CN113396820A - 一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农作物培育技术领域，具体涉及一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法。该利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，以牛大力种子作为组织培养的原料，获得牛大力悬浮细胞培养液，以包含LG1/8上的QTL的辣椒植物作为组织培养的原料，再进行杂交育种，并且QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，获得杂交培育组织，再通过增殖培育和生根培育，最终培育出牛大力新品种。本发明由于采用分子标记的杂交育种法，并引入了含LG1/8上的QTL的辣椒植物的基因，含LG1/8上的QTL的辣椒植物的基因具有对牛肝菌和左旋霉素的抗性，进而能减少死苗现象，整体成活率高，且培育方法简单，培育成本较低。

Description

一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法
技术领域
本发明涉及农作物培育技术领域，具体涉及一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法。
背景技术
牛大力，别名猪脚笠、金钟根、山莲藕、倒吊金钟、大力薯。是一种药材。为豆科崖豆藤属植物。牛大力以根入药，主要成份为蛋白质、淀粉质及生物碱等。牛大力主治肺热、肺虚咳嗽、肺结核、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性支气管炎、慢性肝炎等，是生产多种中成药的主要原料。其主要生产于我国广东、广西、海南和越南，不同牛大力种源叶片、花、果及薯的形态、长势表现各异，根系穿透力强，辐射范围大。近年来，牛大力遭受滥采滥挖，野生资源几近灭绝。因此亟需进行人工繁殖。
目前，牛大力的人工种植方法有播种育苗、扦插育苗和组织培育苗，其中，组织培育苗作为牛大力规模化繁殖的有效方法之一，然而目前多采用幼嫩茎段为外植体，消毒比较困难。另外，人工种植牛大力常出现死苗、叶片发黄、缓苗时间长、不生长等现象，牛大力的整体成活率不高。并且，目前由于牛大力的种子价格较高，导致培育成本较高。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，能够大大减少死苗现象，整体成活率高，且降低了培育成本。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
提供一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，它包括以下步骤：
S1、种子的采集与处理：采集牛大力果实后取出种子，并将种子用清水浸泡，并进行消毒，再用乙醇浸泡，然后用无菌水冲洗，备用；
S2、组织培养：将S1步骤中得到的种子，经诱导培养和继代培养获得继代培养组织，再将继代培养组织经悬浮细胞培养获得牛大力悬浮细胞培养液；
S3、杂交育种：将包含LG1/8上的QTL的辣椒植物依照S2的步骤获得辣椒植物悬浮细胞培养液，然后将S2步骤获得的牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液混合，并且所述QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进行杂交育种，获得杂交培育组织；
S4、增殖培育：将S3步骤获得的杂交培育组织转入增殖培养基中进行增殖培育，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
S5、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽剪下浸泡于IBA溶液中，再接入生根培养基上诱导生根，即培育出牛大力新品种。
上述技术方案中，所述S1步骤中，采集果实后取出种子，并将种子用45～50℃的清水浸泡3～5天，并用0.1～0.2％高锰酸钾溶液进行消毒8～10min，再用80～85％的乙醇浸泡8s～12s，然后用无菌水冲洗3-5次，备用。
上述技术方案中，所述S2步骤中，所述诱导培养的方法为：将S1步骤中得到的种子接种至诱导培养基上于黑暗条件、25-30℃下诱导培养25-30天得到诱导培养组织；
所述继代培养的方法为：将诱导培养组织转接至增殖培养基上于黑暗条件、25-30℃下进行继代培养2-4次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为7-10天；
所述悬浮细胞培养的方法如下：将继代培养组织接种至液体培养基中，并置于转动频率为95-100r/min、温度为27℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每10-15天转接培养一次，转接培养4-6次后，得到牛大力悬浮细胞培养液。
上述技术方案中，所述诱导培养基的配方为：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；所述增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
上述技术方案中，所述S3步骤中，所述SEQ ID NO.1的51位核苷酸是C。
上述技术方案中，所述S3步骤中，所述SEQ ID NO.1的序列号如下：
CCCGAGGTAGACATCATACGAGGAGAATTTCCTGCTAAAATTGAGTTGTT[T/C]TGTCAGAGGAGTCGCTCACATGATAAGTATGTTGGCGAGTTAGACCTCAT。
上述技术方案中，所述S4步骤中，所述增殖培养基为：MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+6-BA 3mg/L+IAA 0.2mg/L+NAA 0.8mg/L，pH值为5.8。
上述技术方案中，所述S4步骤中，所述增殖培育的条件为：温度为25-28℃，光照时间为12h/天，光照强度为1800-2000lx。
上述技术方案中，所述S5步骤中，所述IBA溶液的浓度为45～50mg/L；
所述生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+AC 0.5g/L，pH值为5.8。
上述技术方案中，所述S5步骤中，所述生根培育的条件为：温度为25-28℃，光照时间为12h/天，光照强度为1800-2200lx。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
