CN113382643A - 多层颗粒 - Google Patents

Abstract

公开了包含化合物的多层颗粒和组合物。还公开了制备颗粒和组合物的工艺及其用途。

Description

多层颗粒

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年11月20日提交的标题为“MULTI-LAYERED PARTICLES”的美国临时专利申请第62/769,642号的优先权权益，该美国临时专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明属于多层颗粒、包含多层颗粒的组合物、制备这样的组合物的工艺及其用途的领域。

发明背景

许多生物活性剂的效力是基于它们到达所选定的靶位点并以有效浓度保持存在持续足够的时间段以实现期望的治疗目的或诊断目的的能力。生物活性化合物的分子性质可能损害通过给定递送途径的吸收，从而导致效力显著降低。具有低水溶解度的亲脂性物质通常具有差的口服生物利用度。本质上是疏水性的这些物质表现出润湿困难和差的溶出。这些性质显然代表了它们从固体口服剂型中吸收的限速步骤，并且进而导致其生物利用度的随后的降低。

越来越需要克服常规包封技术的局限性，并且寻找这样的方法：以稳定的方式提供固体的或液体的亲脂性活性物质和其他活性成分，允许它们的受控释放而不丧失它们的活性，当与其他组分接触时保护相同的活性，当需要时掩蔽令人不快的气味，以及掩蔽味道。

发明概述

根据本发明的一些实施方案，提供了颗粒，该颗粒包含：至少一种化合物，该至少一种化合物具有基于蛋白质的壳，该基于蛋白质的壳至少部分地包围所述至少一种化合物；以及包含多糖的包衣，包衣包封至少一种带壳化合物。

在一些实施方案中，提供了具有5nm至10000nm的直径的颗粒。在一些实施方案中，提供了具有1μm至500μm的直径的颗粒。在一些实施方案中，至少一种化合物和壳具有5nm至300nm的直径。

在一些实施方案中，至少部分地包围化合物的基于蛋白质的壳包围至少一种化合物的总表面的至少85％。

在一些实施方案中，颗粒包含1％至80％(w/w)的化合物。

在一些实施方案中，颗粒包含0.1％至99％(w/w)的基于蛋白质的壳。

在一些实施方案中，生物活性化合物在颗粒中的浓度为0.01mg/g至500mg/g。

在一些实施方案中，至少一种化合物可溶于有机溶剂。

在一些实施方案中，至少一种化合物选自由以下组成的组：亲脂性化合物、挥发性有机化合物、香精、蛋白质、芳香剂、维生素、亲脂性代谢物、部分亲脂性代谢物或其任何组合。

在一些实施方案中，基于蛋白质的壳选自由以下组成的组：乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、胶原或其任何组合。

在一些实施方案中，至少一种化合物选自由以下组成的组：虾青素、姜黄素、ω3、咖啡因、β-胡萝卜素、鱼油、葵花油、植物甾醇、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)、辅酶Q10、大麻素或其功能性衍生物、维生素D或其任何组合。

在一些实施方案中，颗粒还包含与基于蛋白质的壳的至少一部分相互作用的阳离子聚合物。

在一些实施方案中，相互作用是静电相互作用。

在一些实施方案中，颗粒具有50nm至300nm的直径。

根据本发明的一些实施方案，提供了包含如本文公开的多个颗粒的组合物。

在一些实施方案中，组合物选自由以下组成的组：可食用组合物、膳食补充剂组合物、药物组合物、农用化学组合物和化妆品组合物。

在一些实施方案中，组合物呈粉末的形式。在一些实施方案中，粉末包含1％至80％(w/w)的至少一种化合物。

在一些实施方案中，粉末具有0.5mg/g至500mg/g的含量的至少一种化合物。

在一些实施方案中，当重新分散在水中时，至少80％的颗粒具有在5nm至300nm的范围内的尺寸。

在一些实施方案中，组合物具有0.05至0.7的多分散性指数。

在一些实施方案中，具有至少部分地包围至少一种化合物的基于蛋白质的壳的至少一种化合物具有-50mV至-10mV的ζ电势。

在一些实施方案中，组合物具有抗氧化活性。

在一些实施方案中，至少80％的颗粒具有50nm至300nm的尺寸。

在一些实施方案中，组合物具有0.05至0.7的多分散性指数。

在一些实施方案中，颗粒具有0mV至100mV的ζ电势。

在一些实施方案中，20％至90％的化合物在生理条件下在肠期(intestinalphase)释放。

根据本发明的一些实施方案，提供了用于包封化合物的方法。在一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：a.将化合物和溶剂混合，b.将化合物和溶剂与蛋白质或多糖或两者混合，从而获得纳米乳液，c.蒸发溶剂，从而获得颗粒，以及d.将具有蛋白质、多糖或其混合物的颗粒干燥，从而包封化合物。

在一些实施方案中，颗粒具有5nm至300nm的直径。

在一些实施方案中，方法包括在干燥之前添加阳离子聚合物的步骤。

在一些实施方案中，干燥是颗粒的喷雾干燥、粒化、团聚或其任何组合。

在一些实施方案中，化合物处于悬浮液中。

在一些实施方案中，溶剂具有在35℃至80℃的范围内的沸点。在一些实施方案中，溶剂包括乙酸乙酯。

在一些实施方案中，化合物和蛋白质呈4:1至1:50(w/w)的比。

在一些实施方案中，方法具有60％至95％的包封产率。

在一些实施方案中，方法具有80％至100％的包封效率(encapsulationefficacy)。

在一些实施方案中，化合物在颗粒中的浓度为0.01mg/g至500mg/g。

根据本发明的一些方面，提供了由本文别处描述的方法产生的颗粒。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实施方案的实践或测试中可以使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文描述示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，将以包括定义的专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的并且不意图必需是限制性的。

从下文给出的详细描述，本发明的其他实施方案和适用性的完整范围将变得明显。然而，应当理解，详细描述和特定的实施例虽然指示本发明的优选的实施方案，但仅通过说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修改根据该详细描述对于本领域技术人员将变得明显。

附图简述

图1是在不具有脱乙酰壳多糖(NP ASX WPI)以及具有两种不同浓度的脱乙酰壳多糖的情况下，虾青素纳米颗粒(NP ASX)尺寸的条形图；

图2是具有乳清分离蛋白(WPI)的NP ASX和在添加脱乙酰壳多糖之后的NP ASXWPI的ζ电势分布的图；

图3是在水中再分散时由乳清分离蛋白(WPI)和麦芽糖糊精(MD)获得的NP ASX粉末制剂的尺寸分布的图；

图4示出了在喷雾干燥之前和之后对来自含有ASX颗粒的粉末的ASX提取物的HPLC分析；

图5A-图5D示出了通过立体显微镜图像20×(A)、分散在水中时颗粒直径的DLS分析(B)和SEM显微照片(C和D)进行的粉末颗粒形态学评价；

图6A-图6B是示出在体外模拟消化期间，ASX从乳清蛋白浓缩物(WPC)ASX NP和从含有ASX颗粒的粉末中释放的图；

图7是在NP ASX形式的消化之前和在NP ASX形式的肠消化2小时之后的不同ASX酯形式(游离形式、单酯和二酯)的相对浓度的条形图；

图8是在消化之前和之后在含有ASX颗粒的粉末中不同ASX酯形式(游离形式、单酯和二酯)的相对浓度的条形图；

图9A-图9C是示出ASX NP的细胞摄取的共聚焦显微镜图像；与NP制品(平均尺寸：107nm)一起孵育的Caco2细胞系(图9A)，与NP制品(平均尺寸：107nm)一起孵育的HepG2细胞系(图9B)，与含有ASX颗粒(平均尺寸：220nm)的重悬粉末一起孵育的J774A1细胞系(图9C)；

图10是示出与通过流化床获得的含有ASX颗粒的团聚物相比，含有ASX颗粒的粉末在水中重悬时的粒度分布的图；

图11是示出姜黄素WPC NP的粒度分布的图；

图12是示出鱼油WPC NP的粒度分布的图；

图13A-图13F是示出随着用于产生NP的蛋白质浓度(图13A和图13B)和H.p.油性树脂浓度(图13C和图13D)变化的Z平均值和PDI(图13A和图13C)和ζ电势(图13B和图13D)的变化的图。值之间的统计学上显著的差异(P<0.05)由不同字母指示。在A组和C组中，由于没有观察到PDI的差异(P>0.05)，因此仅指示了相对于Z平均值的值的显著性。取决于蛋白质浓度(图13E)和H.p.油性树脂浓度(图13F)而产生的纳米颗粒的外观；

图14A-图14C是示出用1％WPC和4.5％H.p.油性树脂获得的NP的DLS分析的图；百分比分布按数目(图14A)、强度(图14B)和体积(图14C)报告。B和C中具有约1400nm的直径的颗粒可能是由于灰尘的存在，并且不取决于包封工艺；

图15是示出H.p.油性树脂和NP的吸收光谱之间的比较的图；

图16A-图16B是H.p.油性树脂(图16A)和NP提取物组合物(图16B)的HPLC色谱图，其示出了包封之前和之后游离的ASX、ASX的单酯和二酯；

图17是示出在不同pH值NP的稳定性的条形图，该稳定性被表示为采用分光光度法在660nm处测量的浊度；

图18是示出在暴露于UV射线之后，在NP中保留的ASX和在H.p.油性树脂中保留的ASX之间的比较的图；值作为平均值±标准偏差给出；

图19是示出在暴露于FeCl₃之后，在NP中保留的ASX和H.p.油性树脂中保留的ASX之间的比较的图；值作为平均值±标准偏差给出；

图20是示出在65℃，NP和H.p.油性树脂的降解动力学的图；值作为平均值±标准偏差给出；

图21是示出在NP的体外模拟消化期间ASX的释放的图；值作为平均值±标准偏差给出；

图22A-图22B是示出NP(图22A)和H.p.油性树脂(图22B)在时间零以及在SGF中消化60min之后和在SIF中消化120min之后，不同ASX酯化形式的相对浓度的条形图；

图23A-图23B是含有姜黄素颗粒的粒剂在水中的溶出行为的照片(图23A)和溶液外观的照片，其中从底部照射烧杯；

图24是通过光学显微镜拍摄的含有姜黄素颗粒的粒剂的显微镜图像；

图25A-图25B是含有辅酶Q10颗粒的粒剂在水中的溶出行为的照片(图23A)和溶液外观的照片，其中从底部照射烧杯；

图26是通过光学显微镜拍摄的含有辅酶Q10颗粒的粒剂的显微镜图像；

图27A-图27B是含有β-胡萝卜素颗粒的粒剂在水中的溶出行为的照片(图23A)和溶液外观的照片，其中从底部照射烧杯；

图28是通过光学显微镜拍摄的含有β-胡萝卜素颗粒的粒剂的显微镜图像；

图29A-图29B是含有鱼油颗粒的粒剂在水中的溶出行为的照片(图23A)和溶液外观的照片，其中从底部照射烧杯；

图30是通过光学显微镜拍摄的含有鱼油颗粒的粒剂的显微镜图像；

图31A-图31B是含有植物甾醇颗粒的粒剂在水中的溶出行为的照片(图23A)和溶液外观的照片，其中从底部照射烧杯；

图32是通过光学显微镜拍摄的含有植物甾醇颗粒的粒剂的显微镜图像；

图33是含有咖啡因颗粒的粉末在水中的溶出行为的照片；

图34是通过光学显微镜拍摄的含有咖啡因颗粒的粉末的显微镜图像；

图35是含有表没食子儿茶素没食子酸酯颗粒的粉末在水中的溶出行为的照片；

图36是通过光学显微镜拍摄的含有表没食子儿茶素没食子酸酯颗粒的粉末的显微镜图像；

图37是示出用含有3％的咖啡因的WPC获得的NP乳液的DLS分析的图；尺寸分布由按％计的数目报告；

图38是示出用含有3％的咖啡因的WPC获得的NP粉末的DLS分析的图；尺寸分布由按％计的数目报告；

图39是示出在不同浓度的H.p.油性树脂和WPC ASX NP孵育的HepG2细胞的细胞生存力的条形图；

图40A-图40D是示出响应于不同自由基发生剂的细胞荧光单位变化的图；

图41A-图41B是示出在成年小鼠巨噬细胞(J774A.1)中经由流式细胞术用WPC ASXNP、H.p.油性树脂和WPC测试的细胞抗氧化活性(图41A)，以及Trolox的抗氧化性质和WPCASX NP的抗氧化性质之间的比较(图41B)的图；

图42是通过共聚焦显微镜获得的HepG2细胞和Caco2细胞的显微照片，该HepG2细胞和Caco2细胞与使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的WPC ASX NP一起孵育持续不同的时间；

图43A-图43B是示出在HepG2细胞(图43A)和Caco2细胞(图43B)中存在阻断条件的情况下WPC ASX NP的细胞摄取抑制的图；

图44A-图44B是示出作为用于产生ASX大豆分离蛋白(SPI)NP的不同蛋白质浓度的结果的尺寸和PDI(图44A)和z电势(图44B)的变化的图。由相同字母指示的值之间的差异是在统计学上显著的(P<0.05)；

