CN113383985B - 具有可变量的环境污染物的烟草和用于制造这种品系的方法 - Google Patents
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Abstract
本文涉及具有可变量的环境污染物的烟草和用于制造这种品系的方法，具体涉及一种由改性的烟草植物或其一部分制成的烟草产品，其中，所述改性的烟草植物包括10TN‑253‑4、10TN‑256‑1和10TN‑287‑4品系中的至少一种。本发明涉及基因改性的烟草植物，以及衍生自这种植物的烟草产品，与衍生该改性的植物的未改性的亲代烟草植物相比，其包括改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。吸收和/或含量的改变可以是对环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低，或者是增加。这些方法和植物可用于改善烟草产品，或者用于产生可具有环境友好的性质的烟草品系。
Description
本申请是国际申请号为PCT/US2013/024730，国际申请日为2013年2月5日的PCT国际申请进入中国国家阶段后的申请，申请号为201380016376.5，发明名称为“具有可变量的环境污染物的烟草和用于制造这种品系的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于制造具有改变量的至少一种环境污染物例如重金属的烟草的方法，以及涉及用这种方法制备的烟草品系。
背景技术
普通的吸烟制品如香烟可具有基本圆柱棒形的结构，包括用包装纸围绕的一支、一卷或一柱可抽吸(smokable)材料，例如切碎的烟草(例如为切割的填充物形式)。此外，烟草可用于无烟产品，例如嚼烟和其它无烟烟草产品。例如，美国专利公开第2011/0048434号列出了各种类型的无烟烟草产品，该文的全部内容通过引用纳入本文。
历经数年，已经开发了各种方法来改善烟草和烟草产品的香味。除了改善香味(flavor)，制造具有减少量的某些潜在的有毒化学品的烟草植物和衍生自这种植物的烟草产品，是非常有帮助的。例如，制造具有减少的重金属的烟草植物和烟草产品是有趣的。
镉(Cd)是可在土壤中发现的重金属。在田地里，磷酸盐肥料可为镉的来源，且浓度可基于耕作方法、土壤特征、气候和植物变种而变化(鲁刚-茂林(Lugon-Moulin)等，《可持续发展农业》(Agronomy for Sustainable Development),26:151-156,2006)。镉可在烟草中聚集。研究表明烟茎位置、种植年代和生长区域可对镉含量有影响。此外，因为气候和土壤的不同，难以精确表征在现有的栽培品种之间形成的真正的基因差异(鲁刚-茂林(Lugon-Moulin)等，《臭氧层》(Chemosphere)，63:1074-1086,2006)。例如，研究表明在烟草(Nicotiana)种之间存在潜在的镉聚集差异，但在烟草(Nicotiana tabacum)的变种之内更少(瓦格纳(Wagner)和亚甘(Yeargan)，《植物生理学》(Plant Physiology),82:274-279,1986)。
因为烟草(例如叶片、杆、花和根)用于制造香烟和其它烟草产品，所以开发能低效率地将镉之类的重金属从根部移位到新芽的新栽培品种是有益的。
此外，因为烟草可吸收这种环境污染物，吸收增加量的这种化合物的烟草品系可用来减少这种化学品在土壤中的量(如，用于土壤清洁)。
因此存在对下述方法的普遍需求：所述方法能提供包括改变吸收重金属污染物、其它非天然化学品或者来自环境的其它化合物的植物品系，其中如果长时间摄取这些化合物可能是潜在有毒的。应设计所述方法，使该方法甚至可用于如烟草的植物物种，所述植物物种具有复杂的基因组并因此可需要大量的突变体筛选事件来分离感兴趣的突变，且较大因此需要大量设施来育种，用于所需表型的筛选是经济的。
发明内容
本发明提供烟草植物，其具有显著改变吸收和/或改变含量(level)的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，以及制造这种植物的方法。
在一些实施方式中，本发明提供制备烟草植物或其一部分的方法，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。吸收和/或含量的改变，可能是与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，对至少一种环境污染物或其它非天然化学品吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变，可能是与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，对至少一种环境污染物或其它非天然化学品吸收和/或含量的增加。
在一些实施方式中，本发明包括制备改性的烟草植物或其一部分的方法，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该改性的烟草植物或其一部分具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，所述方法可包括下述步骤：在包括诱变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物的种子；洗涤所述种子，使其不含突变剂；存在选择剂时，使所述种子发芽，并种植M0烟草幼苗，从而产生包括M1烟草种子的至少一种M0烟草植物，其中M1烟草种子包括至少一种诱变的M1烟草种子；以及使所述至少一种透变的M1烟草种子发芽，从而选择包括改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品的改性的M1烟草植物或其一部分。在一些实施方式中，所述方法可包括在含选择剂的培养基中，使衍生自M0植物的M1植物(和/或M2和/或M3和/或M4植物和/或后续的代)发芽。
在其它实施方式中，本发明包括改性的烟草植物或其一部分，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该改性的烟草植物或其一部分具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。吸收和/或含量的改变，可能是与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，对至少一种环境污染物或其它非天然化学品吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变，可能是与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，对至少一种环境污染物或其它非天然化学品吸收和/或含量的增加。
在一些实施方式中，本发明包括衍生自本文所述的烟草品系中的一种的烟草植物。例如，在一些实施方式中，本发明可包括烟草植物，其包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种。
此外，在一些实施方式中，本发明包括由本发明的植物和烟草品系制造的烟草产品。例如，在一些实施方式中，本发明包括含改性的烟草的烟草产品，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该改性的烟草植物具有减少的吸收和/或降低含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。
在一些实施方式中，本发明包括一种组合物(即，烟草产品)，其包括衍生自本文所述的烟草品系中的一种的烟草。例如，在一些实施方式中，本发明可包括组合物，其包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或1-TN-287-4品系中的至少一种。
在本发明的各实施方式中，具有改变吸收的环境污染物或其它非天然化学品可包括重金属。重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。在一种实施方式中，具有改变吸收和/或含量的重金属是镉。或者，可减少其它重金属和/或其它选定的元素。
附图说明
通过以下详述、所附权利要求书和附图，本发明的各种特征、方面和优点，以及其他的特征、方面和优点将变得更明显。
图1是根据本发明的一种实施方式的示意图，显示了用于产生具有改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品的烟草品系的方法。
图2显示了在本发明一种实施方式的各个烟熏烟M1育种品系选择的植物组织样品中的Cd分布。图中的条是分段的，顺序如图的右侧的图注所示。
具体实施方式
发明详述
定义
