CN113384599B - 一种豪猪刺动物药及其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种豪猪刺动物药，将采购的豪猪刺剪至3~4 cm，加沙炮制至外表微黄，用高速万能粉碎机捣碎，过60~100目筛，加料液比1:10~1:20 g/mL、浓度为50~90%乙醇回流提取30~60 min，共2次，过滤合并续滤液，用石油醚按体积比为1:1~1:5萃取3次，合并萃取液，于旋转蒸发仪中浓缩至流浸膏，置于80℃水浴锅上挥干，干浸膏研磨成极细粉，加香油调制成质量浓度0.2~1.0 g/mL的药膏，于紫外灯下灭菌30 min，密封冷藏。本发明能有效减少烧烫伤或糖尿病足创面的渗出液，缩短创面结痂时间，提高创面的愈合率，为豪猪刺在临床治疗烧烫伤或糖尿病足的推广使用及潜在药效物质的筛选提供了实验依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药动物药领域，特别是一种豪猪刺动物药及其制备方法及用途。
背景技术
豪猪刺为哺乳纲啮齿目豪猪科豪猪属动物豪Hystrix hodgsoni Gray[Hystixhodgsoni subcristata(Swinhoe)[Hystrix hodgsoni papae(GAlen)]，马来豪Hystrixbrachyuran.Linaeus[Hystrix brachyuran yunnanensis Anderson.]的干燥棘刺。本品始载于《本草纲目》，棘刺(毛刺)味甘、腥臭，大寒，行气止痛，解毒消肿，主治心胃气痛、乳蛾、疮肿、皮肤过敏；肉，味甘、性寒，润肠通便，主治大便不畅。现代研究表明豪猪肉甘美多膏，高蛋白、低脂肪，享有肉中“人参”的美名，深受大病初愈、体弱消瘦和术后愈合患者青睐。其刺(豪猪刺或苏格毛或刺猪毛)，除制作浮漂、工艺品等之外，在化腐生肌、愈合伤口等方面有巨大的药用价值潜力。近年来，国内外仅聚焦在豪猪养殖、豪猪肉产品加工等方面的研究，而尚未见豪猪刺药用作用的相关研究报道，豪猪刺药用价值的综合利用依然是一片空白。
近年来，借助民族医药在疑难杂症(如糖尿病)方面的特色治疗优势，探索开发创新新药是近年来的研究热点。本发明人前期走访调查发现，贵州、四川等民间有用豪猪刺治愈烧烫伤及糖尿病足溃疡的成功实例，可见豪猪刺在化腐生肌，愈合伤口等方面有很大的的药用潜力。因此，本发明人通过探究豪猪刺治疗烧烫伤小鼠模型，以及糖尿病足大鼠模型的药效物质基础，筛选豪猪刺治疗烧烫伤及糖尿病足的活性部位，为其在临床烧烫伤或糖尿病足治疗的推广使用及进一步的开发应用提供坚实的理论与实验依据。
中国专利CN1565498A于2005年1月19日公开了《一种治疗烧伤的中药》，它是毛冬青等中草药与豪猪刺共同作用的。经检索，未见豪猪刺动物药治疗糖尿病足的专利方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种豪猪刺动物药及其制备方法及用途，该动物药能减少烧烫伤或糖尿病足创面的渗出液，缩短创面结痂时间，提高创面的愈合率。
本发明的技术方案：
一种豪猪刺动物药，它是用豪猪刺粉碎制粉，加乙醇提取，用石油醚萃取，浓缩至流浸膏，挥干成干浸膏、再研磨成极细粉，再制成药膏。
所述一种豪猪刺动物药的制备方法如下：
将采购的豪猪刺剪至3～4cm，加沙炮制至外表微黄，用高速万能粉碎机捣碎，过60～100目筛，加料液比1:10～1:20g/mL、浓度为50～90％乙醇回流提取30～60min，共2次，过滤合并续滤液，用石油醚按体积比为1:1～1:5萃取3次，合并萃取液，于旋转蒸发仪中浓缩至流浸膏，置于80℃水浴锅上挥干，干浸膏研磨成极细粉，加香油调制成质量浓度0.2～1.0g/mL的药膏，于紫外灯下灭菌30min，密封冷藏。
