CN113384578A - 呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素e2合酶1抑制剂的应用 - Google Patents

呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素e2合酶1抑制剂的应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及化学医药技术领域，尤其涉及一种呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶1抑制剂的应用，该呋喃苯甲酸类化合物的化学结构通式如说明书中式I所示。该呋喃苯甲酸类化合物可以降低PGE2的生成，抑制mPGES‑1蛋白的活性，因此，该类呋喃苯甲酸类化合物可以被开发为一种新型的抗炎mPGES‑1抑制剂，在临床上具有很好的应用前景。

Description

呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶1抑制剂的 应用
技术领域
本申请属于化学医药技术领域，尤其涉及一种呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶1抑制剂的应用。
背景技术
炎症是基体组织对外界刺激如病原体、细胞损伤，或者其他刺激性物质做出的一种复杂的生物防御性反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，过渡的炎症会引起基体组织器官的损伤，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。更严重时会诱发机体出现多器官功能衰竭而死亡，因此，过渡的验证需要提供合适的药物进行控制。
目前，针对炎症采用的抗炎药，大部分是用于治疗组织受到损伤后所发生的反应的炎症，其中，抗炎药有两大类：一类是甾体抗炎药，另一类是非甾体抗炎药(NonsteroidalAntiinflammatory Drugs，NSAIDs)即医疗实践中所指的解热镇痛抗炎药如阿司匹林等。主要使用的是非甾体抗炎药，非甾体抗炎药是一类不含有甾体结构的抗炎药，非甾体抗炎药通过抑制前列腺素的合成，抑制白细胞的聚集，减少缓激肽的形成，抑制血小板的凝集等作用发挥抗炎作用，该类药物具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，在临床上广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎、多种发热和各种疼痛症状的缓解。
然而，大部分的非甾体抗炎药虽然具有一定的治疗效果，但其副作用也较为明显。由于非甾体抗炎药大多为有机酸，与血浆蛋白有高度结合力，从而增加药物在炎症部位的浓度而发挥作用。多数病人对NSAIDs均能耐受。但几乎无一种NSAIDs是安全的，主要毒性反应除胃肠道和肾脏方面外，尚有心血管系统、中枢神经系统、血液系统、皮肤和肝脏等副作用。轻度的副作用表现为过敏反应，如风疹、过敏性鼻炎、哮喘；而重度的副作用表现为可能导致神志恍惚、精神忧郁，影响血小板的凝集，导致转氨酶水平升高等情况。因此，由于目前使用非甾体抗炎药会造成不少不良反应，影响了抗炎症药物的广泛使用。
微粒体前列腺素E2合酶1(mPGES-1)被认为是一个新的抗炎治疗的靶标，其控制前列腺素E2(PGE2，一种主要的会导致炎症及癌症的炎性细胞因子)的合成。因此，mPGES-1抑制剂目前被认为是一种新型的抗炎药物，其通过抑制PGE2的合成来表现其抗炎的作用。此外，mPGES-1抑制剂对于环氧合酶2(COX-2)的表达基本无影响，因此，不同于传统的非甾体抗炎药(NSAIDs)，mPGES-1抑制剂所可能产生的有关心血管疾病的不良反应较少。
在此，本申请旨在解决现有技术中部分抗炎药物会产生有关心血管疾病等不良反应的问题，提出一种新型的可开发为抗炎药物的化合物。
发明内容
本申请的目的在于提供一种微粒体前列腺素E2合酶抑制剂及应用，旨在解决现有技术中部分非甾体抗炎药会产生有关心血管疾病的副作用的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请实施例提供一种呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶1抑制剂的应用，该呋喃苯甲酸类化合物的化学结构通式如式I所示；
Figure BDA0003058866790000031
其中，X1、X2、X3和X4中的任意一个基团为卤素原子，剩余的为氢原子；
R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团为C1-10烷基，剩余的为氢原子。
上述X1、X2、X3和X4中的任意一个基团是指X1基团、X2基团、X3基团或X4基团中任意一个；因此，X1、X2、X3和X4中的任意一个基团为卤素原子，剩余的为氢原子，即指当X1基团为卤素原子，剩余的三个基团为氢原子；当X2基团为卤素原子，剩余的三个基团为氢原子；当X3基团为卤素原子，剩余的三个基团为氢原子；当X4基团为卤素原子，剩余的三个基团为氢原子。
