CN113390941A - 一种基于离子液体涂层的flm-eks-cze在线富集测定有机酸含量的方法 - Google Patents

一种基于离子液体涂层的flm-eks-cze在线富集测定有机酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于离子液体涂层的FLM‑EKS‑CZE在线富集测定有机酸含量的方法，所述的有机酸为香草酸、丹参素钠、阿魏酸，本发明在离子液体修饰涂层毛细管柱的基础上将自由液膜与电动增压在线富集技术相结合，毛细管经离子液体涂层修饰后，电渗流方向被逆转，化学稳定性好，对目标分析物的分离效果好，此外，在后续的FLM‑EKS‑CZE两步在线富集方法中，FLM‑FESI堆积和t‑ITP堆积的发生进一步提高了对目标分析物的富集效率，本发明方法重现性良好、分析时间短、灵敏度较高，检测限低，富集倍数高达2000倍以上，符合绿色化学的要求，适用于中药等复杂样品基质中有机酸含量的测定。

Description

一种基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸 含量的方法
技术领域
本发明涉及毛细管电泳分析领域，尤其涉及一种基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE(自由液膜-电动增压-毛细管区带电泳模式)在线富集测定有机酸的方法。
背景技术
有机酸，即含羧基(–COOH)的酸性化合物，广泛存在于植物的叶、花、茎等各部位。我国天然有机酸资源丰富，在中药中已经发现了较多种类和数量的有机酸类成分，且具有重要的生物活性，如抗氧化、抗癌、抗炎和预防心血管疾病等。然而，中药化学成分复杂，结构类型繁多，含量低微，传统的分析方法往往耗时耗力耗财。因此，寻求快速、高效、简便的分析方法，对高效分析测定中药中有机酸类成分而言具有重要意义。
常用的有机酸检测分析技术主要是高效液相色谱法和气相色谱法等，但上述经典方法存在分析时间过长、溶剂消耗量大等缺点。与之相比，毛细管电泳分析技术(capillaryelectrophoresis，CE)分析速度快、操作简便、有机溶剂消耗少、分离模式多样，但低灵敏度限制了该方法在复杂基质痕量组分测定中的应用。为了提高CE检测灵敏度，获得更佳的富集效果，多种在线富集技术的联用为研究者们提供了新的研究思路。
电动增压(EKS)在线富集技术，结合了场放大进样堆积(FESI)和瞬时等速电泳(t-ITP)两步在线堆积技术，并因上千万倍的检测灵敏度及良好的分离效果而备受研究者们的关注。FESI，是利用电泳和电渗的合力使待测物质在电场作用下进入毛细管内以实现堆积，一般是将待测物质溶解在低电导的溶液中，通过电场力作用使待测物质在界面处堆积，电迁移速率越快的待测物质堆积效果越好。等速电泳(Isotachophoresis，ITP)属于毛细管电泳类型之一，通常用于生物样品中蛋白质、核酸等物质的分离，其原理是根据样本内各组分在毛细管中的淌度不同而逐渐形成各自独立的电泳区带，并在区带内富集聚焦，直至依次流出流路另一端，从而实现分离。
Kuban于2014年提出将不与水混溶的有机溶剂塞与微电膜萃取(μ-EME)相结合，并命名为“自由液膜(FLM)”(Kuban P，Bocek P.Micro-electromembrane extraction acrossfree liquid membranes.Instrumentation and basic principles[J].J.Chromatogr.A,2014,1346:25-33)。FLM作为含水供体和受体溶液之间的选择性相界面，具有促进带电物质在透明管中电诱导转移的作用。2017年，Chui团队首次将FLM运用于EKS方法中，从而进一步提高CE的灵敏度，并将提出的FLM-EKS-CZE技术成功应用于环境水样中的百草枯和敌草快的分析(Chui M Q,Thang L Y,See H H.Integration of the free liquid membraneinto electrokinetic supercharging-capillary electrophoresis for thedetermination of cationic herbicides in environmental water samples[J].J.Chromatogr.A,2016,1481:145-151.)。
