CN113388619A - 一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。WOX11基因在模式植物拟南芥和水稻中的主要功能为参与侧根或不定根的发育。在百合中，通过VIGS技术诱导LlWOX11基因沉默可显著降低珠芽诱导率；过表达LlWOX11后，珠芽诱导率升高，表明LlWOX11在百合珠芽形成中发挥重要的调控功能，所述的LlWOX11基因可对百合珠芽形成进行有效的人工干预，在提高百合繁殖效率方面将有广阔的应用前景。

Description

一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法及应用。

背景技术

百合(Lilium)是世界著名的球根花卉，其花大色艳、香味浓郁，具有很高的经济价值和观赏价值，是世界五大鲜切花之一。此外，百合含有丰富的淀粉、蛋白质、维生素、生物碱等，具有重要的食用、药用价值。

卷丹(Liliumlancifolium)又叫宜兴百合，原产于我国，其适应能力强，分布范围广，是百合属植物中兼具观赏、食用和药用价值的重要物种。其为天然三倍体，不能靠种子繁殖，但其叶腋可产生多达上百粒的珠芽。因此，珠芽繁殖成为其重要的繁殖策略。

珠芽形成于叶腋，即叶片基部与茎相连接的内侧区域，是生长于植物叶腋部位的小鳞茎或小块茎，能够依附于母体生长，成熟后可自然脱落母体并发育成新的完整个体。研究表明，腋生珠芽的形成起源于腋生分生组织，其形成过程包括：1)腋生分生组织的建立；2)珠芽原基的启动；3)珠芽原基分化形成珠芽。这些过程由一系列基因调控。目前，已有较多与腋生分生组织启动相关的基因被克隆并进行了初步的功能验证。如：拟南芥的LAS，REV和SPS基因，番茄的LS 和BL基因及水稻MOC1基因都是腋生分生组织启动的关键调控因子。而关于植物珠芽形成的相关基因分离较少，且主要集中于基因克隆和表达分析上，功能研究未见报道。因此，如何在百合中克隆珠芽形成相关基因并加以利用，对于人工调控百合珠芽形成，显著提高百合的繁殖效率具有重要的理论意义和实际应用价值。

WUSCHEL-related homeobox(WOX)是植物中特有的转录因子家族，含有一个保守的由65个氨基酸组成的DNA结合域，即同源异型结构域。同类表型突变体的筛选和基因功能研究显示，WOX家族成员在植物各级分生组织干细胞维持和器官形成方面起到重要的调控作用。前期转录组数据分析及qRT-PCR结果表明，WOX同源异型盒基因 WOX11可能在珠芽形成过程中发挥重要作用。因此，从百合中分离珠芽形成相关调控基因WOX11并阐明其功能，是研究百合珠芽形成机理的关键环节，对百合利用珠芽进行繁殖，提高百合繁殖效率具有重要意义。

因此需要一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆及其在控制百合珠芽形成中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法及其应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种百合LlWOX11基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种编码权利要求1所述百合LlWOX11基因蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取百合叶腋RNA，反转录获得cDNA；

(2)根据转录组数据设计引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得CDS序列，扩增CDS序列引物如下：

5′端引物：5′-ATGGATAGCCACACACCCAAC-3′

3′端引物：5′-CTACGAAGGCCTCGAAACCAA-3′

扩增出来的5′端和3′端序列经测序验证后与转录组序列对比，最终获得LlWOX11基因全长699bp的cDNA序列。

一种根据所述的百合珠芽形成调控基因LlWOX11在控制百合珠芽形成和提高珠芽诱导率中的应用。

一种重组载体，含有上述克隆LlWOX11基因的cDNA序列。

进一步地，所述重组载体在5′端和3′端引物分别加上16-25bp 的接头序列，引物如下：

5′端引物：5′-CACGGGGGACTCTTGACCATGGATAGCCACACACCCAAC-3′

3′端引物：5′-GGGGAAATTCGAGCTGGCTACGAAGGCCTCGAAACCAA-3′

所述重组载体通过PCR扩增，获得带接头的CDS序列，利用同源重组的方法，将NcoI和BstE II双酶切载体pCAMBIA3301获得的线性载体片段与带接头的CDS序列进行重组，最终获得重组载体。