所述豪猪是采购于贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市，经鉴定为哺乳纲啮齿目豪猪科豪猪属动物豪猪。
所述炮制使用的沙为过80目筛的河沙。
所述高速万能粉碎机型号为FW400A。
所述萃取液的制备：用高速万能粉碎机捣碎后过80目筛，加料液比1:16g/mL、浓度为70％乙醇回流提取60min，共2次，过滤合并续滤液，用石油醚按体积比1:3萃取3次，合并萃取液。
所述极细粉为过100目筛。
所述调制药膏的香油为金龙鱼芝麻油。
所述药膏的质量浓度为0.4g/mL。
所述一种豪猪刺动物药的用途，用于治疗烧烫伤或糖尿病足。
使用时，用棉签涂抹药膏于创面，涂抹均匀，每次涂抹厚度为1mm。实验表明，该动物药能减少烧烫伤或糖尿病足创面的渗出液，缩短创面结痂时间，提高创面的愈合率。
附图说明
图1是谷氨酸标准工作曲线图；
图2是溶剂考察图；
图3是乙醇浓度考察图；
图4是料液比考察图；
图5是提取时间考察图；
图6是样品粒度考察图；
图7是不同影响因素相互作用的等高线图；
图8是不同影响因素相互作用的响应曲面图；
图9是烫伤小鼠创面宏观结果图。
图10是糖尿病足大鼠创面临床表证图。
具体实施方式
下面通过实例及附图对本发明作进一步说明。
一种豪猪刺动物药，它是用豪猪刺粉碎制粉，加乙醇提取，用石油醚萃取，浓缩至流浸膏，挥干成干浸膏、再研磨成极细粉，再制成药膏。
所述一种豪猪刺动物药的制备方法如下：
将采购的豪猪刺剪至3～4cm，加沙炮制至外表微黄，用高速万能粉碎机捣碎，过60～100目筛，加料液比1:10～1:20g/mL、浓度为50～90％乙醇回流提取30～60min，共2次，过滤合并续滤液，用石油醚按体积比为1:1～1:5萃取3次，合并萃取液，于旋转蒸发仪中浓缩至流浸膏，置于80℃水浴锅上挥干，干浸膏研磨成极细粉，加香油调制成质量浓度0.2～1.0g/mL的药膏，于紫外灯下灭菌30min，密封冷藏。
所述豪猪是采购于贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市，经鉴定为哺乳纲啮齿目豪猪科豪猪属动物豪猪。
所述炮制使用的沙为过80目筛的河沙。
所述高速万能粉碎机型号为FW400A。
所述萃取液的制备：用高速万能粉碎机捣碎后过80目筛，加料液比1:16g/mL、浓度为70％乙醇回流提取60min，共2次，过滤合并续滤液，用石油醚按体积比1:3萃取3次，合并萃取液。
所述极细粉为过100目筛。
所述调制药膏的香油为金龙鱼芝麻油。
所述药膏的质量浓度为0.4g/mL。
所述一种豪猪刺动物药的用途，用于治疗烧烫伤或糖尿病足。
本发明是通过以下实验获得和验证的。
标准曲线的绘制
精密量取对照品谷氨酸溶液1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5mL于25mL容量瓶中，依次加入0.5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS液)，2.5mL的2％茚三酮乙醇溶液，并在100℃沸水浴中加热10min，冷却5min，加纯水定容至刻度，即得。以相应的空白溶液作参比，精密吸取上述对照品待测溶液各200μL，采用全波长酶标仪在570nm波长下测定吸光度，以吸光度(y)为纵坐标，谷氨酸含量(x)为横坐标，绘制标准曲线，见表1和图1。
表1谷氨酸对照品标准曲线(n＝5)
由图1可知，在浓度0.0065-0.0281mg/mL范围内有较好的线性关系。线性回归方程为y＝25.698x+0.0875，R2＝0.9953。
总氨基酸含量的测定
精密量取豪猪刺提取液5mL于25mL容量瓶中，依次加入1.0mL磷酸盐缓冲溶液(PBS液)，2％茚三酮的乙醇溶液0.5mL，在沸水浴中加热15min，冷却放置10min后，加相应溶剂定容至刻度，以1.0mL磷酸盐缓冲溶液(PBS液)和2％茚三酮的乙醇溶液1.0mL，在沸水浴加热15min，冷却，用相应乙醇定容至一定体积作为空白溶液，精密吸取200μL用酶标仪在570nm波长处测定吸光度并计算含量。据回归方程计算出提取液中总氨基酸的质量浓度，求出提取率(W)：