(1)本发明提供的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，以牛大力种子作为组织培养的原料，获得牛大力悬浮细胞培养液，同时以包含LG1/8上的QTL的辣椒植物作为组织培养的原料，再将牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液进行杂交育种，并且QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进而获得杂交培育组织，再通过增殖培育和生根培育，最终培育出牛大力新品种。本发明的培育方法，由于采用了分子标记的杂交育种法，并引入了含LG1/8上的QTL的辣椒植物的基因，含LG1/8上的QTL的辣椒植物的基因具有对牛肝菌的抗性和对左旋霉素的抗性，进而能够大大减少死苗现象，整体成活率高。
(2)本发明提供的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，具有培育方法简单，培育成本较低，并能适合于大规模培育的特点。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，它包括以下步骤：
S1、种子的采集与处理：采集牛大力果实后取出种子，并将种子用清水浸泡，并进行消毒，再用乙醇浸泡，然后用无菌水冲洗，备用；
S2、组织培养：将S1步骤中得到的种子，经诱导培养和继代培养获得继代培养组织，再将继代培养组织经悬浮细胞培养获得牛大力悬浮细胞培养液；
S3、杂交育种：将包含LG1/8上的QTL的辣椒植物依照S2的步骤获得辣椒植物悬浮细胞培养液，然后将S2步骤获得的牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液混合，并且所述QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进行杂交育种，获得杂交培育组织；
S4、增殖培育：将S3步骤获得的杂交培育组织转入增殖培养基中进行增殖培育，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
S5、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽剪下浸泡于IBA溶液中，再接入生根培养基上诱导生根，即培育出牛大力新品种。
实施例2。
一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，它包括以下步骤：
S1、种子的采集与处理：采集果实后取出种子，并将种子用48℃的清水浸泡4天，并用0.15％高锰酸钾溶液进行消毒9min，再用83％的乙醇浸泡10s，然后用无菌水冲洗4次，备用；
S2、组织培养：将S1步骤中得到的种子，经诱导培养和继代培养获得继代培养组织，再将继代培养组织经悬浮细胞培养获得牛大力悬浮细胞培养液；
本实施例中，诱导培养的方法为：将S1步骤中得到的种子接种至诱导培养基上于黑暗条件、28℃下诱导培养27天得到诱导培养组织；其中，诱导培养基的配方为：MS+20mg/L2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，继代培养的方法为：将诱导培养组织转接至增殖培养基上于黑暗条件、28℃下进行继代培养3次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为8天；其中，增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，悬浮细胞培养的方法如下：将继代培养组织接种至液体培养基中，并置于转动频率为98r/min、温度为27℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每13天转接培养一次，转接培养5次后，得到牛大力悬浮细胞培养液。
S3、杂交育种：将包含LG1/8上的QTL的辣椒植物依照S2的步骤获得辣椒植物悬浮细胞培养液，然后将S2步骤获得的牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液混合，并且所述QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进行杂交育种，获得杂交培育组织；其中，SEQ ID NO.1的51位核苷酸是C；
其中，SEQ ID NO.1的序列号如下：
Figure BDA0002947847330000051
S4、增殖培育：将S3步骤获得的杂交培育组织转入增殖培养基中进行增殖培育，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
增殖培养基为：MS+蔗糖20g/L+卡拉胶
4g/L+6-BA 3mg/L+IAA 0.2mg/L+NAA 0.8mg/L，pH值为5.8；
其中，增殖培育的条件为：温度为26℃，光照时间为12h/天，光照强度为1900lx；
S5、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽剪下浸泡于浓度为48mg/L的IBA溶液中，再接入生根培养基上诱导生根，即培育出牛大力新品种；
其中，生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+AC 0.5g/L，pH值为5.8；
其中，生根培育的条件为：温度为27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1900lx。
实施例3。
一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，它包括以下步骤：
S1、种子的采集与处理：采集果实后取出种子，并将种子用45℃的清水浸泡5天，并用0.1％高锰酸钾溶液进行消毒10min，再用80％的乙醇浸泡12s，然后用无菌水冲洗3次，备用；
S2、组织培养：将S1步骤中得到的种子，经诱导培养和继代培养获得继代培养组织，再将继代培养组织经悬浮细胞培养获得牛大力悬浮细胞培养液；
本实施例中，诱导培养的方法为：将S1步骤中得到的种子接种至诱导培养基上于黑暗条件、25℃下诱导培养30天得到诱导培养组织；其中，诱导培养基的配方为：MS+20mg/L2，4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，继代培养的方法为：将诱导培养组织转接至增殖培养基上于黑暗条件、25℃下进行继代培养4次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为7天；其中，增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，悬浮细胞培养的方法如下：将继代培养组织接种至液体培养基中，并置于转动频率为95r/min、温度为27℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每10天转接培养一次，转接培养4次后，得到牛大力悬浮细胞培养液。
