭活产物池之间的高分子量(HMW)的比较。病毒灭活步骤在生产第10天手动执行，而第11-16天在自动化系统上执行。图21中的结果表明，后-蛋白A色谱蛋白质分离物级分与后-VI/Neut病毒灭活产物池之间的高分子量(HMW)相当，表明病毒灭活的酸滴定操作和碱滴定操作系统不影响产物质量。
以下是下游分批模式操作的另一个非限制性实例，其中，所有步骤均使用一次性(用完即弃)组件：
几天的BioSMB(第一色谱系统)操作，包括蛋白A亲和色谱，被汇集至蛋白质分离物级分进行病毒灭活(VI)。通过使用2M乙酸将池降低至pH 3.5来进行病毒灭活。酸化池保持1小时。在保持低pH值后，病毒灭活产物池用2M Tris碱中和至pH 5.0。中和的病毒灭活产物池通过
Figure BDA0003205347400000671
HC Pod A1HC深度过滤器(MilliporeSigma)和后续的灭菌级过滤器过滤，来使病毒灭活产物池澄清，然后再将其引入第二层色谱系统。
第二色谱系统包括流通模式的阳离子交换(CEX)柱。该步骤使用
Figure BDA0003205347400000672
EMD(M)COO-树脂(MilliporeSigma)。CEX之后通过第三色谱系统进一步色谱纯化，第三色谱系统例如但不限于具有CaptoTM Adhere(GE Healthcare Life Sciences)树脂的混合模式色谱(MM)。pH和/或电导率负载调节可在上样至MM柱(在线或分批)之前进行。该步骤以流通模式进行。
对MM流通池进行病毒过滤(VF)，作为正交方法通过尺寸去除病毒颗粒，得到包含重组治疗性蛋白质的无病毒过滤物。病毒过滤可采用例如但不限于PlanovaTM 20N过滤器(Asahi Kasei Corporation)进行。使用例如但不限于30kD再生纤维素滤器(MilliporeSigma)来浓缩和渗滤无病毒过滤物池，将纯化的治疗性蛋白质药物以目标产物浓度置于制剂缓冲液中。
实施例3：蛋白A基质的过乙酸(PAA)消毒
通过使用无菌、一次性组件和设备，将无菌包膜从灌注生物反应器延伸至蛋白A亲和色谱捕获步骤(或第一色谱系统)并进入下游过程，可促进成功的连续过程。然而，很难保证内部填充的色谱柱的无菌性，而且伽马射线照射的柱子价格昂贵且无法广泛商业化。为了满足对无菌色谱柱的需求，我们开发了一种化学柱消毒过程，假定使用无菌连接器并彻底检查系统中任何连接的完整性，该过程允许捕获步骤以无菌方式连续运行。
材料和方法。表6中列出的材料用于本实施例3中描述的装填和消毒程序；根据
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Multishot 10E8试剂盒(bioMérieux SA)的制造商说明，制备表6中列出的各个菌种的再水化接种剂，其平均值为0.7至1.5×108cfu，平均标准偏差≤20％。再水化至1.1mL的
Figure BDA0003205347400000674
再水化液(Re-Hydration Fluid)中，以提供10×100μL剂量的107cfu。
表6：材料
Figure BDA0003205347400000681
初级柱装填和消毒程序。将乙醇(70％v/v)添加至空柱外壳中。通过用蠕动泵通过柱出口吸入空气，通过用小桨手动引导气泡，从底部筛板下方除去空气。除去所有空气后，将适量的
Figure BDA0003205347400000682
SuRe蛋白A树脂加入BPG 140/500玻璃柱外壳，填充5cm或10cm树脂床。使用蠕动泵通过柱的出口去除储存缓冲液。表6中所示的储存缓冲液只是一个示例；或者，储存缓冲液可以为树脂运输时使用的任何缓冲液，例如，含有20％乙醇的缓冲液，或者它可以为EQ或其他缓冲液或去离子水，如果之前使用树脂的沉降/倾析来去除细颗粒或获得准确的浆料百分比。
将约3个柱体积(CV，基于沉降床高度)的
Figure BDA0003205347400000683
纯化水或蛋白A平衡缓冲液(EQ)添加至沉降床的顶部。用蠕动泵通过沉降床抽吸该体积以除去残留的储存缓冲液。将约2CV的
Figure BDA0003205347400000684
纯化水或EQ缓冲液添加至沉降床中，用小桨缓慢地将床浆化。为确保一定水平的生物负载并证明消毒程序的有效性，将枯草芽孢杆菌或生物混合物(参见表6)以约100CFU/mL的浆液体积加入浆液中。使用蠕动泵使床沉降并去除多余的体积。
将约3CV的0.7％(v/v)PAA添加至沉降床的顶部；用蠕动泵通过沉降床抽吸该体积以去除残留水(或蛋白A EQ)。将过乙酸(0.7％v/v)添加至柱中以产生树脂和PAA的约50％浆液。用小桨使树脂浆化。使树脂浆液沉降足够长的时间以在床的顶部产生一层液体，该液体层大到足以覆盖色谱柱顶部适配器至高于适配器O形环。将色谱柱顶部适配器放置到位并降低，直至O形环被PAA溶液覆盖。操作顶部适配器以去除玻璃料和O形环中的残留空气。使顶部适配器在0.7％PAA溶液中浸泡约20分钟，然后拧紧O形环。将顶部适配器降低至PAA溶液中以迫使PAA溶液向上通过中心柱管。然后将中心柱管连接至0.7％PAA填充溶液。用0.7％PAA溶液以380至550cm/小时的速度填充色谱柱，但也可使用更高的填充速度，例如600cm/小时。
以下程序用于模拟填充柱在良好生产规范(GMP)生产运行中将经历的步骤。所有步骤均以约150cm/小时的流速进行。将10CV的去离子水冲洗通过色谱柱以去除PAA溶液。将3CV的无菌0.1M NaCl冲洗通过柱子以模拟与理论板(HETP)测试等效的高度。将3CV的储存缓冲液冲洗通过柱子，在用PAA消毒之前将柱子储存过夜。
用0.2％(v/v)PAA对柱子进行消毒。5CV的0.2％PAA以向下流动方向冲洗通过色谱柱，5CV的0.2％(v/v)PAA以向上流动方向冲洗通过色谱柱。将柱子在0.2％PAA中保持60分钟，然后将蛋白A EQ缓冲液冲洗通过柱子以去除PAA溶液。在5CV和7CV下取样，提交用于生物负载分析。然后将该柱连接至含有BAK培养基的2L生物反应器。使用蠕动泵将培养基以约50mL/min的速度再循环通过柱子。用
Figure BDA0003205347400000691
(Parker Hannifin Corp.)压力传感器监测柱的入口压力。如果达到每平方英寸压差(psid)20磅的最大压差，则将泵设置为关闭。使柱与反应器连接10至14天。实验完成后，将后-再循环的样品从柱子上取下并提交进行生物负载分析。
备选装填和消毒程序1。在上述初级装填和消毒程序之后，还使用备选装填和消毒程序，不同之处在于使用0.7％(v/v)PAA进行浆化、装填和消毒。
备选装填和消毒程序2。还尝试了第二备选装填和消毒程序，使用0.2％(v/v)PAA和0.1M NaCl来使柱浆化和填充。填充后用0.2％PAA对色谱柱进行消毒，如上述初级装填和消毒程序所述，添加氯化钠以改善填充性能。然而，氯化钠与PAA溶液相互作用，导致色谱柱上出现空气。因此不推荐将氯化钠与PAA一起加入。
备选装填和消毒程序3。在第三备选装填和消毒程序中，将树脂浆化、填充在不含PAA的0.1M NaCl中。在填充前的初始浆液步骤期间，树脂中加入生物负载混合物(见表6)至约120CFU/mL。通过将约3CV的水(或ProA EQ)冲洗通过色谱柱来去除0.1M NaCl，然后用0.2％(v/v)PAA对色谱柱进行消毒(5CV下降，5CV上升，保持60分钟)，在连接至2L生物反应器之前用蛋白A EQ缓冲液冲洗。冲洗样品和后-生物反应器再循环样品在实验完成后从柱子上取下并提交进行生物负载分析，如在先前采用初级消毒程序(上文)的实验中一样。对于生物负载测试，将约100至200mL的样品拉入无菌样品袋中，如下所述分析生物负载。
