CN113383086A - 用于在提高的盐浓度或体液中扩增的突变型Taq聚合酶 - Google Patents
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Abstract
本发明包括一类突变型Taq聚合酶，该突变型Taq聚合酶在类似体液的盐浓度条件下可以有效扩增目标序列，所述体液包括柠檬酸钠保存的血液、血清或血浆。所述突变型Taq聚合酶或其生物活性片段具有一个或更多个表I所示的区别于野生型的替换。
Description
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过引用将其全部并入。上述ASCII副本创建于2020年1月28日，名为Abclonal-Salt_SL.txt，大小为2,582,368字节。
背景技术
在用于DNA扩增的聚合酶链式反应(PCR)期间，使靶序列-引物-聚合酶混合物经历不同温度下的连续热循环，以便于目标DNA链去退火(通常在约90-99℃下进行)，引物-模板DNA链退火(通常在约40-70℃下进行)，以及DNA聚合酶介导的引物延伸(通常在约50-72℃下进行)，从而产生新的互补的扩增产物链。反应可以包括多达25-45轮循环以产生足够的扩增。
PCR通常使用热稳定的DNA聚合酶进行，该酶可以耐受与去退火相关的高温，而不会因热诱导的蛋白变性而失活。
诊断学和法医学PCR的常见问题是由抑制物质(包括血液样品)引起的假阴性反应或低灵敏度，这些物质通过影响DNA聚合酶而干扰PCR。参见US Pat.No.8,470,563(通过引用并入)和其中引用的参考文献。反应混合物中的高盐浓度也可通过影响DNA聚合酶而干扰PCR。因为柠檬酸钠通常作为防腐剂添加，所以保存的血液、血浆、血清和其他体液及衍生物通常具有高盐浓度。镁离子通常也以足以影响保存的血液、血浆和血清中的DNA聚合酶活性的高浓度存在。
因此，显然需要这样的热稳定DNA聚合酶，其可以促进全血样品、血浆、血清和其他体液和其他衍生物(包括用柠檬酸钠保存的这种样品或其它高盐浓度或高镁浓度的样品)的快速和高效的PCR扩增。
发明概述
本发明包括具有一个或多个与野生型相异的点突变的突变型Taq聚合酶(SEQ IDNO:4显示具有C末端His标签的野生型氨基酸序列；SEQ ID NO:5显示野生型核苷酸序列)，其具有下表I所示的一个或多个氨基酸点替换(在一个或多个以下位点):
____________________________________________________________________
表I-突变及相应的序列ID号
E39K SEQ ID NO:6-7,
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E745K SEQ ID NO:466-467,
M765S SEQ ID NO:468-469,
E774K SEQ ID NO:470-471,
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A791F SEQ ID NO:474-475,
E805K SEQ ID NO:476-477,
L813S SEQ ID NO:478-479
____________________________________________________________________
本发明还包括具有一个或更多个以上所示的氨基酸点替换的突变型Taq聚合酶，其中所述Taq聚合酶序列的剩余部分与野生型Taq聚合酶有至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％，或至少99％的同一性。
本发明还包括编码上述任何突变型Taq聚合酶的核酸序列，包括序列表中给出的相应序列，以及编码上述或序列表中给出的任何突变型Taq聚合酶的氨基酸序列的所有简并核酸序列；以及整合有这种核酸序列的载体和经这种核酸序列转化并能表达上述任何突变型Taq聚合酶的细胞。
本发明还包括包含任何上述突变型Taq聚合酶、编码它们的核酸序列或整合有这种核酸序列的载体的组合物或试剂盒。本发明还包括一种扩增目标核酸的方法，其中将任何上述突变型Taq聚合酶用于被设计为扩增目标核酸的反应混合物中，并使试剂混合物经受用于扩增目标核酸的条件。
上述突变型Taq聚合酶能够比野生型更有效地扩增目标DNA序列，其中PCR在包含有柠檬酸钠作为防腐剂的血液、血浆或血清中或具有相对高的盐浓度的任何反应混合物中进行。
附图简述
图1显示了多个凝胶的合并图像，每个凝胶代表使用其中一种突变型Taq聚合酶进行PCR的结果。每个这种突变体均用数字表示，其中数字对应于表I中列出的突变位点和序列，按照图1所示的顺序，如下所示：
708:E708K SEQ ID NO:412-413
732:D732R SEQ ID NO:414-415
734:E734K SEQ ID NO:436-437
737:V737S SEQ ID NO:438-439
742:E742K SEQ ID NO:440-441
745:E745K SEQ ID NO:466-467
765:M765S SEQ ID NO:468-469
774:E774K SEQ ID NO:470-471
781:L781S SEQ ID NO:472-473
791:A791F SEQ ID NO:474-475
805:E805K SEQ ID NO:476-477
813:L813S SEQ ID NO:478-479
534:Q534R SEQ ID NO:312-313
537:E537K SEQ ID NO:314-315
546:I546S SEQ ID NO:356-357
547:D547R SEQ ID NO:358-359
551:D551R SEQ ID NO:362-363
553:I553S SEQ ID NO:366-367
555:P555G SEQ ID NO:368-369
565:N565R SEQ ID NO:370-371
578:D578R SEQ ID NO:372-373
603:G603P SEQ ID NO:400-401
681:E681K SEQ ID NO:402-403
682:L682S SEQ ID NO:404-405
694:E694K SEQ ID NO:406-407
701:P701G SEQ ID NO:408-409
702:K702E SEQ ID NO:410-411
233:L233S SEQ ID NO:178-179
256:V256S SEQ ID NO:180-181
288:E288K SEQ ID NO:186-187
303:E303K SEQ ID NO:188-189
315:E315K SEQ ID NO:192-193
336:P336G SEQ ID NO:200-201
337:E337K SEQ ID NO:202-203
351:L351S SEQ ID NO:208-209
373:P373G SEQ ID NO:216-217
381:D381R SEQ ID NO:218-219
452:D452R SEQ ID NO:222-223
485:N485R SEQ ID NO:226-227
507:E507K SEQ ID NO:228-229
520:E520K SEQ ID NO:268-269
521:A521F SEQ ID NO:310-311
76:E76K SEQ ID NO:26-27