W＝[(A-0.0875)V1V3]/256.98MV2*％
式中：W为氨基酸提取率(％)，A为吸光度，V1为第一次定容量100mL，V2为取量5mL，V3为第二次定容量25mL，M为取样量(g)。
浸出物的测定
将蒸发皿洗干净，干燥至恒重，记录数值。并精密量取豪猪刺提取液25mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴锅上将水分蒸干后，再把蒸发皿放在烘箱中，在105℃下干燥3h，于有蓝色硅胶的干燥器中冷却30min，快速拿到分析天平中精密称定重量，记录数值。计算出膏率：
出膏率＝m0/M*4*100％
式中：m0为干膏量(g)，M为取样量(g)，4为稀释倍数。
单因素试验：
溶剂的选择
取2.0g豪猪刺细粉，分别加入溶剂为乙醇、水、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇提取，料液比为1:10g/mL，回流提取60min，后用各溶液定容于100mL容量瓶中。按照上述总氨基酸量和浸出物提取率的方法进行测定，考察溶剂对豪猪刺总氨基酸量和浸出物提取率及评分的影响。
综合评分＝(各试验号氨基酸含量/最高试验号氨基酸含量*0.6+各试验号出膏率/最高试验号出膏率*0.4)*100
浓度的选择
取2.0g豪猪刺细粉，分别加入浓度为30％、50％、70％、90％、100％乙醇，料液比为1:10g/mL，回流提取60min，后用各浓度溶液定容于100mL容量瓶中。按照上述总氨基酸量和浸出物提取率的方法进行测定，考察乙醇浓度对豪猪刺总氨基酸量和浸出物提取率及评分的影响。
料液比的选择
取2.0g豪猪刺细粉，分别加入料液比为1:8、1:12、1:16、1:20、1:24g/mL的70％乙醇提取，回流提取60min，后用各溶液定容于100mL容量瓶中。按照上述总氨基酸量和浸出物提取率的方法进行测定，考察料液比对豪猪刺总氨基酸量和浸出物提取率及评分的影响。
提取时间的选择
取2.0g豪猪刺细粉，用70％乙醇，料液比为1:16g/mL，分别回流提取30、60、90、120、150min，后用定容于100mL容量瓶中。按照上述总氨基酸量和浸出物提取率的方法进行测定，考察提取时间对豪猪刺总氨基酸量和浸出物提取率及评分的影响。
样品粒度的选择
分别取2.0g豪猪刺为20、40、60、80、100目细粉，用70％乙醇，料液比为1:16g/mL，回流提取60min，后用各溶液定容于100mL容量瓶中。按照上述总氨基酸量和浸出物提取率的方法进行测定，考察粒度对豪猪刺总氨基酸量和浸出物提取率及评分的影响。
响应面试验
在单因素试验基础上，以评分为响应值，选取乙醇浓度、料液比、提取时间和样品粒度4个因素进行响应面优化试验，确定回流提取豪猪刺中总氨基酸量和浸出物提取率的最佳工艺条件。各因素的水平设计见表2。
表2响应面试验因素水平表
结果与分析：
溶剂的确定
如图2可知，豪猪刺在不同溶剂中提取氨基酸，乙醇的提取率最高。所以在下列表3考察中，用乙醇作为溶剂。
表3溶剂考察结果
浓度的确定
如表4和图3可知，乙醇浓度对豪猪刺总氨基酸量和浸出物提取率影响显著，在一定范围内随着乙醇浓度的提高，豪猪刺评分逐渐增加，当乙醇浓度超过70％后，评分逐渐降低。由此表明，当乙醇溶液中的乙醇和水达到最佳比时，评分可得到最大值。根据乙醇浓度变化的趋势，选择乙醇浓度为50％、70％、90％进行响应面试验设计。
表4浓度考察结果
料液比的确定
如表5和图4可知，豪猪刺的评分随着料液比的增大逐渐增加，当料液比到达1:16g/mL时，评分为92.41，当料液比超过1:16g/mL后，总评分缓慢增加，不会有大幅度的增加。在不影响评分的情况下，考虑到提取效果及成本，选择料液比因素水平为1:12、1:16、1:20g/mL进行响应面试验设计最适合。