在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指代物，除非上下文中另有明确的说明。此外，术语“种子”和“幼苗”包括单数和复数指代。
提及的“干重量百分数”或者“以干重为基准计”指的是基于干成分的重量(即，除了水以外的所有成分)。
术语“非天然”指不是动物天然摄取的和/或本发明的方法改性的植物(如，烟草)中吸收和/或合成的化合物或化学品。这些化合物可能不适宜人类消费。但是，在一些实施方式中，这些化合物对于动物和人类消费来说可能是有益的。术语“非天然化学品”和“非天然化合物”互换使用，除非另有说明。
术语“环境污染物”指在环境中正常不会发现的在环境中的化合物，或者与认为被该化合物污染的环境相比，通常在未污染的环境中以显著更低的水平发现的化合物。在某些情况下，环境污染物可以是重金属。或者，环境污染物可以是另一种化合物，当被同位和/或人类摄入时，该化合物具有潜在的有害或不利影响。
如本文所定义，培养基可包括适于生物组织维持或生长的组合物。培养基可包括水、缓冲溶液或生长培养基，例如但不限于本文实施例所述的那些培养基。一般地，与感兴趣的植物生物相容的任意组合物，可适于用作培养基或培养基的部分。
如本文所定义，诱变包括导致DNA序列改变的过程。术语“诱变”指使用诱变剂来在个体群中诱导基因突变。待诱变的群可包括植物、植物的部分或种子。对于诱变的群，可根据实验决定用于各类植物组织的诱变化学或辐射，从而可获得低于表现为致死的阈值水平的突变频率或者可重复的无菌性。可基于预期的突变频率，来估计诱变处理后导致的M1代种子的数目或M1植物群的尺寸。
在基因中可诱导的突变类型包括例如点突变、增加、缺失、插入、复制、转换、翻转和倒置。诱变可导致移码或核苷酸交联，以及碱基的改性/取代，从而改变蛋白质和DNA(如转录因子)的结合。或者，突变可导致其它基于序列的结构或功能的改变。还包括由这种突变体和物种间和物种内交叉制造的杂种。
除了本文详细描述的方法以外，在一些实施方式中，可通过把植物细胞种在组织培养液中来诱导诱变，这可导致产生体细胞变异体。或者，可采用为了生产杂交植物而开发的、使用原生质体熔合的标准原生质体培育方法，它也可用于产生具有变体基因表达的植物。因此，可从具有变体基因表达的第一和第二植物产生原生质体。可从成功的原生质体熔合和植物再生培育愈伤组织。根据本文所述的方法，可确定和选择所得子代杂交植物用于变体基因表达，且可用于本文所述的配种方案。还包括了方法，该方法包括基因工程如定点诱变。
包含于本发明植物中的植物还包括下述植物(和/或衍生自这种植物的品系)：可使用来自不同物种(例如，用于烟草植物的非烟草DNA)的DNA，在不同于涉及环境污染物或其它非天然化学品吸收的基因的基因座(locus)对其进行基因改造。例如，本发明还包括下述植物：该植物被基因改造成耐杀虫剂，且还通过烟草基因组DNA的诱变进行改性从而呈现减少的对至少一种环境污染物或其它非天然化学品的吸收。在一种实施方式中，本发明的植物包括下述植物：该植物具有与未改性的植物母品系基本上相同的抗生素耐药性分布，从而与未改性的植物母品系相比，改性的植物不包括新的抗生素耐药性。
诱变剂定义为能改变(诱变)细胞中DNA的物质(或处理)。合适的诱变剂包括例如化学诱变剂和电离辐射。典型的化学诱变剂包括，但不限于：甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸、5-溴尿嘧啶、甲基-亚硝基胍、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙锭和移码突变剂如普鲁(proflavin)等。还可通过辐射如UV、X-射线、γ-射线、快速中子辐射等来产生突变。诱变剂还包括遗传成分，如病毒载体、转座子(transponson)等，它们可促进把外源DNA插入烟草基因组。
一般地，用诱变剂处理的第一代包括M0(或M0)代。然后，后续的代则描述为M1(或M1)(即在突变事件后的一代)、M2(在突变事件后的二代)等。因此，如本文所使用，M0指暴露于诱变剂的植物细胞(和由此长成的植物)，而M1指由M0植物自花授粉产生的种子和由该种子长成的植物。M2是自花授粉的M1植物的子代(种子和植物)，M3是自花授粉的M2植物的子代，M4是自花授粉的M3植物的子代，M5是自花授粉的M4植物的子代等。因此，Mn+1(或Mn+1)各为自花授粉的前面的Mn(或Mn)代的子代。
如本文所使用，“改性的植物”、或“改性的烟草植物”、或“改性的烟草”包括基因改性(即突变的)的植物、烟草植物和烟草，从而具有与衍生该改性的植物的未改性的植物(如烟草)不同的基因型和表型。
如本文所使用，术语“衍生该改性的植物的未改性的植物”指用来产生变异(即，“改性的”)植物品系的亲代植物品系。如本文所使用，M0代是衍生该改性的M1植物的未改性的植物。
如本文所定义，组织的物理外观包括它的表型，而组织的基因组成包括它的基因型。杂合子定义成在感兴趣的位置具有不同的等位基因(即，DNA序列)的基因组。例如，杂合子突变将是只在一种等位基因具有突变的序列的植物。因此，对于一个基因，杂合子具有两个不同的等位基因，它们全部可传承至下一代。纯合子定义成在一个或更多个基因座具有相同等位基因的组织。因此，纯合子在感兴趣的位置携带相同的等位基因(例如，两种突变或两种正常的序列)，因此相同的等位基因将传承到所有的子代。
具有改变环境污染物的烟草
本发明提供制备烟草植物的方法，该烟草植物具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在一些实施方式中，本发明包括用于制造改性的烟草植物或其一部分的方法，所述方法包括产生烟草植物，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物具有改变吸收和/或改变含量的环境污染物或其它非天然化学品。
在一些实施方式中，本发明提供制备烟草植物或其一部分(或者衍生自这种植物的烟草品系)的方法，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分具有减少吸收和/或降低含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在一些实施方式中，本发明包括由本发明的植物制成的烟草植物和/或烟草产品，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，本发明的植物具有减少吸收和/或降低含量的环境污染物或其它非天然化学品。
在其它一些实施方式中，本发明提供制备烟草植物或其一部分的方法，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分具有增加的吸收和/或增加含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在一些实施方式中，本发明包括烟草植物，或衍生自这种植物的烟草品系，或由这种植物制成的产品，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，这种植物具有增加吸收和/或增加含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。
在本发明的每一种方法、植物、植物品系或烟草产品的某些实施方式中，环境污染物或其它非天然化学品可包括重金属。具有改变吸收和/或改变含量的重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。例如，在本发明的每一种方法、植物、植物品系或烟草产品的某些实施方式中，具有改变吸收和/或含量的重金属是镉。或者，在本发明的每一种方法、植物、植物品系或烟草产品中可改变其它重金属和/或其它选定的元素。
可通过各种方式实施本发明。
制备具有改变的环境污染物的烟草的方法
本发明的实施方式提供制备烟草植物或其一部分的方法，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。
在各种制备烟草植物或其一部分的方法的一些实施方式中，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，该环境污染物或其它非天然化学品可包括重金属。具有改变吸收和/或改变含量的重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。在一种实施方式中，具有改变吸收和/或含量的重金属是镉。或者，其它重金属和/或其它选定的元素可具有改变的吸收和/或含量。
在期望改变重金属的吸收或含量的一些实施方式中，选择剂是重金属。该重金属可以与期望具有改变吸收和/或含量的重金属相同。例如，在一些实施方式中，期望改变镉的吸收，那么选择剂就是镉。