91:D91R SEQ ID NO:28-29
104:D104R SEQ ID NO:32-33
111:L111S SEQ ID NO:34-35
186:T186I SEQ ID NO:36-37
189:E189K SEQ ID NO:38-39
201:E201K SEQ ID NO:112-113
209:E209K SEQ ID NO:114-115
215:E215K SEQ ID NO:116-117
219:K219E SEQ ID NO:118-119
221:L221S SEQ ID NO:120-121
222:D222R SEQ ID NO:122-123
230:E230K SEQ ID NO:124-125
其中，对于每个凝胶，具有SEQ ID NO:1的序列的目标核酸扩增后，将PCR扩增产物通过凝胶电泳分离。每个凝胶有6个泳道(如沿图1的底部标记的)，其中左侧的两条泳道表示浓度为50ng/μl的突变型Taq聚合酶的PCR后的结果；接下来的两条泳道表示浓度为5ng/μl的突变型Taq聚合酶的结果；而最右边的两条泳道代表浓度为0.5ng/μl的突变型Taq聚合酶的结果。每个凝胶有两行，最上一行表示用突变型Taq聚合酶在反应缓冲液外加100mMKCl的盐浓度下进行PCR后的结果；最下面一行是突变型Taq聚合酶在反应缓冲液没加额外KCl的盐浓度下进行PCR后的结果。正常的反应缓冲液中含有10mM KCl。术语“WT”是指野生型Taq聚合酶。
图2显示多个凝胶的合并图像，每个代表使用其中一个突变型Taq聚合酶的PCR结果。每个这种突变体用数字表示，数字对应于表I中所列的突变位点和序列，按照图2所示的顺序，如下所示：
365:L365S SEQ ID NO:210-211
366:G366P SEQ ID NO:212-213
368:P368G SEQ ID NO:214-215
384:N384R SEQ ID NO:220-221
541:L541S SEQ ID NO:354-355
550:P550G SEQ ID NO:360-361
552:L552S SEQ ID NO:364-365
601:E601K SEQ ID NO:394-395
602:E602K SEQ ID NO:396-397
607:V607S SEQ ID NO:398-399
101:E101K SEQ ID NO:30-31
260:K260E SEQ ID NO:182-183
261:R261D SEQ ID NO:184-185
309:F309A SEQ ID NO:190-191
320:D320R SEQ ID NO:194-195
328:R328D SEQ ID NO:196-197
330:G330P SEQ ID NO:198-199
338:P338G SEQ ID NO:204-205
342:L342S SEQ ID NO:206-207
所示突变型Taq聚合酶是已经被证实在高盐浓度PCR扩增中有效的突变型Taq聚合酶。每个凝胶中的行和泳道所示突变型Taq聚合酶及盐浓度与以上图1所概述的一致。
图3显示多个凝胶的合并图像，每个代表使用其中一个突变型Taq聚合酶进行PCR的结果，其中每个突变体的标记方式与表I中所列的突变位点和序列的方式一致。每个凝胶中的行和泳道所示突变型Taq聚合酶及盐浓度(分别为110mM KCl和10mM KCl)与以上图1所概述的一致。
图4显示多个凝胶的合并图像，每个代表使用其中一个突变型Taq聚合酶进行PCR的结果，其中每个突变体的标记方式与表I中所列的突变位点和序列的方式一致。每个凝胶中的行和泳道所示突变型Taq聚合酶及外加盐浓度(分别为100mM KCl和0mM KCl)与以上图1所概述的一致。
图5显示多个凝胶的合并图像，每个代表使用其中一个突变型Taq聚合酶进行PCR的结果，其中每个突变体的标记方式与表I中所列的突变位点和序列的方式一致。每个凝胶中的行和泳道所示突变型Taq聚合酶及外加盐浓度(分别为100mM KCl和0mM KCl)与以上图1所概述的一致。
图6显示多个凝胶的合并图像，每个代表使用其中一个突变型Taq聚合酶进行PCR的结果，其中每个突变体的标记方式与表I中所列的突变位点和序列的方式一致。每个凝胶中的行和泳道所示突变型Taq聚合酶及外加盐浓度(分别为100mM KCl和0mM KCl)与以上图1所概述的一致。
序列表总述
SEQ ID NO:4和5分别是组胺标签化的野生型Taq聚合酶的氨基酸和核苷酸序列。上表I所列各突变体的氨基酸和DNA序列以与表I相同的顺序给出在所附的序列表中，从表I中E39K的第一个氨基酸序列开始，即SEQ ID NO：6(突变型Taq聚合酶氨基酸序列)。紧随每个突变型Taq聚合酶氨基酸序列(从SEQ ID NO:6到SEQ ID NO:478的偶数序列)之后为其特有的编码序列(从SEQ ID NO:7到SEQ ID NO:479的奇数序列)。
详述
定义
术语“生物活性片段”是指具有该生物分子特征的体内或体外活性的突变型Taq聚合酶的任何片段、衍生物、同源物或类似物。例如，突变型Taq聚合酶可以具有多种生物活性，包括DNA结合活性、核苷酸聚合活性、引物延伸活性、链置换活性、逆转录酶活性、切口引发的聚合酶活性、3'-5'外切酶(校对)活性、热稳定性、离子稳定性、准确性、持续合成能力等。突变型Taq聚合酶的“生物活性片段”是能够催化核苷酸(包括其同源物和类似物)聚合成核酸链的任何片段、衍生物、同源物或类似物。在一些实施方式中，突变型Taq聚合酶的生物活性片段、衍生物、同源物或类似物在体内或体外的任何目标测定中具有突变型Taq聚合酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％以上的生物活性，所述目标测定例如，DNA结合测定、核苷酸聚合测定(其可以是模板依赖或非模板依赖的)、引物延伸测定、链置换测定、逆转录酶测定、校对测定、准确度测定、热稳定性测定、离子稳定性测定等。
聚合酶片段的生物活性可以通过测量任意以下来测定：片段在规定的反应条件下的体外引物延伸活性；在规定的反应条件下片段的体外聚合活性；在规定的反应条件下片段的体外热稳定性；高离子强度条件下片段的体外稳定性；在规定的反应条件下片段的体外准确性；在规定的反应条件下片段的体外加工性；在规定的反应条件下片段的体外链置换活性；在规定的反应条件下片段的体外读长活性；在规定的反应条件下片段的链偏置活性(strand bias activity)；在规定的反应条件下片段的体外校对活性；在规定的反应条件下利用聚合酶片段进行的体外测定的输出，例如测序通量或平均读长；以及在规定的反应条件下的体外核苷酸聚合反应的输出，如聚合酶片段在核苷酸聚合反应中掺入正确的核苷酸的原始准确性。
在一些实施方式中，生物活性片段可包括突变型Taq聚合酶的DNA结合域的任何部分或催化域的任何部分。在一些实施方式中，所述生物活性片段可任选地包括突变型Taq聚合酶的任意25、50、75、100、150或更多个连续氨基酸残基。修饰的聚合酶的生物活性片段可以包括与从SEQ ID NO:4到SEQ ID NO:478的任何一个或更多个偶数序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的至少25个连续氨基酸残基。本发明还包括编码任何上述氨基酸序列的多核苷酸(即从SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:479的奇数序列的编码部分，其中每个奇数多核苷酸序列编码之前的偶数突变型Taq聚合酶)。