表5料液比考察结果
提取时间的确定
如表6和图5可知，随着回流提取时间的延长，豪猪刺总评分先升后降，在60min时达到最大值，之后继续提取，总评分变化不明显。根据评分随着提取时间的变化趋势，从节约时间的角度考虑，故控制响应面试验设计因素水平选择提取时间为30、60、90min。
表6提取时间考察结果
样品粒度的确定
如表7和图6可知，随着样品粒度的变化，评分逐渐上升，到达最大值后评分就会逐渐下降。当评分在粒度为80目处时到达最大值，粒度超过80目后，评分缓慢减小。根据评分随着样品粒度的变化趋势，选择样品粒度为60、80、100目的尺寸作为因素水平，进行响应面试验设计。
表7样品粒度考察结果
响应面试验设计与结果分析：
在单因素试验结果基础上，以评分为响应值，对影响得率的乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)四个因素进行响应面优化实验。各因素水平优化试验设计及结果见表8。
表8豪猪刺响应面试验设计及结果
回归模型的建立与方差分析：
基于响应面试验结果，采用Design Expert 8.0.6软件进行多元拟合回归分析，得到以豪猪刺评分为响应值的四元二次回归模型方程：
Y＝86.80+7.12*A-3.49*B+2.62*C+1.66*D-2.03*A*B+0.058*A*C-3.96*A*D+8.84*B*C+3.77*B*D-0.91*C*D-14.53*A2-12.14*B2-7.63*C2-7.17*D2
由方程一次项可知，影响豪猪刺总氨基酸量和浸出物的因素顺序为：乙醇浓度>料液比>提取时间>样品粒度。由回归模型方差分析结果可知，模型的P＜0.01，极显著，该模型有意义；失拟项>0.05不显著，说明模型与试验的差异值较小，由决定系数R2可知响应值的变化有73.84％来源于四个试验因素，回归模型拟合度良好，预测值与实测值之间相关性较好，试验误差较小，可很好的描述各因素与响应值之间的关系。见表9。
表9回归模型方差分析
利用Design Expert 8.0.6软件，从图7-8相互作用的响应曲面图和等高线图可以看出，响应面坡面越陡峭表明响应面受试验因素变化就越大，响应面坡面越平缓则相反。由图7-8可见AB、AC、AD交互响应面坡面较陡峭，等高线图基本呈扁平椭圆状。表明乙醇浓度与料液比和提取时间和样品粒度交互作用较强，对豪猪刺总氨基酸量和浸出物的影响显著。
试验结果验证
用Design Expert 8.0.6软件进一步分析回归方程，得出豪猪刺的最适条件为：乙醇浓度75.06％、料液比1:16.6g/mL、提取时间62.91min、样品粒度80.12目，预测评分为88.06，提取率为0.35％。结合实际操作，选取提取工艺为：乙醇浓度70％、料液比1:16g/mL、提取时间60min、样品粒度80目。在此条件下进行试验验证，重复试验3次，豪猪刺总氨基酸量和浸出物的评分实际为88.15，提取率为0.36％。与预测值接近，说明拟合良好，参数可靠。
本实验以提取豪猪刺总氨基酸及浸出物为对象，在单因素试验的基础上，结合响应面设计，通过软件拟合得到豪猪刺的最佳提取工艺为：取粒度80目的样品，加料液比1:16g/mL、浓度70％的乙醇提取60min，在该条件下评分为88.15，提取率为0.36％。从方差分析和因素间交互作用分析中得出，四个因素对豪猪刺总氨基酸和浸出物提取均有影响，影响豪猪刺总氨基酸及浸出物的因素顺序为：乙醇浓度>料液比>提取时间>样品粒度。
本实验优化的乙醇回流提取工艺稳定、可靠，可为后续豪猪刺总氨基酸及浸出物的烧烫伤治疗、抑菌作用和抗氧化作用等药效学研究提供实验参考。
下面通过实验说明本发明在治疗烧烫伤的效果：
动物分组造模及给药：