装填和消毒程序的方法规模确认。在制造工厂中进行了两次500L工程运行，利用BioSMB连续捕获目标免疫球蛋白。该生产过程使用四个直径为14cm、床高为10cm的MabSelectTM SuReTM蛋白A亲和基质柱来捕获生物反应器渗透物。第一次运行使用初级装填和消毒程序，将树脂在0.7％(v/v)PAA中制成浆液，然后用0.7％(v/v)PAA填充柱子，然后是0.2％(v/v)PAA消毒步骤。第二次运行时没有重新装柱。在将色谱柱投入使用之前，第二次运行仅使用了0.2％PAA消毒步骤。
生物负载分析。根据USP<61>进行生物负载测试。简言之，从含有100mL总抽取样品的样品袋中无菌地取出十(10)mL样品，将其添加至至少90mL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)或无菌水中(或此类体积的样品和稀释剂，因此产品的稀释比例不超过1：10)。将总等分试样漏入
Figure BDA0003205347400000701
过滤系统(MilliporeSigma)中，过滤，然后在
Figure BDA0003205347400000702
琼脂板上孵育，对于胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)，在30-35℃下孵育3天以上；对于Sabouraud葡萄糖琼脂(SabDex；SDA)，在20-25℃下孵育5天以上。
结果。表7(如下)包含柱消毒实验中使用的每个测试条件的结果。测试的所有条件均产生了完全消毒的色谱柱。在任何冲洗样品中均未观察到生物负载，当连接至2L生物反应器时，所有条件均得到了至少10天的无菌操作。10天是色谱柱连接至2L生物反应器的最短时间。选择10天的孵育期是因为它可在色谱柱和生物反应器中检测到甚至生长缓慢的微生物的生长。
0.7％(v/v)PAA浆液和装填程序(即，上述初级柱装填和消毒程序)被视为方法规模消毒的最严格选择，被选择用于工程运行。将色谱柱连接至BioSMB阀块后，对0.2％(v/v)PAA消毒步骤进行了后-柱性能测试，因为0.2％PAA已被证明可有效对抗形成孢子的细菌，并且所有树脂和色谱柱部件在装填过程中已与0.7％PAA接触。在进行这些实验时，尚未对暴露于0.7％PAA对蛋白A寿命的影响进行全面评估，因此还选择了较低的浓度以限制由于较高浓度的PAA消毒剂而导致的任何不可预见的后果。
表8(以下)包含来自第一工程运行的蛋白A亲和色谱步骤的生物负载结果。如上所述，所有测试的样品的生物负载均为阴性，表明0.7％(v/v)浆液/填充程序可有效消除生物负载，这允许连续下游处理的持续14天无菌下游处理。
表9(以下)包含来自第二工程运行的蛋白A亲和色谱步骤的生物负载结果。测试的所有样品的生物负载均为阴性，系统成功运行了14天的连续下游处理。然而，应该注意的是，这些柱子可能在之前的过程中一直处于无菌状态。
在两个工程运行中使用的0.7％(v/v)PAA树脂浆液和填充程序以及随后的0.2％(v/v)PAA消毒有效地消毒了柱子并允许14天内对蛋白质产品进行连续的蛋白A亲和色谱捕获。对于任一工程运行(参见下表8和表9)，在蛋白A步骤或下游方法中均未检测到生物负载，BioSMB滑架按设计运行了14天。
表7：柱消毒实验的消毒条件和结果
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表8：运行1的生物负载结果。从蛋白A上样液、蛋白A流通液和蛋白A洗脱液中抽取样品。表8中称为“ND”的样品未提交用于生物负载分析。ProA＝蛋白A亲和色谱基质柱；ND＝无数据。
Figure BDA0003205347400000712
表9：运行2的生物负载结果。从蛋白A上样液、蛋白A流通液和蛋白A洗脱液中抽取样品。表9中称为“ND”的样品未提交用于生物负载分析。ProA＝蛋白A亲和色谱基质柱；ND＝无数据。
Figure BDA0003205347400000713
实施例4：一次性生物反应器(SUB)至最终切向流过滤(TFF)的连续过程
以500L灌注生物反应器规模进行一组两个运行，证明本发明方法的连续实施方式，用于生产纯化的目标蛋白质或纯化的蛋白质药物--从一次性灌注生物反应器至最终配制步骤，以获得包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物。示例性方法的流程图显示于图22。在灌注生物反应器的下游，以下步骤流体连接并以连续模式操作：CadenceTM
Figure BDA0003205347400000721
PD系统(Pall)上的蛋白A亲和色谱捕获步骤，两罐PallCadenceTM病毒灭活系统上的低pH病毒灭活(VI)步骤、深度过滤步骤、离子交换精制步骤和连续的最终配制步骤，包括两级单程切向流过滤(SPTFF)和在线渗滤(ILDF)模块。考虑到过滤器的额外成本以及所得材料并非用于非临床或临床研究的事实，这些运行排除了病毒过滤器。然而，在生产用于临床使用的目标蛋白质时，可以包括病毒过滤。在每个单元操作之间，使用一次性缓冲容器(SUSV)来管理工艺中的流速差异并对工艺异常做出反应。此外，在IEX步骤之前的缓冲容器用碱滴定至pH设定值，在IEX步骤之后的缓冲容器用酸滴定至pH值设定值。显示整体的连续方法性能的结果，但重点关注深度过滤和IEX步骤，作为连续队列的新添加步骤。SPTFF-ILDF方法和结果在下文的实施例5中讨论。
材料和方法。500L一次性灌注生物反应器以类似于上文实施例1中描述的方法的方式操作。下游方法连续运行14天。采用的第一色谱系统是蛋白A亲和色谱，它在CadenceTM
Figure BDA0003205347400000722
PD系统(Pall；“BioSMB”)连续色谱系统上进行，使用四根柱子。通过将树脂在0.7％(v/v)PAA中制成浆液，用0.7％(v/v)PAA填充树脂来填充柱子。通过进行高度等效理论板(HETP)和不对称分析来测试填充性能。填充程序是非无菌步骤，因此在开始该过程之前，在将柱连接至BioSMB之后，用0.2％(v/v)PAA对柱进行消毒(参见本文实施例3)。蛋白A亲和色谱步骤以类似于实施例1中描述的方法的方式操作，包括在生物反应器和蛋白A系统之间使用缓冲容器(SUSV1)。
用CadenceTM病毒灭活系统(Pall)进行低pH病毒灭活(VI)，该系统包含两个用于收集、酸化和中和的一次性混合罐。病毒灭活步骤以类似于上文实施例2中描述的方法的方式进行。在两个VI一次性混合罐之一中收集多种蛋白A洗脱液。用酸将蛋白A洗脱池调至低pH值，在此pH值下维持目标孵育时间以灭活可能存在的病毒。病毒灭活后，用碱将池调至中性pH值。然后将此种中和的病毒灭活产物池(NVIP)从混合罐中泵出到位于深度过滤器推车之前的SUSV2。在酸化、保持和中和过程中，下一系列的蛋白A洗脱液被收集在病毒灭活系统的第二个VI一次性混合罐中。在蛋白A过程中重复交替收集罐的循环。