因此，在一种实施方式中，本发明包括用于生产改性的烟草植物或其一部分(或衍生自这种植物的品系)的方法，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分包括改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品的改变表型。所述方法可包括在含诱变剂的溶液中，培育用于感兴趣的植物的至少一个种子(即，一个或多个种子)。所述方法还可包括洗涤所述至少一个种子，使种子不含诱变剂。所述方法还可包括使至少一个种子发芽，并种植至少一种M0幼苗，即一种或更多种幼苗。此时，所述方法还可包括把选择剂添加至一个或多个幼苗，其中选择剂选择M0嵌合植物，其中该M0嵌合植物至少部分地包括预先决定的改变表型。然后，所述方法可包括种植M0植物来产生一个或多个M1种子，其中一个或多个M1种子包括至少一个含预先决定的改变表型的诱变M1种子，以及至少一个诱变M1种子发芽来选择含预先决定的改变表型的至少一种M1植物。在一些实施方式中，所述方法还包括种植至少一个M1植物来产生一个或多个M2种子并使M2种子发芽来种植M2植物，其中至少一种M2植物是用于突变的纯合子，该突变赋予在选择剂存在下生长的能力(例如，改变的表型和基因型)。在一些实施方式中，所述方法可包括在含选择剂的培养基中，使衍生自M0植物的M1和/或M2和/或M3和/或M4植物和/或后续的代发芽。还在一些实施方式中，在某些发育阶段，如在发芽后的预先决定的时段中，把含至少一种选择剂的第二培养基添加至M0幼苗。
例如，在一些实施方式中，所述方法可包括在包括诱变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物的至少一种烟草种子；洗涤所述至少一种种子，使其不含突变剂；存在选择剂时，使所述至少一种种子发芽，并种植至少一种M0烟草幼苗，从而产生包括M1烟草种子的至少一种M0烟草植物，其中来自嵌合烟草植物的M1烟草种子包括至少一种诱变的M1烟草种子；以及使所述至少一种诱变的M1烟草种子发芽，从而选择改性的M1烟草植物，与未改性的烟草植物相比，该改性的M1烟草植物包括显著改变吸收和/或改变含量的环境污染物或其它非天然化学品。
在替代实施方式中，改性的植物(或衍生自这种植物的烟草品系)具有至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或100％减少的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在替代实施方式中，改性的植物具有减少至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100倍的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。例如，在一些实施方式中，改性的烟草植物包括至少100％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％或10％减少的镉含量。
在替代实施方式中，改性的植物(或衍生自这种植物的烟草品系)具有至少10,20,30,40,50,100,200或500％增加的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在替代实施方式中，改性的植物具有增加至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100倍的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。例如，在一些实施方式中，改性的烟草植物包括至少10,20,30,40,50,100,200或500％增加的镉含量。
还在本发明的方法的一些实施方式中，在某些发育阶段，如在发芽后的预先决定的时段中，把含至少一种选择剂的培养基添加至M0幼苗。对于烟草(如烟草(Nicotianatabacum))，可在发芽7-14天后把包括至少一种选择剂的培养基添加至M0幼苗。例如，可在发芽约10天后把包括至少一种选择剂的第二培养基添加至M0幼苗。在另一种实施方式中，在M0幼苗生长时，选择可持续的存在。
如本文所进一步描述，可使用本发明的方法改性多种植物。在某些实施方式中，所述植物包括异源倍体基因组。在一些实施方式中，植物是烟草。在一些优选实施方式中，烟草是烟草(Nicotiana)属。更优选地，烟草可包括烟草种(Nicotiana tabacum)。或者，如本文所述，可使用任意属的烟草(Nicotiana)。这些成员如美国专利公开号2006/0185686和2011/0174323所述的那些，上述各文的全部内容通过引用纳入本文。
或者，可使用如本文所进一步详细描述的其它烟草。例如，用于本发明的方法的烟草可包括野生烟草或已以一些方式基因改性的烟草。因此，所述烟草可以包含多种类型的烟草，例如：烟熏烟、白莱烟、晒干烟(例如，东方烟或者印度卡努尔(Indian Kurnool))、马里兰烟、深色烟、深色烤烟、深色风干烟(例如，passanda烟、cubano烟、jatin烟和bezuki烟)或者微风干烟(例如，北威斯康星烟(North Wisconsin)与galpoa烟)和黄花烟，以及其他罕见的或特种烟或者甚至是绿色或者未熟化烟草。代表性东方烟包含katerini烟、prelip烟、komotini烟、xanthi烟以及yambol烟。
在一些实施方式中，诱变剂是甲磺酸乙酯(EMS)。在一些实施方式中，EMS的最终浓度是0.01-2％。或者，EMS的最终浓度可以是0.05-1％。或者，EMS的最终浓度可以是0.1-0.7％。例如，在一些实施方式中，可使用0.5％的浓度。或者，可使用其它化学诱变剂(或辐射)。
在一些实施方式中，诱变的种子可悬浮于含选择剂的固化琼脂平板中。在其他实施方式中，种子可悬浮于营养培养基中并施加至半透表面，从而在添加选择剂之前生长。或者，可使用水培系统或在土壤中进行选择。或者，可使用本领域已知的其它体外选择方法。
本发明的实施方式包括用于植物诱变的方法，所述方法包括在M0嵌合阶段的选择步骤。例如，在本发明的各种方法、植物(植物品系)和产品的实施方式中，本发明包括选择耐较高(潜在地致命的)量的重金属选择剂的植物。这种耐性可能是因为吸收和/或含量的改变，其包括环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，这种耐性可能是因为吸收和/或含量的改变，其包括环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。
例如，在本发明的各种方法、植物(植物品系)和产品的实施方式中，本发明包括选择耐较高(潜在地致命的)量的镉(Cd)选择剂的植物。或者，可使用其它选择剂，例如其它重金属环境污染物或其它非天然化学品。
选择剂的浓度可取决于环境的性质和所用选择剂而改变。在一些实施方式中，镉是选择剂，镉以约0.02-约15mM,或0.04-约10mM,或约0.050-约5mM的浓度范围存在。或者，镉可以约0.075-约1mM的浓度范围存在。或者，镉可以0.1-约0.3mM的浓度范围存在。或者，镉选择剂可以约0.15mM存在。
在一些实施方式中，M0植物含有耐选择剂的细胞子群；当于存在选择剂(例如但不限于升高水平的镉)下种植植物时，这些细胞可赋予整个植物活力。本发明因此无需种植大量的M0植物来产生M1种子，由此大大减少了M1阶段必须筛选的子代数目，因此得到用于大植物或包括复杂基因组的植物(如烟草)的廉价的植物育种方案。其它方法用于制造含显著增加氨基酸含量的烟草(N.tabacum)品系，以及特别是显著增加的苏氨酸，如美国专利第6,730,832号、第7,173,170号和第7,825,305号所述，以上各文的全部内容通过引用纳入本文。
本发明的实施方式还可包括衍生自使用本发明的方法产生的改性的植物的种子，其中种子能繁殖改性的植物品系，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该改性的植物品系具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。
在用本发明的方法制备的种子一些实施方式中，环境污染物或其它非天然化学品可包括重金属。具有改变吸收和/或改变含量的重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。在一种实施方式中，具有改变吸收和/或含量的重金属是镉。或者，在用本发明的方法制备的种子中，可改变其它重金属和/或其它选定的元素。
此外，如本文所详细描述，本发明包括烟草产品，所述烟草产品衍生自使用本发明的方法产生的植物和/或植物品系，如用于嚼烟的烟叶、用于抽吸烟草的烟熏烟叶、以及其它已知的烟草产品。在一些实施方式中，本发明的包括用于改变至少一种环境污染物或其它非天然化合物含量的方法，该环境污染物或非天然化合物可存在于烟草中和/或加热烟草和/或改善烟草产品香味时产生。所述方法包括产生具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品(或者通过加热烟草衍生的化合物)的改性的烟草植物，混合改性的烟草和未改性的烟草植，以及在烟草产品中包括该混合物。