小鼠适应性喂养3d后，按体重分层随机分为模型组、阳性组(湿润烧伤膏)、豪猪刺浸膏组、豪猪刺水提物组、豪猪刺醇提物组、豪猪刺石油醚组、豪猪刺水层部位组。参阅文献报道，腹腔注射10％水合氯醛0.1mL/10g麻醉，背部剃毛，剃毛后用8％Na2S溶液脱毛，脱毛后用无菌水洗净皮肤，待干燥后将小鼠置于(90±2)℃的烫伤仪上，于小鼠背部同一脱毛区域烫伤10s，造成创面积1x1cm2烫伤小鼠模型，造模24h后各实验组分别用棉签蘸取对应药膏涂抹于创面，均匀涂抹(涂抹厚度约为1mm)，模型组涂抹等量无菌水，1次/d，连续涂抹给药17d，测定并记录各组小鼠创面愈合情况。
豪猪刺不同部位对烫伤小鼠创面的影响：
给药后，分别在第1、3、5、8、11、11、14、17天的同一时间称定模型组、和各实验组小鼠体重，并观察记录烫伤小鼠创面颜色、渗出液、肿胀、长毛、结痂和占体表率(愈合率)的临床表证，结果豪猪刺不同部位对烫伤小鼠创面的影响如下表10-16：
表10湿润烧伤膏对小鼠创面的影响
表11豪猪刺水层部位对小鼠创面的影响
表12豪猪刺石油醚部位对小鼠创面的影响
表13豪猪刺水提部位对小鼠创面的影响
表14豪猪刺醇提部位对小鼠创面的影响
表15豪猪刺浸膏组对小鼠创面的影响
表16模型组小鼠创面的影响
+表示轻微，++表示有效，+++表示强，++++表示超强
表10～表16结果表明，17天内小鼠创面颜色皆由浅变深，其中观察到最为明显的为阳性组，其次为石油醚组，水提组，最不明显的为模型组、醇提组；对烫伤伤口有渗出液效果最为明显的是阳性组和石油醚组，于第3天没有出现渗出液，下层组、水提组、浸膏组于第5天没有出现渗出液，醇提组、模型组于第8天没有出现渗出液；阳性组、石油醚组、水提组对小鼠的肿胀程度最为有效，于第3天没有出现肿胀，其次是下层组和浸膏组于第5天没有出现肿胀，效果最不明显的为水提组与模型组，于第8天没有出现肿胀；长毛情况最好的是阳性组、石油醚组、水提组，其次是下层组和浸膏组，最弱的为醇提组与模型组；结痂程度最明显的是阳性组、石油醚组、水提组，其次是下层组与浸膏组，最弱的为醇提组与模型组；小鼠占体表率最好的是阳性组、石油醚组、水提组几乎达到零，其次较好的是下层组与浸膏组，最弱的为醇提组与模型组。
不同部位豪猪刺对小鼠占体表率的影响：
给药后，分别在第1、3、5、8、11、11、14、17天的同一时间测量各组烫伤小鼠近似椭圆形创面长轴与短轴[根据文献资料Meeh’s公式计算小鼠的体表面积A＝KW2/3cm2；W，体重(g)；K＝10。若小鼠的体重为100g，则A＝10x1002/3＝215cm2，烫伤部位体表面积即为椭圆形面积B＝πR1R2＝3.14x2.35x1.35＝9.96cm2(R1为长轴半径，cm；R2为短轴半径，cm)，所以实际的烫伤面积＝B/A＝9.96/215＝0.046，即烫伤面积占小鼠体表面积的4.6％]，计算给药后不同时间烫伤小鼠占体表率(愈合率)，结果豪猪刺不同部位对小鼠占体表率的影响如下表17：
表17豪猪刺不同部位对小鼠实验性烫伤的影响(X±S，n＝8)
注：与空白组比较，*P<0.05，A.阳性组，B.水层组，C.醇提组，D.浸膏组，E.模型组，F.石油醚组，G.水提组
表17结果表明，与模型组相比，豪猪刺的水层组、醇提组、石油醚组、水提组、浸膏组占体表率逐渐减小。且持续到第14、17天创面结痂占体表面积明显减少，脱痂愈合时间缩短。给予相同剂量的药物，阳性组、石油醚组和水提组效果最为明显。
涂药后与模型组比，阳性组占体表率逐渐减小，第8天(P<0.05)持续到第17天(P<0.05)差异均具有显著性；与模型组比，水层组占体表率逐渐减小，第3、11天(P<0.05)均具有显著性差异；与模型组比，醇提组占体表率逐渐减小，第3天、8天(P<0.05)均具有显著性差异；与模型组比，浸膏组占体表率逐渐减小，第17天(P<0.05)具有显著性差异；与模型组比，石油醚组占体表率逐渐减小，第5、14、17天(P<0.05)均具有显著性差异；与模型组比，水提组占体表率逐渐减小，第8、14、17天(P<0.05)均具有显著性差异。