图45A-图45B是示出随着用于产生ASX SPI NP的不同H.p.油性树脂浓度变化的尺寸和PDI(图45A)和z电势(图45B)的变化的图。由相同字母指示的值之间的差异是在统计学上显著的(P<0.05)；

图46A-图46B是取决于不同蛋白质浓度(图46A)和H.p.油性树脂浓度(图46B)的ASX SPI NP的外观的照片；

图47A-图47B是示出作为用于产生ASX豌豆分离蛋白(PPI)NP的不同蛋白质浓度的结果的尺寸和PDI(图47A)和z电势(图47B)的变化的图。由相同字母指示的值之间的差异是在统计学上显著的(P<0.05)。大写字母对应于PDI的显著性；

图48A-图48B是示出作为用于产生ASX PPI NP的不同H.p.油性树脂浓度的结果的尺寸和PDI(图48A)和z电势(图48B)的变化的图。由相同字母指示的值之间的差异是在统计学上显著的(P<0.05)。大写字母对应于PDI的显著性；

图49是用不同地处理的蛋白质产生的ASX SPI NP的外观的照片：H(加热)、N(未处理)、pH和pH+H(pH+加热)；

图50A-图50B是示出ASX SPI NP尺寸和PDI(图50A)和Z-电势(图50B)对不同蛋白质处理的依赖性的图；由相同字母指示的值之间的差异是在统计学上显著的(P<0.05)；

图51是用不同地处理的蛋白质产生的ASX PPI NP的外观的照片：H(加热)、N(未处理)、pH和pH+H(pH+加热)；

图52A-图52B是示出ASX PPI NP尺寸和PDI(图52A)和Z-电势(图52B)对不同蛋白质处理的依赖性的图；

图53是使用大米分离蛋白RPI作为稳定剂的ASX悬浮液的外观的照片；

图54是示出在体外模拟消化期间，ASX从ASX WPC NP、ASX SPI NP和ASX PPI NP中释放的图；

图55A-图55B是示出在胃期(gastric stage)期间ASX NP的团聚(图55A)和它们在肠期(intestinal stage)中的消失(图55B)的光学显微镜图像；

图56A-图56C是未包封的葵花油(图56A)、葵花油NP制品(50％w/w)(图56B)和葵花油NP制品(71％w/w)(图56B)的照片；以及

图57是示出用水解蛋白产生的NP的粒度分布的图。

发明详细描述

根据一些实施方案，本发明提供了包含至少一种化合物的颗粒，该至少一种化合物具有至少部分地包围该至少一种化合物的基于蛋白质的壳。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳至少部分地包围多于一种化合物。在一些实施方案中，颗粒包含至少部分地包围生物活性化合物的基于蛋白质的壳。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳至少部分地包围多于一种生物活性化合物。在一些实施方案中，根据本发明的颗粒包括包衣。在一些实施方案中，包衣包含多糖。在一些实施方案中，包衣包封带壳化合物。在一些实施方案中，包衣包封多于一种带壳化合物。在一些实施方案中，化合物是亲脂性化合物。在一些实施方案中，化合物是生物活性化合物。

根据一些实施方案，本发明提供了颗粒，其包含：(i)至少一种化合物，该至少一种化合物具有至少部分地包围该至少一种化合物的基于蛋白质的壳，以及(ii)包含多糖的包衣，包衣包封至少一种带壳化合物。

根据一些实施方案，本发明提供了包含至少一种化合物和至少一个基于蛋白质的壳的颗粒。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种化合物、至少一个基于蛋白质的壳和至少一种阳离子聚合物的颗粒。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种化合物、至少一个基于蛋白质的壳、至少一种阳离子聚合物和至少一个包衣的颗粒。在一些实施方案中，包衣包封至少一种化合物、至少一个基于蛋白质的壳和至少一种阳离子聚合物。在一些实施方案中，化合物是生物活性化合物。

颗粒

在一些实施方案中，本发明提供了具有以下直径的颗粒：约5nm至10000nm、5nm至9000nm、5nm至1000nm、5nm至900nm、5nm至700nm、5nm至500nm、5nm至300nm、10nm至10000nm、10nm至9000nm、10nm至1000nm、10nm至900nm、10nm至700nm、10nm至500nm、10nm至300nm、30nm至10000nm、30nm至9000nm、30nm至1000nm、30nm至900nm、30nm至700nm、30nm至500nm、30nm至300nm、50nm至5000nm、50nm至4000nm、50nm至3000nm、50nm至2000nm、50nm至1000nm、50nm至900nm、50nm至700nm、50nm至500nm或50nm至300nm，包括在其间的任何范围。

在一些实施方案中，本发明提供了具有以下直径的颗粒：约1μm至500μm、约1μm至500μm、约1μm至400μm、约1μm至300μm、约1μm至250μm、约1μm至200μm、约1μm至100μm、约1μm至50μm、约50μm至500μm、约100μm至500μm、约150μm至500μm或约50μm至300μm，包括在其间的任何范围。

在一些实施方案中，基于蛋白质的壳具有以下厚度：约1nm至30nm、约2nm至30nm、约3nm至30nm、约4nm至30nm、约5nm至30nm、约5nm至25nm、约5nm至20nm、约1nm至25nm、约1nm至20nm、约1nm至18nm或约1nm至15nm，包括在其间的任何范围。

在一些实施方案中，包衣具有约1nm至30nm的厚度。在一些实施方案中，包衣具有以下厚度：约2nm至30nm、约3nm至30nm、约4nm至30nm、约5nm至30nm、约5nm至25nm、约5nm至20nm、约1nm至25nm、约1nm至20nm、约1nm至18nm或约1nm至15nm，包括在其间的任何范围。

在一些实施方案中，化合物和基于蛋白质的壳具有约5nm至300nm的直径。在一些实施方案中，化合物和基于蛋白质的壳具有以下直径：约10nm至300nm、约20nm至280nm、约50nm至280nm、约50nm至250nm、约50nm至230nm、约50nm至200nm、约50nm至180nm、约50nm至160nm、约50nm至150nm、约50nm至130nm、约50nm至100nm、约70nm至200nm、约70nm至250nm、约100nm至250nm或约100nm至300nm，包括在其间的任何范围。

在一些实施方案中，部分地包围化合物的基于蛋白质的壳为化合物的总表面的至少85％。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳以生物活性化合物的总表面的至少87％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％(包括其间的任何值)部分地包围化合物。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳以化合物的总表面的约85％至100％部分地包围化合物。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳以化合物的总表面的约85％至99％、85％至98％、85％至95％、85％至90％、85％至89％或85％至70％(包括其间的任何范围)部分地包围化合物。在一些实施方案中，部分地包围化合物的基于蛋白质的壳为纳米颗粒的总质量的至少85％。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳以纳米颗粒的总质量的至少87％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％(包括其间的任何值)部分地包围化合物。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳以纳米颗粒的总质量的约85％至100％部分地包围化合物。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳以纳米颗粒的总质量的约85％至99％、85％至98％、85％至95％、85％至90％、85％至89％或85％至70％(包括其间的任何范围)部分地包围化合物。

在一些实施方案中，颗粒包含1％至80％(w/w)、1％至70％(w/w)、1％至60％(w/w)、1％至50％(w/w)、1％至40％(w/w)、2％至40％(w/w)、5％至40％(w/w)、10％至70％(w/w)、10％至40％(w/w)、15％至40％(w/w)、25％至40％(w/w)、1％至35％(w/w)、1％至25％(w/w)、1％至20％(w/w)、1％至15％(w/w)、1％至10％(w/w)、5％至70％(w/w)、5％至55％(w/w)、5％至35％(w/w)、5％至25％(w/w)、5％至20％(w/w)、5％至15％(w/w)或5％至10％(w/w)(包括其间的任何范围)的化合物。

在一些实施方案中，颗粒包含0.1％至99％(w/w)、0.1％至97％(w/w)、0.1％至95％(w/w)、0.1％至90％(w/w)、0.1％至50％(w/w)、0.1％至30％(w/w)、0.5％至30％(w/w)、0.9％至30％(w/w)、1％至99％(w/w)、1％至97％(w/w)、1％至95％(w/w)、1％至90％(w/w)、1％至50％(w/w)、1％至30％(w/w)、1％至20％(w/w)、1％至15％(w/w)、1％至10％(w/w)、0.1％至15％(w/w)、0.1％至10％(w/w)、5％至30％(w/w)、5％至25％(w/w)、5％至20％(w/w)、5％至15％(w/w)或5％至10％(w/w)(包括其间的任何范围)的基于蛋白质的壳。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳的含量取决于需要的包封化合物的最终浓度。如果需要低浓度的化合物，基于蛋白质的壳的含量可以增加至99.9％。

在一些实施方案中，化合物在颗粒中的浓度为约0.01mg/g至500mg/g。在一些实施方案中，化合物在颗粒中的浓度为约0.01mg/g至450mg/g、约0.01mg/g至400mg/g、约0.01mg/g至350mg/g、约0.01mg/g至300mg/g、约0.01mg/g至250mg/g、约0.01mg/g至200mg/g、0.01mg/g至180mg/g、约0.01mg/g至150mg/g、约0.01mg/g至100mg/g、约0.01mg/g至80mg/g、约0.01mg/g至50mg/g、约0.01mg/g至30mg/g、约0.01mg/g至20mg/g、约0.01mg/g至10mg/g、约0.5mg/g至200mg/g、约0.5mg/g至150mg/g、约0.05mg/g至50mg/g、约0.1mg/g至5mg/g、约0.5mg/g至5mg/g、约0.5mg/g至3mg/g、约1mg/g至100mg/g、约1mg/g至50mg/g、约1mg/g至30mg/g或约1mg/g至5mg/g，包括其间的任何范围。

在一些实施方案中，至少一种化合物可溶于有机溶剂。

在一些实施方案中，当在pH大于6的溶液中时，如本文描述的颗粒是稳定的。在一些实施方案中，当在pH大于6.5、大于6.7、大于7、大于7.5、大于8、大于8.5、大于9、大于9.5、大于10、大于10.5或大于11(包括其间的任何值)的溶液中时，如本文描述的颗粒是稳定的。

在一些实施方案中，化合物是生物活性化合物。在一些实施方案中，生物活性化合物是亲脂性化合物。在一些实施方案中，化合物是一种或更多种亲脂性化合物、挥发性有机化合物、香精、蛋白质、芳香剂、维生素、亲脂性代谢物、部分亲脂性代谢物或其任何组合。在一些实施方案中，化合物包括虾青素、姜黄素、ω3、咖啡因、β-胡萝卜素、鱼油、葵花油、植物甾醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、辅酶Q10、维生素D、大麻素(例如大麻二酚(CBD)、四氢大麻酚(THC))或其任何功能性衍生物或其任何组合。

如本文使用的，术语“亲脂性化合物”指的是这样的化合物和物质，该化合物和物质不溶于水并具有在非极性物质诸如脂质中溶解的能力。亲脂性物质的特征可以是对油或脂肪具有亲和力或是在有机溶剂中至少部分地可溶。

如本文使用的，术语“生物活性化合物”和“生物活性剂”可互换地使用，以指对人类或动物代谢具有有益效果的化合物。在一些实施方案中，生物活性化合物从植物、微生物、酵母或动物来源的产品开始获得、提取、富集或纯化。

如本文使用的，术语“获得的”指的是直接在商业上可得的生物活性产品。术语“提取的”指的是已经提取的生物活性组成部分(principle)。术语“富集的”指的是生物活性产品，其中非生物活性化合物已经被尽可能多地分离。术语“纯化的”指的是仅回收生物活性化合物的生物活性产品。

在一些实施方案中，生物活性化合物选自由以下组成的组：类胡萝卜素、大麻素、脂肪酸、多酚、亲脂性物质、维生素、亲脂性维生素、类黄酮、异黄酮、类姜黄素、神经酰胺、原花青素、萜类、甾醇、植物甾醇、多酚、精油、食用油和馏分、生育酚和生育三烯酚、亲脂性四吡咯、甾醇酯、鲨烯和类视黄醇、树胶脂或其任何组合。

在一些实施方案中，生物活性化合物是虾青素。在一些实施方案中，生物活性化合物是ω3。在一些实施方案中，生物活性化合物是姜黄素。在一些实施方案中，生物活性化合物是β-胡萝卜素。在一些实施方案中，生物活性化合物是墨角藻黄素。在一些实施方案中，生物活性化合物是亚麻籽油。在一些实施方案中，生物活性化合物是鱼油。在一些实施方案中，生物活性化合物是含有大麻二酚(CBD)的提取物。在一些实施方案中，生物活性化合物是儿茶素。

在一些实施方案中，如本文描述的颗粒和组合物在一些实施方案中包含大麻二酚(CBD)或其任何功能性衍生物(即具有类似、等同或增强的效力的CBD衍生物)。

根据一些实施方案，措辞“CBD或其任何功能性衍生物”指的是包含至少80％CBD或其任何功能性衍生物、至少90％CBD或其任何功能性衍生物、至少92％CBD或其任何功能性衍生物、至少95％CBD或其任何功能性衍生物、至少97％CBD或其任何功能性衍生物、或至少99％CBD或其任何功能性衍生物(包括其间的任何值)的化合物和/或组合物。在一些实施方案中，CBD或其任何功能性衍生物包括四氢大麻酚(THC)。