S3、杂交育种：将包含LG1/8上的QTL的辣椒植物依照S2的步骤获得辣椒植物悬浮细胞培养液，然后将S2步骤获得的牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液混合，并且所述QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进行杂交育种，获得杂交培育组织；其中，SEQ ID NO.1的51位核苷酸是C；
其中，SEQ ID NO.1的序列号如下：
Figure BDA0002947847330000061
S4、增殖培育：将S3步骤获得的杂交培育组织转入增殖培养基中进行增殖培育，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
增殖培养基为：MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+6-BA 3mg/L+IAA 0.2mg/L+NAA0.8mg/L，pH值为5.8；
其中，增殖培育的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/天，光照强度为1800lx；
S5、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽剪下浸泡于浓度为45mg/L的IBA溶液中，再接入生根培养基上诱导生根，即培育出牛大力新品种；
其中，生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+AC 0.5g/L，pH值为5.8；
其中，生根培育的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/天，光照强度为1800lx。
实施例4。
一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，它包括以下步骤：
S1、种子的采集与处理：采集果实后取出种子，并将种子用50℃的清水浸泡3天，并用0.2％高锰酸钾溶液进行消毒8min，再用85％的乙醇浸泡8ss，然后用无菌水冲洗5次，备用；
S2、组织培养：将S1步骤中得到的种子，经诱导培养和继代培养获得继代培养组织，再将继代培养组织经悬浮细胞培养获得牛大力悬浮细胞培养液；
本实施例中，诱导培养的方法为：将S1步骤中得到的种子接种至诱导培养基上于黑暗条件、30℃下诱导培养25天得到诱导培养组织；其中，诱导培养基的配方为：MS+20mg/L2，4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，继代培养的方法为：将诱导培养组织转接至增殖培养基上于黑暗条件、30℃下进行继代培养2次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为10天；其中，增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，悬浮细胞培养的方法如下：将继代培养组织接种至液体培养基中，并置于转动频率为100r/min、温度为27℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每15天转接培养一次，转接培养6次后，得到牛大力悬浮细胞培养液。
S3、杂交育种：将包含LG1/8上的QTL的辣椒植物依照S2的步骤获得辣椒植物悬浮细胞培养液，然后将S2步骤获得的牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液混合，并且所述QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进行杂交育种，获得杂交培育组织；其中，SEQ ID NO.1的51位核苷酸是C；
其中，SEQ ID NO.1的序列号如下：
Figure BDA0002947847330000071
S4、增殖培育：将S3步骤获得的杂交培育组织转入增殖培养基中进行增殖培育，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
增殖培养基为：MS+蔗糖20g/L+卡拉胶
4g/L+6-BA 3mg/L+IAA 0.2mg/L+NAA 0.8mg/L，pH值为5.8；
其中，增殖培育的条件为：温度为28℃，光照时间为12h/天，光照强度为2000lx；
S5、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽剪下浸泡于浓度为50mg/L的IBA溶液中，再接入生根培养基上诱导生根，即培育出牛大力新品种；
其中，生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+AC 0.5g/L，pH值为5.8；
其中，生根培育的条件为：温度为28℃，光照时间为12h/天，光照强度为2200lx。
实施例5。
一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，它包括以下步骤：
S1、种子的采集与处理：采集果实后取出种子，并将种子用46℃的清水浸泡4天，并用0.18％高锰酸钾溶液进行消毒9min，再用81％的乙醇浸泡11s，然后用无菌水冲洗4次，备用；
S2、组织培养：将S1步骤中得到的种子，经诱导培养和继代培养获得继代培养组织，再将继代培养组织经悬浮细胞培养获得牛大力悬浮细胞培养液；
本实施例中，诱导培养的方法为：将S1步骤中得到的种子接种至诱导培养基上于黑暗条件、29℃下诱导培养26天得到诱导培养组织；其中，诱导培养基的配方为：MS+20mg/L2，4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，继代培养的方法为：将诱导培养组织转接至增殖培养基上于黑暗条件、26℃下进行继代培养3次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为9天；其中，增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；
本实施例中，悬浮细胞培养的方法如下：将继代培养组织接种至液体培养基中，并置于转动频率为96r/min、温度为27℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每12天转接培养一次，转接培养5次后，得到牛大力悬浮细胞培养液。
S3、杂交育种：将包含LG1/8上的QTL的辣椒植物依照S2的步骤获得辣椒植物悬浮细胞培养液，然后将S2步骤获得的牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液混合，并且所述QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进行杂交育种，获得杂交培育组织；其中，SEQ ID NO.1的51位核苷酸是C；