烫伤小鼠创面临床表证结果，见图9：
将豪猪刺不同部位研磨成极细粉，各称取约4g，量取10mL香油调制成0.4g/mL的药膏，按上述给药方法，连续给药后分别在第1、3、5、8、11、11、14、17天的同一时间对各组小鼠创面进行拍照，结果烫伤小鼠创面临床表证见图9。
由图9表明：A～G组烫伤创面的第1天，小鼠创面颜色为浅黄色；第3～5天，创面颜色相对变深，均出现结痂情况,创面周围充血组织逐渐消退；均出现结痂，其中阳性组、石油醚组、水提组结痂效果较明显；第8～11天，创面结痂面颜色逐渐加深；创面坏死组织呈干硬的黑色焦痂状，边缘开始脱痂，创面底下有轻微的炎症反应，结痂面积开始减小；且阳性组、石油醚组、水提组开始长毛；第14～17天，各组创面颜色皆变得很深，创面明显减小，明显看出愈合情况，并且均有长毛现象，原烫伤创面皆有明显的愈合，阳性组基本完全脱痂，发现创面处没有留下任何瘢痕，皮肤完好如初，全部长毛。其次是石油组和水提组效果较为明显，创面近愈合，愈合创面均长毛。模型实验组在第5天后才开始结痂，直至17天创面仍然没有愈合全部脱痂。
和模型组相比，各组小鼠创面颜色均加深，涂豪猪刺不同部位的烫伤小鼠更能促进伤口愈合，豪猪刺石油醚萃取部位组占体表率低于模型组(P<0.05)，具有统计学意义；水提组占体表率低于模型组(P<0.05)，具有统计学意义，且阳性组>石油醚组≈水提组>水层组>浸膏组>醇提组>模型组。因此，从对小鼠实验性烫伤的治疗效果表明，豪猪刺石油醚部位和水提部位可能是豪猪刺治疗烫伤小鼠的两个潜在有效部位，均能有效的促进创面愈合，缩短结痂时间。
综上，豪猪刺的石油醚部位和水提部位均能较好减轻烫伤小鼠的创面结痂面积，改善皮肤的渗出液，促进创面愈合，愈合率较高。故本发明能减少烧烫伤创面的渗出液，缩短创面结痂时间，提高创面的愈合率，为豪猪刺在临床治疗烧烫伤的推广使用及潜在药效物质的筛选提供了实验依据。
下面通过实验说明本发明在治疗糖尿病足的效果：
糖尿病足溃疡DFUs模型的建立：
参考文献方法，采用高脂饲料联合链脲佐菌素(STZ)和外科手术法制备2型糖尿病足溃疡大鼠Diabetic foot ulcers(DFUs)模型。SPF雄性SD大鼠(220～240g，8周龄，许可证号SCXK(川)2015-030，购于成都达硕实验动物有限公司)，随机挑选10只为正常对照组，普通饲料喂养，其余为模型筛选组，喂养高脂饲料。连续饲养8周后，禁食不禁水12h，模型组大鼠腹腔注射小剂量STZ(45mg·kg-1，链脲佐菌素临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH4.2～4.5)于冰上配置成浓度为14mg/mL溶液，贮存于棕色试剂瓶，暗室操作，10min内用完)，造模后除了正常充足的进食和水，还需提供10％葡萄糖水，防止6～12h内低血糖致死，正常组腹腔注射等体积缓冲液，造模72h后大鼠尾尖取血，用血糖仪测定大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)，FBG≥11.0mmol/L视为DM成模。选成模DM，腹腔内注射10％水合氯醛0.4mL/100g麻醉，用一个6mm皮肤活检穿孔和威斯克剪刀在大鼠后肢背侧创建一个全层皮肤伤口(近似椭圆形面积1x1cm2)，即为糖尿病足溃疡DFUs模型，正常组大鼠不做处理。
分组及给药：