如本文使用的，术语“大麻素”包括天然存在的大麻素衍生物和非天然的大麻素衍生物，非天然的大麻素衍生物可以通过天然大麻素的衍生来获得。本发明的制剂中使用的大麻素是天然的、半合成的或合成的。大麻素以其游离形式或以盐的形式；酯的酸加成盐；酰胺；对映异构体；异构体；互变异构体；前药；本发明的活性剂的衍生物；不同的异构形式(例如，对映异构体和非对映异构体)，以纯的形式和以混合物(包括外消旋混合物)两者；烯醇形式被包括。术语“大麻素”还意在涵盖由另一种类似结构的化合物通过替代(例如使一个原子、分子或基团被另一个原子、分子或基团取代)而产生的衍生物，诸如11-羟基-δ-8-四氢大麻酚和11-羟基-δ-9-四氢大麻酚。如本发明中使用的术语“大麻素”还包括δ-8-四氢大麻酚、δ-9-四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚、大麻萜酚、大麻隆(nabilone)、δ-9-四氢大麻酚酸(delta-9-tetrahydro cannabinolic acid)、非精神性大麻素3-二甲基庚基-11-甲酸同系物8。(J.Med.Chem.35,3135,1992，通过引用以其整体并入本文)。术语大麻素还包括大麻素的前药，以及大麻素的药学上可接受的盐和复合物。合适的前药的实例是THC-半琥珀酸酯。术语“大麻素”还意在涵盖已经被纯化或修饰的天然大麻素和合成来源的大麻素。

在一种实施方案中，如本文描述的颗粒或组合物包含CBD提取物。在一种实施方案中，如本文描述的颗粒或组合物包含CBD油性树脂。在一种实施方案中，如本文描述的颗粒或组合物包含植物材料。在一种实施方案中，如本文描述的组合物包含富含CBD的植物材料。

如本文使用的，术语“植物材料”指的是含有主要药物活性成分的整株植物、植物提取物及其部分，例如植物的地上部分或分离的叶、茎、头状花序(flowering head)、果实或根。

在一种实施方案中，植物材料指的是已知含有大麻素的任何植物材料。在一种实施方案中，植物材料来源于一种或更多种大麻属植物。

术语“大麻属植物”涵盖野生型大麻(Cannabis sativa)及其变种，包括天然地含有不同量的单独的大麻素的大麻属化学变型，包括变种var.indica和var.kafiristanica的印度大麻亚种(Cannabis sativa subspecies indica)，印度大麻(Cannabis indica)以及作为遗传杂交(genetic cross)、自交(self-cross)或其杂交体的结果的植物。术语“大麻属植物材料”应相应地解释为涵盖源自一种或更多种大麻属植物的植物材料。为避免疑问，在此阐明“大麻属植物材料”包括干燥的大麻属生物质。

在本发明的组合物和方法的情况下使用的虾青素的非限制性实例包括虾青素的游离形式、反式虾青素、9-顺式-虾青素异构形式和13-顺式-虾青素异构形式、虾青素脂肪酸单酯和虾青素脂肪酸二酯。除非另外说明，否则这些组分在本文中统称为“虾青素”。虾青素脂肪酸酯中的脂肪酸的实例包括月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、反油酸、蓖麻油酸、岩芹酸、反型异油酸(vaccenic acid)、桐酸、石榴酸、十八碳-9,11,13-三烯-4-酮酸(licanic acid)、十八碳四烯酸(parinaric acid)、顺式-9-二十碳烯酸(gadoleic acid)、5-二十碳烯酸、5-二十二碳烯酸、鲸蜡烯酸、芥酸、5,13-二十二碳二烯酸(5,13-docosadienoic acid)、鲨油酸、癸烯酸、十二碳烯酸、油酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸。

在一些实施方案中，本发明的虾青素是合成产生的。在一些实施方案中，本发明的虾青素是天然虾青素。在一些实施方案中，本发明的虾青素是从微生植物(microscopicplant)中获得的。在另一种实施方案中，植物是微藻雨生红球藻(micro-algaHaematococcus pluvialis)。在一些实施方案中，本发明的虾青素是合成产生的虾青素和天然虾青素的混合物。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

在一些实施方案中，基于蛋白质的壳包含乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、胶原或其任何组合。

在一些实施方案中，基于蛋白质的壳包含蛋白质。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳包含乳清蛋白。在一些实施方案中，基于蛋白质的壳包含胶原。

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，以指氨基酸残基的聚合物。如本文使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”涵盖天然肽、模拟肽(通常包括非肽键或其他合成修饰物)以及肽类似物、类肽和半类肽或其任何组合。在另一种实施方案中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”适用于其中至少一个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。

在一些实施方案中，本文描述的蛋白质提取物的多肽选自但不限于动物蛋白、植物蛋白或藻类蛋白。在一些实施方案中，本文描述的蛋白质提取物的多肽选自：纯化的蛋白质、浓缩的蛋白质、分离的蛋白质级分、蛋白质水解产物或其任何组合。

如本文使用的，术语“蛋白质水解产物”包括通过使用蛋白水解酶制品、含有合适的蛋白水解活性的微生物或酸水解或其任何组合来制备的并且具有血脂概况改善效果的所有的蛋白质水解产物。可以使用商业上可得的水解产物，或者可以制备水解产物。在一些实施方案中，水解产物具有300Da-100000Da的分子量。在一些实施方案中，水解产物具有500Da-50000Da的分子量。在一些实施方案中，水解产物具有500Da-30000 Da的分子量。在一些实施方案中，水解产物仅微溶于水。

植物蛋白、动物蛋白或微生物蛋白和/或它们的混合物可以用作水解产物的蛋白质来源。在一些实施方案中，蛋白质是植物来源的。在一些实施方案中，蛋白质是谷物来源的或豆类来源的。合适的植物蛋白来源是例如大豆蛋白、小麦蛋白、小麦谷蛋白、玉米蛋白、燕麦蛋白、黑麦蛋白、大米蛋白、油菜籽蛋白或卡诺拉蛋白(canola protein)、大麦蛋白、亚麻籽蛋白、马铃薯蛋白、豌豆蛋白、羽扇豆蛋白、葵花蛋白、大麻蛋白、蚕豆蛋白和荞麦蛋白。

在一些实施方案中，蛋白质是动物来源的。合适的动物蛋白来源是例如乳蛋白，诸如酪蛋白和乳清蛋白以及它们的级分(fraction)、卵蛋白、胶原和明胶。在一些实施方案中，蛋白质可以以不同的商业上可得的纯化形式或非纯化形式被用作水解产物的来源。在一些实施方案中，含有这些蛋白质和其他主要成分诸如碳水化合物的材料被用作水解产物的来源。

在一些实施方案中，蛋白质提取物是植物蛋白。在一些实施方案中，植物蛋白从以下、但不限于以下中提取：马铃薯、豌豆、大豆、鹰嘴豆、藜麦、小麦、兵豆、蚕豆或菜豆(bean)。在一些实施方案中，植物蛋白是从马铃薯中提取的。在一些实施方案中，植物蛋白是从豌豆中提取的。在一些实施方案中，植物蛋白是从鹰嘴豆中提取的。

在一些实施方案中，蛋白质提取物是动物蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是从但不限于哺乳动物、鸟或昆虫中提取的。在一些实施方案中，蛋白质选自卵蛋白或乳清蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是乳清蛋白。

如本文使用的，术语“乳清蛋白”指的是乳制品来源的产品，其来自如在制作奶酪的工艺中从凝乳中分离的乳的水性部分，其是在除去乳脂、酪蛋白和白蛋白之后剩余的。在一些实施方案中，“乳清蛋白”指的是包含至少80％的乳清蛋白的产品。在一些实施方案中，“乳清蛋白”指的是包含至少85％的乳清蛋白的产品。在一些实施方案中，“乳清蛋白”指的是包含至少90％的乳清蛋白的产品。

如本文使用的，术语“多糖”指的是由许多经由糖苷键连接的较小单糖制成的大分子。特异性的酶将这些小单体结合在一起，产生大的糖聚合物或多糖。多糖也被称为聚糖。多糖可以是所有单糖都相同的同多糖，或者是单糖不同的杂多糖。具有单糖的直链的分子被称为线性多糖，而具有臂并转动的链被称为支链多糖。在一些实施方案中，术语多糖指的是树胶、右旋糖酐、纤维素和杂多糖及其衍生物、其水解产物、其交联产物及其组合。在一些实施方案中，多糖是麦芽糖糊精。

如本文使用的，术语“麦芽糖糊精”指的是具有小于20的右旋糖当量(DE)的葡萄糖聚合物。在一些实施方案中，麦芽糖糊精具有小于或等于10的DE。在一些实施方案中，麦芽糖糊精具有小于5的DE。术语“右旋糖当量”指的是淀粉水解产物的还原能力(或还原糖含量)，计算为以干重计的右旋糖(右旋糖或葡萄糖具有DE＝100)。具有高DE的麦芽糖糊精相比于具有低DE的麦芽糖糊精具有较低的分子量(被更高度地转化)，麦芽糖糊精可以由任何合适的可食用淀粉制成，可食用淀粉例如来自玉米、大米、小麦、甜菜、马铃薯、木薯和高粱的淀粉。

麦芽糖糊精通常通过以下产生：用热稳定的α-淀粉酶在85℃-90℃的温度使淀粉浆料水解，直到达到期望的水解度，并且然后通过第二热处理使α-淀粉酶失活。麦芽糖糊精可以通过过滤纯化，并且然后喷雾干燥成最终产品。麦芽糖糊精典型地通过以下表征：其右旋糖当量(DE)值，该右旋糖当量(DE)值与水解度有关，定义为：DE＝MW右旋糖/数均MW淀粉水解产物×100。通常，麦芽糖糊精被认为具有小于直链淀粉分子的分子量。

在一些实施方案中，颗粒还包含与基于蛋白质的壳的至少一部分相互作用的阳离子聚合物。在一些实施方案中，相互作用是静电相互作用。

如本文使用的，术语“阳离子聚合物”指的是天然来源和合成来源的阳离子聚合物。

在一些实施方案中，阳离子聚合物包括阳离子多糖。

如本文使用的，术语“阳离子多糖”指的是基于5个或6个碳的糖及其衍生物的聚合物，其通过在多糖主链上接入阳离子部分而成为阳离子型。它们可以包括一种类型的糖或多于一种类型的糖，即上述衍生物和阳离子材料的共聚物。单体可以呈直链或支链几何排布。阳离子多糖聚合物的非限制性实例包括以下：阳离子纤维素和羟乙基纤维素；阳离子型淀粉和羟烷基淀粉；基于阿拉伯糖单体的阳离子聚合物，诸如可以衍生自阿拉伯糖植物胶的那些；衍生自在诸如木材、秸秆、棉籽壳(cottonseed hull)和玉米芯的材料中发现的木糖聚合物的阳离子聚合物；衍生自作为海藻细胞壁组分发现的岩藻糖聚合物的阳离子聚合物；衍生自果糖聚合物诸如在某些植物中发现的菊粉的阳离子聚合物；基于含酸糖诸如半乳糖醛酸和葡糖醛酸的阳离子聚合物；基于胺糖(amine sugar)诸如半乳糖胺和葡糖胺的阳离子聚合物；基于5元环多元醇和6元环多元醇的阳离子聚合物；基于半乳糖单体的阳离子聚合物，该半乳糖单体存在于植物胶和植物黏液中；基于甘露糖单体的阳离子聚合物，该甘露糖单体诸如在植物、酵母和红藻中发现的那些；基于半乳甘露聚糖共聚物的阳离子聚合物，该半乳甘露聚糖共聚物作为从瓜尔豆的胚乳中获得的瓜尔胶是已知的。

在一些实施方案中，阳离子聚合物包括脱乙酰壳多糖。

如本文使用的，术语“脱乙酰壳多糖”指的是衍生自甲壳质(聚-N-乙酰基-D-葡糖胺)的天然来源的聚合物，其中N的乙酰基基团的重要部分已经通过水解被消除。在一些实施方案中，脱乙酰度大于40％。在一些实施方案中，脱乙酰度大于60％。在一些实施方案中，脱乙酰度在60％至98％的范围内。脱乙酰壳多糖具有氨基-多糖结构和阳离子特性。

在一些实施方案中，在本发明中使用的脱乙酰壳多糖的特征在于具有低的分子量。在一些实施方案中，诸如上文描述的脱乙酰壳多糖或其衍生物具有小于90kDa的分子量。在一些实施方案中，脱乙酰壳多糖具有在1kDa至90kDa的范围内的分子量。在一些实施方案中，脱乙酰壳多糖具有在1kDa至75kDa的范围内的分子量。在一些实施方案中，脱乙酰壳多糖具有在2kDa至50kDa的范围内的分子量。在一些实施方案中，脱乙酰壳多糖具有在2kDa至30kDa的范围内的分子量。在一些实施方案中，脱乙酰壳多糖具有在2kDa至15kDa的范围内的分子量。具有该分子量的脱乙酰壳多糖通过本领域技术人员熟知的方法获得，该方法诸如使用不同比例的NaNO₂进行的脱乙酰壳多糖聚合物的氧化还原。