在一个实施例中，式I所示的呋喃苯甲酸类化合物中，X1、X2、X3和X4中的所述卤素原子选自氟原子、氯原子、溴原子和碘原子中的任意一种。
进一步地，X1为卤素原子，X2、X3和X4为氢原子。
更进一步地，X1为氯原子，X2、X3和X4为氢原子。
上述R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团即可以是R1基团、R2基团、R3基团、R4基团和R5基团中单独一个，或者任意两个组合；因此，R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团为C1-10烷基，剩余的为氢原子，即指当R1基团、R2基团、R3基团、R4基团和R5基团中任意一个为C1-10烷基，剩余的为氢原子，或者，当R1基团、R2基团、R3基团、R4基团和R5基团中任意两个为C1-10烷基，剩余的为氢原子。而C1-10烷基是指碳原子数为1-10个的直链烷基或支链烷基。
在一个实施例中，式I所示的呋喃苯甲酸类化合物中，R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团为C1-5烷基，剩余的为氢原子。该C1-5烷基是指碳原子数为1-10个的直链烷基或支链烷基。
进一步地，R1、R2、R3、R4和R5中的任意两个基团为C1-3烷基，剩余的为氢原子。
更进一步地，R1和R3为C1-3烷基，R2、R4和R5为氢原子。
更进一步地，R1和R3为甲基，R2、R4和R5为氢原子。
更进一步地，上述微粒体前列腺素E2合酶抑制剂为：2-氯-5-(5-{[((2Z，5E)-2-[(2,4-二甲基苯基)亚氨基]-4-氧代-1,3-噻唑烷丁-5-亚烷基]甲基}呋喃-2-yl)苯甲酸(简称CLOTH)。
第二方面，本申请提供一种上述式I所示的呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于抑制炎症的药物中的应用。
第三方面，本申请提供一种上述式I所示的呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物中的应用。
第四方面，本申请提供一种上述式I所示的呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的并发症的药物中的应用。
第五方面，本申请提供一种治疗炎症性疾病的药物组合物，所述药物组合物包括如式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐，及药学上可接受的辅料。
本申请第一方面提供的一种微粒体前列腺素E2合酶抑制剂，所提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而体现抗炎活性；同时，在作用的同时未打破PGI2和TXA2之间的平衡，对COX-1、COX-2无明显的影响，这意味着其在应用中引起心血管方面的副作用的风险较传统的选择性COX-2抑制剂或其他非甾体抗炎药小；因此，所提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂可用于炎症的治疗，同时不会引起心血管疾病的副作用，作用效果较佳，不良反应较少，适合广泛应用。
本申请第二方面提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于抑制炎症的药物中的应用，基于微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此微粒体前列腺素E2合酶抑制剂能够广泛用于抑制炎症的药物的制备中。
本申请第三方面提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物中的应用，基于微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此微粒体前列腺素E2合酶抑制剂能够广泛用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物的制备中。
本申请第四方面提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的并发症的药物，基于微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此微粒体前列腺素E2合酶抑制剂能够广泛用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物的制备中。