其中，SEQ ID NO.1的序列号如下：
Figure BDA0002947847330000081
Figure BDA0002947847330000091
S4、增殖培育：将S3步骤获得的杂交培育组织转入增殖培养基中进行增殖培育，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
增殖培养基为：MS+蔗糖20g/L+卡拉胶
4g/L+6-BA 3mg/L+IAA 0.2mg/L+NAA 0.8mg/L，pH值为5.8；
其中，增殖培育的条件为：温度为27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1950lx；
S5、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽剪下浸泡于浓度为46mg/L的IBA溶液中，再接入生根培养基上诱导生根，即培育出牛大力新品种；
其中，生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+AC 0.5g/L，pH值为5.8；
其中，生根培育的条件为：温度为26℃，光照时间为12h/天，光照强度为2100lx。
最后应当说明的是，以上实施例和实验例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
基因序列表
<110> 广州麦林种业有限公司
<120> 一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法
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<212> DNA
<213> BsaID
<400> 1
CCCGAGGTAGACATCATACGAGGAGAATTTCCTGCT
AAAATTGAGTTGTT[T/C]TGTCAGAGGAGTCGCTCAC
ATGATAAGTATGTTGGCGAGTTAGACCTCAT

Claims (10)

1.一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
S1、种子的采集与处理：采集牛大力果实后取出种子，并将种子用清水浸泡，并进行消毒，再用乙醇浸泡，然后用无菌水冲洗，备用；
S2、组织培养：将S1步骤中得到的种子，经诱导培养和继代培养获得继代培养组织，再将继代培养组织经悬浮细胞培养获得牛大力悬浮细胞培养液；
S3、杂交育种：将包含LG1/8上的QTL的辣椒植物依照S2的步骤获得辣椒植物悬浮细胞培养液，然后将S2步骤获得的牛大力悬浮细胞培养液与辣椒植物悬浮细胞培养液混合，并且所述QTL与SEQ ID NO.1的分子标记连接，进行杂交育种，获得杂交培育组织；
S4、增殖培育：将S3步骤获得的杂交培育组织转入增殖培养基中进行增殖培育，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
S5、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽剪下浸泡于IBA溶液中，再接入生根培养基上诱导生根，即培育出牛大力新品种。
2.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S1步骤中，采集果实后取出种子，并将种子用45～50℃的清水浸泡3～5天，并用0.1～0.2％高锰酸钾溶液进行消毒8～10min，再用80～85％的乙醇浸泡8s～12s，然后用无菌水冲洗3-5次，备用。
3.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S2步骤中，所述诱导培养的方法为：将S1步骤中得到的种子接种至诱导培养基上于黑暗条件、25-30℃下诱导培养25-30天得到诱导培养组织；
所述继代培养的方法为：将诱导培养组织转接至增殖培养基上于黑暗条件、25-30℃下进行继代培养2-4次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为7-10天；
所述悬浮细胞培养的方法如下：将继代培养组织接种至液体培养基中，并置于转动频率为95-100r/min、温度为27℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每10-15天转接培养一次，转接培养4-6次后，得到牛大力悬浮细胞培养液。
4.根据权利要求3所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述诱导培养基的配方为：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；所述增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
5.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S3步骤中，所述SEQ ID NO.1的51位核苷酸是C。
6.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S3步骤中，所述SEQ ID NO.1的序列号如下：
CCCGAGGTAGACATCATACGAGGAGAATTTCCTGCT
AAAATTGAGTTGTT[T/C]TGTCAGAGGAGTCGCTCAC
ATGATAAGTATGTTGGCGAGTTAGACCTCAT。
7.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S4步骤中，所述增殖培养基为：MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+6-BA 3mg/L+IAA0.2mg/L+NAA 0.8mg/L，pH值为5.8。
8.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S4步骤中，所述增殖培育的条件为：温度为25-28℃，光照时间为12h/天，光照强度为1800-2000lx。
9.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S5步骤中，所述IBA溶液的浓度为45～50mg/L；
所述生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+卡拉胶4g/L+AC 0.5g/L，pH值为5.8。
10.根据权利要求1所述的一种利用分子标记杂交育种法培育牛大力新品种的方法，其特征在于：所述S5步骤中，所述生根培育的条件为：温度为25-28℃，光照时间为12h/天，光照强度为1800-2200lx。
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