在一些实施方案中，在本发明中使用脱乙酰壳多糖的替代物或其衍生物。在一些实施方案中，脱乙酰壳多糖具有小于90kDa的分子量，其中一个或更多个羟基基团和/或一个或更多个胺基团已经被修饰，目的是增加脱乙酰壳多糖的溶解度或增加其粘合性质。这些衍生物包括尤其是乙酰化的脱乙酰壳多糖、烷基化的脱乙酰壳多糖或磺化的脱乙酰壳多糖、硫醇化的衍生物。

在一些实施方案中，脱乙酰壳多糖衍生物选自O-烷基醚、O-酰基酯、三甲基脱乙酰壳多糖或用聚乙二醇修饰的脱乙酰壳多糖。其他可能的衍生物是盐诸如柠檬酸盐、硝酸盐、乳酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐等。在任何情况下，本领域技术人员知道如何鉴定可以对脱乙酰壳多糖进行而不影响制剂的稳定性和商业可行性的修饰。

在一些实施方案中，阳离子聚合物经由静电相互作用与基于蛋白质的壳的至少一部分相互作用。

在一些实施方案中，还包含与基于蛋白质的壳的至少一部分相互作用的阳离子聚合物的颗粒具有约50nm至300nm的直径。在一些实施方案中，还包含与基于蛋白质的壳的至少一部分相互作用的阳离子聚合物的颗粒具有以下的直径：约50nm至250nm、50nm至230nm、约50nm至200nm、约50nm至180nm、约50nm至160nm、约50nm至150nm、约50nm至130nm、约50nm至100nm、约70nm至200nm、约70nm至250nm、约100nm至250nm，包括在其间的任何范围。

在一些实施方案中，当在pH在1至5.5的范围内的溶液中时，如本文描述的颗粒是稳定的。在一些实施方案中，当在pH在1至5.5、1至3、1至2.5或1至3.5的范围内(包括其间的任何范围)的溶液中时，如本文描述的颗粒是稳定的。

组合物

根据一些实施方案，本发明提供了包含如本文别处描述的多个颗粒的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含多个颗粒的组合物，该多个颗粒包含(i)至少一种化合物，该至少一种化合物具有至少部分地包围该至少一种化合物的基于蛋白质的壳，和(ii)包含多糖的包衣，包衣包封至少一种带壳化合物。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物是可食用组合物。在一些实施方案中，组合物是化妆品组合物。在一些实施方案中，如本文描述的组合物是膳食补充剂组合物。在一些实施方案中，如本文描述的组合物是药物组合物。在一些实施方案中，如本文描述的组合物是农用化学组合物。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物呈粉末的形式。在一些实施方案中，如本文描述的组合物呈粒剂的形式。在一些实施方案中，如本文描述的组合物呈团聚物的形式。在一些实施方案中，组合物呈高度水溶性或可分散性组合物的形式。在一些实施方案中，粉末在环境温度可溶于水或可分散于水。

在一些实施方案中，如本文描述的粉末在环境温度是稳定的。在一些实施方案中，如本文描述的粉末在25℃至40℃是稳定的。在一些实施方案中，如本文描述的粉末在25℃至40℃、25℃至37℃、25℃至35℃、25℃至32℃或25℃至30℃(包括其间的任何范围)是稳定的。

在一些实施方案中，组合物包含1％至80％(w/w)、1％至70％(w/w)、1％至60％(w/w)、1％至50％(w/w)、1％至40％(w/w)、2％至40％(w/w)、5％至40％(w/w)、10％至70％(w/w)、10％至40％(w/w)、15％至40％(w/w)、25％至40％(w/w)、1％至35％(w/w)、1％至25％(w/w)、1％至20％(w/w)、1％至15％(w/w)、1％至10％(w/w)、5％至70％(w/w)、5％至55％(w/w)、5％至40％(w/w)、5％至35％(w/w)、5％至25％(w/w)、5％至20％(w/w)、5％至15％(w/w)或5％至10％(w/w)(包括其间的任何范围)的至少一种化合物。

在一些实施方案中，粉末具有0.5mg/g至500mg/g的含量的至少一种化合物。在一些实施方案中，粉末具有以下含量的至少一种化合物：0.5mg/g至450mg/g、0.5mg/g至400mg/g、0.5mg/g至350mg/g、0.5mg/g至300mg/g、0.5mg/g至250mg/g、0.5mg/g至200mg/g、0.5mg/g至150mg/g、0.5mg/g至100mg/g、0.5mg/g至50mg/g、0.5mg/g至30mg/g、0.5mg/g至20mg/g、0.5mg/g至10mg/g、0.5mg/g至5mg/g、0.5mg/g至15mg/g、0.5mg/g至8mg/g、0.5mg/g至7mg/g、0.5mg/g至5mg/g、0.5mg/g至3mg/g、0.5mg/g至2mg/g、0.5mg/g至1.5mg/g、0.5mg/g至1mg/g、0.8mg/g至2mg/g、1mg/g至5mg/g、1mg/g至10mg/g、1mg/g至20mg/g、1mg/g至50mg/g、1mg/g至100mg/g、1mg/g至250mg/g或1mg/g至3mg/g，包括其间的任何范围。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物中至少80％的颗粒具有在5nm至300nm的范围内的直径。在一些实施方案中，如本文描述的组合物中至少80％、至少85％、至少89％、至少90％、至少95％的颗粒具有在5nm至300nm的范围内的直径。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物的颗粒当重新分散在水中时具有在5nm至300nm的范围内的直径。在一些实施方案中，如本文描述的组合物的颗粒当重新分散在水中时具有以下直径：约5nm至280nm、约5nm至250nm、约5nm至230nm、约5nm至200nm、约5nm至180nm、约5nm至160nm、约5nm至150nm、约5nm至130nm、约5nm至100nm、约15nm至280nm、约15nm至250nm、约15nm至230nm、约15nm至200nm、约15nm至180nm、约15nm至160nm、约15nm至150nm、约15nm至130nm、约15nm至100nm、约50nm至280nm、约50nm至250nm、约50nm至230nm、约50nm至200nm、约50nm至180nm、约50nm至160nm、约50nm至150nm、约50nm至130nm、约50nm至100nm、约70nm至200nm、约70nm至250nm、约100nm至250nm或约100nm至300nm，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，颗粒呈粉末或粒剂的形式。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约0.05至0.7的范围内的多分散性指数。在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约0.05至0.5、0.05至0.3、约0.05至0.25、约0.08至0.3、约0.1至0.3、约0.12至0.3或约0.15至0.3的范围内(包括其间的任何范围)的多分散性指数。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约-50mV至-10mV的范围内的ζ电势。在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约-35mV至-10mV、约-34mV至-10mV、约-33mV至-10mV、约-50mV至0mV、约-50mV至-5mV、约-35mV至-5mV或约-35mV至0mV的范围内(包括其间的任何范围)的ζ电势。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有抗氧化活性。在一些实施方案中，如本文描述的组合物增加化合物的抗氧化活性。在一些实施方案中，化合物是生物活性化合物。在一些实施方案中，如本文描述的包含包封的化合物的组合物具有比未包封的化合物高1倍至100倍的抗氧化活性。在一些实施方案中，如本文描述的包含包封的化合物的组合物具有比未包封的化合物高1倍至90倍、1倍至80倍、1倍至70倍、1倍至60倍、1倍至50倍、1倍至40倍、1倍至30倍、1倍至20倍、1倍至15倍、1倍至10倍、1倍至9倍、1倍至8倍、1倍至7倍、1倍至6倍或1倍至5倍(包括其间的任何范围)的抗氧化活性。

根据一些实施方案，本发明提供了包含如本文别处描述的多个颗粒的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含多个颗粒的组合物，该多个颗粒包含(i)至少一种化合物，该至少一种化合物具有至少部分地包围该至少一种化合物的基于蛋白质的壳；和(ii)包含多糖的包衣，该包衣包封至少一种带壳化合物；以及与基于蛋白质的壳的至少一部分相互作用的阳离子聚合物。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物中至少80％的颗粒具有在50nm至250nm的范围内的直径。在一些实施方案中，如本文描述的组合物中至少80％、至少85％、至少89％、至少90％、至少95％的颗粒具有在50nm至250nm的范围内的直径。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物的颗粒具有在50nm至250nm的范围内的直径。在一些实施方案中，如本文描述的组合物的颗粒具有约50nm至230nm、约50nm至200nm、约50nm至180nm、约50nm至160nm、约50nm至150nm、约50nm至130nm、约50nm至100nm、约70nm至200nm、约70nm至250nm或约100nm至250nm(包括其间的任何范围)的直径。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约0.05至0.7的范围内的多分散性指数。在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约0.05至0.5、0.05至0.3、约0.05至0.25、约0.08至0.3、约0.1至0.3、约0.12至0.3或约0.15至0.3的范围内(包括其间的任何范围)的多分散性指数。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约0mV至100mV的范围内的ζ电势。在一些实施方案中，如本文别处描述的组合物具有在约0mV至80mV、约0mV至70mV、约0mV至60mV、约0mV至50mV、约0mV至45mV或约0mV至40mV的范围内(包括其间的任何范围)的ζ电势。

如本文使用的，术语“ζ电势”指的是胶体体系中关于电动电势的科学术语。在胶体化学文献中，它通常使用希腊字母ζ来表示，因此为ζ电势。ζ电势是颗粒之间排斥或吸引的大小的量度。ζ电势是胶体颗粒之间相互作用的大小的指标，并且ζ电势的测量用于评估胶体体系的稳定性。

在含水介质中，样品的pH影响其ζ电势。例如，如果向具有负ζ电势的悬浮液中添加碱，则颗粒倾向于获取更多的负电荷。如果向悬浮液中添加足够的酸，那么将达到电荷将被中和的点。进一步添加酸将导致正电荷的积聚。

在一些实施方案中，如本文描述的组合物在25℃具有ζ电势。在一些实施方案中，如本文描述的组合物具有在约0.5mV至100mV或约-0.5mV至-100mV的范围内的ζ电势。在一些实施方案中，ζ电势在约1mV至60mV或约-1mV至-60mV、约14mV至50mV或约-14mV至-50mV、约30mV至50mV或约-30mV至-50mV的范围内。在一些实施方案中，ζ电势在约0.5mV至100mV或约-0.5mV至-100mV、约1mV至60mV或约-1mV至-60mV、约14mV至50mV或约-14mV至-50mV、约30mV至50mV或约-30mV至-50mV的范围内，包括其间的任何范围。

在一些实施方案中，化合物在生理条件下在肠期从颗粒中释放。在一些实施方案中，20％至90％的化合物在生理条件下在肠期释放。在一些实施方案中，20％至85％、20％至60％、30％至90％、40％至90％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至70％、55％至90％、60％至90％或55％至85％(包括其间的任何范围)的化合物在生理条件下在肠期释放。在一些实施方案中，生物活性化合物在生理条件下在肠期从颗粒中释放。在一些实施方案中，20％至90％的生物活性化合物在生理条件下在肠期释放。在一些实施方案中，20％至85％、20％至60％、30％至90％、40％至90％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至70％、55％至90％、60％至90％或55％至85％(包括其间的任何范围)的生物活性化合物在生理条件下在肠期释放。

在一些实施方案中，组合物是抗胃(gastro-resistant)组合物。在一些实施方案中，颗粒是抗胃颗粒。

如本文使用的，术语“颗粒”指的是纳米级颗粒和微米级颗粒两者，并且除非另有说明，通常与术语“纳米颗粒”同义。

在一些实施方案中，如本文描述的纳米颗粒是纳米级的。在一些实施方案中，纳米级纳米颗粒在至少一个可测量的维度上测量为在1纳米和1000纳米之间。在一些实施方案中，纳米颗粒可以在至少一个可测量的维度上测量为大于20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm或240nm。在一些实施方案中，纳米颗粒可以在至少一个可测量的维度上测量为小于250nm、240nm、230nm、220nm、210nm、200nm、190nm、180nm、170nm、160nm、150nm、140nm、130nm、120nm、110nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm或40nm。在一些实施方案中，纳米颗粒具有多种形状，包括杆状、球状和片状。

在一些实施方案中，颗粒直径是平均颗粒直径。在一些实施方案中，粒度是平均粒度。在一些实施方案中，粒度和颗粒直径指的是Z-平均值。术语“平均粒度”指的是长度维度，其在本文中被指定为Z-平均值，并且如本文使用指的是通过动态光散射(DLS)测量的颗粒的全体集合的强度加权平均流体力学尺寸。Z平均值是由所测量的自相关曲线的累积量分析导出的，其中假定单一粒度，并且将单指数拟合应用于自相关函数。在一些实施方案中，通过数目％来分析直径，此时重要的是知道颗粒的准确尺寸，而不受以低百分比存在于样品中的较大颗粒的信号的影响。

在一些实施方案中，颗粒指的是不连续相的乳液颗粒。在一些实施方案中，颗粒增加掺入的生物活性剂的生物利用度。在一些实施方案中，生物活性剂是亲脂性剂。在一些实施方案中，由于颗粒的相对大的表面积和生物活性化合物的有效包封，该颗粒增加生理靶位点处掺入的生物活性剂的生物利用度。根据本发明可以被包封的生物活性剂包括药物组合物或化合物、化妆品制剂、营养组合物或化合物、营养组分或生物活性组分。