一种重组载体，含有上述克隆LlWOX11基因的特异性沉默序列。

进一步地，所述重组载体在5′端和3′端引物分别加上21bp的接头序列，引物如下：

5′端引物为：

5′-GTGAGTAAGGTTACCGAATTCCTCGCCTTCATCATCTTCGTTTGT-3′

3′端引物为：

5′-TCCCCATGGAGGCCTTCTAGACCATATTCATTTACAGGAAGCAGC-3′

所述重组载体通过PCR扩增，获得带接头的LlWOX11基因的特异性沉默序列，利用同源重组的方法，将EcoR I酶切载体TRV₂获得的线性载体片段与带接头的目的序列进行重组，最终获得重组载体。

本发明采用上述技术方案与现有技术相比，最大的特点在于：

本发明WOX11基因功能在模式植物拟南芥和水稻中主要参与侧根或不定根的发育，克隆LlWOX11基因在VIGS沉默LlWOX11后，珠芽诱导率下降；过表达LlWOX11后，珠芽诱导率升高，表明LlWOX11 在百合中能够参与珠芽的形成，可对百合珠芽形成进行有效的人工干预，在提高百合繁殖效率方面将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为LlWOX11基因CDS区扩增电泳图；

图2为LlWOX11在珠芽形成过程中的表达模式图。A为LlWOX11 在珠芽形成不同阶段表达相对表达情况。B为LlWOX11在不同组织中相对表达情况。数值为平均值±SDs(n＝3)。小写字母a-f表示在 P<0.05水平差异显著。

图3为LlWOX11与其他WOX11s蛋白氨基酸序列对比图；

图4为LlWOX11系统进化树分析图；A：LlWOX11与拟南芥WOX 转录因子家族系统进化树分析图。B：LlWOX11与其他WOX11s系统进化树分析图。

图5为LlWOX11蛋白的亚细胞定位；

图6为pCAMBIA3301和TRV2载体示意图。A：pCAMBIA3301载体示意图。B：TRV2载体示意图。

图7为转基因拟南芥表型及分子检测图。A：PCR检测T3代拟南芥转基因植株。+为阳性对照；-为阴性对照。1-13为不同转基因株系。B：野生型Col和过表达LlWOX11的转基因植株的分枝表型。C：野生型Col和过表达LlWOX11的转基因植株的分枝数量。

图8LlWOX9和LlWOX11经VIGS沉默后叶腋的表型和相关表达分析。A：VIGS技术沉默LlWOX11后叶腋的表型。B：培养两周后的珠芽形成率。C：经VIGS沉默后LlWOX11的相对表达情况。数值为平均值±SDs(n＝3)。图C中刻度尺等于50mm。图B、C中的小写字母a-b表示在P<0.05水平差异显著。

图9LlWOX11瞬时过表达后叶腋的表型和珠芽诱导率。A：LlWOX11 瞬时过表达后叶腋的表型。B：LlWOX11瞬时过表达后叶腋异常增殖的表型。

具体实施方式

下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

本发明生物材料的来源卷丹为中国农业科学院蔬菜花卉研究所玻璃温室种植，可以对公众发放。实验中所涉及试剂盒均按照试剂说明书进行。RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、

-Blunt Cloning Kit克隆试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。反转录试剂盒

Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNAdigester plus)、荧光定量试剂盒HieffTM qPCR

Green Master Mix(No Rox)购自翌圣生物科技(上海)有限公司。CV16-Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit购自北京艾德莱生物科技有限公司。

氨苄青霉素钠盐(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin)购自Bio-topped，预混热启动高保真酶KAPA HiFi HotStart ReadyMix购自KAPA，限制性内切酶Ncol I、BstE II、EcoR I、Xba I和Xma I购自NEB。Silwet L-77购自Phytotechnology，Basta除草剂购自Coolaber。pCAMBIA-3301和TRV2载体为实验室保存。引物合成、测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例1 LlWOX11基因的克隆和生物信息学分析

1、RNA提取与cDNA合成

RNA提取：取卷丹含珠芽叶腋组织，利用天根生化科技(北京) 有限公司RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取植物总 RNA，提取方法按照说明书进行。

cDNA合成：利用翌圣生物科技(上海)有限公司

Ⅱ1st Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) 反转录试剂盒进行cDNA合成，按如下步骤操作：