将上述造模成功的大鼠随机分为8组，每组8只：二甲双胍阳性组(YX)、醇提组(CT)、石油醚层组(SY)、乙酸乙酯层组(YS)、正丁醇组(ZD)、水层组(SC)豪猪刺水提组(ST)、模型组(MX)。给药组按生药量计灌胃给予0.80g·kg-1药物(取上述各豪猪刺水提物、醇提物及其萃取层的干燥极细粉，加0.5％CMC-Na配制成80mg/mL的药液)，同时于大鼠创面涂抹厚度约为1mm的上述各豪猪刺药膏(取上述各豪猪刺水提物、醇提物及其萃取层的干燥极细粉，加香油调制成0.4g/mL的药膏)，阳性对照组给予0.25g·kg-1二甲双胍，模型组和正常对照组(KB)给予等量的0.5％CMC-Na溶液，同时阳性组和模型组大鼠创面涂抹适量生理盐水，各组按1mL/100g灌胃给药，每日灌胃涂抹1次，连续30d。实验期间除正常对照组外，其余各组大鼠继续给予高脂饲料，在洁净的代谢鼠笼中单只单笼饲养。
豪猪刺不同部位对DFUs大鼠血糖值、体重量、饮食量、饮水量和尿量的影响：
给药后，分别在第3、7、11、15、19、23天的同一时间测定各组大鼠血糖值、体重量、饮食量、饮水量和尿量的变化，结果豪猪刺不同部位对DFUs大鼠上述指标的的影响如下表18
表18豪猪刺不同部位对DFUs大鼠不同指标的影响(n＝6)
注：表18实验结果以平均数±标准差表示，采用spss19.0软件进行统计分析，与空白组比较，*P<0.05，有统计学意义。
表18结果表明，与空白组相比，其他各组大鼠血糖浓度都高于FBG≥11.0mmol/L，从大鼠体重，尿量，饮水量和饮食量不难发现，实验模型符合糖尿病及其并发症的“三多一少”特征，表明本实验满足要求。与模型组比较，各实验组对DFUs大鼠的高血糖以及“三多一少”症状均有不同程度的改善作用。石油醚组降血糖浓度，抑制体重减少，改善尿量增多，缓解多饮多食的作用较明显，可以推测豪猪刺石油醚萃取部位可能具有一定的降血糖作用。所以，豪猪刺石油醚萃取部位可能是治疗糖尿病足的潜在药效物质基础。
不同部位豪猪刺对大鼠占体表率的影响：
给药后，分别在第1、3、7、11、15、19、23天的同一时间测量各组大鼠近似椭圆形创面的长轴与短轴[根据文献资料Meeh’s公式计算大鼠的体表面积A＝KW2/3cm2；W，体重(g)；K＝10。若大鼠的体重为100g，则A＝10x1002/3＝215cm2，溃疡部位体表面积即为椭圆形面积B＝πR1R2＝3.14x2.35x1.35＝9.96cm2(R1为长轴半径，cm；R2为短轴半径，cm)，所以实际的创面面积＝B/A＝9.96/215＝0.0463，即创面面积占大鼠体表面积的4.6％]，计算给药后不同时间DFUs大鼠占体表率，结果豪猪刺不同部位对大鼠占体表率的影响如下表19：
表19豪猪刺不同部位对DFUs大鼠创面愈合率的影响(X±S，n＝6)
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表19结果表明，涂药后与模型组比，阳性组占体表率逐渐减小，第11天(P<0.05)持续到第23天(P<0.05)差异均具有显著性；与模型组比，醇提组占体表率逐渐减小，第15天(P<0.05)具有显著性差异；与模型组比，石油醚组占体表率逐渐减小，第11天(P<0.05)持续到第23天(P<0.05)差异均具有显著性；与模型组比，水层组占体表率逐渐减小，第19和23天(P<0.05)均具有显著性差异；与模型组比，水提组占体表率逐渐减小，第11、19、23天(P<0.05)均具有显著性差异。实验结果表明，与模型组相比，各实验组大鼠占体表率逐渐减小，且持续到第19、23天创面结痂占体表面积明显减少，脱痂愈合时间缩短。给予相同剂量的药物，石油醚组愈合DFUs大鼠的效果最为显著，因此从愈合糖尿病足创面的实验结果表明，豪猪刺石油醚萃取部位可能是治疗糖尿病足的潜在药效物质基础。
DFUs大鼠创面临床表证结果：
连续给药后分别在第1、3、7、11、19、23天的同一时间对各组DFUs大鼠创面进行拍照，观察DFUs大鼠创面临床表证，结果见图10。