公开号为CN108519421B的中国专利文献中公开了一种基于FESI-sweeping-MSS联用在线富集测定痕量有机阴离子的方法，该发明以离子液体为毛细管柱涂层材料，改变了有机阴离子的电渗流(EOF)方向，同时以离子液体为胶束，基于FESI-sweeping-MSS(场放大-扫集-有机溶剂堆积)三步富集有机阴离子，但该发明基于胶束电动毛细管色谱(MEKC)技术，待测离子需依赖阳离子胶束的作用进行富集，可利用该方法检测的有机阴离子为丹参素钠、原儿茶酸、香草酸的阴离子。
公开号为CN111007160A的中国专利文献中公开了一种基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，该发明利用胶束电动色谱模式(MEKC)下的场放大进样(FESI)和胶束溶剂堆积技术(MCDS)的联用技术来分析测定复杂样品基质中的中性分析物，但该发明中，待测中性物质仍需依赖胶束的作用进行富集，富集倍数为140～152倍，可利用该方法检测的中性物质为酸枣仁皂苷A或酸枣仁皂苷B。
发明内容
本发明提供了一种基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，操作简单、分析时间短、重现性较好、试剂消耗少，目标物富集效果好、检测灵敏度高。
具体采用的技术方案如下：
一种基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，所述的有机酸为香草酸、丹参素钠、阿魏酸，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)制备离子液体涂层的毛细管柱
取新的石英毛细管，用NaOH溶液冲洗活化，再用纯水、离子液体冲洗后，得到离子液体涂层的毛细管柱；
(2)FLM-EKS-CZE两步在线富集测定有机酸含量
将待测样品预处理后利用FLM-EKS-CZE两步在线富集后进行检测，再结合建立的香草酸、丹参素钠和阿魏酸的标准曲线得到样品中的香草酸、丹参素钠、阿魏酸的含量；
所述的FLM-EKS-CZE两步在线富集条件为：背景缓冲液为含甲醇的缓冲盐溶液，取步骤(1)制备得到的离子液体涂层的毛细管柱，压力注入前导电解质(LE)溶液，再压力导入不溶水的有机溶剂塞(FLM)，随后注入样品溶液，负压移除有机溶剂塞，最后压力注入后导电解质(TE)溶液，分离电压为–20～–30kV，温度为20～30℃，检测波长为205nm。
本发明利用离子液体修饰涂层毛细管柱，并在毛细管区带电泳模式(CZE)下将自由液膜与电动增压在线富集技术相结合，技术原理为：毛细管柱经离子液体涂层修饰后，电渗流方向被逆转，与有机酸阴离子分析物电泳方向一致，再利用FLM-EKS-CZE两步在线富集测定有机酸含量。
FLM-EKS-CZE两步在线富集的技术原理为：
(1)FLM-FESI堆积：在电动注入样品溶液之前，先向毛细管柱内常压导入一段的水不混溶的有机溶剂塞(FLM)，然后，电动注入样品溶液，样品离子靠其自身电泳迁移穿过FLM，处于样品和LE区带间的低电导率FLM，可增强电动进样的FESI堆叠效率，此时，因为样品区带与LE区带存在明显的场强差，使得样品离子在与LE区相邻界面迁移速率减慢，并在该界面处实现初步FESI堆积；
(2)t-ITP堆积：因自由液膜的存在会破坏后续的t-ITP堆积过程，因此在t-ITP阶段开始之前需移除柱内的FLM，在负压下，将FLM从毛细管入口端完全移出，随后注入TE溶液，施加正电压，t-ITP堆叠发生，到达稳态时，所有区带具有相同的迁移速度，各区带始终保持相邻，随着分离模式从t-ITP转换为CZE，样品离子因其不同的迁移率而最终被分离。