(1)在RNAse-free的离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。

(2)在上一步反应管中直接加入

ⅡSuperMix plus，用移液枪轻轻吹打混匀。于PCR仪中进行如下反应：25℃，5min； 42℃，30min；85℃，5min。

2、LlWOX11基因cDNA序列PCR扩增

根据转录组数据用Primer Premier 6.0设计LlWOX11基因cDNA 序列引物，LlWOX11-F/R，正向引物序列为：5′ -ATGGATAGCCACACACCCAAC-3′，反向引物序列为：5′ -CTACGAAGGCCTCGAAACCAA-3′，以卷丹叶腋cDNA为模板进行扩增。

(1)加入

(2)98℃预变性3min；98℃加热变性10sec，60℃退火15sec， 72℃延伸15sec，35个循环；72℃充分延伸2min。

(3)将获得的PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用北京全式金生物技术有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行扩增产物片段纯化回收。

3、PCR产物与载体连接及大肠杆菌转化利用北京艾德莱生物科技有限公司CV16-Zero Background pTOPO-Blunt克隆载体将PCR回收产物连接到Blunt载体上，连接体系见表3-2，用移液枪轻轻吹打混匀后，室温连接5-10min。

连接产物按照热激法转入大肠杆菌感受态DH5α中，单克隆经PCR检测后测序。

4、生物信息学分析

利用在线软件ORF Finder(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析LlWOX11的开放阅读框以及其编码的氨基酸序列。利用DNAMAN软件将LlWOX11编码的氨基酸与其他WOX11s蛋白氨基酸序列进行同源序列比对。通过MEGA 7.0软件将LlWOX11氨基酸与拟南芥WOX转录因子家族以及其他物种 WOX11s氨基酸序列构建Neighbor-Joining系统进化树，bootstrap 重复次数为1000次。

5、结果分析

LlWOX11的开放阅读框长699bp(图1)，序列见SEQ ID NO. 1，编码232个氨基酸残基，序列见SEQ ID NO.2。利用在线软件ORF Finder使用DNAMAN软件将LlWOX11编码的232个氨基酸与其他 WOX11s蛋白氨基酸序列进行对比，LlWOX11氨基酸与其它WOX11s蛋白氨基酸序列同源性为55.46％，N-端具有HOX结构域(图2中方框内)。通过MEGA 7.0软件将LlWOX11氨基酸与拟南芥WOX转录因子家族氨基酸序列构建系统发育树，发现LlWOX11属于WOX转录因子家族的中间进化支成员(图3A)。通过MEGA 7.0软件将LlWOX11氨基酸与其他物种WOX11s氨基酸序列构建系统发育树，发现LlWOX11与单子叶植物WOX11s聚为一支，并与油棕亲缘关系最近(图3B)。

实施例2 LlWOX11基因表达分析

1、RNA提取与cDNA合成

RNA提取：取卷丹含珠芽叶腋组织以及不同组织(茎尖、根尖、鳞片、幼叶、成熟叶、茎、花瓣、柱头、花药和子房)，利用天根生化科技(北京)有限公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取植物总RNA，提取方法按照说明书进行。

cDNA合成：利用翌圣生物科技(上海)有限公司

Ⅱ1st Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) 反转录试剂盒进行cDNA合成。

2、Quantitative Real-time RT-PCR

使用Primer 6.0设计荧光定量引物，qLlWOX11-F/R，正向引物序列为：5′-TCGCTGCGTCCAATCCTCGG-3′，反向引物序列为：5′-CTGCCTGTTCTCCATCAATCCC-3′。以lilyActin(Gene Bank Accession Number：JX826390)为内参基因，荧光定量引物为qlilyActin-F/R，正向引物序列为：5′-GCACCTGAAGAGCACCCT-3′，反向引物序列为：5 ′-GGCGTAAAGCGACAAAA-3′。使用上海翊圣公司Hieff^TM qPCR

Green Master Mix(NoRox)试剂盒进行荧光定量PCR，扩增程序如下：95℃3min；95℃20s，60℃10s，72℃20s，40个循环。用CFX ManagerTM软件v3.1(Bio-Rad)分析引物扩增效率。采用2^-ΔΔCt方法计算不同基因的相对表达量。所有qRT-PCR实验均包含3次生物学重复和3次技术重复。

3、LlWOX11基因的表达分析

根据之前的结果，本发明将珠芽形成过程分为6个时期(S0-S5)，其中S1-S2为珠芽原基启动阶段，S3-S4为珠芽原基形成阶段，S5为珠芽形成阶段。对LlWOX11在这一过程中的表达量进行分析，结果如图4所示，LlWOX11在整个珠芽形成过程中表达量持续升高，表明LlWOX11可能与珠芽形成相关(图4A)。不同组织的表达结果表明， LlWOX11主要在叶腋(S4时期)、茎尖、根和鳞片中表达，在S4时期的叶腋具有最高的相对表达(图4B)，进一步表明LlWOX11可能参与珠芽形成。