使用深度过滤推车，中和的病毒灭活产物池(NVIP)通过深度过滤器和0.22μm过滤器过滤(参见图22)。图22所示的SUSV2和SUSV3之间的深度过滤推车更详细的示意图如图23所示。使用前，深度过滤器在123.1℃下高压灭菌60分钟，以减少任何潜在的生物负载。然后将深度过滤器安装到过滤器支架中，冲洗，用0.5N NaOH进行消毒，用缓冲液平衡。然后将过滤器支架安装在深度过滤推车上。推车上可安装两个深度过滤器/终过滤器组件。NVIP材料通过一侧(DF-1)过滤，直至达到深度过滤器的最大通量。此时，第二深度过滤器/终过滤器组件上线以接收上样材料。达到上样目标后，用缓冲液冲洗第一深度过滤器组件以从深度过滤器中回收残留产品。这与使用连接至深度过滤器组件和缓冲袋的第二泵进行在线处理同时发生。冲洗完成后，安装新的深度过滤器组件。在安装到系统中之前，每组深度过滤器均经过高压灭菌和冲洗。以达到通量限制的程度重复该过程，直至蛋白A循环完成。
如图22所示，在上样至第二色谱系统(离子交换(IEX)柱)之前，将过滤的中和病毒灭活产物池(FNVIP)收集在SUSV3中至适当体积。IEX流通步骤在
Figure BDA0003205347400000731
Ready(GEHealthcare Life Sciences)一次性色谱系统上进行。柱子和树脂在使用前用0.5NNaOH进行消毒。在IEX色谱步骤开始之前，病毒灭活产物池视需要通过向SUSV3中连续添加滴定剂来调节pH值。在线监测IEX柱流出物在280nm波长处的吸光度，用于收集IEX池；视需要，通过在SUSV4中连续添加滴定剂来调节包含蛋白质的纯化产物池的pH值，以进行继续处理，在最终UF/DF之前过滤(0.22μm)以得到过滤物，在包括病毒过滤系统的实施方式中，其将是无病毒过滤物，例如，用于获得临床可用的蛋白质药物(参见图22)。对于此连续IEX步骤，使用单个柱子。由于非上样步骤(平衡、洗涤、汽提、再生)需要将色谱柱从样品中取出，这导致该步骤的非上样阶段SUSV3体积增加。为了在SUSV3中保持液位控制，一旦重新开始上样阶段，使用比进入的缓冲容器体积流速更高的流速来降低缓冲容器的体积。也通过使用自动化来改变IEX色谱系统的泵速来保持一次性缓冲容器中的预设体积范围，来维持SUSV3中的液位控制。
如本文所述，本发明的方法利用连续单元操作之间的SUSV来管理流速差异，以提供单元操作之间的压力中断，以及提供对系统中的干扰做出反应的时间。这些缓冲容器的自动化控制策略如实施例1中所述进行操作。进行了两次运行(运行#1和运行#2)，上游单元操作以相同方式进行。对于下游处理，运行#1与运行#2略有不同，运行#1的单元操作通过IEX步骤连接并连续运行。在运行#1中，SPTFF/ILDF没有连接至上游的单元操作，而是以半连续形式单独运行。而在运行#2中，所有单元操作均连接起来，从灌注生物反应器至SPTFF/ILDF步骤以连续形式运行，得到包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物。某些控制方面(如SUSV1的液位控制)在运行#1中也不起作用，但除此之外，方法步骤和操作参数以类似的方式配置。
结果。灌注培养过程进行了22至23天的生产。连续的下游过程连接至500L灌注生物反应器并运行总持续时间为14天。运行#1和运行#2的结果相似。作为运行#2的总体总结，每根柱子有39个蛋白A循环(总共156个洗脱峰)、53个VI循环在两个罐之间交替、4个深度过滤循环(在循环之间更换新过滤器)和70个IEX循环。
所有上游和下游步骤均作为完全/功能封闭的系统进行操作。“完全封闭的”系统被定义为不将产品暴露于室内环境的工艺系统，向封闭系统添加材料可避免产品暴露于室内环境。例如，上游生物反应器是一个完全封闭的系统，永远不会对环境开放。“功能封闭的”系统被定义为可打开(例如，安装过滤器或色谱柱)但通过在引入产品之前对系统进行消毒而恢复至封闭状态的工艺系统，例如下游系统通过使用消毒剂使其关闭而在功能上关闭(Palberg等，Challenging the Cleanroom Paradigm for BiopharmaceuticalManufacturing of Bulk Drug,Substances，BioPharm International，第24卷，第8期(2011))。所有系统均设置了伽马辐照和高压灭菌的组件、用于连接的无菌连接器或可焊接管，以及用于废弃物管线的一次性气闸组件，以便为每个步骤建立一个封闭的系统边界。通过对无法进行伽马辐照或高压灭菌的组件进行消毒，使系统在功能上处于封闭状态。如本实施例4中方法部分所述，用过乙酸(PAA)对蛋白A柱和树脂进行消毒，用0.5N NaOH对深度过滤膜、IEX柱和树脂以及SPTFF-ILDF膜进行消毒。下表10和表11总结了在不同日期从过程中的多个点采样的生物负载和内毒素数据。结果表明，使用适当的程序将连续过程作为完全/功能封闭的系统进行操作可成功实现低生物负载控制的状态。
表10：图22中示意性说明的实施方式中500L运行#2的生物负载结果(CFU/10mL)的总结。ProA＝蛋白A亲和色谱基质柱。
Figure BDA0003205347400000741
表11：图22中示意性说明的实施方式中500L运行#2的内毒素结果(EU/mL)的总结。ProA＝蛋白A亲和色谱基质柱。
Figure BDA0003205347400000751
实施例5：单程切向流过滤/在线渗滤(SPTFF/ILDF)
在本实施例中，实施例4中描述的本发明方法的一组两个运行从生物反应器至最终配制步骤以完全连续模式进行，包括单程切向流过滤(SPTFF)和在线渗滤(ILDF)。SPTFF和ILDF的好处包括最大限度地减少对大型过程中储存容器或贮存器的需求，以及减少产物池需要保持在可能比最终配方条件更不稳定的条件下的时间。此外，与传统的批处理过程相比，可能使用更少的过滤面积。然而，实施连续方法形式存在挑战，包括：SPTFF和ILDF设备的长时间运行以及以前未知的长时间污垢特性；由于自动化进行调整以保持缓冲容器容量以及使不同单元操作之间的流速匹配，改变进料流速的先前未知的影响；以及长期保持清洁加工。如下文进一步描述的，本发明满足了所有这些挑战。
方法和材料。上文的实施例3和实施例4中描述了在SPTFF/ILDF步骤之前的前述制造方法步骤和消毒。对于下游的单程切向流过滤(SPTFF)和在线渗滤单元操作，两次运行均使用了CadenceTM单程TFF模块(SPTFF；Pall)和CadenceTM在线渗滤(ILDF；Pall)设备。两种设备均是多级切向流过滤(TFF)盒，每次运行均使用新膜。SPTFF和ILDF设备和流路在图24中示意性说明。对于运行#1中的设置，系统的SPTFF部分的所有管道组件均经过高压灭菌，而对于系统的ILDF部分，系统的某些部分仅用0.5N NaOH进行消毒且未高压灭菌；这导致在ILDF池中观察到生物负载。为了缓解运行#2的这个问题，所有管线、流量计和压力传感器均进行了高压灭菌，但电导率传感器未进行高压灭菌。电导率传感器喷有消毒剂
Figure BDA0003205347400000752
并连接至无菌罩中的管线上。将生产线连接至SPTFF和ILDF设备后，膜和流路在使用前用0.5N NaOH进行消毒。使用前冲洗以更快的流速进行，同时保持压力<20psi。消毒后，系统在功能上封闭运行，所有连接器均由可焊接管制成或为商业获得的
Figure BDA0003205347400000753