生物活性片段可以产生于转录后加工或选择性剪接RNA的翻译，或者可以通过改造、大量合成或其他适当的操作产生。生物活性片段包括在天然或内源性细胞中表达的片段，以及在表达系统中产生的片段，例如，在细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞中。
本文中，短语“保守性氨基酸替换”或“保守性突变”是指一种氨基酸被另一种具有共同性质的氨基酸所取代。从功能上定义单个氨基酸之间的共同性质的方法是分析同源生物中相应蛋白质之间氨基酸变化的标准化频率(Schulz(1979)Principles of ProteinStructure，Springer-Verlag)。根据这样的分析，可以确定出氨基酸的族，其中族内的氨基酸优先相互替换，因此它们对蛋白质整体结构的影响最相似(Schulz(1979)同上)。以这种方式定义的氨基酸的组的实例包括:“带电/极性族”，包括Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His；“芳香族或环族”，包括Pro、Phe、Tyr和Trp；以及“脂肪族”，包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys。在每一族中，还可以确定子族。例如，带电荷/极性的氨基酸的族可以再分为亚族，所述亚族包括：“正电荷亚族”包括Lys、Arg和His；“负电荷亚族”包括Glu和Asp；以及“极性亚族”包括Asn和Gln。在另一实例中，芳香或环族可以再分为亚族，包括：“氮环亚族”，包括Pro、His和Trp；和“苯基亚族”，包括Phe和Tyr。在另一个实例中，脂肪族可再分为亚族，包括：“大脂肪族非极性亚族”，包括Val、Leu和Ile；“脂肪族微极性亚族”，包括Met、Ser、Thr和Cys；以及“小残基亚族”包括Gly和Ala。保守性突变的例子包括上述亚族内的氨基酸的氨基酸取代，例如，但不限于：Lys替换Arg或反之，以保持正电荷；Glu替换Asp或反之，这样可以保持负电荷；Ser替换Thr或反之，这样可以保持游离-OH；Gln替换Asn或反之，这样可以保持游离-NH2。“保守性变体”是这样的多肽，其包含已经被具有共同性质的氨基酸(例如属于上述相同氨基酸族或亚族)取代以替换参考多肽(例如，序列已在文献或序列数据库中公开，或序列由核酸测序确定的多肽)的一个或更多个氨基酸的一个或更多个氨基酸。
当涉及基因时，“突变体”是指相对于天然或野生型基因具有至少一个碱基(核苷酸)改变、缺失或插入的基因。突变(一个或更多个核苷酸的改变、缺失和/或插入)可以发生在基因的编码区，或可以发生在内含子、3'UTR、5'UTR或启动子区。作为非限制性的例子，突变基因可以是在启动子区域内具有插入的基因，从而增加或减少基因的表达；可以是具有缺失的基因，导致产生非功能蛋白、截短蛋白、显性负蛋白或无蛋白；或者，可以是具有一个或更多个点突变的基因，导致编码蛋白质的氨基酸发生变化，或者导致基因转录本的异常剪接。
“天然的”或“野生型”是指在自然中发现的形式。例如，天然或野生型多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，例如未通过人为操作有意修饰的Taq聚合酶序列。
关于核酸或多肽序列的术语“百分比同一性”或“同源性”定义为在以最大百分比同一性为目的对齐序列并且在需要时引入空位以达到最大百分比同源性后，在候选序列中与已知多肽相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。N端或C端插入或缺失不应被解释为影响同源性。核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或同一性可通过BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)分析使用通过程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序执行的算法确定(Altschul(1997),Nucleic Acids Res.25,3389-3402,和Karlin(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,2264-2268)，其为序列相似度搜索定制。BLAST程序使用的方法是，首先考虑查询序列和数据库序列之间具有和不具有空位的相似区段，然后评估所有识别出的匹配项的统计显著性，最后只总结那些满足预先选定的显著性阈值的匹配项。关于序列数据库相似度搜索的基本问题的讨论，见Altschul(1994)，NatureGenetics 6，119-129页。柱形图、描述、比对、期望值(即用于针对数据库序列报告匹配项的统计显著性阈值)、截断值、矩阵和过滤(低复杂度)的搜索参数可以是默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10915-10919),推荐用于长度超过85个单位(核苷酸碱基或氨基酸)的查询序列。
突变型Taq聚合酶的应用
在一些实施方式中，本发明涉及用于执行核苷酸聚合反应的方法(以及相关试剂盒、系统、装置和组合物)，所述方法包括以下或由以下组成：在一个或更多个核苷酸的存在下使突变型Taq聚合酶或其生物活性片段与核酸模板接触，以及使用修饰的聚合酶或其生物活性片段聚合所述一个或更多个核苷酸中的至少一个。突变型Taq聚合酶或其生物活性片段包括表I中给出的相对于野生型的一个或更多个氨基酸修饰，且所述突变型Taq聚合酶或其生物活性片段在高离子强度溶液(包括高达110mM盐或KCl总浓度的溶液)中具有提高的活性。
在一些实施方式中，所述方法可以进一步包括以依赖模板的方式聚合至少一个核苷酸。在一些实施方式中，在热循环条件下进行聚合。在一些实施方式中，所述方法还可包括在所述接触之前、期间或之后，使引物与所述核酸模板杂交，其中所述聚合包括使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段将至少一个核苷酸聚合到引物的末端。在一些实施方式中，所述聚合在能够检测所述聚合或生物活性片段的传感器附近进行。在一些实施方式中，该方法还可包括使用传感器检测指示通过经修饰的聚合酶或其生物活性片段进行的聚合的信号。在一些实施方式中，传感器是离子敏场效应晶体管(ISFET)。在一些实施方式中，传感器可包括聚合反应中的检测标记或检测试剂。
在一些实施方式中，该方法还包括确定经修饰的聚合酶聚合的一个或更多个核苷酸是何种核苷酸。在一些实施方式中，该方法还包括确定经修饰的聚合酶聚合的核苷酸的数目。在一些实施方式中，聚合在至少110mM盐的高离子强度溶液的存在下进行。在一些实施方式中，所述高离子强度溶液包含KCl和/或NaCl。
在一些实施方式中，本发明涉及用于检测核苷酸掺入的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)，所述方法包括以下或由以下组成：使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段、核酸模板和一个或更多个核苷酸三磷酸进行核苷酸掺入反应：产生核苷酸的掺入以及检测核苷酸的掺入。检测核苷酸掺入可以通过任何适当的方法进行，如PAGE、荧光、dPCR定量、核苷酸副产物生产检测(如氢离子或焦磷酸检测；适合的核苷酸副产物检测系统包括但不限于下一代测序平台，如Rain Dance、Roche 454、Ion Torrent系统))或核苷酸延伸产物检测(如延伸产物的光学检测或标记的核苷酸延伸产物的检测)。在一些实施方式中，用于检测核苷酸掺入的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)包括以下或由以下组成：通过使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段检测核苷酸掺入。