本申请第五方面提供的一种治疗炎症性疾病的药物组合物，所述药物组合物包括如式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐，及药学上可接受的辅料。由于该药物组合物中包括如式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂，该微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此得到的药物组合物具有可用于炎症的治疗，同时不会引起心血管疾病的副作用，作用效果较佳，不良反应较少，适合广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CLOTH对白细胞介素-1β介导的A549细胞的细胞毒性效果图；
图2为CLOTH对脂多糖介导的大鼠原代腹腔巨噬细胞的细胞毒性效果图；
图3为CLOTH及阳性对照药物MK886在无细胞ELISA测试中对PGE2产物的作用效果图；
图4为CLOTH及阳性对照药物MK886在无细胞ELISA测试中对mPGES-1蛋白活性的作用效果图；
图5为CLOTH对mPGES-1蛋白亲和力的作用效果图；
图6为CLOTH及阳性对照药物MK886在白细胞介素-1β(IL-1β)介导的A549细胞上对PGE2产物的作用效果图；
图7为CLOTH及阳性对照药物MK886在脂多糖(LPS)介导的大鼠原代腹腔巨噬细胞上对PGE2的作用效果图；
图8为CLOTH及阳性对照药物MK886在脂多糖(LPS)介导的大鼠原代腹腔巨噬细胞上对PGI2的作用效果图；
图9为CLOTH及阳性对照药物MK886在脂多糖(LPS)介导的大鼠原代腹腔巨噬细胞上对TXA2的作用效果图；
图10为CLOTH及阳性对照药物MK886在脂多糖(LPS)介导的大鼠原代腹腔巨噬细胞上对PGI2和TXA2的作用效果图；
图11为CLOTH在白细胞介素-1β(IL-1β)介导的A549细胞上对mPGES-1蛋白表达水平的影响效果图；
图12为CLOTH在脂多糖(LPS)介导的大鼠原代腹腔巨噬细胞上对mPGES-1蛋白表达水平的影响效果图；
图13为CLOTH在脂多糖(LPS)介导的大鼠原代腹腔巨噬细胞上对COX-2蛋白表达水平的影响效果图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例提供的式I所示的呋喃苯甲酸类化合物可以降低PGE2的生成，抑制mPGES-1蛋白的活性，因此，该类呋喃苯甲酸类化合物可以被开发为一种新型的抗炎mPGES-1抑制剂，在临床上具有很好的应用前景。
具体地，该类呋喃苯甲酸类化合物作为mPGES-1抑制剂，可以开发成治疗与mPGES-1相关的疾病的药物，例如，该呋喃苯甲酸类化合物可以用于制备抗炎症药物。本申请实施例第一方面提供一种式I所示的化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂的应用。
本申请第一方面提供的一种式I所示的化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂，通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而体现抗炎活性；同时，该微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在作用的同时未打破PGI2和TXA2之间的平衡，对COX-1、COX-2无明显的影响，这意味着微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在应用中引起心血管方面的副作用的风险较传统的选择性COX-2抑制剂或其他非甾体抗炎药小；因此，所提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂可用于炎症的治疗，同时不会引起心血管疾病的副作用，作用效果较佳，不良反应较少，适合广泛应用。
在一些实施例中，如结构式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过调控微粒体前列腺素E2合酶1的蛋白表达以抑制PGE2产生。通过抑制PGE2产生体现抗炎活性。
在一些实施例中，如结构式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂对COX-1、COX-2无影响，微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在作用的同时未打破PGI2和TXA2之间的平衡，因此，其在应用中引起心血管方面的副作用的风险较传统的选择性COX-2抑制剂或其他非甾体抗炎药小。
本申请实施例第二方面提供一种式I所示的呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于抑制炎症的药物中的应用。
本申请第二方面提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于抑制炎症的药物中的应用，基于微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此微粒体前列腺素E2合酶抑制剂能够广泛用于抑制炎症的药物的制备中。
本申请实施例第三方面提供一种式I所示的呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物中的应用。