步骤(1)中，所述的离子液体为10～60mM的1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐水溶液，优选30mM，选用离子液体1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐涂层能够实现三种待测有机酸阴离子的基线分离，且具有较高的灵敏度，且该离子液体涂层具有较好的耐酸碱性、耐有机溶剂性以及较强的稳定性。
优选的，步骤(1)中，制备离子液体涂层的毛细管柱的方法为：取新的石英毛细管，在+25kV压力下，依次用1M的NaOH水溶液冲洗20min、0.1M的NaOH水溶液冲洗10min进行活化，随后依次用纯水冲洗10min、1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐水溶液冲洗30min、纯水冲洗5min，得到离子液体涂层的毛细管柱。
步骤(2)中，所述的待测样品为中药制剂脑心通胶囊或大鼠粪便样品。
步骤(2)中，所述的待测样品预处理方法为：
中药制剂脑心通胶囊：取脑心通胶囊的内容物，研细，按料液比1:20(w/v，g/mL)与70％甲醇水溶液(v/v)混合密封，水浴超声提取，将提取液蒸至近干，用纯水复溶，并用30％甲醇水溶液(v/v)稀释，制备得到脑心通胶囊样品溶液。
大鼠粪便样品：取干燥粪便样品，研碎，按料液比1:5(w/v，g/mL)与甲醇混合，涡旋、超声提取后离心，然后转移上清液于快速溶剂挥发仪中挥干甲醇，用纯水超声复溶，再次离心，最后，向上述处理后的粪便样品中加入香草酸、丹参素钠和阿魏酸的混合标准溶液，并用30％甲醇水溶液(v/v)稀释得到加标大鼠粪便样品溶液。
步骤(2)中，所述的背景缓冲液中甲醇体积分数为0～35％，缓冲盐为醋酸铵、磷酸二氢钠、硼砂或Tris-HOAc，浓度为10～50mM。
考虑到分离度，峰形和分离效率，所述的背景缓冲液中甲醇的体积分数优选为5％，缓冲盐优选为Tris-HOAc，浓度优选为20mM。
t-ITP堆叠的发生须满足以下条件：LE的电泳淌度最高，TE的电泳淌度最低，样品溶液的电泳淌度介于LE和TE之间，因此，LE具有比样品溶液更高的离子迁移率。
步骤(2)中，所述的LE溶液为氯化铵(NH4Cl)溶液，浓度为30～100mM，注入时间为10～90s。
步骤(2)中，所述的样品溶液的注入时间为30～180s。
毛细管内的FLM一直存在，会破坏后续的t-ITP过程，从而阻碍后续过程中待测目标物的进一步分离，因此在t-ITP堆积发生前，移除FLM是非常必要的。
步骤(2)中，所述的FLM为邻硝基苯辛醚(NPOE)、磷酸三辛酯(TEHP)或正辛醇。
优选的，步骤(2)中，所述的FLM为NPOE，注入时间为3～8s，移除时间为5～15s。
步骤(2)中，所述的TE为2-环己胺基乙磺酸(CHES)溶液，浓度为5～60mM，注入时间为10～50s。
优选的，步骤(2)中，所述的背景缓冲液为20mM Tris-HOAc溶液(含5％体积分数甲醇，pH＝6)；所述的LE溶液为50mM NH4Cl溶液，所述的TE溶液为20mM CHES溶液，取步骤(1)制备得到的离子液体涂层的毛细管柱，0.5psi压力注入LE溶液30s，0.5psi压力导入NPOE有机溶剂塞5s，10kV电压注入样品溶液120s，施加–0.5psi压力移除NPOE有机溶剂塞10s，最后0.5psi压力注入TE溶液40s，分离电压为–20kV，温度为30℃，检测波长为205nm。
所述的标准曲线建立方法为：将浓度分别为0.05～0.5μg/mL的香草酸、丹参素钠和阿魏酸的混合标准溶液利用FLM-EKS-CZE两步在线富集后进行检测，再根据得到的毛细管电泳谱图分别绘制香草酸、丹参素钠和阿魏酸的标准曲线。
在优化的检测条件下，三种有机酸香草酸、丹参素钠、阿魏酸能够在15min内实现基线分离，富集倍数分别可达到2745、2862、2006倍。
本发明相对现有技术，具有如下的优点：