在一些实施方式中，本发明涉及用于扩增核酸的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)，该方法通过在适和扩增核酸的条件下使核酸与突变型Taq聚合酶或其生物活性片段接触；采用聚合酶链反应、乳浊液聚合酶链反应、等温扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应、近接扩增、滚环扩增或链置换扩增扩增核酸。扩增包括在溶液中克隆扩增核酸，以及在固体支持物上克隆扩增核酸，所述固体支持物例如核酸珠、流细胞、核酸阵列或存在于固体支持物表面上的孔。
在一些实施方式中，用于扩增核酸的方法包括在桥式PCR条件下扩增核酸。桥式PCR条件包括将一个或更多个扩增的核酸杂交到固体支持物上。杂交的一个或更多个扩增的核酸可作为进一步扩增的模板。
在一些实施方式中，本公开一般涉及通过使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段将至少一个核苷酸整合到引物末端来合成核酸的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)。任选地，该方法还包括检测至少一个核苷酸在引物末端的整合。在一些实施方式中，该方法还包括确定整合到引物末端的至少一个核苷酸为何种核苷酸。在一些实施方式中，该方法可包括确定整合到引物末端的所有核苷酸为何种核苷酸。在一些实施方式中，该方法包括以依赖模板的方式合成核酸。在一些实施方式中，该方法可包括在溶液中、在固体支持物上或在乳浊液(如emPCR)中合成核酸。
突变型Taq聚合酶的制造
在一些实施方式中，为了提供能耐受通常存在于体内的盐浓度的突变型Taq聚合酶，可在一个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、3个或更多个氨基酸或更多个氨基酸上发生氨基酸取代，包括野生型序列的氨基酸总数的多达30％被取代。突变型Taq聚合酶的一些实施方式可与野生型具有70％至99.99％的同一性。突变型Taq聚合酶的所有实施方式包括表I中所示的一个或更多个氨基酸取代，还可包括对野生型序列的剩余部分的取代、插入或修饰。在一些实施方式中，为提供可耐受通常存在于体内的盐浓度的突变型Taq聚合酶，可以包括表I所示的若干个氨基酸取代。这些额外的取代不限于表I中所示的组合。例如，表显示以下组合：E189K/E230K/E537K和E189K/E507K/E537K。表I中的这些特定组合以及其他组合可与表I中的其他取代或与包括对野生型序列的其他部分的取代、插入或修饰的突变型Taq聚合酶一起运用。
本发明的突变型Taq聚合酶可在任何合适的宿主系统中表达，包括细菌、酵母、真菌、杆状病毒、植物或哺乳动物的宿主细胞。对于细菌宿主细胞，用于指导本公开的核酸构建体的转录的合适的启动子包括：从大肠杆菌(E.coli)乳糖操纵子，天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因(dagA),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)左旋蔗糖酶基因(sacB)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP),枯草芽孢杆菌xylA和枯草芽孢杆菌xylB基因，和原核-β内酰胺酶基因获得的启动子(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl Acad.Sci.USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:21-25)。
对于丝状真菌宿主细胞，用于指导本公开的核酸构建体的转录的合适的启动子包括：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天门冬氨酸蛋白酶，黑曲霉(Aspergillus niger)中性α淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)，Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉三糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰酰胺酶、刺孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性淀粉酶和米曲霉三糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)及其突变、截短和杂合启动子。
在酵母宿主中，适用的启动子可来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(enolase,ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油激酶的基因。其他对酵母宿主细胞适用的启动子由Romanos等人.,1992,Yeast 8:423-488.阐述。
杆状病毒的表达以鳞翅目(蛾类和蝴蝶)的昆虫细胞系为宿主，如草地贪夜蛾。基因表达受强启动子(如pPolh)的调控。
植物表达载体基于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒、或烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯X病毒或豇豆花叶病毒。植物表达载体中常用的组成型启动子是花菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。
对于哺乳动物中的表达，可用培养的哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS，包括人类细胞系如HEK和HeLa来生产突变型Taq聚合酶。哺乳动物表达载体的例子包括腺病毒载体、pSV和pCMV系列质粒载体、牛痘和逆转录病毒载体以及杆状病毒。巨细胞病毒(CMV)和SV40启动子是哺乳动物表达载体中常用的驱动基因表达的启动子。非病毒启动子如延伸因子(EF)-1启动子也是众所周知的。
表达中的控制序列也可以是适宜的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地连接到编码该多肽的核酸序列的3'端。任何在所选宿主细胞中有功能的终止子都可以被使用。
例如，从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉蒽醌合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和棘孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因中可以获得丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子。