优选地，通过诱变烟草种子和选择至少部分诱变的植物来制备改性的烟草植物，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该诱变的植物具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。
因此，本发明的实施方式涉及通过在M0嵌合阶段选择来制备具有改变表型的植物的方法的应用，以及使用所述方法来生产具有降低至少一种氨基酸的植物。诱变已用作开发多种庄稼(包括烟草)的改善的栽培变种的常规育种方法(参见，如A.M.范哈藤(A.M.vanHarten)，Mutation Breeding:Theory and Practical Applications(突变育种：理论和实际应用),第1-63页，剑桥大学出版社，纽约，1998)。一般地，使用化学诱变剂来开发所需突变的目标植物材料可分为两类：(1)种子和(2)组织或细胞培养。
例如，可用特定的诱变剂处理种子，种植存活的种子来产生它们的子代(如赫尔摩斯(Heremans)和雅各布斯(Jacobs)，1995)。从诱变的种子生长的代称为M0代，且从M0植物收集的子代是M1代，通常可从M1代选择所需的突变。可通过在选择条件下种植来自M1植物的子代(即，M2代)，进一步选择纯合植物来得到感兴趣的突变。
尽管可在组织培养细胞上进行诱变和选择(如卡特-里内特斯(Cattoir-Reynaerts)等，1983；多特桑(Dotson)等，1990；希本德(Hibberd)等，1980)，突变的细胞或组织必须再生为可育植物。构建用于从感兴趣的基因组再生可育植物的系统是耗时、昂贵的且需要高水平的专业技能。此外，在传代的感兴趣的突变体中，因为常染色体的复制，常常发生不期望的体细胞变异。
还使用了基因工程来生产转基因植物。已显示在拟南芥中(Arabidopsis)，细菌重金属转运体的表达可增强对重金属的耐性和降低重金属的吸收(J.李(J.Lee)等，《植物生理学》(Plant Physiology),2003,133:589-596)。此外，这种方法对技术要求很高，需要把外源DNA引入基因组，且通常无法产生在各种生态系统中繁衍庄稼所需的多种突变。此外，通过基因工程生产的转基因作物对生态系统的长期稳定性的影响尚未可知(N.C.伊斯兰德(N.C.Ellstrand),2001,Plant Physiol.(植物生理学),125:1543-1545)。最后，转基因作物还没有被公众广泛接受，例如在某些欧洲国家。
因此本发明的目的是使用筛选方法，其中筛选至少部分地使用M0植物来进行。现在参考图1，在一方面中，本发明提供制造烟草(如，烟草(Nicotiana tabacum)品系的方法，该烟草品系具有改变(增加的或减少的)吸收和/或改变量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤:(a)在包含约0.5％浓度的诱变剂甲磺酸乙酯(EMS)4的溶液中，把烟草种子2诱变20小时；(b)在水6中洗涤诱变的种子；(c)在振荡器10上，用70％的乙醇和随后用20％次氯酸钠(Chlorox)漂白液8对种子2杀菌；(d)用无菌水6冲洗；(e)把种子2悬浮于具有0.1％琼脂(半固体胶体悬浮液)12的营养培养基中；(f)把具有约50种子2的约0.750毫升的悬浮液施加至含选择剂16的固化植物琼脂平板上；(g)使种子发芽，并在25℃下把幼苗18种植到组织培养室中，其具有来自冷白光荧光灯的16小时光照时间；(h)把健康的幼苗18移植到土壤中，并在温室中生长成M0植物22；(i)在田野里种植来自M0植物22的单个M1种子23，并产生M1植物24；(j)测试M1植物的改变含量的感兴趣的至少一种环境污染物或其它非天然化学品(例如，Cd)；(k)种植具有改变含量的感兴趣的至少一种环境污染物或其它非天然化学品的M1植物的M2种子25，并测试M2品系26，该品系产生改变含量的感兴趣的至少一种环境污染物或其它非天然化学品(例如，Cd)。这些非嵌合的烟草植物可以是杂合子和纯合子的混合物。基于化学，可添加附加的选择步骤来选择在田野里的烟草品系。
这些改性的植物和/或品系还提供生产杂交品系的基础，利用一种或两种亲代、本发明的新颖的品系。所述新颖的品系的克隆(clone)、体细胞无性系(somaclone)和衍生物，也在本发明的范围之内。
在一些实施方式中，本发明的方法用来产生衍生自本文所述的烟草品系中的一种的烟草植物。例如，在一些实施方式中，本发明的方法可用来产生烟草植物，其包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种。或者，本发明可包括用于制备本文所述的其它烟草品系的方法。
在一些实施方式中，通过本发明的方法制造的改性的烟草植物可包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种，其中根据布达佩斯条约规定的条件，这些品系种子的代表性样品已于2012年2月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801大学大道，弗吉尼亚州马纳萨斯，20110-2209)，其中关于这些种子的公共可用性的所有限制会在专利授权后不可撤销地解除。到2012年3月20日，测试了保藏的种子并确定其是存活的，并分别分配了ATCC获取号PTA-12602(10TN-278-2),PTA-12601(10TN-253-4),PTA-12599(10TN-256-1)和PTA-12600(10TN-287-4)。或者，可通过本发明的方法来制造其它植物，如本文所述的那些，和/或用于本发明的产品中。
具有改变含量的至少一种环境污染物的烟草植物
在一些实施方式中，本发明包括植物或其一部分，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该植物或其一部分具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在一些实施方式中，本发明包括改性的烟草植物或其一部分，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该改性的烟草植物或其一部分具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，其中该改性的烟草植物的基因组包括在选择剂存在下呈耐生长显性表型的突变。
吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或水平的增加。
在用本发明的各种植物的一些实施方式中，环境污染物或其它非天然化学品可包括重金属。具有改变吸收和/或改变含量的重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。在一种实施方式中，具有改变吸收和/或含量的重金属是镉。或者，在本发明的植物中，其它重金属和/或其它选定的元素可具有改变的吸收和/或含量。
在期望改变重金属的吸收或含量的一些实施方式中，选择剂是重金属。该重金属可以与期望具有改变吸收和/或含量的重金属相同。例如，在一些实施方式中，期望改变镉的吸收，那么选择剂就是镉。
如本文所进一步描述，可改性多种植物。在某些实施方式中，所述植物包括异源倍体基因组。在一些实施方式中，植物是烟草。在一些优选实施方式中，烟草是烟草(Nicotiana)属。更优选地，烟草可包括物种烟草(Nicotiana tabacum)。或者，如本文所述，可使用任意属的烟草(Nicotiana)。这些烟草如美国专利公开号2006/0185686和2011/0174323所述的那些，上述各文的全部内容通过引用纳入本文。
或者，可使用其它烟草。例如，用于产生本发明的植物的烟草可包括野生烟草或已以一些方式进行基因改性的烟草。因此，所述烟草可以包含多种类型的烟草，例如：烟熏烟、白莱烟、晒干烟(例如，东方烟或者印度卡努尔(Indian Kurnool))、马里兰烟、深色烟、深色烤烟、深色风干烟(例如，passanda烟、cubano烟、jatin烟和bezuki烟)或者微风干烟(例如，北威斯康星烟(North Wisconsin)与galpoa烟)和黄花烟，以及其他罕见的或特种烟或者甚至是绿色或者未熟化烟草。代表性东方烟包含katerini烟、prelip烟、komotini烟、xanthi烟以及yambol烟。
因此，在一些实施方式中，本发明可包括含改性烟草的烟草植物或其一部分，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该改性的烟草具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。
例如，本发明可包括烟草植物或其一部分，与未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，其中该改性的烟草植物的基因组包括具有突变的异源倍体基因组，该突变在镉或另一种选择剂存在下呈耐生长的显性表型。