(1)本发明方法首次在毛细管区带电泳模式下，将自由液膜与电动增压技术相结合，并成功应用于分离和检测中药等复杂样品基质中的有机酸(香草酸、丹参素钠、阿魏酸)。
(2)本发明联用了离子液体涂层修饰改性毛细管内壁的方法和FLM-EKS-CZE两步在线富集方法，毛细管经离子液体涂层修饰后，电渗流方向被逆转，化学稳定性好，且显著改善了对目标分析物的分离效果、提高了富集效率，便于后续FLM-EKS-CZE两步在线富集方法的进行。
(3)本发明方法重现性良好、分析时间短、灵敏度较高，且目标分析物的富集倍数高达2006～2862倍，检测限低至1.5～5.0ng/mL，相比高效液相色谱法而言，更加符合绿色化学的要求，更适用于中药等复杂样品基质中有机酸的测定，拓宽了毛细管电泳分析技术的应用范围。
附图说明
图1为不同涂层材料对三种待测有机酸阴离子分离的影响，其中，1为丹参素钠，2为香草酸，3为阿魏酸。
图2为背景缓冲液中缓冲盐种类及浓度对三种待测有机酸阴离子分离的影响，图中，A为缓冲液种类对三种待测有机酸阴离子分离的影响，B为缓冲液浓度对三种待测有机酸阴离子分离的影响，其中，1为丹参素钠，2为香草酸，3为阿魏酸。
图3为背景缓冲液中甲醇含量对三种待测有机酸阴离子分离的影响，其中，1为香草酸，2为丹参素钠，3为阿魏酸。
图4为前导电解质NH4Cl溶液的浓度和注入时间对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响，其中，A为NH4Cl溶液的浓度对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响，B为NH4Cl溶液的注入时间对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响。
图5为后导电解质CHES溶液的浓度和注入时间对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响，其中，A为CHES溶液的浓度对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响，B为CHES溶液的注入时间对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响。
图6为样品溶液进样时间对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响，其中，A为样品溶液进样时间对三种待测有机酸阴离子特征峰峰高的影响；B为样品溶液不同进样时间下三种待测有机酸阴离子的分离电泳图，1为香草酸，2为丹参素钠，3为阿魏酸。
图7为有机溶剂塞的种类对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响，其中，1为香草酸，2为丹参素钠，3为阿魏酸。
图8为常规进样模式、FESI-CZE一步富集、EKS-CZE一步富集和FLM-EKS-CZE两步在线富集方法下三种待测有机酸阴离子的电泳图，其中，1为香草酸，2为丹参素钠，3为阿魏酸。
图9为基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法测试加标大鼠粪便样品(A)和脑心通胶囊(B)中三种待测有机酸阴离子电泳图，其中，a为溶剂组，b为样品溶液组，1为香草酸，2为丹参素钠，3为阿魏酸。
具体实施方式
实施例1：离子液体涂层的毛细管柱的制备与稳定性考察
1)不同涂层材料对于有机酸阴离子分离性能的比较
实验主要探究了未经涂层的裸柱以及常规阳离子表面活性剂海美溴铵(HDMB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和离子液体1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐水溶液涂层后的毛细管柱分离三种待测有机酸阴离子的效果。在毛细管内充满背景缓冲液前，需先用HDMB或离子液体溶液直接冲洗30min，对毛细管内壁进行涂层，制备得到HDMB和离子液体涂层的毛细管柱，这可以起到抑制或反转电渗流(EOF)的作用。与其他两种涂层材料不同的是，将CTAB添加于背景缓冲液中，即可作为动态涂层而使毛细管内壁带正电荷。分离效果图如图1所示，就分辨率而言，涂层毛细管柱的性能明显优于未涂层的裸柱，其次，就目标分析物的分离度而言，离子液体涂层的毛细管柱能够实现三种待测有机酸阴离子的基线分离，且具有较高的灵敏度，因此，选择离子液体涂层用于后续实验研究。