连接器(Colder Products Company)。SPTFF(来自SUSV4)的进料流速与前一色谱步骤的产物流出物流速相匹配。滞留物泵控制滞留物流速，从而控制SPTFF设备中的产物浓缩系数。对于SPTFF步骤，产物在过滤器中浓缩。设定的滞留物流速(例如，比进料流速低5至10倍，取决于所需的浓缩系数)决定了通过渗透物取出的缓冲液的量，浓缩滞留的产品。ILDF进料连接至SPTFF的滞留物，在步骤之间有一个可选的断流水箱，即缓冲容器。在本实施例中，在运行#1中，带有混合器的高压灭菌2L生物反应器用作SPTFF和ILDF步骤之间的可选缓冲容器，但也可使用另一种类型的缓冲容器，例如一次性缓冲容器(SUSV)。SPTFF/ILDF设置的示意图(图24)显示了运行#1设置，在SPTFF和ILDF之间有一个带有混合器的高压灭菌2L缓冲容器(图24中称为“断流水箱”)用于大部分运行。如下面的数据所示，在运行的最后几天拆除了缓冲容器。在运行#2中，SPTFF和ILDF单元操作之间没有放置缓冲容器。运行#2将SPTFF滞留物管线直接连接至ILDF进料管线。此种连接不仅消除了对缓冲容器的需要，而且还消除了泵2的设置。ILDF的进料流速与SPTFF的滞留物流速相匹配。ILDF的滞留物被控制在与进料流相同的速率。单独的渗滤泵将制剂缓冲液送入ILDF装置的多个通道。向制剂缓冲液的转化由渗滤进料流速与ILDF进料/滞留物流速的比率控制。两个装置的渗透物均通过前面实施例中所述的气闸排出。
结果。SPTFF和ILDF模块在两次运行期间始终以完全连续模式运行，在12天内没有明显的结垢迹象或性能降低，在整个运行期间SPTFF低于5psi的一致压力和ILDF低于15psi的一致压力证明了这一点。在中断所有泵后，两个系统均迅速恢复。产品的浓缩系数在整个运行期间保持在低于进料流速约5至10倍的预定值，基于所需的浓缩系数，池的最终电导率与起始渗滤缓冲液相匹配。运行1处理了总共4.8kg质量输出量的产品，运行#2处理了7.3kg质量输出量的产品。运行1的总产率为98％；未计算运行2的总产率。
上述仅是示例性的，本发明的技术人员可根据目标特定重组治疗性蛋白质药物的需要容易地改变组分和操作参数。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.生产纯化的目标蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统中，得到包含纯化的目标蛋白质的组合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中，第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统中的一个以上包括一次性组件。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在2个、3个、4个、5个或6个一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，一个以上一次性生物反应器可包含约50L至约4000L体积的液体培养基。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液以相对于彼此固定的比例直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，同时还以相对于多种不同的浓缩组分溶液的不同比例添加水性稀释剂，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂以相对于彼此固定的比例直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂以相对于彼此固定的比例注入混合室中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中；所述新鲜的无菌液体培养基在添加至每个灌注生物反应器之前同时进行混合，保持恒定的培养体积。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，使用包括检测器的自动化控制器来测量一次性缓冲容器中的流体体积，并且处理器改变第一色谱系统的泵速，在一次性缓冲容器中保持预设的体积范围。
13.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(b)、(c)、(d)或(e)中的一个以上从前一步骤开始以不间断流的方式自动且流体地进行；在一个以上步骤之间采用缓冲容器，并且处理器在后续步骤中改变泵速，在后续步骤之前调节缓冲容器的预设体积范围。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在步骤(b)、(c)、(d)或(e)中的一个以上之间进行pH和/或电导率负载的在线或容器内调节。
15.根据权利要求1所述的方法，其中：
(i)过程自动化系统至少与一个以上一次性灌注生物反应器、一次性缓冲容器和第一色谱系统进行电子通信；
(ii)所述过程自动化系统存储第一组控制模块，控制一个以上一次性灌注生物反应器的至少一个一次性灌注生物反应器的操作；
(iii)所述过程自动化系统存储第二组控制模块，控制进料罐的操作；
(iv)所述过程自动化系统存储第三组控制模块，控制收集罐的操作；以及
(v)至少一个一次性灌注生物反应器在逻辑上被配置为与一个以上进料罐、一个以上收集罐或过滤器组连接。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述至少一个一次性灌注生物反应器设置在滑架上，所述滑架包括多个通信接口，将所述至少一个一次性灌注生物反应器电子连接至多个便携式设备。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述方法还包括：
通过所述过程自动化系统，基于经由通信接口接收的数据，确定所述一次性缓冲容器已连接至多个通信接口中的一个通信接口，所述数据指示所述一次性缓冲容器的标识符和所述一次性缓冲容器的功能；以及
至少部分地基于所述一次性缓冲容器的标识符和功能，确定所述一次性缓冲容器是收集罐以及确定所述第三组控制模块用于控制所述一次性缓冲容器的操作。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述方法还包括：
通过所述过程自动化系统，基于经由附加通信接口接收的附加数据，确定混合容器已连接至多个通信接口中的附加通信接口，所述附加数据指示所述混合容器的附加标识符和所述混合容器的附加功能；以及
至少部分地基于所述混合容器的附加标识符和附加功能，确定所述混合容器是进料罐以及确定所述第二组控制模块用于控制所述混合容器的操作。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生产培养期为至少20天。
20.用于生产纯化的目标蛋白质的自动化设备，其中，所述自动化设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于通过入口将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；
(b)多个贮存器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，所述多个贮存器直接或通过可选的混合容器间接地流体连接至每个灌注生物反应器的入口，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至每个灌注生物反应器的入口。
(c)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；以及
(d)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSV1的无细胞渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中；以及