包含于本发明的植物(如烟草植物)还包括下述植物(和/或衍生自这些植物的品系)：可使用来自外源(例如，非烟草的)DNA，在不同于涉及环境污染物或其它非天然化学品吸收的基因(例如，涉及吸收感兴趣的环境污染物或其它非天然化学品的基因)的基因座对其进行基因改造。例如，本发明包括下述烟草植物：其被基因改造成耐杀虫剂，且还通过烟草基因组DNA(例如，在涉及吸收感兴趣的环境污染物或其它非天然化学品的基因处)的诱变改性该烟草植物，使得与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物相比，其具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。
此外，本发明的实施方式可包括改性的烟草植物或其一部分，或者衍生自这种植物的烟草品系，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分和/或烟草品系相比，其具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，其中改性的烟草植物的基因组由植物DNA组成或者主要由植物DNA组成。优选地，所述改性的烟草植物的基因组由下述组成或主要由下述组成：烟草DNA。
本发明还包括改性的烟草植物或其一部分和/或衍生自这种植物的烟草品系，与未改性的亲代烟草品系或其一部分相比，其具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，其中改性的植物由下述组成或主要由下述组成：与未改性的亲代品系相同的抗生素耐药性。
在本发明的各种烟草植物的一些实施方式中，环境污染物或其它非天然化学品可包括重金属。具有改变吸收和/或降低含量的重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。在一种实施方式中，具有改变吸收和/或含量的重金属是镉。或者，其它重金属和/或其它选定的元素可具有改变的吸收和/或水平。
因此，在另一方面，本发明包括改性的烟草植物或其一部分，或衍生自这种植物的烟草品系，与未改性的亲代烟草植物相比，其具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，其中所述改性的烟草植物的基因组由植物DNA组成或主要由植物DNA组成，和/或其中通过使烟草基因组DNA的突变和选择具有感兴趣的突变的M0植物的步骤来生产所述改性的烟草植物。更优选地，涉及改性的吸收和/或含量的环境污染物或其它非天然化学品的改性的烟草植物的一个或多个基因由下述组成或主要由下述组成：烟草基因组DNA。吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。
因此，在一些实施方式中，本发明包括改性的烟草植物和/或衍生自该烟草植物的烟草品系，与未改性的亲代烟草品系相比，其具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，其中通过使烟草基因组DNA的突变和选择具有感兴趣的突变的M0植物来生产烟草植物。吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。在一些实施方式中，通过下述步骤来生产烟草植物：使至少一个烟草种子突变；在选择剂如镉和/或其它重金属存在下，使突变的一个或多个种子发芽，用于产生具有改变的镉和/或其它重金属吸收的烟草；在选择剂存在下，种植至少一种M0植物来产生一个或多个M1种子，其中该一个或多个M1种子包括至少一个诱变的M1种子；以及使所述至少一个突变的M1种子在培养基中发芽，从而选择突变的M1植物。因此，在一种实施方式中，通过含下述步骤的方法来制备改性的烟草植物：在包括诱变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物的至少一种烟草种子；洗涤所述至少一种种子，使其不含突变剂；存在选择剂时，使所述至少一种种子发芽，并种植至少一种M0烟草幼苗，从而产生包括M1烟草种子的至少一种M0烟草植物，其中来自嵌合烟草植物的M1烟草种子包括至少一种诱变的M1烟草种子；以及使所述至少一种诱变的M1烟草种子发芽，从而选择改性的M1烟草植物，与未改性的烟草植物相比，该改性的M1烟草植物包括显著改变吸收和/或改变含量的环境污染物或其它非天然化学品。在一些实施方式中，制备改性的植物的方法包括下述步骤：种植M1烟草植物来产生一个或多个M2种植，然后使M2种植发芽以生长成M2植物，其中至少一种M2植物是用于突变的纯合子，该突变赋予在增加的选择剂(如镉)存在下生长的能力。在一些实施方式中，所述方法可包括在含选择剂的培养基(或土壤)中，使衍生自M0植物的M1和/或M2和/或M3和/或M4植物和/或后续的代发芽。
在另一种实施方式中，改性的植物(或衍生自该植物的品系)具有降低至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或100％的至少一种环境污染物。在替代实施方式中，改性的植物具有减少至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100倍的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。例如，在一些实施方式中，改性的烟草植物包括减少至少100％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％或10％的镉含量。
在另一种实施方式中，改性的植物(或衍生自该植物的品系)具有增加至少10,20,30,40,50,100,200或500％的至少一种环境污染物。在替代实施方式中，改性的植物具有增加至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100倍的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。例如，在一些实施方式中，改性的烟草植物包括增加至少10,20,30,40,50,100,200或500％的镉含量。
因此，在一些实施方式中，本发明提供烟草植物和/或衍生自这些植物的烟草品系，其已被突变从而与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，呈现改变含量(浓度)的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。
在一些实施方式中，这些新颖的品系在烟熏干燥的叶片中产生小于0.5微克(μg)镉每毫克干重量的烟草。与未改性的烟草亲代(N.tabacum)相比，这表示约2倍的减少，取决于田野、年度时间和/或其它因素，烟草亲代通常产生最高0.9-1.25微克(μg)镉每毫克干重量的烟草。
在另一种实施方式中，这些新颖的品系可吸收增加量的镉，从而在干燥的叶片中具有大于或等于约1.49微克(μg)的镉每毫克干重量的烟草。与未改性的烟熏烟草(N.tabacum)亲代相比，这可表示约20％的镉增加，亲代通常产生最多约0.9-1.25微克(μg)镉每毫克干重量的烟草。这种植物可用于减少田野中镉的量。特定环境污染物或其它非天然化学品的绝对量可取决于烟叶的加工，或者烟草的发育阶段。
在一些实施方式中，本发明包括衍生自本文所述的烟草品系中的一种的烟草植物。例如，在一些实施方式中，本发明可包括烟草植物，其包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种。或者，本发明可包括本文所述的其它烟草品系。在一些实施方式中，通过本发明的方法制造的改性的烟草植物可包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种，其中根据布达佩斯条约规定的条件，这些品系种子的代表性样品已于2012年2月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801大学大道，弗吉尼亚州马纳萨斯，20110-2209)，其中关于这些种子的公共可用性的所有限制会在专利授权后不可撤销地解除。到2012年3月20日，测试了保藏的种子并确定其是存活的，并分别分配了ATCC获取号PTA-12602(10TN-278-2),PTA-12601(10TN-253-4),PTA-12599(10TN-256-1)和PTA-12600(10TN-287-4)。或者，可通过本发明的方法来制造其它植物，如本文所述的那些，和/或用于本发明的产品中。
烟草产品