本申请第三方面提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物中的应用，基于微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此微粒体前列腺素E2合酶抑制剂能够广泛用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物的制备中。
本申请实施例第四方面提供一种式I所示的呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的并发症的药物。
本申请第四方面提供的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的并发症的药物，基于微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此微粒体前列腺素E2合酶抑制剂能够广泛用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物的制备中。
本申请实施例第五方面提供一种治疗炎症性疾病的药物组合物，药物组合物包括如式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐，及药学上可接受的辅料。
本申请第五方面提供的一种治疗炎症性疾病的药物组合物，药物组合物包括如式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐，及药学上可接受的辅料。由于该药物组合物中包括如式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂，该微粒体前列腺素E2合酶抑制剂通过显著地降低PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，进而调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而达到抗炎效果，且对COX-1、COX-2无明显的影响，因此得到的药物组合物具有可用于炎症的治疗，同时不会引起心血管疾病的副作用，作用效果较佳，不良反应较少，适合广泛应用。
在一些实施例中，药物组合物中，辅料选自增稠剂、填充剂、稀释剂和药物载体中的一种或多种。
在一些实施例中，药物组合物配制为以下任意一种形式：糖浆剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂、乳剂、气雾剂。
进一步地，上述微粒体前列腺素E2合酶抑制剂为：2-氯-5-(5-{[((2Z，5E)-2-[(2,4-二甲基苯基)亚氨基]-4-氧代-1,3-噻唑烷丁-5-亚烷基]甲基}呋喃-2-yl)苯甲酸(简称CLOTH)，结构式如下所示：
Figure BDA0003058866790000111
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
细胞活性检测试验
试验过程
(1)A549细胞培养及处理
A549细胞系是从AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Manassas,VA,USA)处购买。
细胞培养基为RPMI 1640，并添加10％的胎牛血清(Gibco BRL Co,Grand Island,NY,USA)和1％的盘尼西林G(100ml/unit)、链霉素(100mg/ml)以及L-谷氨酰胺(2mM)(GibcoBRL Co,Grand Island,NY,USA)。
细胞于37℃含有5％CO2的环境中孵育；将A549细胞以1×105的密度接种于6孔板中，孵育24小时。
(2)大鼠原代腹腔巨噬细胞的分离与培养
提供购自香港大学的SD大鼠(体重180～280g)，从该鼠中分离得到腹腔巨噬细胞(RPM)，并在Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)中培养；其中，培养基添加了10％的胎牛血清(Gibco BRL Co,Grand Island,NY,USA)和1％的盘尼西林G(100ml/unit)、链霉素(100mg/ml)以及L-谷氨酰胺(2Mm)(Gibco BRL Co,Grand Island,NY,USA)。
SD大鼠被给予标准食水，通过使用冷的无菌汉克平衡盐溶液(HBSS)冲洗大鼠腹腔以获得原代RPM；将洗涤液以1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用15mL完全DMEM培养基重悬细胞，并以2mL体系接种至6孔板中；将细胞在37℃含有5％CO2的环境中孵育2小时，然后用预热的完全DMEM培养基将附着后的细胞洗涤两次，以确保无未贴壁的悬浮细胞。