其中，自动化设备由过程自动化系统(PAS)控制。
21.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：
(e)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；以及
(f)储存容器或第二一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池。
22.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：
(g)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或第二一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(h)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(i)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化的目标蛋白质。
23.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述一个以上一次性灌注生物反应器可包含约50L至约4000L体积的液体培养基。
24.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括自动化控制器，所述自动化控制器包括检测器和处理器，所述检测器用于测量SUSVl中的流体体积，所述处理器用于改变第一色谱系统的泵速，保持SUSV1中的预设体积范围。
25.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统中的一个以上包括一次性组件。
26.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括并且在所述第一色谱系统下游直接流体连接有：
(i)第二一次性缓冲容器；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)，其适用于接收蛋白质分离物级分；
其中，(i)和(ii)适用于接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分并将所述蛋白质分离物级分流体输送至低pH或去污剂病毒灭活系统。
27.根据权利要求21所述的自动化设备，其中，低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统包括：
(i)第二一次性缓冲容器，其适用于接收蛋白质分离物级分；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)，其适用于接收蛋白质分离物级分；
其中，病毒灭活和视需要的中和在第二一次性缓冲容器内或在SUCV1和SUCV2内进行。
28.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，在将渗透物自动且流体地输送至SUSV1之前，所述自动化设备还包括中空纤维膜、一系列深度过滤器或过滤推车。
29.根据权利要求21所述的自动化设备，其中，所述自动化设备在(f)中包括一次性缓冲容器，所述一次性缓冲容器适用于接收病毒灭活产物池。
30.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括位于SUSV1上游的热交换器。
31.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括位于SUSV1上游的过滤系统。
32.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，将以下系统中的一个以上自动且流体地连接至先前的系统：
(i)第二色谱系统；
(ii)可选的第三色谱系统；
(iii)病毒过滤系统；以及
(iv)超滤/渗滤系统；
其中，可选地采用缓冲容器来调节连接系统之间的材料的不间断流。
33.根据权利要求20至22中任一项所述的自动化设备，其中：
至少一个以上一次性灌注生物反应器、SUSV1、第一色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、储存容器或一次性缓冲容器、第二色谱系统、可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统以及超滤/渗滤系统包括布置在生产线的第一配置中的第一设备，用于纯化目标蛋白质；以及
第一组控制模块被实施，控制所述第一设备的操作。
34.根据权利要求33所述的自动化设备，其中：
第二设备布置在生产线的第二配置中，用于其他纯化的目标蛋白质；所述生产线的第二配置包括至少一个以上一次性灌注生物反应器、第一色谱系统、低pH值或去污剂病毒灭活系统、第二色谱系统、超滤/渗滤系统和多个混合容器；
生产线的所述第二配置不同于生产线的所述第一配置；
第二组控制模块被实施，控制所述第二设备的操作；
所述多个混合容器中的至少一个混合容器包括在所述第一配置和所述第二配置中；以及
所述至少一个混合容器在所述第一配置中具有第一功能并且在所述第二配置中具有第二功能，所述第二功能不同于所述第一功能。
35.根据权利要求20至22中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括便携式过滤器组和生产设备控制系统，所述便携式过滤器组包括多个过滤器组件，其中：
所述多个过滤器组件中的第一过滤器组件包括第一过滤器，所述多个过滤器组件中的第二过滤器组件包括第二过滤器；以及
所述生产设备控制系统：
当材料流过第一过滤器组件时，监测所述第一过滤器组件内的压力；
确定第一过滤器组件内的压力至少为阈值；以及
发送信号，引起连接至第一过滤器组件和第二过滤器组件的分流阀运行，使材料流入第二过滤器组件。
36.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述一个以上一次性灌注生物反应器能够在允许培养的细胞将蛋白质分泌至培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少20天的生产培养期。
37.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
38.根据权利要求20所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
39.用于制造包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中；
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将所述无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统，得到包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，将新鲜的无菌液体培养基与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，然后加到一种以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