在一些实施方式中，本发明包括由烟草植物或其一部分制成的组合物和/或烟草产品，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该烟草植物或其一部分具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在一些实施方式中，本发明可包括含改性的烟草的烟草产品，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物相比，改性的烟草具有显著改变吸收和/或改变含量的环境污染物。
对于本发明的各种产品的各种实施方式，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加，如果这种化学品对于消费有益。
在本发明的各种组合物和/或烟草产品的一些实施方式中，环境污染物或其它非天然化学品可包括重金属。具有改变吸收和/或改变含量的重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。在一种实施方式中，具有改变吸收和/或论题的重金属是镉。或者，其它重金属和/或其它选定的元素可具有改变的吸收和/或含量。例如，在一些实施方式中，本发明的烟草产品可包括含改性的烟草的烟草产品，与未改性的烟草相比，其具有降低含量的镉。或者，可减少其它重金属或另一环境污染物或非天然化学品。
在期望改变重金属的吸收或含量的一些实施方式中，选择剂是重金属。该重金属可以与期望具有改变吸收和/或含量的重金属相同。例如，在一些实施方式中，期望改变镉的吸收，那么选择剂就是镉。
本文所述的任意改性的植物可用于本发明的组合物和/或产品。例如，本发明可包括含改性的烟草的组合物和/或烟草产品，与衍生该改性的植物的未改性的烟草植物或其一部分相比，该改性的烟草具有改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，其中改性的烟草植物的基因组包括异源倍体基因组，和/或已使用外源(例如，非烟草的)DNA在不同于涉及感兴趣的环境污染物或其它非天然化学品吸收的基因的基因座对其进行基因改造，和/或其中改性的烟草植物的基因组由下述组成或主要由下述组成：植物DNA，和/或其中改性的植物由下述组成或主要由下述组成：与未改性的亲代品系相同的抗生素耐药性，以及具有在选择剂(如镉或另一种选择剂)存在下呈耐生长的显性表型的突变。吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可以是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。
在替代实施方式中，与未改性的烟草相比，组合物和/或烟草产品具有至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或100％减少吸收和/或降低含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在替代实施方式中，组合物和/或烟草产品具有至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100倍减少吸收和/或降低含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。例如，在一些实施方式中，改性的烟草植物包括减少至少100％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％或10％的镉含量。
在替代实施方式中，与未改性的烟草相比，组合物和/或烟草产品具有至少10,20,30,40,50,100,200或500％增加的吸收和/或增加含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。在替代实施方式中，组合物和/或烟草产品具有至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100倍增加的吸收和/或增加含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品。例如，在一些实施方式中，改性的烟草植物包括增加至少10,20,30,40,50,100,200或500％的镉含量。
如本文所进一步描述，可改性多种烟草植物来产生本发明的组合物和/或产品。在某些实施方式中，所述植物包括异源倍体基因组。在一些实施方式中，植物是烟草。在一些优选实施方式中，烟草是烟草(Nicotiana)属。更优选地，烟草可包括烟草种(Nicotianatabacum)。或者，如本文所述，可使用任意属的烟草(Nicotiana)或其混合物。这些烟草和共混物如美国专利公开号2006/0185686和2011/0174323所述的那些，上述各文的全部内容通过引用纳入本文。
或者，可使用其它烟草和共混物。用于本发明的产品的烟草可变化，且通常包括野生烟草或已以一些方式进行基因改性的烟草。例如，所述烟草可以包含多种类型的烟草，例如：烟熏烟、白莱烟、晒干烟(例如，东方烟或者印度卡努尔(Indian Kurnool))、马里兰烟、深色烟、深色烤烟、深色风干烟(例如，passanda烟、cubano烟、jatin烟和bezuki烟)或者微风干烟(例如，北威斯康星烟(North Wisconsin)与galpoa烟)和黄花烟，以及其他罕见的或特种烟或者甚至是绿色或者未熟化烟草。代表性东方烟包含katerini烟、prelip烟、komotini烟、xanthi烟以及yambol烟。
在本发明的一些实施方式中，可评估植物的不同部分和/或单个烟草级别烟雾中的环境污染物或其它一种或更多种非天然化学品的含量。例如，在一些实施方式中，上部茎级别可具有少于下部茎级别的镉(或其它非天然污染物或环境污染物)。此外，与其它级别(如，烟熏级别)相比，某些烟草特定的级别(例如白肋(burley)和东方(oriental)等级)可具有减少或增加含量的镉(或其它非天然污染物或环境污染物)。
在一些实施方式中，本发明提供热处理的烟草组合物。如本文所使用，术语“热处理的烟草组合物”指含烟草材料的组合物，该烟草材料已在升高的温度下(如在至少约60℃的温度下、更典型至少约100℃)热处理足以改变烟草组合物的特征或性质的时间，如至少约10分钟。在某些情况下，热处理可改变烟草组合物的化学或感官特征(如味道和香气)。热处理过程可以是常规烟草处理过程的改性版本，例如用来形成调味和芳香化合物(如麦拉德反应产物)的过程、用来对烟草组合物进行巴氏杀菌(pasteurization)的过程、制备烟草盒制品的过程、重组烟草过程(如烟草盒带和造纸重组烟草过程)、烟草提取过程、重新排序的过程、烘烤过程中、蒸汽过程和干燥过程。
可使用本发明的烟草植物和/或烟草品系来产生的示例烟草产品如美国专利公开号2011/0048434所述，该文的全部内容通过引用纳入本文。因此，本发明的烟草组合物可用作用于吸烟制品的添加剂，或作为无烟烟草组合物，例如散装湿鼻烟、散装干鼻烟、嚼烟、颗粒化的烟草片、如美国专利号5,819,751所述的包括绝缘燃料元件的烟草(即，加热但不燃烧技术)、挤出或成形的烟条、片、杆、或棒、细碎地研磨粉末、细碎的或研磨的粉块或组分的聚集体、薄片状片、模压加工过的烟草片、含烟草的口香糖片、带状薄膜卷、易溶于水或分散于水中的薄膜或带，或胶囊状材料。
本发明所用的烟草包括用于以无烟形式使用的烟草组合物，且可包括单一类型的烟草(如，以所谓的“纯净等级(straight grade)”形式)。例如，烟草组合物中的烟草可以仅包含烟熏烟(例如，所有的烟草可以包含或者衍生自烟熏烟草叶片或者烟熏烟草叶片与烟熏烟草茎的混合物)。烟草组合物中的烟草还可具有所谓的“混合的”的形式。例如，在本发明的烟草组合物中的烟草可包含具有烟熏烟、白莱烟(例如，Malawi白肋烟)以及东方烟(例如，包含或者衍生自烟草叶片或者烟草叶片与烟草茎的混合物的烟草)的份或者块的混合物。例如，以干重计，代表性掺混物可以含有约30份-约70份的白莱烟(例如，叶片或者叶片和茎)与约30份-约70份的烟熏烟(例如，茎、叶片或者叶片和茎)。以干重计或类似的百分比(例如，总量为100％，各单独组分的范围在10％范围之内)，其他示例性烟草混合物可包含约75份的烟熏烟、约15份的白莱烟以及约10份的东方烟；或者包含约65份的烟熏烟、约25份的白莱烟以及约10份的东方烟；或者包含约65份的烟熏烟、约10份的白莱烟以及约25份的东方烟。其它示例烟草共混物包括约20-约30份的东方烟和约70-约80份的烟熏烟(例如，总量为100％，各单独组分的范围在10％范围之内)。或者，可使用其它烟草或烟草共混物，如在美国专利公开号2006/0185686中所述的那些，该文的全部内容通过引用纳入本文。或者，可使用其它共混物。
组合物和/或烟草产品中烟草的相对量可改变。优选地，以干重为基准计，烟草产品中的烟草的量可在至少约10％或者至少约25％的范围。在某些情况下，以干重计，烟草产品中的其他组分的量可能超过约20,30,40,50,60,70,80或90％。以干重计，烟草产品中烟草材料范围通常为约10至约60重量％，更常见的为约20至约40重量％。例如，烟草产品可包括额外的调味剂、填料、粘合剂、缓冲剂、色素和加湿剂。