实施例3 LlWOX11亚细胞定位

1、pCAMBIA2300-LlWOX11载体构建

根据LlWOX11基因的CDS序列，设计接头引物，PCR扩增基因全长序列(去除终止密码子)，上游引物sl-LlWOX11-F为：5′ -TTGGAGAGGACAGGGTACCCGGGATGGATAGCCACACACCCAAC-3′；下游引物sl-LlWOX11-R为：5′ -CCATGGTACTAGTGTCGACTCTAGACTACGAAGGCCTCGAAACCAA-3′。PCR产物回收后备用。pCAMBIA2300载体经XmaI和XbaI酶切后，回收备用。

采用同源重组法将LlWOX11接头产物融合到pCAMBIA2300线性载体中。同源重组体系中载体与插入片段摩尔比为1:5。移液枪轻轻吹打混匀后于PCR仪中，50℃重组15-20min，重组产物转入大肠杆菌感受态转化中，单克隆经检测阳性后送测序。

2、农杆菌转化

阳性质粒通过冻融法转入到农杆菌感受态GV3101菌株中，转化步骤如下：

(1)2μL质粒加入50μL GV3101感受态细胞中，液氮速冻1 min，37℃水浴5min。

(2)加入500μL YEB液体培养基，28℃200rpm振荡培养 2-4h。

(3)5000rpm离心2min，吸出300μL上清后吹打混匀，涂布于含50mg/L Kana和25mg/L Rif的YEB固体培养基上，28℃恒温倒置培养2d。

(4)挑取单克隆进行菌落PCR检测，将条带正确的菌液保存于 50％无菌甘油中于-80℃冰箱保存备用。

3、亚细胞定位

以培养3-4周的本生烟为试验材料，进行亚细胞定位。具体操作步骤如下：

a.将含有pCAMBIA-2300和构建的 pCAMBIA-2300-LlWOX9/LlWOX11的GV3101菌株，涂布于YEB平板(含 Rif和Kan)，28℃倒置培养至长出单菌落。

b.取单菌落于1mL YEB液体培养基中，28℃200rpm，过夜振荡培养。

c.取500μL菌液加入50mL YEB培养基中，28℃200rpm，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8。

d.5000rpm，离心10min，弃上清，用渗透缓冲液(10mM MES +10mM MgCl₂+200μM乙酰丁香酮)重悬，调整OD₆₀₀＝0.8，黑暗室温孵育2h。

e.用1mL注射器注射烟草叶片背面，黑暗培养72h后收集叶片。

f.用0.5mg/mL DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，Sigma) 处理叶片，1×PBS清洗后，用激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM 510) 采集图像。

实验结果：结果如图5所示，LlWOX11-GFP蛋白绿色荧光信号在细胞核中，表明LlWOX11蛋白为细胞核定位。

实施例4转基因拟南芥表型分析

1、pCAMBIA3301-LlWOX11载体构建

根据LlWOX11基因的CDS序列，设计接头引物，PCR扩增基因全长序列，上游引物oe-LlWOX11-F为：5′ -GTGAGTAAGGTTACCGAATTCATGGATAGCCACACACCCAAC-3′；下游引物 oe-LlWOX11-R为：5′-TCCCCATGGAGGCCTTCTAGACTACGAAGGCCTCGAAA CCAA-3′。PCR产物回收后备用。pCAMBIA2300载体经NcoI和BstEII 酶切后，回收备用。

采用同源重组法将LlWOX11接头产物融合到pCAMBIA3301线性载体中。同源重组体系中载体与插入片段摩尔比为1:5。移液枪轻轻吹打混匀后于PCR仪中，50℃重组15-20min，重组产物转入大肠杆菌感受态转化中，单克隆经检测阳性后送测序。

2、农杆菌转化

阳性质粒通过冻融法转入到农杆菌感受态GV3101菌株中，转化步骤如下：

(1)2μL质粒加入50μL GV3101感受态细胞中，液氮速冻1 min，37℃水浴5min。

(2)加入500μL YEB液体培养基，28℃200rpm振荡培养 2-4h。

(3)5000rpm离心2min，吸出300μL上清后吹打混匀，涂布于含50mg/L Kana和25mg/L Rif的YEB固体培养基上，28℃恒温倒置培养2d。