42.根据权利要求39所述的方法，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
43.用于生产纯化的蛋白质药物的自动化设备，其中，所述自动化设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的哺乳动物细胞将目标蛋白质分泌至培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；
(b)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；
(c)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSVl的渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中；
(d)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(e)储存容器或一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池；
(f)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(g)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(h)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化蛋白质药物；以及
其中，自动化设备由过程自动化系统(PAS)控制。
44.根据权利要求43所述的自动化设备，其中，多个贮存器直接或通过可选的混合容器间接地流体连接至灌注生物反应器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至所述灌注生物反应器。
45.根据权利要求43所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
46.根据权利要求43所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
47.根据权利要求20至22或43中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备被配置为以连续形式操作。
48.根据权利要求1-3、6或39中任一项所述的方法，其中，所述方法以连续形式进行。
49.根据权利要求1-3、6或39中任一项所述的方法，其中，所述第一色谱系统在使用前用包含过乙酸的化学消毒剂溶液进行消毒。
50.根据权利要求3或39所述的方法，其中，所述超滤/渗滤系统包括单程切向流过滤(SPTFF)，将SPTFF的操作压力控制在约0.25psi至约60psi。
51.根据权利要求3或39所述的方法，其中，所述超滤/渗滤系统包括在线深度过滤(ILDF)，将ILDF的操作压力控制在约0.25psi至约60psi。

Claims (56)

1.生产纯化的目标蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中。
2.生产纯化的目标蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统中，得到包含纯化的目标蛋白质的组合物。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
7.根据权利要求1、2或4所述的方法，其中，第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统中的一个以上包括一次性组件。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在2个、3个、4个、5个或6个一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，一个以上一次性生物反应器可包含约50L至约4000L体积的液体培养基。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液以相对于彼此固定的比例直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，同时还以相对于多种不同的浓缩组分溶液的不同比例添加水性稀释剂，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
11.根据权利要求2所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂以相对于彼此固定的比例直接注入灌注生物反应器中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
12.根据权利要求2所述的方法，其中，通过将多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂以相对于彼此固定的比例注入混合室中，将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中；所述新鲜的无菌液体培养基在添加至每个灌注生物反应器之前同时进行混合，保持恒定的培养体积。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，使用包括检测器的自动化控制器来测量一次性缓冲容器中的流体体积，并且处理器改变第一色谱系统的泵速，在一次性缓冲容器中保持预设的体积范围。
14.根据权利要求3或4所述的方法，其中，步骤(b)、(c)、(d)或(e)中的一个以上从前一步骤开始以不间断流的方式自动且流体地进行；在一个以上步骤之间采用缓冲容器，并且处理器在后续步骤中改变泵速，在后续步骤之前调节缓冲容器的预设体积范围。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤(b)、(c)、(d)或(e)中的一个以上之间进行pH和/或电导率负载的在线或容器内调节。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中：
(i)过程自动化系统至少与一个以上一次性灌注生物反应器、一次性缓冲容器和第一色谱系统进行电子通信；
(ii)所述过程自动化系统存储第一组控制模块，控制一个以上一次性灌注生物反应器的至少一个一次性灌注生物反应器的操作；
(iii)所述过程自动化系统存储第二组控制模块，控制进料罐的操作；
(iv)所述过程自动化系统存储第三组控制模块，控制收集罐的操作；以及
(v)至少一个一次性灌注生物反应器在逻辑上被配置为与一个以上进料罐、一个以上收集罐或过滤器组连接。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述至少一个一次性灌注生物反应器设置在滑架上，所述滑架包括多个通信接口，将所述至少一个一次性灌注生物反应器电子连接至多个便携式设备。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述方法还包括：
通过所述过程自动化系统，基于经由通信接口接收的数据，确定所述一次性缓冲容器已连接至多个通信接口中的一个通信接口，所述数据指示所述一次性缓冲容器的标识符和所述一次性缓冲容器的功能；以及