在一些实施方案中，本发明提供了包含化合物的组合物，该组合物相比于当单独提供该化合物时具有更好的生物利用度。在一些实施方案中，本发明提供包含生物活性化合物的组合物，该组合物相比于单独提供该化合物时具有更好的生物利用度。

方法

根据一些实施方案，本发明提供用于包封化合物的方法。在一些实施方案中，化合物是生物活性化合物。在一些实施方案中，本发明提供用于包封化合物的方法，该方法包括以下步骤：a)将化合物和溶剂混合；b)将化合物和溶剂与蛋白质或多糖或两者混合，从而获得纳米乳液；c)蒸发溶剂，从而获得颗粒；以及d)将具有蛋白质、多糖或其混合物的颗粒干燥，从而包封化合物。在一些实施方案中，颗粒是纳米颗粒。

在一些实施方案中，本发明提供用于包封化合物的方法，该方法包括以下步骤：a)将化合物和溶剂混合，b)将化合物和溶剂与蛋白质或多糖或两者混合，从而获得纳米乳液，c)蒸发溶剂，从而获得纳米颗粒，以及d)将具有蛋白质、多糖或其混合物的纳米颗粒干燥，从而包封化合物。

在一些实施方案中，方法包括在干燥之前添加阳离子聚合物的步骤。

在一些实施方案中，化合物是一种或更多种亲脂性化合物、挥发性有机化合物、香精、蛋白质、芳香剂、维生素、亲脂性代谢物、部分亲脂性代谢物或其任何组合。在一些实施方案中，化合物包括虾青素、姜黄素、ω3、咖啡因、β-胡萝卜素、鱼油、植物甾醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、辅酶Q10或其任何组合。

在一些实施方案中，干燥是颗粒的喷雾干燥、粒化、团聚或其任何组合。

在一些实施方案中，化合物处于悬浮液中。在一些实施方案中，化合物为溶剂中的悬浮液。

在一些实施方案中，溶剂具有在35℃至80℃的范围内的沸点。在一些实施方案中，溶剂具有在35℃至79℃、35℃至78℃、37℃至80℃、38℃至80℃或38℃至78℃的范围内(包括其间的任何范围)的沸点。在一些实施方案中，溶剂包括乙酸乙酯。在一些实施方案中，溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、戊烷、氯仿、1,4-二氧六环、苯、甲苯、正戊烷、正己烷、环己烷或其任何组合。

在一些实施方案中，化合物和蛋白质以4:1至1:50(w/w)的比使用。在一些实施方案中，生物活性化合物和蛋白质以3:1至1:50(w/w)、2:1至1:50(w/w)、1:1至1:50(w/w)、4:1至1:40(w/w)、4:1至1:35(w/w)、4:1至1:30(w/w)、4:1至1:25(w/w)、4:1至1:20(w/w)、4:1至1:10(w/w)、2:1至1:40(w/w)、2:1至1:35(w/w)、2:1至1:30(w/w)、2:1至1:25(w/w)、2:1至1:20(w/w)、2:1至1:10(w/w)、1:0.1至1:5(w/w)、1:0.1至1:4(w/w)、1:0.1至1:3(w/w)、1:0.1至1:2(w/w)、0.1:0.1至0.1:10(w/w)、0.5:0.1至0.5:10(w/w)、0.5:0.1至1:10(w/w)、0.1:0.8至0.1:10(w/w)、0.1:0.9至0.1:10(w/w)、0.1:1至0.1:10(w/w)、0.1:0.8至0.1:9(w/w)、0.1:0.8至0.1:8(w/w)、0.1:0.8至0.1:7(w/w)、0.1:0.8至0.1:6(w/w)、0.1:0.8至0.1:5(w/w)或0.1:0.8至0.1:4(w/w)(包括其间的任何范围)的比使用。

在一些实施方案中，蛋白质在溶液中。在一些实施方案中，蛋白质在水溶液中。在一些实施方案中，水溶液中蛋白质的浓度为0.5％至25％(w/w)。在一些实施方案中，水溶液中蛋白质的浓度为1％至25％(w/w)、0.5％至23％(w/w)、0.5％至20％(w/w)、0.5％至19％(w/w)、0.5％至17％(w/w)、0.5％至15％(w/w)、0.5％至14％(w/w)、0.5％至13％(w/w)、0.5％至12％(w/w)、0.5％至11％(w/w)或0.5％至10％(w/w)，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，蛋白质浓度取决于需要的包封的化合物的最终浓度。如果需要低浓度的化合物，则基于蛋白质的壳的浓度可以增加多至99.9％(w/w)。

在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用超声发生器(ultra-sonicator)进行。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用超声发生器进行持续5秒至30分钟。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用超声发生器进行持续10秒至30分钟、20秒至30分钟、50秒至30分钟、5秒至10分钟、5秒至20分钟、1分钟至25分钟、1分钟至20分钟、1分钟至15分钟、1分钟至10分钟或1分钟至5分钟，包括其间的任何范围。

在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用高剪切均化器进行。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用高剪切均化器以17500rpm至24000rpm进行。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用高剪切均化器进行持续5分钟至30分钟。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用高剪切均化器进行持续5分钟至20分钟、5分钟至25分钟、5分钟至20分钟、5分钟至15分钟、1分钟至10分钟或1分钟至5分钟，包括其间的任何范围。

在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用高剪切均化器和超声发生器的组合进行。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用微流体混合器进行。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用压力高达3000巴的微流体混合器进行。在一些实施方案中，将化合物和溶剂与蛋白质混合使用膜乳化进行。

在一些实施方案中，方法包括添加阳离子聚合物的步骤。在一些实施方案中，方法包括在干燥之前添加阳离子聚合物的步骤。在一些实施方案中，方法包括在步骤b)之后添加阳离子聚合物的步骤。在一些实施方案中，方法包括在步骤b)之后和在步骤c)之前添加阳离子聚合物的步骤。在一些实施方案中，方法包括向纳米乳液中添加阳离子聚合物的步骤。在一些实施方案中，方法包括在步骤c)之后添加阳离子聚合物的步骤。在一些实施方案中，方法包括在蒸发溶剂之后添加阳离子聚合物的步骤。在一些实施方案中，阳离子聚合物包括脱乙酰壳多糖。

在一些实施方案中，蒸发溶剂使用氮气流、黑暗中的氮气流、蒸发器、旋转蒸发器诸如循环蒸发器、降膜蒸发器、升膜蒸发器、升膜和降膜板式蒸发器、多效蒸发器、搅拌薄膜蒸发器、空气流或其任何组合进行。

在一些实施方案中，可以使用闭环喷雾干燥系统或能够使溶剂冷凝的类似仪器而跳过步骤c)。

在一些实施方案中，方法包括使颗粒粒化或团聚的步骤。在一些实施方案中，进行使颗粒溶液粒化或团聚的步骤而不是喷雾干燥。在一些实施方案中，使颗粒团聚的步骤在喷雾干燥之后进行。在一些实施方案中，通过湿法制粒工艺获得粒剂。在一些实施方案中，在步骤c)之后通过湿法制粒工艺获得粒剂。在一些实施方案中，通过使用闭环仪器通过湿法制粒工艺获得粒剂。如本文使用的，“湿法制粒”指的是本领域已知的任何合适的湿法制粒工艺。在一些实施方案中，湿法制粒工艺选自由以下组成的组：流化床制粒、混合制粒、挤出机制粒、圆盘制粒和滚筒制粒。

在一些实施方案中，本发明的方法具有60％至95％的包封产率。在一些实施方案中，本发明的方法具有65％至95％、60％至90％、70％至90％、70％至85％、75％至80％或75％至90％(包括其间的任何范围)的包封产率。

在一些实施方案中，本发明的方法具有80％至100％的包封效率。在一些实施方案中，本发明的方法具有81％至100％、82％至100％、85％至100％、87％至100％、89％至100％、90％至100％、80％至95％或80％至90％(包括其间的任何范围)的包封效率。

在一些实施方案中，化合物在颗粒中的浓度为约0.01mg/g至500mg/g。在一些实施方案中，化合物在颗粒中的浓度为约0.01mg/g至450mg/g、约0.01mg/g至400mg/g、约0.01mg/g至350mg/g、约0.01mg/g至300mg/g、约0.01mg/g至250mg/g、约0.01mg/g至200mg/g、0.01mg/g至180mg/g、约0.01mg/g至150mg/g、约0.01mg/g至100mg/g、约0.01mg/g至80mg/g、约0.01mg/g至50mg/g、约0.01mg/g至30mg/g、约0.01mg/g至20mg/g、约0.01mg/g至10mg/g、约0.5mg/g至200mg/g、约0.5mg/g至150mg/g、约0.05mg/g至50mg/g、约0.1mg/g至5mg/g、约0.5mg/g至5mg/g、约0.5mg/g至3mg/g、约1mg/g至100mg/g、约1mg/g至50mg/g、约1mg/g至30mg/g或约1mg/g至5mg/g，包括其间的任何范围。

在一些实施方案中，方法包括喷雾干燥具有蛋白质的颗粒溶液的步骤。在一些实施方案中，方法包括喷雾干燥具有多糖的颗粒的步骤。在一些实施方案中，方法包括喷雾干燥具有包括麦芽糖糊精的多糖的颗粒的步骤。

在一些实施方案中，方法包括喷雾干燥具有从1％至60％(w/w)浓度的多糖的颗粒的步骤。

在一些实施方案中，方法包括喷雾干燥具有以下浓度的多糖的颗粒的步骤：从1％至50％(w/w)、1％至40％(w/w)、1％至30％(w/w)、1％至20％(w/w)、1％至10％(w/w)、1％至9％(w/w)、1％至8％(w/w)、1％至7％(w/w)或1％至6％(w/w)，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，颗粒是纳米颗粒。

根据一些实施方案，本发明提供了用于在施用时增加受试者对化合物的生物利用度的方法。根据一些实施方案，本发明提供了用于在施用时增加受试者对亲脂性生物活性化合物的生物利用度的方法。

如本文使用的，术语“喷雾干燥”指的是通过用热气体快速干燥而由液体或浆料产生干燥粉末的方法。这种方法用于干燥许多热敏材料，诸如食品和药物。空气是加热的干燥介质；然而，如果液体是易燃溶剂诸如乙醇，或者产品是氧敏感的，则使用氮气。所有喷雾干燥器使用某种类型的雾化器或喷雾喷嘴以将液体或浆料分散成受控的液滴尺寸的喷雾。这些之中最常见的是转盘和单流体高压旋流喷嘴。已知雾化器轮提供较宽的粒度分布，但两种方法均允许一致的粒度分布。可选择地，对于一些应用，使用双流体喷嘴或超声喷嘴。取决于工艺需求，在适当选择的情况下可以实现从5μm至500μm的液滴尺寸。最常见的应用是在100μm至200μm的直径范围内。干燥粉末通常是自由流动的。最常见的喷雾干燥器被称为“单效”喷雾干燥器，因为在干燥室的顶部处只有一股干燥空气流。在大多数情况下，空气与喷雾的液体顺流吹动。用这种类型的干燥器获得的粉末是细的，具有大量粉尘和差的流动性。为了减少粉尘和增加粉末的流动性，已经开发了被称为“多效”喷雾干燥器的新一代喷雾干燥器。不是在一个阶段内干燥液体，干燥以两个步骤完成：一个步骤在顶部处(按照单效)，并且一个步骤用于室底部处的一体式固定床(integrated static bed)。这种流化床的一体化允许通过在潮湿的气氛内部使粉末流体化来使细颗粒团聚并获得通常具有在100μm至300μm的范围内的中等粒度的粒剂。由于这种大的粒度，这些粉末是自由流动的。由第一阶段干燥产生的细粉末可以在室的顶部处(所喷雾的液体周围)或在一体式流化床内部的底部处以连续流再循环。粉末的干燥可以在外部振动流化床上完成。热干燥气体作为与雾化器方向顺流或逆流的流经过。顺流的流使得颗粒能够在系统中具有较少的停留时间，并且颗粒分离器(通常是旋风分离器装置)更有效地操作。逆流流动方法使得颗粒能够在室中有较长的停留时间，并且通常与流化床系统搭配使用。喷雾干燥器的替代物包括静电喷雾干燥器、冷冻干燥器、转鼓式干燥器和脉冲燃烧干燥器。

一般

如本文使用的，术语“约”指的是±10％。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”和其同源词意指“包括但不限于”。

术语“由……组成”意指“包括且限于”。

术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部件，但前提是所述另外的成分、步骤和/或部件不实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本的和新颖的特性。

词语“示例性”在本文被用来意指“用作实例、事例或例证”。被描述为“示例性”的任何实施方案不一定被解释为比其他实施方案优选的或有利的，和/或排除并入来自其他实施方案的特征。

词语“任选地”在本文被用来意指“在一些实施方案中被提供且在其他实施方案中不提供”。本发明的任何特定的实施方案可以包括多于一个“任选的”特征，除非这样的特征矛盾。

如本文使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多于一种化合物，包括其混合物。

在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围格式来呈现。应当理解，以范围格式的描述仅是为了方便和简洁并且不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单独的数值。例如，范围的描述诸如从1至6应当被认为是已经具体地公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的单独的数字例如1、2、3、4、5、和6。不论范围的宽度如何，这都适用。