从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因中可以获得酵母宿主细胞的示例性终止子。
昆虫、植物和哺乳动物的宿主细胞的终止子也众所周知。
控制序列也可以是合适的前导序列，其为mRNA的非翻译区域，对宿主细胞的翻译有重要意义。前导序列可操作地连接到编码多肽的核酸序列的5'端。任何在所选宿主细胞中有功能的前导序列都可以被使用。丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列可从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉三糖磷酸异构酶的基因中获得。适合酵母宿主细胞的前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(enolase,ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母阿尔法因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因中获得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，这一序列可操作地连接到核酸序列的3'端，当被转录时，宿主细胞识别其为将多腺苷残基添加到转录的mRNA上的信号。任何在所选宿主细胞中有功能的聚腺苷酸化序列可用于本发明中。丝状真菌宿主细胞的示例性聚腺苷化序列可来自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、奈曲霉蒽醌合成酶、棘孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。
控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基端相连的氨基酸序列，并将编码的多肽导入细胞分泌途径。核酸序列中编码序列的5'端可固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码区在翻译阅读框中与编码分泌的多肽的编码区区段天然地连接在一起。或者，编码序列的5'端可以包含对所述编码序列而言为外源的信号肽编码区。当编码序列不天然地包含信号肽编码区时，可需要外源信号肽编码区。
或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区，从而增强多肽的分泌。然而，任何引导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌通路的信号肽编码区都可以被运用。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从以下基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌NCIB 11837麦芽糖淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶，地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶，地衣芽孢杆菌β内酰胺酶，嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,npr,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。一些其他信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiol Rev 57:109-137阐述。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区可以是从以下基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶、Humicola lanuginosa脂肪酶。
酵母宿主细胞的可用信号肽可以来自酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他宿主细胞系统的信号肽也是众所周知的。
所述控制序列也可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽称为前酶或前多肽(在某些情况下称为原酶)。前多肽通常是无活性的，可以通过从前多肽催化或自催化切割前肽转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和Myceliophthora thermophila乳酸酶(WO 95/33836)的基因获得。
当多肽的氨基末端同时存在信号肽和前肽区时，前肽区紧邻多肽氨基末端，信号肽区紧邻前肽区的氨基末端。
添加调控序列可以是期望的，所述调控序列允许相对于宿主细胞的生长调控突变型Taq聚合酶的表达。调节系统的例子那些导致基因表达应答于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开放或关闭的调控系统。在原核宿主细胞中，合适的调控序列包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母宿主细胞中，合适的调控系统包括例如ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，合适的调控序列包括TAKA -α淀粉酶启动子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子。其他宿主细胞的调节系统也是众所周知的。
调控序列的另一些例子是允许基因扩增的调控序列。在真核生物系统中，这些序列包括二氢叶酸还原酶基因，它在甲氨蝶呤存在时扩增，以及金属硫蛋白基因，它在重金属存在时扩增。在这些情况下，本发明的编码KRED多肽的核酸序列将与调控序列可操作地连接在一起。
另一实施方式包括重组表达载体，所述重组表达载体包含编码经改造的突变型Taq聚合酶或其变体的多核苷酸，以及一个或更多个表达调控区域(如启动子和终止子)，以及复制起点(取决于它们将被引入的宿主类型)。上述各种核酸和控制序列可以连接在一起产生重组表达载体，该表达载体可以包括一个或更多个方便的限制性位点，以便在这些位点插入或取代编码突变型Taq聚合酶的核酸序列。或者，突变型Taq聚合酶的核酸序列可以通过将核酸序列或包含所述序列的核酸构建体插入合适的载体中表达。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，以便将所述编码序列与用于表达的合适控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA程序，并且可以导致突变型Taq聚合酶多核苷酸序列的表达。载体的选择通常取决于载体与待引入所述载体的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线性或闭环质粒。
表达载体可以是自主复制载体，即作为染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何保证自我复制的工具。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并与整合到其中的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒，或两个或更多个一起包含待引入宿主细胞基因组的总DNA的载体或质粒，或转座子。