(3)将A549细胞和RPM细胞均被接种于6孔板中。用不同浓度的CLOTH(0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)预处理后，将A549细胞和PRM细胞分别用IL-1β(1ng/ml)和LPS(1μg/ml)进行刺激24小时，再向每孔中加入MTT溶液并孵育4小时。其后再向每孔加入100μL 10％SDS-HCL溶液，孵育18小时以溶解甲臜结晶，使用微板UV/VIS分光光度计(Tecan,Mannedorf,Switzerland)。在570nm吸收波长和650nm参比波长处测量吸光度。将空白组(未经化合物及IL-1β、LPS处理)的吸光值(OD)设为100％。
结果分析
实施例1中对细胞活性检测试验，用不同浓度的CLOTH预处理后，将A549细胞和PRM细胞分别用IL-1β和LPS进行刺激24小时。之后，使用MTT法对细胞活性进行检测。
结果如附图1和附图2所示，附图1为CLOTH对IL-1β激活的A549细胞的细胞毒性分析，图2为CLOTH对LPS激活的RPM细胞的细胞毒性分析，结果显示，当浓度低于20μM时，CLOTH对IL-1β激活的A549细胞和LPS激活的RPM细胞没有明显的细胞毒性。
实施例2
无细胞ELISA试验中CLOTH对PGE2和mPGES-1蛋白活性的影响
试验过程
(1)制备mPGES-1蛋白
将A549细胞以1.6×106的密度接种于175cm2的烧瓶中，并孵育24小时；再用1ng/mLIL-1β刺激细胞72小时；再收集细胞并用PBS洗涤2次；将收集的细胞沉淀物以1000rpm离心5分钟，然后弃去上清液；用预冷的均质缓冲液(0.1M磷酸钾缓冲液pH7.4、1mM苯基甲磺酰氟、60μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、1μg/mL亮肽素、2.5mM GSH和250mM蔗糖)重悬细胞沉淀用声波振荡器破碎细胞。收集混悬液并以10000g离心10分钟。收集上清液并以50000rpm离心1.5小时。超高速离心后，弃去上清液，收集沉淀并用均质缓冲液重悬，保存于-80℃。
(2)在含有2.5mM GSH(总体积为100μL)的磷酸钾缓冲液(0.1M,pH 7.4)中稀释A549细胞的微粒体膜。通过添加PGH2(20μM终浓度)来启动PGE2的合成。在4℃下孵育工作液1分钟，然后用100μL终止溶液(40mM FECl2、80mM柠檬酸和10μM 11β-PGE2)终止反应。通过ELISA测量PGE2水平。在测试中，MK886被选做阳性对照。
结果分析
由于MK886(IC50＝2.4μM)是最早发现的mPGES-1抑制剂之一，其通常在mPGES-1蛋白活性测定中作为参考抑制剂，因此通过无细胞ELISA方法检测了CLOTH对PGE2和mPGES-1蛋白的活性的影响。
结果如附图3和附图4所示，附图3为测定PGE2的蛋白活性的分析图，附图4为测定mPGES-1蛋白活性的分析图；从图3可以看出，CLOTH降低PGE2蛋白活性，同样的，阳性对照MK886也降低PGE2蛋白活性；从图4可以看出，CLOTH降低mPGES-1蛋白活性，同样的，阳性对照MK886也降低mPGES-1蛋白活性。因此，CLOTH可以同时降低PGE2和mPGES-1蛋白活性。同样的，阳性药物MK886也可以降低该两种蛋白的活性。
实施例3
无细胞试验中进行mPGES-1蛋白与化合物的亲和力检测
试验过程
使用FortéBio Octet Red仪器进行测定，所有测定均采用96孔板(Greiner Bio-One,PN:655209)进行。所有的最终反应体积均控制为200μL/孔。将生物素化的mPGES-1蛋白固定在SA尖端上。测定步骤包括：基线归零、化合物结合、解离。蛋白质和药物亲和力结果分析由ForteìBio数据分析软件进行。为了测量化合物CLOTH和mPGES-1蛋白之间的相互作用，在此测定法中采用了7个浓度的化合物CLOTH(3.13、6.25、12.5、25、50、100μM)。
结果分析
由于实施例2的结果已表明CLOTH可同时降低PGE2和mPGES-1的蛋白活性，因此本研究后续使用分子对接法对CLOTH于mPGES-1蛋白的结合能力进行了测试。结果如附图5所示，CLOTH与mPGES-1蛋白具有结合能力。
实施例4
CLOTH对IL-1β诱导的A549细胞中PGE2蛋白表达的影响
试验步骤
(1)A549细胞系是从AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Manassas,VA,USA)处购买。细胞培养基为RPMI 1640，并添加10％的胎牛血清(Gibco BRL Co,Grand Island,NY,USA)和1％的盘尼西林G(100ml/unit)、链霉素(100mg/ml)以及L-谷氨酰胺(2Mm)(GibcoBRL Co,Grand Island,NY,USA)。细胞于37℃含有5％CO2的环境中孵育。
(2)将A549细胞以1×105的密度接种于6孔板中，孵育24小时；再分别用CLOTH(10μM)、MK886(10μM)、DEX(0.5μM)预处理1小时，然后用白细胞介素-1β(IL-1β)(1ng/mL)刺激24小时。