本文无论何时指示数值范围，其意在包括在该指示的范围内的任何引用的数值(分数或整数)。措辞“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围内”与“在从第一指示数字至第二指示数字的范围内”在本文可互换地使用并且意在包括第一指示数字和第二指示数字以及其间的全部分数和整数数值。

如本文使用的，术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学领域、药理学领域、生物学领域、生物化学领域和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序，或容易由化学领域、药理学领域、生物学领域、生物化学领域和医学领域的从业者已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文使用的，术语“治疗”包括废除、大体上抑制、减缓或逆转状况的进展；大体上改善状况的临床症状或美学症状或大体上预防状况的临床症状或美学症状的出现。

应理解的是，为了清楚而在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单一实施方案中以组合来提供。相反地，为了简洁而在单一实施方案的上下文中描述的本发明的各个特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供或合适地在本发明的其任何他描述的实施方案中提供。除非实施方案在没有那些要素下是无法实施的，否则在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征。

如上文描绘的和如在下文权利要求部分中要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在提及以下实施例，实施例与上文的描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。

材料和方法

化学品和试剂

80％的乳清蛋白浓缩物(WPC)由I.T.ALI.srl.(意大利)友情提供。蛋白质含量为80％(w/w)。雨生红球藻干燥细胞和油性树脂从Algatechnology(以色列)获得。麦芽糖糊精DE19来自Agrana(奥地利)，乳清分离蛋白(WPI，Isolac)来自Carbery(爱尔兰)。Capsul和HICAP改性淀粉来自Ingredion Incorporated(US)。淀粉、阿拉伯树胶、乙酸乙酯、HPLC级丙酮、低分子量脱乙酰壳多糖、胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、胆酸钠购自Sigma-Aldrich(US)。所有的酶都是猪来源的。

从H.p.中提取虾青素

H.p.油性树脂是使用由Bustos-Garza及同事提出的方案经过微小的修改获得的。简而言之，通过将5g的藻类和1ml的3M HCl混合并在微波炉中在100W处理样品持续1min来预处理藻类粉末。预处理的藻类用25ml的乙酸乙酯在具有螺旋盖的管中提取，在50℃热浴中在搅拌下持续60min。通过以3000g离心持续10min来分离固体部分，以消除生物质。油性树脂通过旋转蒸发器(Buchi，瑞士)干燥，并且在4℃的黑暗处直到使用。

分光光度法分析

使用UV/VIS分光光度计(Unicam UV2)进行ASX的定量。样品在乙酸乙酯中稀释，并且在480nm处测量吸光度。ASX的浓度遵照以下等式计算：

其中[A]是表示为mg/ml的ASX的浓度；A480样品在480nm处的吸光度；DF：稀释因子；E(1％；1cm)：在乙酸乙酯(2150)中的ASX百分比溶液消光系数[(g/100ml)^-1cm^-1]；d：光程(cm)。

浊度分析

通过监测660nm处的吸光度来进行浊度分析。

HPLC分析

含虾青素的样品的反相HPLC用Beckman System Gold(Beckman Coulter)在C30柱(4.6×250mm，粒度5μm)(YMC Europe，谢姆贝克，德国)上进行，遵照经过微小修改的先前描述的方法。通过Beckman 168二极管阵列检测器在480nm处监测吸光度。注射体积是50μl。使用丙酮(溶剂A)和水(溶剂B)、以1ml/min的流量如下进行洗脱：以84:16(A:B)等度洗脱持续10min，并且梯度至97:3(A:B)持续100min。

虾青素纳米颗粒制备

虾青素纳米颗粒(ASX NP)是遵照经过一些修改的所描述的方法来产生的。乳清蛋白浓缩物(WPC)以在1％和10％之间的浓度范围溶解在蒸馏水中。将溶液在室温搅拌持续30分钟，而没有pH改变。将H.p.提取物在乙酸乙酯中不同地稀释，并与蛋白质溶液以9:1(蛋白质溶液:提取物)的比组合。使用超声发生器(Microson超声细胞破裂仪XL)在10W的功率持续10分钟产生细乳液。在该过程结束时，在黑暗中使用氮气流除去乙酸乙酯。WPC ASX NP被保持在4℃的黑暗中直至使用。

为了获得另外的层，可以将产生的纳米颗粒与等体积的阳离子聚合物溶液混合，阳离子聚合物溶液诸如处于从0.01％至0.5％的范围内的浓度的脱乙酰壳多糖，其中脱乙酰壳多糖先前溶解在含有乙酸的溶液中。由于相反电荷之间的静电相互作用，由WPC构成的带负电的壳与脱乙酰壳多糖的正电荷之间的接触瞬间给出壳的形成。

为了获得水可分散的粉末，将ASX油性树脂溶解在乙酸乙酯中。将包封剂基质在使用前在去离子水中再水合持续至少1小时，以允许聚合物的完全溶出。将ASX油性树脂在乙酸乙酯中稀释，并与聚合物溶液以9:1(聚合物溶液:有机相)的比组合。使用超声发生器(Microson超声细胞破裂仪XL)在12W的功率持续10分钟产生细乳液。在该过程结束时，使用旋转蒸发器系统(rotavapor system)来除去乙酸乙酯。之后可以在雾化之前添加另外的聚合物(例如MD)。干燥过程使用Buchi Mini喷雾干燥器B-290(瑞士)进行。使用的条件如下：干燥空气流量40m³/h；入口空气温度180±3；出口空气温度100±3，以及4mL/min的进料流量。将形成的微粒收集在旋风分离器底部处的收集器中。ASX颗粒粉末被保持在氧化铝密封袋中，并在4℃储存直至使用。

蒸发之后的NP可以可选择地经历湿法制粒工艺。根据本发明，湿法制粒可以是选自由以下组成的组的任何合适的湿法制粒工艺：流化床制粒、混合制粒、挤出机制粒、圆盘制粒和滚筒制粒。

制粒工艺由流化床制粒机(Mini-Glatt流化床系统，德国)进行。通过6m³/h的流动空气流使五十克的MD(用作种子)流化，温度设定在65℃。在预热粉末持续5分钟之后，通过蠕动泵以1ml/min的速度注射100ml的ASX NP。使液体顶部喷雾在MD上。喷嘴的空气压力设定为1巴。在此过程期间，空气流从6m³/h上升到19m³/h，以允许生长的颗粒流化。使产物在45℃干燥持续10分钟，直到达到0.2-0.25的水活度。

虾青素纳米颗粒的表征

表面电荷和平均直径

使用Malvern Zetasizer(Nano-ZS；Malvern Instruments，乌斯特郡，UK)通过动态光散射原理来分析ASX纳米颗粒的ζ电势、平均直径和多分散性指数(PDI)。在分析之前，将样品稀释80倍以避免多重散射效应。范围从0到1的PDI值指示粒度的分布，接近0的值指示均匀的颗粒群体，并且接近1的值指示粒度的各种各样的尺寸。ζ电势给出关于颗粒稳定性的重要信息，对于接近0的值，认为体系是不稳定的，因为缺乏可以比照NP团聚过程的净电荷。获得的结果是至少三次测量结果的平均值。

包封效率

在37℃的热摇床(Biosan)中，用2mg/ml的胰蛋白酶在0.1M的PBS 10mM中酶处理ASX NP持续4h。将酶消化的溶液与双倍体积的乙酸乙酯混合，并置于旋转摇床上持续60分钟。将溶液以12,000g离心持续5分钟，以允许分离两个不混溶的相。如上文描述的，从上面的相中回收ASX，适当地稀释并通过分光光度法定量。包封效率由随后的公式来估算：

其中ASXi表示在NP中负载的ASX的初始量，而ASXf指的是经由酶提取破坏蛋白质壳之后从NP中回收的ASX的量。

表面ASX(ASXs)如下计算：将0.5ml的NP与1ml的乙酸乙酯混合持续5分钟。在以12,000g离心持续5分钟之后，通过分光光度法分析上清液，以通过以下式测量ASXs：

ABTS自由基清除活性(RSA)

对于ABTS测定，遵循经过一些修改的所描述的程序。制备两种储备溶液，即7.4mMABTS和2.6mM过硫酸钾。然后通过以等量混合两种储备溶液并允许它们在室温在黑暗中反应持续12h来获得工作溶液。然后用甲醇(对于H.p.油性树脂而言)或PBS(对于ASX NP而言)适当地稀释溶液，以在734nm处获得0.75单位的吸光度。对于每次测定制备新鲜的ABTS溶液。将样品(20μl)装载入96孔板中，并在黑暗条件中与180μl的ABTS溶液反应持续2h。然后使用酶标仪(microplate reader,Bio-Tek)在734nm处获取吸光度。结果表示为遵照以下等式的清除活性％：

其中，A空白是在734nm处由溶剂给出的吸光度，而A样品是由样品给出的吸光度。

化学稳定性

在使用NaOH或HCl溶液调节的具有不同pH值(1-10)的溶液中测试了ASX NP的化学稳定性。使用UV/VIS分光光度计(Unicam UV2)在分光光度化学上评价稳定性，读取650nm处的吸光度作为浊度测定指数。

pH的作用

在使用NaOH或HCl调节的具有不同pH值(1-10)的溶液中测试了ASX NP的稳定性。通过分光光度法评价稳定性，读取660nm处的吸光度作为浊度测定指数。

UV辐照

使用透照器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)来研究ASX NP和H.p.油性树脂(如上文描述的溶解于DMSO中)的针对UV-B光的稳定性。在暴露期间，在不同的时间点采集样品的等分试样：5’、30’、60’和120’。如先前描述的，通过分光光度法确定残余ASX的％。

氧化稳定性

根据经过一些修改的由Pan和同事提出的方法，分析了ASX NP和来自H.p.提取物的ASX针对化学氧化的稳定性。简而言之，将H.p.油性树脂溶解在DMSO中，并在水中稀释以达到7.5μg/ml的最终浓度。将980μl的样品与10μl的FeCl₃溶液(350μg/ml)混合，并在室温孵育持续24小时。在不同的时间点，分析溶液的等分试样，并评价保留的ASX的％。如先前描述的，通过用胰蛋白酶进行酶消化(enzymatic digestion)来分析来自NP的残余ASX的％。直接在双倍体积的乙酸乙酯中提取含有H.p.油性树脂的样品。在提取之前，向样品中添加抗坏血酸溶液(来自1.3mg/ml储备溶液中的10μl)，以便停止氧化反应。保留的ASX的％使用以下等式进行评价：

其中ASXr对应于在暴露于氧化条件之后保留的ASX的量，并且ASXi是通过包封过程之后的酶提取来确定的ASX的初始量。

储存稳定性

通过在65℃的加速系统评价ASX NP和H.p.油性树脂的储存稳定性。样品被保持在静态烘箱(Memmert,德国)中在封闭的聚丙烯管中。为了研究提取物的稳定性，除去乙酸乙酯以获得仅有的来自H.p.的油性树脂。在不同的时间点，通过分光光度法分析样品的残余ASX的含量，并进行HPLC分析。

模拟体外消化

体外消化遵照Infogest方案(Minekus等人，2014)进行。遵照上文提及的方案制备模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)。两个期的持续时间为对于胃期而言的1h和对于肠期而言的4h。所使用的酶对于胃期(pH 3)和肠期(pH7)分别是胃蛋白酶和胰酶。将呈胆酸钠的形式的胆汁盐添加至SIF中至10mM的最终浓度。简而言之，将0.5mL分散在水中的样品和SGF以1:1的比混合，用HCl 1M将pH调节至3。在1小时之后，以1:1的比添加SIF，并且用NaOH 1M将pH调节至7。反应在旋转摇床中于37℃进行。在不同的时间点，用双倍体积的乙酸乙酯提取样品。通过分光光度法评价从ASX NP释放的ASX的量。通过HPLC分析来评价去酯化度。

统计学分析

所有测量至少进行三次，并且结果报告为平均值±标准偏差。统计学分析使用单向方差分析(ANOVA)，使用SigmaPlot v12.5软件(Systat Software Inc.CA,US)进行。

细胞培养

与细胞有关的实验已经与由Roberto Chignola教授指导的维罗纳大学(University of Verona)的动物细胞培养实验室合作进行。所利用的细胞系来自ATCC(American Type Culture Collection Rockville,马里兰州,USA)。

将来自成年小鼠的单核巨噬细胞细胞系(J774A)、HepG2(人类肝细胞癌，ATCC HB-8065，细胞类型：上皮细胞)和Caco2(人类结肠直肠腺癌，ATCC HT-B37，细胞类型：上皮细胞)在RPMI 1640培养基(Biochrom AG，柏林，德国)中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺(Sigma,圣路易斯,MO.,USA)和35mg/l的庆大霉素。使细胞在T75培养瓶(Greiner Bio-One,Frickenhausen,德国)中于37℃在湿润的5％CO₂气氛中生长，并定期地用新鲜培养基稀释以避免饥饿。在台盼蓝(在PBS中的0.1％，Biochrom AG)存在的情况下，通过细胞仪测量活细胞的浓度。