至少部分地基于所述一次性缓冲容器的标识符和功能，确定所述一次性缓冲容器是收集罐以及确定所述第三组控制模块用于控制所述一次性缓冲容器的操作。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述方法还包括：
通过所述过程自动化系统，基于经由附加通信接口接收的附加数据，确定混合容器已连接至多个通信接口中的附加通信接口，所述附加数据指示所述混合容器的附加标识符和所述混合容器的附加功能；以及
至少部分地基于所述混合容器的附加标识符和附加功能，确定所述混合容器是进料罐以及确定所述第二组控制模块用于控制所述混合容器的操作。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述一次性缓冲容器的标识符和所述一次性缓冲容器的功能存储在与所述一次性缓冲容器连接的加密锁上。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述生产培养期为至少20天。
22.用于生产纯化的目标蛋白质的自动化设备，其中，所述自动化设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的细胞将蛋白质分泌至液体培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；
(b)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；以及
(c)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSV1的无细胞渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中；以及
其中，自动化设备由过程自动化系统(PAS)控制。
23.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：多个贮存器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，所述多个贮存器直接或通过可选的混合容器间接地流体连接至所述灌注生物反应器，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至所述灌注生物反应器。
24.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：
(d)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；以及
(e)储存容器或第二一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池。
25.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括：
(f)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或第二一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(g)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(h)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化的目标蛋白质。
26.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述一个以上一次性灌注生物反应器可包含约50L至约4000L体积的液体培养基。
27.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括自动化控制器，所述自动化控制器包括检测器和处理器，所述检测器用于测量SUSVl中的流体体积，所述处理器用于改变第一色谱系统的泵速，保持SUSV1中的预设体积范围。
28.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，第一色谱系统、第二色谱系统、第三色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、中和系统、病毒过滤系统或超滤/渗滤系统中的一个以上包括一次性组件。
29.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括并且在所述第一色谱系统下游直接流体连接有：
(i)第二一次性缓冲容器；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)，其适用于接收蛋白质分离物级分；
其中，(i)和(ii)适用于接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分并将所述蛋白质分离物级分流体输送至低pH或去污剂病毒灭活系统。
30.根据权利要求24所述的自动化设备，其中，低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统包括：
(i)第二一次性缓冲容器，其适用于接收蛋白质分离物级分；或
(ii)至少两个可自动切换的交替一次性收集容器(SUCV1和SUCV2)，其适用于接收蛋白质分离物级分；
其中，病毒灭活和视需要的中和在第二一次性缓冲容器内或在SUCV1和SUCV2内进行。
31.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，在将渗透物自动且流体地输送至SUSV1之前，所述自动化设备还包括中空纤维膜、一系列深度过滤器或过滤推车。
32.根据权利要求24所述的自动化设备，其中，所述自动化设备在(e)中包括一次性缓冲容器，所述一次性缓冲容器适用于接收病毒灭活产物池。
33.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括位于SUSV1上游的热交换器。
34.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括位于SUSV1上游的过滤系统。
35.根据权利要求25所述的自动化设备，其中，将以下系统中的一个以上自动且流体地连接至先前的系统：
(i)第二色谱系统；
(ii)可选的第三色谱系统；
(iii)病毒过滤系统；以及
(iv)超滤/渗滤系统；
其中，可选地采用缓冲容器来调节连接系统之间的材料的不间断流。
36.根据权利要求22至25中任一项所述的自动化设备，其中：
至少一个以上一次性灌注生物反应器、SUSV1、第一色谱系统、低pH或去污剂病毒灭活系统、储存容器或一次性缓冲容器、第二色谱系统、可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统以及超滤/渗滤系统包括布置在生产线的第一配置中的第一设备，用于纯化目标蛋白质；以及
第一组控制模块被实施，控制所述第一设备的操作。
37.根据权利要求36所述的自动化设备，其中：
第二设备布置在生产线的第二配置中，用于其他纯化的目标蛋白质；所述生产线的第二配置包括至少一个以上一次性灌注生物反应器、第一色谱系统、低pH值或去污剂病毒灭活系统、第二色谱系统、超滤/渗滤系统和多个混合容器；
生产线的所述第二配置不同于生产线的所述第一配置；
第二组控制模块被实施，控制所述第二设备的操作；