(4)挑取单克隆进行菌落PCR检测，将条带正确的菌液保存于 50％无菌甘油中于-80℃冰箱保存备用。

3、拟南芥侵染

以哥伦比亚野生型型拟南芥(col)为转化材料，具体操作步骤如下：

(1)将含有pCAMBIA-2300和构建的 pCAMBIA-2300-LlWOX9/LlWOX11的GV3101菌株，涂布于YEB平板(含 Rif和Kan)，28℃倒置培养至长出单菌落。

(2)取单菌落于1mL YEB液体培养基中，28℃200rpm，过夜振荡培养。

(3)取500μL菌液加入50mL YEB培养基中，28℃200rpm，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8。

(4)5000rpm，离心10min，弃上清，配置2×重悬缓冲液Buffer (10％蔗糖溶液：0.1％转化Buffer-Sliwet L-77)，1/2体积的无菌水悬浮农杆菌菌株，转化时再加入1/2体积的2×重悬缓冲液Buffer 重悬。

(5)侵染时用滴管吸取菌液滴在哥伦比亚野生型的花蕾上，侵染后避光保湿24h。之后于正常环境20-22℃中培养，直至种子成熟。

(6)转化植株收的种子先干燥1周，4℃春化(打破休眠)处理 2-4天后，用10％次氯酸钠消毒5min，无菌水清洗3-5次，在含草铵膦抗性(Basta)的1/2MS平板上进行筛选。直至收获T3代种子，通过表型观察和分子水平鉴定。

实验结果：结果如图5所示，经PCR检测，本发明从转化植株中筛选到11个转化成功株系(图7A)。过表达LlWOX11的T3代拟南芥，与哥伦比亚野生型相比，具有明显的侧枝增多的表型(图7B)。对独立的15株转化植株和野生型植株侧枝数量进行统计，结果如图 7C所示，过表达LlWOX11的T3代拟南芥侧枝数量显著高于野生型。表明LlWOX11过表达能够影响拟南芥中叶腋分生组织的活性，从而促进侧枝的形成。

实施例5 VIGS诱导百合叶腋LlWOX11基因沉默

1、TRV₂-LlWOX11载体构建

选取LlWOX11基因特异片段构建TRV₂-LlWOX11沉默载体，设计接头引物，PCR扩增基因特异序列，上游引物vs-LlWOX11-F为：5′ -GTGAGTAAGGTTACCGAATTCCTCGCCTTCATCATCTTCGTTTGT-3′；下游引物 vs-LlWOX11-R为：5′ -TCCCCATGGAGGCCTTCTAGACCATATTCATTTACAGGAAGCAGC-3′。PCR产物回收后备用。TRV₂载体经EcoRI酶切后，回收备用。

采用同源重组法将LlWOX11接头产物融合到TRV₂线性载体中。同源重组体系中载体与插入片段摩尔比为1:5。移液枪轻轻吹打混匀后于PCR仪中，50℃重组15-20min，重组产物转入大肠杆菌感受态转化中，单克隆经检测阳性后送测序。

阳性质粒通过冻融法转入到农杆菌感受态EHA105菌株中。

2、农杆菌侵染百合茎段

(1)将TRV1、TRV2和构建的TRV2-LlWOX11的EHA105菌株，涂布于YEB平板(含Rif和Kan)，28℃倒置培养至长出单菌落。

(2)取单菌落于1mL YEB液体培养基中，28℃200rpm，过夜振荡培养。

(3)取1mL菌液加入100mL YEB培养基中，28℃200rpm，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8。