细胞毒性测定

HepG2细胞最初以200μl的完全培养基中25000个细胞的密度接种在96孔培养板中。在6h之后，移除25μl的培养基，并用相同体积的抗氧化剂替代，并在37℃孵育持续30分钟。抗氧化剂由溶解于1％DMSO中的H.p.油性树脂和ASX NP表示，两者均在以下浓度测试：0.2mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml。使用20％甲醇作为阴性对照，RPMI培养基作为阳性对照以及1％DMSO用于测试是否即使以少量其也可能影响细胞活力。使用光相差显微镜(lightphase-contrast microscopy,Olympus IX51；Olympus,东京,日本)、使用Burker室来对细胞进行计数，并使用活体染料台盼蓝(1:2v/v稀释)来排除死细胞。遵照制造商的使用说明，通过荧光素/荧光素酶法使用

发光细胞生存力测定试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)来确定ATP。使用微孔板光度计(FL_x 800，Bio-tek Instruments)来测量发射光，并且数据以发光任意单位表示。

根据流式细胞术的细胞抗氧化活性

将成年小鼠巨噬细胞细胞系J774A以1×10⁵个细胞的密度接种在2ml的RPMI培养基中。在37℃孵育24h之后，移除1ml的培养基，并且添加500μl的DCFH-DA 50μM和500μl的抗氧化剂。测试的抗氧化剂为：溶解于1％DMSO中的H.p.油性树脂和溶解于RPMI中的ASX NP，两者均处于14μg/ml、7μg/ml、3.5μg/ml、1.75μg/ml、0.875μg/ml和0.438μg/ml的H.p.油性树脂的浓度。作为对照，还分析了处于25μg/ml、12.5μg/ml和6.25μg/ml的浓度的天然WPC蛋白质的抗氧化活性。在与抗氧化剂一起孵育之后，移除培养基并将相同体积(500μl)的氧化剂物质添加至板(600μM ABAP和0.002％H₂O₂作为不同的应激条件进行测试)。将经处理的细胞在37℃孵育持续30分钟。在孵育之后，从板刮下细胞以获得细胞悬浮液，用于细胞荧光分析。悬浮液被保持在4℃直至使用。使用Guava easyCyte TM 5流式细胞仪v.2.7软件(MerckMillipore,Billerica,MA,U.S)测量细胞相关的荧光。细胞仪配备有488nm、20mW的蓝色激光，以及前向散射(FSC)光电二极管和侧向散射(SSC)光电倍增管。绿色荧光525/30滤光器、黄色583/26滤光器和红色680/30滤光器允许分析来自样品的荧光发射。根据制造商的使用说明，使用Guava EasyCheck试剂盒(Merck Millipore,Billerica,MA,U.S.)对细胞仪的校准进行常规检查。将原始数据导出，并且然后通过Mathematica软件进行处理和分析。

共聚焦显微镜学

通过共聚焦显微镜学来分析ASX NP的摄取。为此，用荧光素异硫氰酸酯(FITC)来标记ASX NP。特别地，将10mg的冻干的ASX NP重悬在1.695μl的碳酸盐缓冲液(pH 7.3)中。将十毫克的FITC重悬在1ml的DMSO中。将80μl的FITC浓溶液添加至ASX NP溶液，并在黑暗中反应持续2h。使用具有Sephadex G-25树脂的PD Mini-Trap脱盐柱(Supelco,Bellefonte,PA,U.S.)来除去未反应的FITC。

使用了以下细胞系：Caco2(人类结肠直肠腺癌，ATCC HT-B37，细胞类型：上皮细胞)，HepG2(人类肝细胞癌，ATCC HB-8065，细胞类型：上皮细胞)。在RPMI 1640(BiocromAG，柏林，德国)中于37℃在润湿的5％CO₂气氛中常规地培养细胞，RPMI 1640补充有2mM谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,MO,USA)、35mg/l庆大霉素(Biocrom AG)和10％热灭活胎牛血清(Biocrom AG)。以5·10⁴个细胞/孔的初始细胞密度将细胞接种到玻璃底μ-SlideIbiTreat室(Ibidi GmBH，Martinsried，德国)的孔中在200μl完全生长培养基中，并在37℃孵育持续24小时。然后添加50μl体积的FITC标记的ASX NP溶液(绿色荧光)，并且将细胞在37℃另外孵育持续1小时。将细胞用PBS仔细洗涤，用4％(w/v)多聚甲醛固定持续30min，并且在用PBS洗涤并用50mM NH₄Cl猝灭之后，用PBS-0.1％Triton X-100透性化。然后将细胞用罗丹明-鬼笔环肽染色(以标记F-肌动蛋白，红色荧光；Cytoskeleton,丹佛,CO,USA)持续30min，并且然后用DAPI染色(以标记细胞核，蓝色荧光；Sigma-Aldrich,圣路易斯,MO,USA)持续10min。使用来自Leica Microsystems(Mannheim,德国)的SP5共聚焦显微镜收集在Δz＝0.5μm时的图像，该SP5共聚焦显微镜具有63×的物镜(HCX PL APOλ蓝1.4NA OIL)。图像分析使用ImageJ v.2.0.0软件进行。

细胞纳米颗粒摄取

为了获得涉及细胞摄取的机制的信息，实验是在阻断条件存在的情况下即在低温进行的。事实上，Caco2细胞和HepG2细胞与FITC标记的ASX NP(0.02mg/ml)在4℃一起孵育持续30分钟，并在37℃孵育作为对照。

实施例1

虾青素WPC NP的物理评价

以1.1％w/w的最大产率从H.p.细胞中提取ASX。进行油性树脂的HPLC分析，以了解微波辅助提取和在50℃的热处理是否可能对ASX完整性(integrity)具有不利影响。概况(profile)显示ASX主要以单酯化形式(80％)，其次是二酯化形式(18％)和少量游离形式(2％)存在。观察到微量的其他类胡萝卜素，但没有定量。

将WPC用作生物相容性基质，以通过乳化-溶剂蒸发技术改善ASX在水中的生物利用度和分散性。考虑两个参数来优化工艺。

考虑的第一参数是WPC浓度，因为如早前所报告的，基质材料的量不仅可以影响NP的尺寸(这是由于倾向于形成生长结构直到达到稳定构象的蛋白质的分层效应)，而且还可以影响消化过程期间释放生物活性化合物所需的时间。

含有ASX NP的溶液是透明的，带有红橙色的明亮颜色，但是增加的蛋白质浓度导致透明度的丧失。平均尺寸、PDI和ζ电势被认为是评价该过程的参考参数。如表1中所示，蛋白质量的增加导致ASX NP的尺寸从以最低浓度获得的90nm的平均尺寸增长到10％WPC的128nm。数据示出尺寸与蛋白质浓度的明显依赖性。所有制剂的PDI值都是低的，在从1％制剂的0.247到10％制剂的0.261的范围内。ζ电势值是高度负的，因为在中性pH的WPC壳是带负电的。

表1：作为用于产生ASX NP的不同蛋白质浓度的结果的Z平均值、(b)PDI和(c)ζ电势变化

蛋白质浓度％	Z平均值(nm)	PDI	ζ电势±ζ偏差
				0.1	90.83±2.02	0.247±0.0015	-31.3±8.95
0.5	92.3±2.34	0.259±0.005	-31.2±7.7
				0.8	95.67±0.08	0.262±0.010	-29.8±6.87
1	103.37±0.98	0.255±0.014	-28.5±6.5
				2	106.1±1.25	0.260±0.011	-24.7±6.32
5	116.5±0.36	0.254±0.005	-20.0±5.47
				8	125.07±1.11	0.259±0.023	-17.9±4.56
10	128.27±1.98	0.261±0.011	-17.0±4

通过增加用于包封的WPC的％，观察到ζ电势值的降低：10％制品显示出-17.0±4的ζ电势。虽然用在从0.1％至1％的范围内的WPC浓度获得了最佳的ζ平均值、PDI值和ζ电势值，但是在从0.1％至0.5％的WPC浓度，经历了ASX的快速降解。因此，后续实验使用1％的WPC浓度进行。

考虑的第二参数是所使用的H.p.油性树脂的量。如表2中所示，ASX NP的直径随着油性树脂的增加而减小，具有94.98±1.27的最小值和0.235±0.015的PDI。该样品显示出高于-20mV(-17.9±4.56mV)的表面电荷，这强调了结构的不稳定性。这可能是由于油性树脂高的量，该量超过构成壳的蛋白质的量。用4.5mg的H.p.油性树脂制成的NP给出了令人满意的结果，该NP具有102.7±0.36的Z平均值，0.242±0.016的PDI和-28.5±6.5的高度负的表面电荷。

表2：作为用于产生ASX NP的不同油性树脂浓度的结果的Z平均值、PDI和ζ电势变化

H.p.油性树脂％	Z平均值(nm)	PDI	ζ电势±ζ偏差
				1	117.40±0.52	0.256±0.008	-31.3±8.95
2.5	108.53±3.16	0.272±0.012	-31.2±7.7
				3.5	102.87±1.97	0.245±0.009	-29.8±6.87
4.5	102.7±0.36	0.242±0.016	-28.5±6.5
				6.5	98.09±1.71	0.245±0.057	-24.7±6.32
9	96.99±0.62	0.248±0.032	-20.0±5.47
				11	94.98±1.27	0.235±0.015	-17.9±4.56

包封效率为96±2.5％。ASX的略微损失可能是由从超声过程产生的氧化引起的，或者是由酶提取期间蛋白质壳的不完全降解引起的。进行了来自ASX NP的提取物的HPLC分析，并与包封过程之前的H.p.油性树脂的HPLC分析进行了比较，未观察到改变(数据未显示)。所达到的较高浓度的有效载荷为11％。

实施例2

具有脱乙酰壳多糖的虾青素-WPC NP

进行了具有1％的WPC和0.1％-0.05％的脱乙酰壳多糖的ASX NP的评价。

ASX NP的表面电荷是负的，因为脱乙酰壳多糖是阳离子聚合物，所以决定尝试在已经形成的NP周围形成另一个壳。

尺寸：NP尺寸随着脱乙酰壳多糖的添加以与浓度依赖性的方式而增加(从105nm至120nm)(图1)。

表面电荷：ASX NP的起始电荷为负(-33±6.63mV)，但添加脱乙酰壳多糖之后变为正33.5±5.21(图2)。

实施例3

ASX NP的喷雾干燥

评价了不同的制剂和包封条件，并且呈现在表3中。

测试不同的聚合物以通过喷雾干燥获得ASX颗粒粉末。乳清分离蛋白(WPI)被用于所有的制剂中以产生主要的壳。研究了作为填料的两种改性淀粉：CAPSUL和HICAP，它们常用于喷雾干燥应用。由于消费者对天然成分显示较高依从性，因此对非改性淀粉进行了分析。麦芽糖糊精(MD)和阿拉伯树胶是喷雾干燥使用最多的聚合物，其具有最佳的包封和特定的释放特征。

一些基质是在用WPI进行超声过程期间添加的，其他基质是在超声之后或在蒸发过程结束时添加的，以研究它们的存在对NP形成的影响。制剂编号2、5、8、9和10从分散在水中时颗粒的在水中的分散性、PDI和平均尺寸的角度给出了令人满意的结果。最佳结果由制剂编号10显示，其显示出0.2的PDI和147.2nm的平均尺寸。

表3：为获得虾青素的喷雾干燥粉末而表示为不同聚合物的％w/v的制剂组成。

表4：不同粉末制剂的特性

图3显示了用制剂10获得的颗粒的尺寸分布。

实施例4

虾青素-WPI-MD粉末表征

经由喷雾干燥产生虾青素水可分散粉末(ASX WD P)。

评价聚合物的不同组合，以便获得当重新分散在水中时直径约100nm-200nm的ASX颗粒。在不同的组合中，选择WPI和MD的混合物。所获得的粉末的颜色为亮橙色，并且易于分散在水中。包封效率(EE)为95.73％，并且包封产率(YE)为85±2％。ASX浓度为11.8mg/g的粉末，并且在相同浓度，抗氧化活性比Trolox高5倍，比β-胡萝卜素高26倍，并且比ASX油性树脂高8倍。

实施例5

虾青素-WPI-MD粉末表征

从粉末中提取的ASX主要包含ASX的单酯(86％)、其次是二酯(13％)和1％的游离形式，与最初的油性树脂相同(图4)。

发现粒度在100nm-200nm的范围内，具有0.214的多分散性指数PDI。通过光学显微镜和SEM来评价颗粒形态学(图5)，两个图像均证实了球形颗粒的存在。

实施例6

体外消化期间释放概况的比较

ASX以NP形式和以粉末形式的释放概况在图6A-图6B中示出。

在消化期间类胡萝卜素的吸收主要发生在肠的第一部分中，在那里发生通过肠粘膜的摄取。还公认的是，胃中通常存在的高度酸性的条件可能显著地影响ASX的稳定性。

理想的体系应该在运输通过胃期间保护ASX，并允许在肠期的前两个小时内释放ASX。胃期期间的ASX NP释放为约45％(图6A)。考虑到在该期期间可观察到NP的明显团聚，这种释放可以被解释为可能是由于接近于乳清蛋白的pI的低pH值的结果。在肠期中，团聚物消失。在肠消化2小时之后，ASX从NP中的释放达到约65％，肠消化在该模型中代表小肠。在肠消化4小时之后，释放的ASX的量为约90％。