本发明的烟草产品可制造成各种制造制品。对于无烟烟草组合物，本发明的烟草组合物可成形为所需的产品形状。用来成形烟草组合物的方法和设备取决于所需的形状。例如，烟草组合物可具有下述形式：压缩烟草颗粒、多层挤出片、挤出或成形的棒或杆、具有一种烟草制剂被不同类烟草制剂环绕的组合物、带状膜卷、易溶于水或分散于水的膜或带、或者胶囊状材料，该胶囊状材料具有外鞘(如可以是本质上透明、无色、半透明或高度着色的柔软或硬质外鞘)和含烟草或烟草调味料的内部区域。
本发明的烟草组合物可用作制造吸烟制品的添加剂。本发明的烟草可结合进入烟草混合物、代表性香烟组分或由该组分制造的代表性香烟。例如，本发明的烟草叶可结合进入吸烟制品，作物可抽吸材料填充物的一部分。或者，本发明的烟草可包含进入卷烟滤嘴(例如，在滤嘴棒、滤嘴棒外包纸(plug wrap)、或接装纸(tipping paper))或包含进入卷烟包头纸(wrapping paper)，优选的在内表面，在卷烟制造过程中。
在本发明的组合物和/或烟草产品的一些实施方式中，所得吸烟制品的特点是使用时在主流烟雾中具有显著改变含量的至少一种环境污染物或非天然化学品，或由此衍生的化合物。例如，相对于对照吸烟制品(即，比较性吸烟制品，但包括未改性的烟草来取代本发明的改性的烟草)，使用时在主流烟雾中，吸烟制品可具有显著降低含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，或由此衍生的化合物，减少至少约10％,至少约20％,至少约30％,至少约40％,至少约50％,至少约60％,至少约70％,至少约80％或更多。使用相同的吸烟设备和相同的吸烟条件下(如ISO 3308:1991和ISO 4387:1991所述的吸烟设备和吸烟条件，以上标准通过引用纳入本文)抽吸时，与对照吸烟制品相比，本发明的吸烟制品(如包含本发明的烟草组合物的香烟)以重量计在主流烟雾中可产生显著降低水平的至少一种环境污染物或其它非天然化学品，或由此衍生的化合物。或者，在某些情况下，可存在非天然化合物或由此衍生的化合物的增加，如果这种化学品对消费是有益的。
在一些实施方式中，这些新颖的品系在干燥的叶片中具有小于0.5微克(μg)镉每毫克干重量的烟草。与未改性的烟草(N.tabacum)亲代相比，这可表示约2倍的降低，亲代通常产生最多约0.33-2.24μg/mg(参见例如，鲁刚-茂林(Lugon-Moulin)等,《臭氧层》(Chemosphere)，2006,1074-1086),或约0.9–1.25μg镉每毫克干重量的烟草。在某些情况下，例如在将污泥施肥到田野时，镉的含量可高达9.46μg/mg(亚大木(Adamu)等，《环境污染》(Environmental Pollution),1989,56:113-126)。特定环境污染物或其它非天然化学品的绝对量可取决于田野、年度时间、烟叶的加工，或者烟草的发育阶段，以及其它因素。
在一些实施方式中，本发明包括一种组合物(即，烟草产品)，其包括衍生自本文所述的烟草品系中之一的烟草。例如，在一些实施方式中，本发明可包括组合物，其包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种。或者，所述组合物可包括本文所述的其它烟草品系。在一些实施方式中，组合物和/或烟草产品可包括10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种，其中根据布达佩斯条约规定的条件，这些品系种子的代表性样品已于2012年2月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801大学大道，弗吉尼亚州马纳萨斯，20110-2209)，其中关于这些种子的公共可用性的所有限制会在专利授权后不可撤销地解除。到2012年3月20日，测试了保藏的种子并确定其是存活的，并分别分配了ATCC获取号PTA-12602(10TN-278-2),PTA-12601(10TN-253-4),PTA-12599(10TN-256-1)和PTA-12600(10TN-287-4)。或者，可将其它植物，如本文所述的那些用于本发明的产品。
参考下文的非限制性例子，将更好的理解本发明。
实施例1烟草的突变
用0.5％EMS(甲磺酸乙酯)诱变来自NL Madole(一种深色烤烟变种)和K326(一种烟熏烟变种)的种子，并指定为M0。在含150μM Cd的组织培养基上对M0突变体群落进行筛选。
为了产生突变的烟草，把多种(即，约10份分开的)等份的NL Madole或K326种子在包含约0.5％浓度的甲磺酸乙酯(EMS)的溶液中培育20小时。同时使用K326种子和未突变的NL Madole种子作为对照。然后，用MiliQ水(用NANO纯净I I系统纯化；爱荷华州迪比克的百纳斯德/斯莫因公司(Barnstead/Thermolyne)把处理的种子洗涤30分钟，并在振荡器上用70％的乙醇杀菌30秒，随后用20％次氯酸钠(Clorox)杀菌20分钟。
然后，在含150μM Cd的组织培养基上对M0突变体群落进行筛选。因此，用无菌MiliQ水洗涤至少5次后，用1/2穆拉什格-斯固格(Murashige和Skoog Salt)(MSS)培养基+1.5％蔗糖、5克植物琼脂和选择剂(150μM Cd)，把种子(约50种子每平板)悬浮于固化植物琼脂平板中。MSS培养基如美国专利号7,173,170的表1所述；描述这种培养基的全部内容通过引用纳入本文。使种子在25℃的组织培养室中发芽，具有使用冷白光荧光灯(赛维尼亚(Sylvania)，马萨诸塞州丹弗斯市)的16小时光照时间，强度为约80 8E m-2s-1。10天之后，除去生长培养基，并将含150μM Cd的相同培养基添加至幼苗。然后，把存活的植物移植到土壤中，并种植在温室中，以使耐高水平Cd的烟草(N.tabacum)品系发育。
拯救在富Cd培养基上选择的存活的M0小植株，并转移到生长室内的土壤。然后，把这些M0植物转移到温室，并收集来各植物的自花授粉的种子并称为M1。在正常的田野条件下种植M1品系。根据传统的操作烟熏各M1品系。
通过使用组织培养垂直平板技术，在选择剂(即，150μM Cd)存在下种植来筛选M1种子，其中小株垂直生长且测量芽和根。基于新鲜的芽重量和根长度来进行选择。对芽和根数据的分析表明在所测M1品系中存在显著差异。将选定的M1植物转移到温室，并收集自花授粉的种子(M2)，用于进一步繁殖。
实施例2分析使用本发明的方法突变的各种烟草品系中的Cd含量
评估了潜在的22块田野，递交了土壤样品进行Cd分析。在田纳西州格林维尔确定了一块含相对高水平Cd的田野(见表1)。评估了M1和M2烟草育种品系，并在这个位置的田野条件下进行筛选。此外，为了比较，与M1和M2选择一起，测试了已报道的耐Cd吸收的几种野生烟草(N.tabacum)物种。
所有样品都是在萌芽阶段收集的。从单个M1植物收集下部叶片，用于分析，因为单个植物在M1代有变种。从整个试验田的一些M2品系收集下部叶片，用于分析。所有叶片都在干冰上冷冻，然后冷冻干燥以保持叶片完整性。分析冷冻干燥样品的Cd含量和其它选定的重金属。下文表1显示了对来自选定的田野的土壤酸(1N HNO3)提取物进行的As,Cd,Cr,Ni,Pb和Se分析。报道的结果是平均值，且重复1N HNO3提取物的标准偏差已通过土壤干重量校正。
表1
选定来自M1品系的四种植物，用于代推进至M2，用小袋包装以防止异型杂交，并用
或
杀虫剂处理以防止种子被昆虫损坏。各自选择单一植物，如上所述地产生M2品系和M3种子，用于M1推进。该田野实验是随机完全区组涉及，有3个重复样。使用
统计软件(α＝0.05)(SAS,北卡罗来纳州的凯力(Cary))分析数据。
烟熏结果：M1品系的结果列于下表2。
评估96个实验烟熏M1选择物，使用K326作为对照(表2)。已发现24个M1选择物聚集比对照物显著更多的Cd，而50个品系聚集比对照显著更少的Cd。表2显示了在各个烟熏M1育种品系选择物中的平均Cd含量。在表2中，用于对照物的数据用斜体表示。没有用相同字母或符号连接的含量是显著不同的。在表2中以粗体显示的两种M1选择物即10TN-269-2和10TN-266-2，聚集的Cd小于
标准的0.5μg/g。
表2
深色风干结果：
评估了59种实验深色风干M2品系，使用NL Madole作为对照(表3)。因此，表3显示在深色风干M2育种品系中的平均Cd含量。在表3中，用于对照的数据用斜体表示。没有用相同字母或符号连接的含量是显著不同的。一种品系即10TN-232聚集比NL Madole显著更多的Cd。几种品系(粗体)聚集比NL Madole对照物(用斜体表示)少得多的Cd。
表3
评估了20种实验深色风干M1选择物，使用NL Madole作为对照(表4)。因此，表4显示了在单个深色风干M1育种品系选择物中的平均Cd含量。具有最低和最高水平的Cd的M1品系用粗体显示；对照用斜体显示。同样的，没有用相同字母或符号连接的含量是显著不同的。两种M1选择物聚集比对照物明显更多的Cd。14种品系聚集比对照物显著更少的Cd，但不少于