(4)5000rpm，离心10min，弃上清，用渗透缓冲液(10mM MES +10mM MgCl₂+200μM乙酰丁香酮)重悬，调整OD₆₀₀＝1.0。

(5)将pTRV1分别与pTRV2或pTRV2-LlWOX11菌液以1:1的比例混合，黑暗室温孵育3h。

(6)选取百合茎段进行表面灭菌，灭菌后单叶腋茎段分别装入广口瓶中备用。

(7)悬浮后的不同混合菌液分别装入广口瓶中，进行抽真空侵染，以-50kpa抽真空5min，缓慢放气后再重复抽一次。

(8)无菌水冲洗侵染后的茎段，接种到仅含30g/L蔗糖的MS 培养基中，15℃黑暗培养2d，然后在16/8h的光照/黑暗下，在22℃下培养。

(9)培养两周后统计珠芽诱导率，并对叶腋进行取材。每个处理包含3次重复，每次重复30个叶腋。

实验结果：培养两周后，对各组叶腋表型进行观察发现，未做处理的对照组(CK)与TRV2空载组珠芽正常形成，而TRV2-LlWOX11沉默组中，存在珠芽发育受到抑制的表型(图8A)。对珠芽诱导率进行统计发现，TRV2-LlWOX11沉默组中珠芽诱导率显著下降，只有55％左右(图8B)。进一步对各组叶腋进行RNA提取，检测各组叶腋中LlWOX11表达情况，结果显示TRV2空载组与对照组相比，LlWOX11表达量无显著变化，而TRV2-LlWOX11沉默组中，LlWOX11表达量显著降低，只有30％左右(图8C)。以上结果说明，LlWOX11基因沉默后，会显著抑制珠芽的形成。

实施例6百合叶腋瞬时过表达LlWOX11基因

1、表达载体转入EHA105菌株

本例所用质粒同实施例3中的pCAMBIA3301-LlWOX11，将质粒转入农杆菌菌株EHA105中。转化步骤如下：

(1)2μL质粒加入50μL EHA105感受态细胞中，液氮速冻1 min，37℃水浴5min。

(2)加入500μL YEB液体培养基，28℃200rpm振荡培养 2-4h。

(3)5000rpm离心2min，吸出300μL上清后吹打混匀，涂布于含50mg/L Kana和25mg/L Rif的YEB固体培养基上，28℃恒温倒置培养2d。

(4)挑取单克隆进行菌落PCR检测，将条带正确的菌液保存于 50％无菌甘油中于-80℃冰箱保存备用。

2、农杆菌侵染百合茎段

(1)将pCAMBIA3301-LlWOX11的EHA105菌株，涂布于YEB平板 (含Rif和Kan)，28℃倒置培养至长出单菌落。

(2)取单菌落于1mL YEB液体培养基中，28℃200rpm，过夜振荡培养。

(3)取1mL菌液加入100mL YEB培养基中，28℃200rpm，振荡培养至OD₆₀₀＝1.0。

(4)5000rpm，离心10min，弃上清，用渗透缓冲液(10mM MES +10mM MgCl2+200μM乙酰丁香酮)重悬，调整OD600＝1.0，黑暗室温孵育2h。

(5)选取百合茎段进行表面灭菌，灭菌后单叶腋茎段分别装入广口瓶中备用。

(6)悬浮后的菌液装入广口瓶中，进行抽真空侵染，以-50kpa 抽真空5min，缓慢放气后再重复抽一次。

(7)无菌水冲洗侵染后的茎段，接种到仅含30g/L蔗糖的MS 培养基中，15℃黑暗培养1d，然后在16/8h的光照/黑暗下，在22℃下培养。

(8)培养一周后统计珠芽诱导率，并对叶腋进行取材。每个处理包含3次重复，每次重复30个叶腋。

实验结果：培养一周后，未做处理的对照组(CK)和pCAMBIA3301 空载组中，珠芽发育时期绝大多数处于S3时期，而 pCAMBIA3301-LlWOX11过表达组中，大多数叶腋中珠芽已经形成(图 9A)。对珠芽诱导率进行统计发现，对照组和空载处理组中珠芽诱导率为13％左右，而pCAMBIA3301-LlWOX11过表达组中，珠芽诱导率达到50％左右(图9B)。说明，LlWOX11过表达后能显著促进珠芽的形成。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法及其应用