结果分析
由于实施例3的实验已证明CLOTH与mPGES-1蛋白具有亲和力，因此在IL-1β诱导的A549细胞模型上对CLOTH进行了进一步检测。
结果如附图6所示，在刺激24小时以后，IL-1β诱导的A549细胞的PGE2表达水平显著增加。而用CLOTH预处理则可有效的降低PGE2表达水平。地塞米松(DEX)和MK886也可以显著的降低该细胞模型中的PGE2表达水平。
实施例5
检测A549细胞和RPM中PGE2、PGI2和TXA2的表达水平
试验步骤
将A549细胞和RPM细胞接种于6孔板中，用于后续实验中。该两种细胞均用CLOTH(10μM)或阳性药MK886(10μM)或DEX(0.5μM)预处理1小时。然后用IL-1β刺激A549细胞、用LPS刺激RPM细胞24小时。刺激后，收集培养基。使用ELISA方法测量培养基汇总PGE2水平。选择检测6-kEto-PGF1α和TXB2在培养基中的表达水平以代表PGI2和TXA2的表达水平，因为前者为后者的稳定降解产物。
结果分析
由于在自然条件下，PGI2和TXA2会在极短的时间内无酶降解为6-kEto-PGF1α和TXB2，因此本研究中选择检测后者的表达水平以间接反映前两者的表达水平。
图7为PGE2水平的分析图，可以看出，在经过24小时LPS的刺激后，RPM细胞表达的PGE2水平显著的增加。而用CLOTH预处理后，PGE2的表达水平呈剂量依赖性的降低，随着CLOTH的浓度增加，PGE2的表达水平呈下降的趋势；地塞米松和MK886均显著地降低了PGE2的表达水平。
图8为PGI2表达水平的分析图，可以看出，用CLOTH预处理后，PGI2的表达水平呈剂量依赖性的降低，随着CLOTH的浓度增加，PGI2的表达水平呈下降的趋势；地塞米松和MK886均显著地降低了PGI2的表达水平。
图9是TXA2表达水平的分析图，由图中可以看出，用CLOTH预处理后，TXA2的表达水平并未受到显著的影响；地塞米松和MK886均显著地降低了TXA2的表达水平。
图10是TXA2表达水平和PGI2表达水平比值的分析图，可以看出，CLOTH对PGI2和TXA2之间的平衡并未有明显的影响；而地塞米松还打破了PGI2和TXA2之间的平衡，其显著地改变了PGI2和TXA2之间的比例。
实施例6
CLOTH对IL-1β诱导的A549细胞中mPGES-1、COX-1和COX-2蛋白表达水平的影响以及对对LPS诱导的RPM细胞中mPGES-1和COX-2蛋白表达水平的影响
试验过程
(1)收集经预处理和刺激后的细胞后，用预冷的PBS洗涤。然后用混合了1×蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science,Germany)的RIPA裂解缓冲液(Cell Signalingtechnology,Boston,MA,USA)对细胞进行裂解；使用Bio-Rad蛋白定量试剂(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)对蛋白浓度进行测定。
(2)选用13.5％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行凝胶电泳以对蛋白进行分离。
(3)电泳分离后，将分离好的蛋白从SDS-PAGE凝胶上转移至硝酸纤维素膜上(NC膜，GE Healthcare Life Sciences,Buckinghamshire,UK)。然后，将NC膜用5％的脱脂牛奶进行封闭；其后再用一抗(β-actin、COX-1、COX-2、mPGES-1)对膜进行过夜孵育；之后在室温下将膜与荧光二抗IRDye 800CW goat anti-mouse IgG(H+L)或IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG(H+L)secondary antibodies(Li-COR,Lincoln,NE,USA)孵育共同孵育1小时。其后通过Odyssey CLxImager(Li-COR,USA)获取抗原-抗体复合物条带，并使用Odysseyv3.0软件(Li-COR,USA)对蛋白表达水平进行定量与分析。COX-1、COX-2、mPGES-1蛋白与β-actin蛋白的密度比，通过Odyssey v3.0进行分析。
结果分析
(1)CLOTH对IL-1β诱导的A549细胞中mPGES-1、COX-1和COX-2蛋白表达水平的影响
由于在选定的细胞模型中CLOTH降低了刺激后的PGE2表达水平。因此后续本研究采用western blot方法验证了CLOTH对这些模型中mPGES-1、COX-1和COX-2的蛋白表达水平的影响。
结果如附图11所示，IL-1β诱导的A549细胞中mPGES-1蛋白表达明显增加。而CLOTH预处理对细胞的mPGES-1的蛋白表达有明显的抑制作用，而对COX-1和COX-2蛋白的表达无明显的作用。
(2)CLOTH对LPS诱导的RPM细胞中mPGES-1和COX-2蛋白表达水平的影响