2)离子液体涂层的毛细管柱的制备
取新的未涂层石英毛细管(内径50μm，总长50cm，有效长度41.5cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)，在+25kV压力下，依次用1M的NaOH水溶液冲洗20min、0.1M的NaOH水溶液冲洗10min进行活化，随后依次用纯水冲洗10min、离子液体(30mM的1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐的水溶液)冲洗30min、纯水冲洗5min，得到离子液体涂层的毛细管柱备用。
3)离子液体涂层的毛细管柱的化学稳定性考察
涂层的化学稳定性是评价涂层毛细管柱优良的重要指标，可以凭借EOF的变化加以判断。表1记录了离子液体涂层的毛细管柱经0.1M NaOH、0.1M HCl、甲醇和乙腈的冲洗后测得EOF的变化情况。由结果可见，经强酸、强碱和有机溶剂冲洗后，其EOF降解率小于5.15％，因此，离子液体涂层具有较好的耐酸碱、耐有机溶剂性，化学稳定性好。
表1离子液体涂层的毛细管柱的化学稳定性
Figure BDA0003105217570000081
电泳条件：背景缓冲液为40mM Tris-HOAc溶液，分离电压为20kV，内标物为丙酮。
实施例2：FLM-EKS-CZE两步在线富集测定方法的建立
1)富集条件的优化
(1)背景缓冲液中缓冲盐的种类和浓度的选择
实验探究了多种背景缓冲液体系，如醋酸铵(NH4Ac)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、Tris-HOAc或硼砂(Na2B4O7)缓冲液，以便选择最优选的背景缓冲液。缓冲盐种类对三种待测有机酸阴离子分离效果的影响如图2A所示，当选用Tris-HOAc背景缓冲液体系时，三种待测有机酸阴离子能够实现基线分离，噪声低、基线平稳且峰形良好，因此选用Tris-HOAc背景缓冲液体系。
对Tris-HOAc的浓度进行优化，维持背景缓冲液中甲醇体积分数为35％，探究Tris-HOAc浓度在10～50mM范围内变化对待测三种有机酸分离效果的影响。如图2B所示，Tris-HOAc浓度从10mM增加到20mM时，三种有机酸的峰高、峰面积及检测灵敏度均有所提高，但当Tris-HOAc浓度超出20mM时，峰面积虽持续增加，但峰展宽明显，且迁移时间延长，这可能归因于较高的运行电流产生的焦耳热效应。基于对分离度，峰形和分离效率三者的考虑，Tris-HOAc浓度优化为20mM。
(2)背景缓冲液中甲醇含量的优化
背景缓冲液中的有机改性剂含量是影响分离效率和提高目标分析物之间分离度的重要参数之一。实验探究了甲醇体积分数为0％、5％、15％、25％、35％时三种待测有机酸阴离子的出峰情况。由图3可知，当甲醇体积分数为5％时，三种待测有机酸阴离子即可达到基线分离，随着甲醇含量的增加，三种待测有机酸阴离子的分离度不断增大，但分析时间逐渐增加且拖尾明显，综上，当甲醇的体积分数为5％时，即可在不影响分析时间的情况下获得基线分离的目标峰，所以背景缓冲液中甲醇的体积分数优选为5％。
(3)LE的浓度和注入时间的优化
t-ITP堆叠的发生须满足以下条件：LE溶液的电泳淌度最高，TE溶液的电泳淌度最低，待测样品的电泳淌度介于LE溶液和TE溶液之间，因此，LE溶液具有比待测样品更高的离子迁移率。Cl-因其较高的电泳迁移率而常被选为前导离子，因此，本实验选用NH4Cl溶液作为前导电解质溶液，并在30～100mM的浓度范围内探究LE溶液浓度对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响。由图4A可见，三种待测有机酸阴离子的富集倍数随LE溶液浓度增加而不断增加，并在LE溶液浓度为50mM达到最高，若Cl-浓度过高(＞50mM)，不但没有提高检测灵敏度，还导致了富集倍数和富集效率的降低，综上，LE溶液优选为50mM NH4Cl溶液。