<141> 2021-06-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 699

<212> DNA

<213> Lilium lancifolium

<400> 1

atggatagcc acacacccaa ccaccatggc gccgcccaag aacggggcgg tgccgagcct 60

gtgaggtccc gatggatccc taaacccgag caaatcctca tcttagaatc catcttcaac 120

agcggcatgg tgaatccgcc gaaagacgag acaattcgca tccgaaagct actcgagaag 180

ttcgggtctg ttggcgatgc caacgtcttc tactggttcc agaatcggag gtccagatct 240

cgccgccgcc agcggcagat gcaagctgaa gccgatctcg ctgcgtccaa tcctcgggtc 300

cccaattcat cagggacttc atcttccaac tcctcttgca gtggattctt cccgtcttcg 360

acaacaacct cctcgccttc atcatcttcg tttgttcaag atgatactgc cgatgatctc 420

ttctcaatat cccgtcagat gggattgatg gagaacaggc agatgggtca gttcatgtgt 480

gcttcagatt tacactatca aactgggact ataactgtat tcatcaatgg aatcccttca 540

gagtttccaa gaggacccat tgacatgagg gcaatgtttg gtcaagatgt gatgttggtg 600

cattcctcag gagagctgct tcctgtaaat gaatatggaa tattgttgca aagcttacaa 660

atgggagaaa actacttttt ggtttcgagg ccttcgtag 699

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> Lilium lancifolium

<400> 3

Met Asp Ser His Thr Pro Asn His His Gly Ala Ala Gln Glu Arg Gly

1 5 10 15

Gly Ala Glu Pro Val Arg Ser Arg Trp Ile Pro Lys Pro Glu Gln Ile

20 25 30

Leu Ile Leu Glu Ser Ile Phe Asn Ser Gly Met Val Asn Pro Pro Lys

35 40 45

Asp Glu Thr Ile Arg Ile Arg Lys Leu Leu Glu Lys Phe Gly Ser Val

50 55 60

Gly Asp Ala Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ser Arg Ser

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gln Arg Gln Met Gln Ala Glu Ala Asp Leu Ala Ala Ser

85 90 95

Asn Pro Arg Val Pro Asn Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ser Asn Ser Ser

100 105 110

Cys Ser Gly Phe Phe Pro Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Ser

115 120 125

Ser Ser Phe Val Gln Asp Asp Thr Ala Asp Asp Leu Phe Ser Ile Ser

130 135 140

Arg Gln Met Gly Leu Met Glu Asn Arg Gln Met Gly Gln Phe Met Cys

145 150 155 160

Ala Ser Asp Leu His Tyr Gln Thr Gly Thr Ile Thr Val Phe Ile Asn

165 170 175

Gly Ile Pro Ser Glu Phe Pro Arg Gly Pro Ile Asp Met Arg Ala Met

180 185 190

Phe Gly Gln Asp Val Met Leu Val His Ser Ser Gly Glu Leu Leu Pro

195 200 205

Val Asn Glu Tyr Gly Ile Leu Leu Gln Ser Leu Gln Met Gly Glu Asn

210 215 220

Tyr Phe Leu Val Ser Arg Pro Ser

225 230

Claims (8)

1.一种百合LlWOX11基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述百合LlWOX11基因蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种百合珠芽形成调控基因LlWOX11的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取百合叶腋RNA，反转录获得cDNA；

(2)根据转录组数据设计引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得CDS序列，扩增CDS序列引物如下：

5′端引物：5′-ATGGATAGCCACACACCCAAC-3′

3′端引物：5′-CTACGAAGGCCTCGAAACCAA-3′

扩增出来的5′端和3′端序列经测序验证后与转录组序列对比，最终获得LlWOX11基因全长699bp的cDNA序列。

4.一种根据权利要求1所述的百合珠芽形成调控基因LlWOX11在控制百合珠芽形成和提高珠芽诱导率中的应用。

5.一种重组载体，其特征在于，含有上述克隆LlWOX11基因的cDNA序列。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体在5′端和3′端引物分别加上16-25bp的接头序列，引物如下：

5′端引物：5′-CACGGGGGACTCTTGACCATGGATAGCCACACACCCAAC-3′

3′端引物：5′-GGGGAAATTCGAGCTGGCTACGAAGGCCTCGAAACCAA-3′

所述重组载体通过PCR扩增，获得带接头的CDS序列，利用同源重组的方法，将Nco I和BstE II双酶切载体pCAMBIA3301获得的线性载体片段与带接头的CDS序列进行重组，最终获得重组载体。

7.一种重组载体，其特征在于，含有上述克隆LlWOX11基因的特异性沉默序列。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体在5′端和3′端引物分别加上21bp的接头序列，引物如下：

5′端引物为：

5′-GTGAGTAAGGTTACCGAATTCCTCGCCTTCATCATCTTCGTTTGT-3′

3′端引物为：

5′-TCCCCATGGAGGCCTTCTAGACCATATTCATTTACAGGAAGCAGC-3′

所述重组载体通过PCR扩增，获得带接头的LlWOX11基因的特异性沉默序列，利用同源重组的方法，将EcoR I酶切载体TRV₂获得的线性载体片段与带接头的目的序列进行重组，最终获得重组载体。

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