由于CLOTH降低了RPM细胞中PGE2的表达水平且并未明显影响PGI2和TXA2的表达水平，因此本研究使用western blot方法来验证了CLOTH对LPS刺激的RPM中mPGES-1和COX-2的蛋白表达水平的影响。
结果如附图12所示，LPS刺激显著增加了RPM细胞中mPGES-1和COX-2蛋白的表达水平。从图12可以看出，CLOTH的预处理对细胞表达的mPGES-1蛋白有呈剂量依赖性的抑制作用，从图13可以看出，对COX-2蛋白无明显的影响。
综上研究表明，化合物CLOTH是一种新型的mPGES-1抑制剂；在无细胞试验中，CLOTH显著地降低了PGE2的生成，并抑制了mPGES-1蛋白的活性，说明其可通过调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而体现抗炎活性。在细胞实验中，CLOTH以剂量依赖地(10、5、2.5μM)方式下调了mPGES-1蛋白的表达和PGE2的产生，同样说明其可通过调控mPGES-1蛋白表达以抑制PGE2产生而体现抗炎活性。同时，CLOTH并未打破PGI2和TXA2之间的平衡，对COX-1、COX-2无明显的影响，这意味着CLOTH在应用中引起心血管方面的副作用的风险较传统的选择性COX-2抑制剂或其他非甾体抗炎药小。因此，CLOTH可应用于制备用于抑制炎症的药物中、制备用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物中、制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的并发症的药物。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种呋喃苯甲酸类化合物作为微粒体前列腺素E2合酶1抑制剂的应用，所述呋喃苯甲酸类化合物的化学结构通式如式I所示；
Figure FDA0003058866780000011
其中，X1、X2、X3和X4中的任意一个基团为卤素原子，剩余的为氢原子；
R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团为C1-10烷基，剩余的为氢原子。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，X1、X2、X3和X4中的所述卤素原子选自氟原子、氯原子、溴原子和碘原子中的任意一种；或者，
X1为卤素原子，X2、X3和X4为氢原子。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团为C1-5烷基，剩余的为氢原子；或者，
R1和R3为C1-3烷基，R2、R4和R5为氢原子。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述呋喃苯甲酸类化合物的化学结构如下所示：
Figure FDA0003058866780000021
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述呋喃苯甲酸类化合物用于制备抑制炎症的药物。
6.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述呋喃苯甲酸类化合物用于制备预防和/或治疗炎症性疾病和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的药物；或者，
所述呋喃苯甲酸类化合物用于制备预防和/或治疗炎症性疾病的并发症和/或与微粒体前列腺素E2合酶1相关的疾病的并发症的药物。
7.一种治疗炎症性疾病的药物组合物，所述药物组合物包括如式I所示的微粒体前列腺素E2合酶抑制剂其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐，及药学上可接受的辅料；
Figure FDA0003058866780000031
其中，X1、X2、X3和X4中的任意一个基团为卤素原子，剩余的为氢原子；
R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团为C1-10烷基，剩余的为氢原子。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，X1、X2、X3和X4中的所述卤素原子选自氟原子、氯原子、溴原子和碘原子中的任意一种；或者，
X1为卤素原子，X2、X3和X4为氢原子。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，R1、R2、R3、R4和R5中的任意一个基团或两个基团为C1-5烷基，剩余的为氢原子；或者，
R1和R3为C1-3烷基，R2、R4和R5为氢原子。
10.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述呋喃苯甲酸类化合物的化学结构如下所示：
Figure FDA0003058866780000041
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