进一步地，实验探究了0.5psi下不同LE溶液注入时间(10～90s)对待测有机酸阴离子富集效果的影响。如图4B所示，0.5psi下持续注入LE溶液30s，获得了理想的富集效果。但随着注入时间的增加，富集倍数开始逐渐下降，当LE溶液注入时间较长时，可能会扩大堆积前t-ITP区的迁移范围，甚至使t-ITP堆积后的样品分离所需的有效毛细管空间变小，综上，LE溶液的注入条件为：50mM NH4Cl溶液以0.5psi恒压注入30s。(4)TE溶液的浓度和注入时间的优化
TE溶液也是控制t-ITP堆叠的另一关键因素。因此，为了获得更好的目标分析物的富集效果，本实验采用CHES溶液作为TE溶液，在5～60mM的浓度范围内探究TE溶液浓度对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响。如图5A所示，当CHES溶液浓度为20mM时，富集倍数最大，随着CHES溶液浓度的进一步增加，由于t-ITP区带的扩展，峰高降低，灵敏度降低，综上，TE溶液优选为20mM CHES溶液。
进一步地，实验探究了0.5psi下不同TE溶液注入时间(10～50s)对三种待测有机酸阴离子富集效果的影响。如图5B所示，当注入时间由10s增加到40s时，富集倍数迅速增加，在40s时富集倍数达到最大，但注入时间大于40s时，富集效果又开始减弱，可能与堆积前t-ITP区带的长时间迁移扩展有关，综上，TE溶液的注入条件为：20mM CHES溶液以0.5psi恒压注入40s。
(5)样品溶液进样时间的优化
增加进样量是提高毛细管电泳灵敏度的有效方法之一。在10kV电压下，实验探究了不同进样时间(30～180s)对三种待测有机酸阴离子的峰高和分离情况的影响，结果如图6A所示，随着样品溶液电动进样时间增加至120s，峰高逐渐增加；当进样时间在120s～180s时，峰高趋于稳定，但峰展宽愈加明显且分析时间延长(图6B)，因此，基于对灵敏度和分辨率的考虑，样品溶液进样时间优选为120s。
(6)FLM种类的选择
在上述优化的EKS条件下，实验探究三种不同的有机溶剂FLM，邻硝基苯辛醚(NPOE)、磷酸三辛酯(TEHP)和正辛醇，对三种待测有机酸阴离子的分离效果的影响，结果如图7所示，与无FLM引入的对照组相比，以TEHP为FLM时，分离时间相对最久，且峰形严重展宽，而以正辛醇为FLM时，待测有机酸阴离子的峰面积显著减小，富集效果被大大削减。相反，NPOE的引入使待测有机酸阴离子的峰高增加、峰面积增大、分析灵敏度提高，获得了令人满意的分离富集效果，综上，FLM优选为NPOE。
(7)FLM注入时间及移除时间的优化
实验探究了3s、5s和8s的FLM注入时间对三种待测有机酸阴离子富集效率的影响。实验结果表明，注入3s NPOE时，分析物的峰面积、峰高和检测灵敏度均无明显提高，增加FLM的注入时间至8s，发现峰形变差、重现性降低，并时常有堵柱情况发生，然而，0.5psi压力下注入NPOE 5s所得分析效果优异，且重现性良好。但若毛细管内的FLM一直存在，会破坏后续的t-ITP过程，从而阻碍后续过程中待测有机酸阴离子的进一步分离，因此在t-ITP堆积发生前，移除FLM是非常必要的。实验继续探究了–0.5psi反压下移除FLM所需的最佳时间(5s，10s，15s)，结果表明，三种待测有机酸阴离子的峰面积和峰高随FLM移除时间的增加而增加，10s时即可达到较为理想的堆叠效率，但延长FLM的移除时间后，可能会因FLM移除而携带走部分样品组分，从而导致峰面积和灵敏度的降低。综上，NPOE将以0.5psi注入5s，并在注入TE之前，施加–0.5psi压力10s以移除柱内的FLM。
2)不同富集步骤的比较