标准的0.51.1μg/g。
如本文所述，通过本发明的方法制造的烟草植物可包括本文所述的10TN-278-2,10TN-253-4,10TN-256-1或10TN-287-4品系中的至少一种，其中根据布达佩斯条约规定的条件，这些品系种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801大学大道，弗吉尼亚州马纳萨斯，20110-2209)，ATCC获取号分别为PTA-12602,PTA-12601,PTA-12599和PTA-12600。
表4
| 登记 | 谱系/名称 | 平均Cd(μg/g) |
| 10TN-253-4 | EMS NL Madole(M1) | 1.494 A |
| 10TN-252-4 | EMS NL Madole(M1) | 1.471 A |
| 10TN-254-4 | EMS NL Madole(M1) | 1.290 B |
| 10TN-200 | NL Madole对照 | 1.251 B |
| 10TN-254-3 | EMS NL Madole(M1) | 1.248 BC |
| 10TN-252-1 | EMS NL Madole(M1) | 1.180 BCD |
| 10TN-251-1 | EMS NL Madole(M1) | 1.176 BCD |
| 10TN-251-3 | EMS NL Madole(M1) | 1.103 CDE |
| 10TN-252-2 | EMS NL Madole(M1) | 1.072 DEF |
| 10TN-255-1 | EMS NL Madole(M1) | 1.068 DEF |
| 10TN-251-2 | EMS NL Madole(M1) | 1.059 DEFG |
| 10TN-255-2 | EMS NL Madole(M1) | 1.003 EFGH |
| 10TN-253-1 | EMS NL Madole(M1) | 1.001 EFGH |
| 10TN-256-2 | EMS NL Madole(M1) | 0.932 FGHI |
| 10TN-254-2 | EMS NL Madole(M1) | 0.930 FGHI |
| 10TN-257-1 | EMS NL Madole(M1) | 0.912 GHI |
| 10TN-253-3 | EMS NL Madole(M1) | 0.871 HI |
| 10TN-254-1 | EMS NL Madole(M1) | 0.871 HI |
| 10TN-252-3 | EMS NL Madole(M1) | 0.822 IJ |
| 10TN-256-1 | EMS NL Madole(M1) | 0.714 J |
| 10TN-253-2 | EMS NL Madole(M1) | 0.682 J |
实施例3在烟草植物诱变和育种内的Cd吸收和分布
基本上如实施例1所述，用EMS(甲磺酸乙酯)诱变来自K326、烟熏变种的种子。在含150μM Cd的组织培养基上对M0突变体群落进行筛选。拯救从该处理存活的小株，并转移到土壤。从在温室中的各存活的植物收集自花授粉的种子。播种这种M1种子，并成熟移植至实施例2(即，表1)所述的、已知具有高于平均Cd水平的田纳西州田野。评估了M1烟熏烟草育种品系，并在这个位置的田野条件下进行筛选。从下部茎绿叶收集早季样品，并分析Cd。
基于早季(即，移植后65天)重金属数据，选择植物用于晚季(即，移植后145天)分析，来决定Cd是否分布，如果Cd真的会分布的话。在移植约145天后，从健康的植物收集晚季样品。取样下部、中部和上部叶片(无中脉)。还将茎切成三部分，指定为下部、中部和上部，并也进行取样。此外，收集根和终端萌芽样品，并分析Cd含量。所有组织都在干冰上冷冻，然后冷冻干燥以保持样品完整性。分析冷冻干燥样品的Cd含量。对每种样品分析三个重复样品。
贯穿植物分布的镉水平：
来自13早季实验烟熏M1品系和K326对照的镉结果见表5。因此，表5显示了植物组织中单个烟熏M1育种品系选择物的Cd(皮克/克)含量。定量限(LOQ)是100μg/g。没有用相同字母或符号连接的含量是显著不同的。
可知，在上部叶片中，K326对照聚集了最大浓度的Cd。在下部叶片组织中，品系10TN-290-1聚集最大浓度的Cd。在中部叶片和花/终端萌芽组织中，品系10TN290-2聚集最大浓度的Cd。在根、下部茎、中部茎和上部茎组织中，品系10TN-290-4聚集最大浓度的Cd。品系10TN-285-2在下部叶片组织中发现最低浓度的Cd。品系10TN-266-2在中部叶片组织中发现最低浓度的Cd。品系10TN-278-4在上部叶片组织中发现最低浓度的Cd。品系10TN-278-6在花/终端萌芽组织中发现最低浓度的Cd。总体来说，在包括对照K326的所有样品中，根部组织聚集最少量的Cd。图2显示了评估的培养品系的比较。再次发现，与对照物相比，10TN-290M1品系聚集最高浓度的Cd。
表5
表6显示了用于晚季烟草(即，移植后145天)的Cd聚集的根相对于地面上烟草组织的比例，为烟草组织[Cd]/根[Cd]。可知当在上部烟草组织中的分布微克Cd每克(g)干重量相对于根以比例表达时，10TN-290-1,10TN-290-2和10TN-290-3品系在所有的叶片位置具有最高的Cd比例。这表明与对照物相比，这些品系将Cd高度聚集至叶片。相反，10TN-266-2在所有的叶片位置具有最低比例的Cd，即使它在根部有更高的Cd浓度。这表明，Cd没有像10TN-290品系那么高效地移位至叶片。此外，K326在上部茎位置具有最高的Cd比例，且10TN-285-5在花/终端萌芽组织中具有最高的Cd比例。
可知10TN-266-2品系没有像评估的其它品系一样高效地，将Cd从根部移动到地面上的组织。这可以是理想的特性，因为叶将具有更少的Cd。像10TN-290M1这种高度聚集Cd的品系，可用来从土壤除去Cd(即，用于田野清洁)。
因此，这些结果表明能通过传统的植物育种方法，来改变植物内的Cd分布。
表6
用于10TN-278-6的根样品<LOQ，因此没有报道比例。考虑到与K326相比Cd的可用性，粗体的样品聚集了高比例的Cd。
因此，EMS突变育种技术成功地确定了两种烟熏M1育种品系，其落在用于Cd的
极限以下。此外，在一些实施方式中，可把来自野生物种的基因渗入现代烟草中，作为用于减少Cd吸收的替代基因来源。
因此，本发明的方法适用快速和经济的诱变方法来开发具有显著改变吸收和/或改变含量的至少一种环境污染物或其它非天然化学品的植物品系。吸收和/或含量的改变可能是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的降低。或者，吸收和/或含量的改变可能是环境污染物或其它非天然化学品的吸收和/或含量的增加。在一个实施方式中，植物是烟草。本发明提供一种方法，借助该方法允许突变的烟草种子在选择条件下发芽，并随后选择嵌合植物，该嵌合植物至少部分的包括耐高浓度的镉或其它环境污染物或其它非天然化学品的表型。
本发明所包括的改性的烟草品系具有改变的重金属。具有改变吸收和/或改变含量的重金属可为下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。在一种实施方式中，具有改变吸收和/或含量的重金属是镉。或者，可改变其它重金属和/或其它选定的元素。这些基因改性的烟草品系可用作种质以开发具有改变的重金属分布的新烟草变种，和/或与其它烟草株混合以制备具有改善的味道和香气的混合物。
本文引用的所有文献通过引用全文纳入本文。
Claims (8)
1.一种由改性的烟草植物或其一部分制成的烟草产品，其中，所述改性的烟草植物包括10TN-287-4品系。
2.如权利要求1所述的烟草产品，其特征在于，所述改性的烟草植物具有改变吸收和/或改变含量的环境污染物和/或其它非天然化学品，是下述的至少一种：砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、镍(Ni)、铅(Pb)、硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、水银(Hg)或银(Ag)。
3.如权利要求1所述的烟草产品，其特征在于，所述改性的烟草植物具有减少吸收和/或含量的镉。
4.如权利要求1所述的烟草产品，其特征在于，所述改性的烟草植物包括降低至少20％的镉含量。
5.如权利要求1所述的烟草产品，其特征在于，所述改性的烟草植物是烟草品种。
6.如权利要求1所述的烟草产品，其特征在于，所述产品是吸烟制品。
7.如权利要求1所述的烟草产品，其特征在于，所述产品是无烟烟草组合物。
8.一种由改性的烟草植物或其一部分制成的组合物，其中，所述改性的烟草植物包括10TN-287-4品系。
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