本文中的表达载体优选地包含一个或更多个选择标记，其允许容易地选择经转化的细胞。选择标记是基因，所述基因的产物提供对生物杀灭剂或病毒的抗性，对重金属的抗性，以及对营养缺陷型的原营养型等。细菌选择标记的例子有来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素(实施例1)或四环素抗性。酵母宿主细胞的合适标记为ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记基因包括以下但不限于amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)，bar(草丁膦乙酰转移酶)，hph(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸还原酶)，pyrG(乳清酸-5’磷酸脱羧酶)，sC(硫酸盐腺嘌呤转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸盐合成酶)及其等效物。曲霉属细胞使用的一些实施方式包括包括构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。昆虫、植物和哺乳动物细胞的选择标记也是众所周知的。
本发明的表达载体优选地包含使载体整合到宿主细胞基因组或使载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组中，载体可依赖编码该多肽的核酸序列或载体的任何其他元件，通过同源或非同源重组将载体整合到基因组中。
或者，表达载体可包含用于引导通过同源重组整合到宿主细胞基因组中的额外核酸序列。额外核酸序列能使载体整合到宿主细胞基因组中染色体上的精确位点。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体还可包括使载体能够在目的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的例子有P15A ori，或质粒pBR322,pUC19,pACYC177(该质粒具有P15Aori)，或允许在大肠杆菌中复制的pACYC184，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110,pE194,pTA1060，或pAM31的复制起点。酵母宿主细胞中使用的复制起点的例子有2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，ARS4和CEN6的组合。复制起点可具有突变，使其在宿主细胞中对温度敏感(参见，例如，Ehrlich,1978,Proc Natl Acad Sci USA 75:1433)。
多于一个拷贝的突变型Taq聚合酶的核酸序列可被插入宿主细胞，以增加基因产物的产量。增加核酸序列的拷贝数可以通过将至少一个额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中，或者通过将扩增选择标记基因与核酸序列组合，从而包含选择标记基因的扩增拷贝并因而包含核酸序列的额外拷贝的细胞可以通过在适当选择试剂的存在下培养细胞来选择。
突变型Taq聚合酶多核苷酸的表达载体可商购获得。合适的商业表达载体包括Sigma-Aldrich Chemicals,St.Louis Mo.的p3xFLAGTM表达载体，其包括用于在哺乳动物宿主细胞中表达的CMV启动子和hGH聚腺苷酸化位点，和pBR322复制起点和氨比西林抗性标记，便于在大肠杆菌中扩增。另一些合适的表达载体有pBluescriptII SK(-)和pBK-CMV，其可从Stratagene,LaJolla Calif.商购获得，以及来源于pBR322(Gibco BRL)、pUC(GibcoBRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)或pPoly(lalajolla等，1987,Gene 57:19-201)的质粒。
用于表达本公开的编码突变型Taq聚合酶多肽的多核苷酸的合适宿主细胞使本领域公知的，并且包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、克非尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、小乳杆菌(Lactobacillus minor)、链霉菌和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC登录号201178))；昆虫细胞如果蝇S2和鳞翅目Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS、BHK、293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞适宜的培养基和生长条件是本领域公知的。
用于表达突变型Taq聚合酶多肽的多核苷酸可以通过本领域已知的各种方法导入细胞。技术包括电穿孔，生物粒子轰击，脂质体介导转染，氯化钙转染，和原生质体融合等。本领域技术人员知晓将多核苷酸导入细胞的各种方法。
根据已知的合成方法，编码突变型Taq聚合酶的多核苷酸可以用标准固相法制备。在一些实施方式中，多达约100个碱基的片段可单独合成，然后进行连接(例如，通过酶或化学连接方法，或聚合酶介导的方法)以形成任何期望的连续序列。例如，多核苷酸可以通过化学合成制备，其使用如Beaucage等人，1981,Tet Lett 22:1859-69所述的经典亚磷酰胺法，或Matthes等人，1984,EMBO J.3:81-05所述的方法，例如如同通常在自动化合成方法中实施的那样。通过亚磷酰胺法，可在例如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并在适当的载体上克隆。此外，基本上任何核酸都可以从任何各种商业来源获得，如TheMidland Certified Reagent Company,Midland,Tex.,The Great American GeneCompany,Ramona,Calif.,ExpressGen Inc.Chicago,Ill.，和Operon Technologies Inc.,Alameda,Calif。
宿主细胞中表达的经改造突变型Taq聚合酶可以使用任何一种或多种已知的蛋白纯化技术从细胞和培养基中回收，包括溶菌酶处理、超声、过滤、盐析、超离心和层析等。适用于从例如大肠杆菌的细菌中裂解和高效提取蛋白质的溶液可从来自密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich的商品名CelLytic B.TM获得。
分离突变型Taq聚合酶多肽的色谱技术包括反相色谱、高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和亲和层析等。纯化条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等因素，并且对本领域技术人员显而易见。