实验分别探究了常规进样模式、FESI-CZE一步富集、EKS-CZE一步富集和FLM-EKS-CZE两步在线富集方法对三种待测有机酸阴离子的分离和富集效果，结果见图8，FLM-EKS-CZE两步在线富集方法与常规进样模式相比，富集效果十分显著，且与ESI-CZE一步富集和EKS-CZE一步富集相比，富集效果也明显提升。
综上所诉，优选的检测条件所述的背景缓冲液为20mM Tris-HOAc溶液(含5％体积分数的甲醇，pH＝6)；所述的LE为50mM NH4Cl溶液，所述的TE为20mM CHES溶液，取实施例1制备得到的离子液体涂层的毛细管柱，0.5psi压力注入LE 30s，0.5psi压力导入NPOE有机溶剂塞5s，10kV电压注入样品溶液120s，施加–0.5psi压力移除NPOE有机溶剂塞10s，最后0.5psi压力注入TE溶液40s。分离电压为–20kV，温度为30℃，检测波长为205nm。
实施例3：建立标准曲线、方法的线性范围、检出限、重现性和富集倍数
分别取适量1mg/mL标准溶液，精准配制浓度范围均为0.05～0.50μg/mL香草酸、丹参素钠和阿魏酸三者的混合标准溶液，并采用FLM-EKS-CZE两步在线富集方法在实施例2中优选的检测条件下平行测定三次，得到混合标准溶液的毛细管电泳谱图，以所得谱图中各标准品阴离子的峰面积为纵坐标、混合标准溶液中标准品的浓度为横坐标分别绘制香草酸、丹参素钠和阿魏酸的标准曲线，以完成标准曲线的构建。如表2所示，三种有机酸离子均呈现良好的线性关系，相关系数(r)在0.9995～0.9998之间。将1μg/mL混合对照品溶液一天之内连续进样6次以评价日内精密度，连续3天每天进样3次来评价日间精密度，最后计算所得峰面积的相对标准偏差RSD均低于2.92％。
表2方法的线性范围、检出限、重现性和富集倍数
Figure BDA0003105217570000121
富集倍数＝(本方法待测样品的峰面积/常规进样待测样品的峰面积)×稀释倍数。
常规进样条件：背景缓冲液含20mM Tris-HOAc和5％甲醇，0.5psi压力下注入50μg/mL的香草酸、丹参素钠和阿魏酸的混合标准溶液5s。计算得出FLM-EKS-CZE两步在线富集方法在实施例2中优选的检测条件下使香草酸、丹参素钠、阿魏酸三种有机酸阴离子的富集倍数高达2006～2862倍，有效提高了毛细管电泳分析技术对有机酸类化合物的检测灵敏度。
实施例4：FLM-EKS-CZE两步在线富集方法在实际样品中的应用
为了验证该基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集方法测定三种有机酸含量的实用性，在实施例2中优选的检测条件下，将实验建立的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE两步在线富集方法用于大鼠粪便样品和中药制剂脑心通胶囊中有机酸成分的检测，样品检测前需经如下预处理操作：
(1)大鼠粪便样品的预处理方法：取干燥粪便样品，研碎，精密称取100mg，并加入500μL甲醇予以混合。涡旋辅助3min，再超声提取10min，然后以13000rpm转速离心10min。随后，转移上清液于快速溶剂挥发仪下挥干甲醇，加入1mL纯水超声复溶，并再次离心10min。最后，取向上述处理后的粪便样品中加入香草酸、丹参素钠和阿魏酸混标溶液，并用30％甲醇水溶液(v/v)稀释得到加标大鼠粪便样品溶液(含有0.5μg/mL的香草酸、丹参素钠和阿魏酸)。
(2)中药制剂脑心通胶囊的预处理方法：首先，取20粒脑心通胶囊，去胶囊外壳包装后取内容物，研细。然后，精密称定2.5g粉末，置于具塞锥形瓶中，并加入50mL 70％甲醇，密塞，水浴超声提取1h(功率250W，频率50kHz)。提取液摇匀滤过，药渣及滤器用20mL的70％甲醇分数次洗涤，洗液并入滤液中，将滤液蒸至近干，用纯水复溶，并用30％甲醇水溶液(v/v)稀释至2.5mg/mL，得到脑心通胶囊样品溶液。