由图10表明：第1天时，各组DFUs大鼠的创面颜色为浅黄色，且大鼠创面渗出液流出，脚足肿胀明显；第3～7天，创面颜色相对变深，创面周围充血组织逐渐消退，均开始出现结痂现象，其中石油醚组结痂效果较显著，乙酸乙酯组次之，但是其他部分组的痂壳下还有渗出液流出，甚至流恶臭脓水现象，其中模型组最明显，阳性组次之；第8～11天，各豪猪刺治疗组的创面结痂面颜色逐渐加深，创面坏死组织呈干硬的黑色焦痂状，边缘开始脱痂，创面底下有轻微的炎症反应，结痂面积开始减小，已几乎无渗出液，流恶臭脓水现象，且石油醚组开始长毛，愈合效果较显著，乙酸乙酯组次之；第11～19天，各组创面颜色皆变得更深，创面明显减小，看出明显的愈合情况，并且均有长毛现象，模型组创面有一点儿愈合迹象，但是痂壳下也有渗出液，脓水流出，有感染可能，石油醚组和乙酸乙酯组组开始脱痂，发现创面处没有留下任何瘢痕，皮肤完好如初，全部长毛。第23天，除模型组和阳性药组外，豪猪刺治疗组DFUs大鼠创面近愈合，愈合创面均长毛，从图10不难看出，石油醚组愈合创面效果最为显著，其次是乙酸乙酯组，因此，从治疗DFUs大鼠模型的实验结果表明，灌胃附涂抹豪猪刺药膏，在连续治疗23天左右，DFUs大鼠溃疡创面完全愈合，而阳性药物组愈合创面的效果不明显。
根据豪猪刺对DFUs大鼠的血糖浓度，体重、饮水量、饮食量和尿量指标的影响，结合测定的愈合率及其创面愈合临床表证，实验结果表明豪猪刺不同部位均有一定治疗DFUs大鼠的作用，其中石油醚萃取部位能较好减轻DFUs大鼠的创面结痂面积，改善皮肤的渗出液，减少感染，促进创面愈合效果较高。
综上豪猪刺在治疗烧烫伤或糖尿病足上的实验结果，故本发明能有效减少烧烫伤或糖尿病足溃疡创面的渗出液，改善烧烫伤创面肿胀或糖尿病足足脚肿胀效果明显，缩短创面结痂时间，促进创面愈合的效果极显著，为豪猪刺(石油醚萃取部位)在临床治疗烧烫伤或糖尿病足溃疡的推广使用及潜在药效物质的筛选提供了实验依据。
Claims (6)
1.一种用于治疗烧烫伤或糖尿病足的豪猪刺动物药，其特征在于：它是这样制成的，用豪猪刺粉碎制粉，加乙醇提取，用石油醚萃取，浓缩至流浸膏，挥干成干浸膏、再研磨成极细粉，再制成药膏；
所述豪猪是采购于贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市，经鉴定为哺乳纲啮齿目豪猪科豪猪属动物豪猪；
具体步骤为：将采购的豪猪刺剪至3~4 cm，加沙炮制至外表微黄，用高速万能粉碎机捣碎后过80目筛，加料液比1:16 g/mL、浓度为70%乙醇回流提取60 min，共2次，过滤合并续滤液，用石油醚按体积比1:3萃取3次，合并萃取液；于旋转蒸发仪中浓缩至流浸膏，置于80 ℃水浴锅上挥干，干浸膏研磨成极细粉，加香油调制成质量浓度0.2~1.0 g/mL的药膏，于紫外灯下灭菌30 min，密封冷藏。
2.如权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤或糖尿病足的豪猪刺动物药，其特征在于：所述炮制使用的沙为过80目筛的河沙。
3.如权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤或糖尿病足的豪猪刺动物药，其特征在于：所述高速万能粉碎机型号为FW400A。
4.如权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤或糖尿病足的豪猪刺动物药，其特征在于：所述极细粉为过100目筛。
5.如权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤或糖尿病足的豪猪刺动物药，其特征在于：所述调制药膏的香油为金龙鱼芝麻油。
6.如权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤或糖尿病足的豪猪刺动物药，其特征在于：所述药膏的质量浓度为0.4 g/mL。
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