所述多个混合容器中的至少一个混合容器包括在所述第一配置和所述第二配置中；以及
所述至少一个混合容器在所述第一配置中具有第一功能并且在所述第二配置中具有第二功能，所述第二功能不同于所述第一功能。
38.根据权利要求22至25中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备还包括便携式过滤器组和生产设备控制系统，所述便携式过滤器组包括多个过滤器组件，其中：
所述多个过滤器组件中的第一过滤器组件包括第一过滤器，所述多个过滤器组件中的第二过滤器组件包括第二过滤器；以及
所述生产设备控制系统：
当材料流过第一过滤器组件时，监测所述第一过滤器组件内的压力；
确定第一过滤器组件内的压力至少为阈值；以及
发送信号，引起连接至第一过滤器组件和第二过滤器组件的分流阀运行，使材料流入第二过滤器组件。
39.根据权利要求38所述的自动化设备，其中，在第一时间段内，所述过滤器组连接在所述第一一次性缓冲容器(SUSVl)和所述第一色谱系统之间，所述材料包括渗透物，所述过滤器组连接至第一加密锁，所述第一加密锁指示所述过滤器组的第一标识符和所述过滤器组的第一功能。
40.根据权利要求39所述的自动化设备，其中，在第二时间段内，所述过滤器组被包括在所述超滤/渗滤系统中，所述材料是无病毒过滤物，所述过滤器组连接至第二加密锁，所述第二加密锁指示所述过滤器组的第二标识符和所述过滤器组的第二功能。
41.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述一个以上一次性灌注生物反应器能够在允许培养的细胞将蛋白质分泌至培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少20天的生产培养期。
42.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
43.根据权利要求22所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
44.用于制造包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许细胞将蛋白质分泌至培养基中的条件下，在包含液体培养基的一个以上一次性灌注生物反应器中培养哺乳动物细胞至少10天的生产培养期；在生产培养期间，周期性地或连续地将新鲜的无菌液体培养基添加至一个以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积，这与从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的培养物体积直接相关；移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至一次性缓冲容器，然后进入第一色谱系统，由此使蛋白质集中在蛋白质分离物级分中；
(b)将蛋白质分离物级分转移至低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，得到包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(c)将病毒灭活产物池引入第二色谱系统，得到包含蛋白质的纯化产物池；
(d)将包含蛋白质的纯化产物池转移至可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，得到包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(e)将所述无病毒过滤物转移至超滤/渗滤系统，得到包含目标蛋白质的纯化蛋白质药物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，将新鲜的无菌液体培养基与多种不同的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂同时进行混合，然后加到一种以上灌注生物反应器中，在每个灌注生物反应器中保持恒定的培养体积。
46.根据权利要求44所述的方法，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
47.根据权利要求44所述的方法，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
48.用于生产纯化的蛋白质药物的自动化设备，其中，所述自动化设备包括：
(a)一个以上一次性灌注生物反应器，所述一次性灌注生物反应器能够在允许培养的哺乳动物细胞将目标蛋白质分泌至培养基中的条件下，容纳液体培养基持续至少10天的生产培养期；所述一次性灌注生物反应器适用于将新鲜的无菌液体培养基流体地接收至每个灌注生物反应器中，这与生产培养期间从每个灌注生物反应器中作为渗透物或细胞渗出物体积连续或周期性取出的条件培养基体积直接相关；
(b)第一一次性缓冲容器(SUSV1)，所述移除体积的渗透物从一个以上一次性灌注生物反应器自动且流体地输送至所述第一一次性缓冲容器(SUSV1)；
(c)第一色谱系统，其适用于自动且流体地接收来自SUSVl的渗透物，从而将蛋白质捕获在蛋白质分离物级分中；
(d)低pH或去污剂病毒灭活系统和视需要的中和系统，其适用于自动且流体地接收来自第一色谱系统的蛋白质分离物级分，由此获得包含蛋白质的病毒灭活产物池；
(e)储存容器或一次性缓冲容器，其适用于接收病毒灭活产物池；
(f)第二色谱系统，其适用于流体地接收来自储存容器或一次性缓冲容器的病毒灭活产物池，由此获得包含蛋白质的纯化产物池；
(g)可选的第三色谱系统和/或病毒过滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统的包含蛋白质的纯化产物池，由此获得包含蛋白质的无病毒过滤物；以及
(h)超滤/渗滤系统，其适用于流体地接收来自第二色谱系统或第三色谱系统和/或病毒过滤系统的无病毒过滤物，由此获得纯化蛋白质药物；以及
其中，自动化设备由过程自动化系统(PAS)控制。
49.根据权利要求48所述的自动化设备，其中，多个贮存器直接或通过可选的混合容器间接地流体连接至灌注生物反应器，每个贮存器适用于容纳浓缩的培养基组分溶液或水性稀释剂，所述混合容器适用于接收来自多个贮存器的预定比例的浓缩培养基组分溶液和水性稀释剂并同时混合它们，可选的混合容器直接流体连接至所述灌注生物反应器。
50.根据权利要求48所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是重组蛋白质。
51.根据权利要求48所述的自动化设备，其中，所述目标蛋白质是治疗性蛋白质。
52.根据权利要求22至25或48中任一项所述的自动化设备，其中，所述自动化设备被配置为以连续形式操作。
53.根据权利要求1-4、7或44中任一项所述的方法，其中，所述方法以连续形式进行。
54.根据权利要求1-4、7或44中任一项所述的方法，其中，所述第一色谱系统在使用前用包含过乙酸的化学消毒剂溶液进行消毒。
55.根据权利要求4或44所述的方法，其中，所述超滤/渗滤系统包括单程切向流过滤(SPTFF)，将SPTFF的操作压力控制在约0.25psi至约60psi。
56.根据权利要求4或44所述的方法，其中，所述超滤/渗滤系统包括在线深度过滤(ILDF)，将ILDF的操作压力控制在约0.25psi至约60psi。
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