在一些实施方式中，可使用亲和技术分离突变型Taq聚合酶。对于亲和层析纯化而言，任何特异性结合突变型Taq聚合酶多肽的抗体都可被运用。为了产生抗体，各种宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等都可以通过注射化合物进行免疫。该化合物可以通过侧链官能基团或与侧链官能基团连接的接头连接到合适的载体上，如BSA。根据宿主的物种，各种佐剂可以用来增强免疫应答，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物质凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质，如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳化佐剂、钥孔戚血蓝蛋白、二硝基酚和潜在适用的人佐剂如BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌。
实施例
PCR中使用野生型和突变型Taq聚合酶来扩增具有SEQ ID NO：1的序列的示例目标核酸
CAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGA；使用具有SEQ ID NO：2：CAGTGCTGCAATGATACC的正向引物，及SEQ ID NO：3：TCCTTGAGAGTTTTCGCC的反向引物。Taq聚合酶(野生型和突变体)的多种KCl浓度及多种稀释度如以上附图简述所示。PCR使用各突变型Taq聚合酶进行，每次以野生型为对照，并且PCR混合物中具有以下试剂和比例：
4μl突变型(或野生型)Taq聚合酶溶液，其中Taq聚合酶的起始浓度为50ng/μl，在实验中进行10倍系列稀释，其结果显示于图1至图43；以及在实验中进行2倍系列稀释，其结果显示于图44至图63。
10X反应缓冲液2μl(其中10X缓冲液由以下组成:200mM Tris-HCl,100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％
X-100pH 8.8@25℃)；
正向引物，SEQ ID NO:2(100uM)0.1μl；
反向引物，SEQ ID NO:3(100uM)0.1μl；
dNTP(10mM)0.8μl；和
pUC19(1ng/μl)1μl。
按照需要加入盐KCl以达到图1到63中所示的多个反应轮次的盐浓度。通过加入蒸馏水使反应混合物的总体积保持为20μl。
进行SEQ ID NO：1的PCR扩增后，对反应混合物中的扩增产物使用凝胶电泳进行分离，条件如下：使用的凝胶为1.2％琼脂糖凝胶(Agarose LE,Goldbio.com,cat:A-2Q1-1000)；缓冲液为：1xTBE缓冲液(Research Products International,cat:T22020-10.0)；凝胶尺寸为12x14 cm；200V下电泳20分钟。
实施例I
图1至6显示来自电泳的合并结果，其是表I中列出的一些突变型Taq聚合酶的各凝胶的合并图像。
本文进行的实验的结果(如图1-6所示)表明，表I中许多突变型Taq聚合酶在高达110mM KCl的盐浓度下没有实质上被抑制。与野生型相比(图1-6中的“WT”)，图1-6中几乎每一个突变型Taq聚合酶在更低的突变型Taq聚合酶浓度和/或更高的盐浓度下显示目标序列的扩增(黑斑块)。这些突变型Taq聚合酶及其生物活性片段已被证明在通常体液(如血液、血清和血浆)(即便它们被使用柠檬酸钠保存)中的盐浓度下有效。
实施例II
表I中所示但在图1-6中未显示的突变型taq聚合酶被用于PCR中以扩增例如SEQID NO:1的序列的示例性目标核酸。不同的KCl浓度和不同稀释度的突变型Taq聚合酶如以上附图简述所示。使用每个突变型Taq聚合酶进行PCR，每次以野生型作为对照，PCR混合物中的试剂盒比例如实施例I所示。实验表明，这些突变型Taq聚合酶在盐浓度高达110mM KCl条件下没有实质上被抑制。
血液、血清、血浆和甚至柠檬酸钠保存的血液的渗透压都低于110mM KCl，因此，预计即使使用柠檬酸钠保存，突变型Taq聚合酶也不会受到血液、血清、血浆或其他体液样品的抑制。
本文所述的具体方法和组合物代表优选实施方案，并且是示例性的，并不意在限制本发明的范围。在考虑了本说明书之后，本领域技术人员将想到其他目的，方面和实施例，并且其他目的，方面和实施例被包括在由权利要求的范围所限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文说明性地描述的本发明可以在不存在任何要素或限制的情况下适当地实践，这在本文中没有具体公开为必要的。因此，例如，在本文的每个实例中，在本发明的实施方式或实例中，术语“包括”，“包含”，“包含”等中的任何一个都应被广泛且不受限制地阅读。可以以不同的步骤顺序来实践本文中所描述的步骤，并且它们不一定限于本文或权利要求中所指示的步骤的顺序。除非上下文另外明确指出，“一个”和“该”包括复数形式，并且复数形式包括单数形式。。在任何情况下，专利商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员所作的任何陈述都不能解释为对专利的限制，除非这种陈述是明确的,盟友且无条件或保留地由申请人在回应性写作中明确采用。
在此已经广泛地和概括地描述了本发明。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。已经采用的术语和表达被用作描述性的术语，而不是限制性的，并且不意图使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是可以理解。在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变型，并且可以将这种修改和变型视为对本发明的限制。在由所附权利要求书限定的本发明的范围内。
Claims (20)
1.突变型Taq聚合酶，其包含一种或更多种在所示位置的区别于野生型序列的以下突变：
E39K SEQ ID NO:6-7,
E39K/E189K SEQ ID NO:8-9,E39K/E230K SEQ ID NO:10-11,E39K/D320R SEQ ID NO:12-13,E39K/E507K SEQ ID NO:14-15,E39K/E520K SEQ ID NO:16-17,E39K/E537K SEQ IDNO:18-19,E39K/D578R SEQ ID NO:20-21,E39K/D732R SEQ ID NO:22-23,E39K/E742K SEQID NO:24-25
E76K SEQ ID NO:26-27,
D91R SEQ ID NO:28-29,
E101K SEQ ID NO:30-31,
D104R SEQ ID NO:32-33,
L111S SEQ ID NO:34-35,
T186I SEQ ID NO:36-37,