在实施例2中优选的检测条件下，对样品溶液和溶剂对照组进行检测，得到样品溶液和溶剂毛细管电泳谱图(见图9)，图9A为加标大鼠粪便样品，图9B为脑心通胶囊，将所得谱图中香草酸、丹参素钠、阿魏酸三种分析物的峰面积分别代入实施例3构建的标准曲线中，计算得出样品中香草酸、丹参素钠、阿魏酸三种分析物的含量。结果如下：
中药制剂脑心通胶囊中，香草酸含量为21.7μg/g，丹参素钠含量为20.82μg/g，阿魏酸含量为30.32μg/g。
大鼠粪便样品中，香草酸含量为3.08μg/g，丹参素钠含量为3.16μg/g，阿魏酸含量为3.48μg/g。
实验证明，本发明方法适用于中药等复杂样品基质中有机酸的检测，且富集效果显著，大大提高了CE检测灵敏度，具有较强的应用前景。

Claims (10)

1.一种基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，所述的有机酸为香草酸、丹参素钠、阿魏酸，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)制备离子液体涂层的毛细管柱
取新的石英毛细管，用NaOH溶液冲洗活化，再用纯水、离子液体冲洗后，得到离子液体涂层的毛细管柱；
(2)FLM-EKS-CZE两步在线富集测定有机酸含量
将待测样品预处理后利用FLM-EKS-CZE两步在线富集后进行检测，再结合建立的香草酸、丹参素钠和阿魏酸的标准曲线得到样品中的香草酸、丹参素钠、阿魏酸的含量；
所述的FLM-EKS-CZE两步在线富集条件为：背景缓冲液为含甲醇的缓冲盐溶液，取步骤(1)制备得到的离子液体涂层的毛细管柱，压力注入前导电解质溶液，再压力导入不溶水的有机溶剂塞，随后注入样品溶液，负压移除有机溶剂塞，最后压力注入后导电解质溶液，分离电压为–20～–30kV，温度为20～30℃，检测波长为205nm。
2.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的离子液体为10～60mM的1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐水溶液。
3.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的待测样品为中药制剂脑心通胶囊或大鼠粪便样品。
4.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，所述的背景缓冲液中甲醇体积分数为0～35％，缓冲盐为醋酸铵、磷酸二氢钠、硼砂或Tris-HOAc，浓度为10～50mM。
5.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的前导电解质溶液为氯化铵溶液，浓度为30～100mM，注入时间为10～90s。
6.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的样品溶液的注入时间为30～180s。
7.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的有机溶剂塞为邻硝基苯辛醚、磷酸三辛酯或正辛醇。
8.根据权利要求7所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的有机溶剂塞为邻硝基苯辛醚，注入时间为3～8s，移除时间为5～15s。
9.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的后导电解质溶液为2-环己胺基乙磺酸溶液，浓度为5～60mM，注入时间为10～50s。
10.根据权利要求1所述的基于离子液体涂层的FLM-EKS-CZE在线富集测定有机酸含量的方法，其特征在于，所述的标准曲线建立方法为：将浓度分别为0.05～0.5μg/mL的香草酸、丹参素钠和阿魏酸的混合标准溶液利用FLM-EKS-CZE两步在线富集后进行检测，再根据得到的毛细管电泳谱图分别绘制香草酸、丹参素钠和阿魏酸的标准曲线。
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