E189K SEQ ID NO:38-39,E189D SEQ ID NO:40-41,E189L SEQ ID NO:42-43,E189MSEQ ID NO:44-45,E189P SEQ ID NO:46-47,E189Q SEQ ID NO:48-49,E189R SEQ ID NO:50-51,E189T SEQ ID NO:52-53,E189Y SEQ ID NO:54-55,E189K/E230K/E507K SEQ IDNO:56-57,E189K/E230K/E520K SEQ ID NO:58-59,E189K/E507K/E520K SEQ ID NO:60-61,E189K/E230K SEQ ID NO:62-63,E189K/E507K SEQ ID NO:64-65,E189K/E520K SEQ IDNO:66-67,E189K/E537K SEQ ID NO:68-69,E189K/D578R SEQ ID NO:70-71,E189K/D732RSEQ ID NO:72-73,E189K/E742K SEQ ID NO:74-75,E189K/E230K/E537K SEQ ID NO:76-77,E189K/E507K/E537K SEQ ID NO:78-79,E189K/E520K/E537K SEQ ID NO:80-81,E189K/E230K/D578R SEQ ID NO:82-83,E189K/E507K/D578R SEQ ID NO:84-85,E189K/E520K/D578R SEQ ID NO:86-87,E189K/E537K/D578R SEQ ID NO:88-89,E189K/E230K/D732R SEQID NO:90-91,E189K/E507K/D732R SEQ ID NO:92-93,E189K/E520K/D732R SEQ ID NO:94-95,E189K/E537K/D732R SEQ ID NO:96-97,E189K/D578R/D732R SEQ ID NO:98-99,E189K/E230K/E742K SEQ ID NO:100-101,E189K/E507K/E742K SEQ ID NO:102-103,E189K/E520K/E742K SEQ ID NO:104-105,E189K/E537K/E742K SEQ ID NO:106-107,E189K/D578R/E742K SEQ ID NO:108-109,E189K/D732R/E742K SEQ ID NO:110-111
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E230M SEQ ID NO:126-127,E230S SEQ ID NO:128-129,E230T SEQ ID NO:130-131,E230V SEQ ID NO:132-133,E230W SEQ ID NO:134-135,
E230K/E507K SEQ ID NO:136-137,E230K/E520K SEQ ID NO:138-139,E230K/E537KSEQ ID NO:140-141,E230K/D578R SEQ ID NO:142-143,E230K/D732R SEQ ID NO:144-145,E230K/E742K SEQ ID NO:146-147,E230K/E507K/E520K SEQ ID NO:148-149,E230K/E507K/E537K SEQ ID NO:150-151,E230K/E520K/E537K SEQ ID NO:152-153,E230K/E507K/D578R SEQ ID NO:154-155,E230K/E520K/D578R SEQ ID NO:156-157,E230K/E537K/D578R SEQ ID NO:158-159,E230K/E507K/D732R SEQ ID NO:160-161,E230K/E520K/D732R SEQ ID NO:162-163,E230K/E537K/D732R SEQ ID NO:164-165,E230K/D578R/D732R SEQ ID NO:166-167,E230K/E507K/E742K SEQ ID NO:168-169,E230K/E520K/E742K SEQ ID NO:170-171,E230K/E537K/E742K SEQ ID NO:172-173,E230K/D578R/E742K SEQ ID NO:174-175,E230K/D732R/E742K SEQ ID NO:176-177,
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A521F SEQ ID NO:310-311,
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E745K SEQ ID NO:466-467,M765S SEQ ID NO:468-469,E774K SEQ ID NO:470-471,L781S SEQ ID NO:472-473,A791F SEQ ID NO:474-475,E805K SEQ ID NO:476-477,L813SSEQ ID NO:478-479。
2.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其在含有盐的PCR混合物中。
3.根据权利要求2所述的突变型Taq聚合酶，其中所述盐是钠或钾。
4.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其在含有全血、血浆和血清的PCR混合物中有活性。
5.根据权利要求4所述的突变型Taq聚合酶，其在含有柠檬酸钠的PCR混合物中有活性。
6.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其仅具有所列的突变中的一种。
7.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中所述野生型序列与SEQ ID NO:4序列相同，但不具有C端的组氨酸标签。
8.DNA序列，其编码权利要求1所述的突变型Taq聚合酶。
9.载体，其整合有任意权利要求8的所述DNA序列。
10.细胞，其被权利要求8的所述DNA序列转化并表达权利要求8的所述DNA序列。
11.细胞，其被权利要求8的所述DNA序列转化并表达权利要求8的所述DNA序列。
12.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中所述突变型Taq聚合酶在盐浓度大于10mM的PCR混合物或含有镁离子的PCR混合物，或者在血液、血浆或血清中有活性。
13.一种在10mM或更高的盐浓度或在血液、血浆或血清中进行PCR的方法，所述方法包括:
向包含目标序列和目标序列引物的PCR混合物中添加权利要求1所述的突变型Taq聚合酶；
通过温度循环使所述目标序列扩增，以使所述引物退火到所述目标序列且使所述引物延伸，然后使延伸的引物去退火。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述血液、血浆或血清包含柠檬酸钠或含盐的防腐剂。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述盐浓度小于110mM。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述盐浓度小于110mM KCl。
17.根据权利要求13的方法，其还包括在扩增之后回收扩增的目标序列。
18.根据权利要求13所述的方法，其中在镁离子存在的条件下进行所述方法。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述血液、血浆或血清包含柠檬酸钠。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述突变型Taq聚合酶仅具有权利要求1所列的突变中的一种。
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