根据对于ASX NP获得的结果，ASX颗粒粉末制剂(图6B)显示在胃期结束时38％的释放，在肠期期间，生物活性化合物的释放迅速增加，直到肠期的4小时之后达到93％。类似的释放概况示出，在体外模拟消化期间，制剂的较高固体含量不影响ASX的释放。

进行模拟消化(SD)不仅是为了解决包封的ASX的生物可利用度，还是为了评价类胡萝卜素可能的化学修饰。来自消化之前和之后收集的NP的提取物的HPLC分析可以给出ASX酯化度的描述(picture)。图7示出，来自消化之前的NP的提取物的组成主要由单酯和二酯表示，单酯和二酯总体上占存在的ASX的99％，而在肠消化两小时之后，主要形式由游离ASX(66％)表示。在消化4小时之后，向游离形式的转化达到75％。

图8示出了消化之前和之后ASX颗粒粉末中ASX酯的组成。

在体外模拟消化期间释放的H.p.提取物的HPLC分析示出ASX在肠水平的高去酯化率，其为从0.88％至75.36％的游离虾青素(图7)。该参数被认为是理论生物利用度的指标，理论生物利用度被定义为生物活性化合物或药物在作用部位被吸收并变得可用的比率和程度，其使得类胡萝卜素的去酯化成为通过肠粘膜吸收的强制性步骤。对于水可分散粉末形式，该比率普遍较低(图8)，在肠期结束时检测到从1.8％至3.4％的游离ASX。低去酯化率的可能性可以是制剂中需要通过脂肪酶处理的ASX的量较高。事实上，在该制剂中使用的油性树脂中存在的ASX和脂质的量比用于产生NP制剂的量高27.5倍，并且所使用的模拟消化方案大部分被设计用于蛋白质的消化。

实施例7

NP的细胞内吞作用：共聚焦显微镜学分析

使用了以下细胞系：Caco2(人类结肠直肠腺癌，ATCC HT-B37，细胞类型：上皮细胞)，HepG2(人类肝细胞癌，ATCC HB-8065，细胞类型：上皮细胞)，J774A1(小鼠网状细胞肉瘤，ATCC TIB-67，细胞类型：单核细胞/巨噬细胞)。在RPMI 1640(Biocrom AG，柏林，德国)中于37℃在润湿的5％CO₂的气氛中常规地培养细胞，RPMI 1640补充有2mM谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,MO,USA)、35mg/l庆大霉素(Biocrom AG)和10％热灭活胎牛血清(Biocrom AG)。以5·10⁴个细胞/孔的初始细胞密度将细胞接种到玻璃底μ-SlideIbiTreat室(Ibidi GmBH，Martinsried，德国)的孔中在200μl完全生长培养基中，并在37℃孵育持续24小时。然后添加50μl体积的FITC标记的NP溶液(绿色荧光)，并且将细胞在37℃另外孵育持续1小时。将细胞用PBS仔细洗涤，用4％(w/v)多聚甲醛固定持续30min，并且在用PBS洗涤并用50mM NH₄Cl猝灭之后，用PBS-0.1％Triton X-100透性化。然后用罗丹明-鬼笔环肽使细胞染色(以标记F-肌动蛋白，红色荧光；Cytoskeleton,丹佛,CO,USA)持续30min，并且然后用DAPI染色(以标记细胞核，蓝色荧光；Sigma-Aldrich,圣路易斯,MO,USA)持续10min。使用来自Leica Microsystems(Mannheim,德国)的SP5共聚焦显微镜收集在Δz＝0.5μm时的图像，该SP5共聚焦显微镜具有63×的物镜(HCX PL APOλ蓝1.4NA OIL)。图像分析使用ImageJ v.2.0.0软件进行。

在图9A-图9C中描绘了共聚焦显微镜学图像，示出ASX NP的细胞摄取。

实施例8

呈团聚物形式的ASX颗粒的产生

图10中示出了与水可分散ASX颗粒粉末制剂相比的通过流化床获得的团聚物的尺寸分布分析的结果。在重悬时，释放的NP的平均直径几乎相同。

实施例9

姜黄素-WPC/WPI NP的产生

来自姜黄(Curcuma longa)(姜黄粉(turmeric))的姜黄素通过上文公开的相同程序被包封。简而言之，将WPC或WPI以在1％和10％之间的浓度范围溶解在蒸馏水中。将溶液在室温搅拌持续30分钟，而没有pH改变。使姜黄素溶于乙酸乙酯中，并以9:1(蛋白质溶液:提取物)的比与蛋白质溶液组合。使用超声发生器(Microson超声细胞破裂仪XL)在10W的功率持续10分钟产生细乳液。在该过程结束时，在黑暗中使用氮气流除去乙酸乙酯。WPC或WPI姜黄素-NP被保持在4℃的黑暗中直至使用。如上文描述的，可以产生包围NP的另外的层。水可分散粉末可以用与对富含ASX的油性树脂所描述的相同的程序获得。图11示出所获得的NP的DLS分析。

实施例10

ω3-WPC/WPI NP的产生

富含长链ω3脂肪酸诸如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的鱼油通过上文公开的相同的程序被包封。ω3脂肪酸的其他来源如鱼肝油或亚麻籽油也是合适的。简而言之，将WPC或WPI以在1％和10％之间的浓度范围溶解在蒸馏水中。将溶液在室温搅拌持续30分钟，而没有pH改变。使鱼油溶解于乙酸乙酯中，并以9:1(蛋白质溶液:提取物)的比与蛋白质溶液组合。使用超声发生器(Microson超声细胞破裂仪XL)在10W的功率持续10分钟产生细乳液。在该过程结束时，在黑暗中使用氮气流除去乙酸乙酯。WPC或WPI鱼油-NP被保持在4℃的黑暗中直至使用。如上文描述的，可以产生包围NP的另外的层。水可分散粉末可以用与对富含ASX的油性树脂所描述的相同的程序获得。图12示出所获得的NP的DLS分析。

实施例11

油性树脂的包封

通过乳化-溶剂蒸发方法来进行H.p.油性树脂的包封，其中使亲脂性材料溶解在乙酸乙酯中，并用含有WPC的水相乳化，WPC充当水包油界面的稳定剂。对两个关键参数进行评价以优化工艺。第一个是WPC的浓度。监测尺寸(Z-平均值)、多分散性指数(PDI)和电荷(ζ-电势)以研究蛋白质浓度对纳米颗粒的形成的作用。如图13A中所示，使油性树脂浓度保持在1％，蛋白质浓度的增加导致NP直径从用最低浓度获得的90nm的平均尺寸增加到用10％WPC获得的128nm。PDI值对于所有制剂都是低的，指示NP群体的均匀尺寸，但在样品之间没有观察到统计学上显著的差异。

NP的ζ电势值为负(图13B)，因为在中性pH的WP壳是带负电的。高于±20mV-30mV的值通常与稳定的NP有关，因为在该电势范围内，强排斥力抑制基于疏水性相互作用和范德华相互作用的自然团聚现象。通过增加蛋白质浓度而观察到的ζ电势大小的降低可能是蛋白质在界面处不同程度的展开、多层形成或如先前描述的某些蛋白质的优先吸附的结果。虽然用在从0.1％至1％的范围内的WPC浓度获得了最佳的Z-平均值、PDI值和ζ电势值，但是在从0.1％至0.5％的浓度经历了ASX的快速降解。因此，使用1％的WPC浓度进行了以下实验。

考虑的第二参数是H.p.油性树脂的浓度。如图13C中所示，NP的直径由于增加油性树脂浓度而略有减小。该结果与在图13A中示出的先前的数据一致，因为油性树脂与蛋白质比率的增加(WPC被保持在1％)将减少蛋白质的多层团聚，减小颗粒的直径。在最后一点处，用11％的油性树脂获得，主要的直径达到95nm。此外，在这种情况下，ζ电势大小降低(图13D)，这与直径的减小一致，在最后一点处达到高于-20mV(-17.9mV±4.6mV)的表面电荷。该值通常与纳米结构的低稳定性有关。这可能是由于油性树脂的高的量，该量可能已经超过蛋白质在油滴表面适当排布的能力，并且从而影响所得颗粒的表面电荷。此外，在该情况下PDI值是低的，并且通过增加油性树脂浓度获得的样品之间没有测量到显著差异。在图13E和图13F中分别呈现了取决于蛋白质浓度和H.p.油性树脂浓度而产生的纳米颗粒的外观。用4.5％的H.p.油性树脂产生的NP给出了令人满意的结果，该NP具有103nm的Z-平均值、0.242的PDI以及-28.5mV的表面电荷。最佳方案(1％WPC，4.5％H.p.油性树脂)的DLS结果呈现在图14A-图14C中。

实施例12

NP的表征

在乙酸乙酯中的H.p.油性树脂的吸收光谱和在水中的NP的吸收光谱之间的比较揭示了包封过程之后ASX的最大吸收从470nm至480nm的红移(图15)。这可能是由于蛋白质壳的存在连同溶剂必然不同的事实。在NP的情况下，在<300nm波长的大吸收是由蛋白质的存在给出的。总的来说，包封的ASX在可见光谱中的吸收特性是保守的。

包封效率为96.0±2.5％，其中表面ASX仅占0.16±0.02％。ASX的略微损失可能是由超声过程产生的氧化引起的，或者是由酶消化期间蛋白质壳的不完全降解引起的，这可能限制类胡萝卜素在溶剂中的总体溶解。将来自优化的NP的提取物的HPLC分析与包封过程之前的H.p.油性树脂的HPLC分析进行比较(图16A-图16B)。没有观察到特别的定性差异，指示包封过程不影响酯分布的性质。

一些工作表明，ASX的自由基清除活性(RSA)是由氢或电子的转移介导的，并且在单线态氧猝灭的情况下，是由亲电子单线态氧和多烯链之间的能量转移介导的。ABTS代表评价亲水性分子和高亲脂性分子诸如类胡萝卜素的RSA的最常用的方式中的一种。来自H.p.油性树脂的ASX的0.2mg/ml的浓度显示出具有72.1％的RSA，而NP尽管呈现低8倍的ASX浓度(即0.025mg/ml相对于0.2mg/ml)，但NP呈现出95.8％的RSA(表5)。测试WPC天然蛋白质的活性并发现其贡献高达总NP活性的74.2％。这可以考虑到蛋白质结构中存在的一些氨基酸残基如半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和组氨酸的清除性质来解释。

表5：H.p.油性树脂和NP的ABTS自由基清除活性

实施例13

NP的稳定性

pH的作用

分析了在不同pH值的NP稳定性。在3.5和5.5之间的pH，发现NP不稳定，使得形成倾向于沉淀的团聚物(图17)。pH范围对应于乳清蛋白的平均等电点。Qian及同事报告，蛋白质稳定的纳米乳液的团聚可能源于在pH值接近于蛋白质的pI时登记的小的净表面电荷，并且因此不足以在颗粒中施加静电排斥。

UV辐照

如已经报告的，导致ASX降解的主要因素中的一种是光。鉴于该方面的重要性，分析了NP对UV辐照的稳定性，并且与H.p.油性树脂进行比较。如图18中所示，在暴露于UV-B光两小时之后，ASX在NP中和在H.p.油性树脂中的百分比分别为70.5％和4.1％，这示出蛋白质壳发挥保护作用。在两种情况下，零级降解动力学均是可观察到的。

Fe(III)诱导的氧化

影响ASX稳定性的另一个因素是促氧化物质的存在。食物产品中普遍存在的许多铁化合物被称为苛性氧化剂(harsh oxidizer)。由WPC壳代表的物理屏障及其螯合金属离子的固有能力可能影响NP中含有的ASX的稳定性。为此，通常使用氯化铁(FeCl₃)作为氧化剂以研究类胡萝卜素的稳定性。在图19中报告的结果示出样品之间的不同行为：在暴露的前20min内，H.p.油性树脂表现出以快速降解动力学为特征的模式，其中ASX含量损失近40％，随后降解速率较慢，直到实验结束，其中24h之后仅保留5.6％ASX。与前者相比，NP显示出ASX较慢的减少。事实上，在20分钟之后保留的ASX的量为95％。在24小时之后，ASX的量为31％。结果示出WPC蛋白质壳对Fe³⁺介导的降解的保护作用。

热处理

加速测试定期地应用于研究亲脂性物质诸如食用油的稳定性。采用该测试来研究NP和H.p.油性树脂的热稳定性(图20)。正如对于许多类胡萝卜素已经观察到的，存在于NP中的ASX呈现出典型的一级降解动力学。相反，在H.p.油性树脂中，ASX显示出以两个一级动力学为特征的概况：第一个一级动力学具有较低的反应速率常数，接近于油性树脂的反应速率常数，并且从第8天开始的第二个一级动力学具有较高的降解速率。H.p.油性树脂的较快的降解可能源于保护性玻璃样基质的缺乏，这允许源自氧化的反应性降解物质的较快积累。当这些降解物质达到一定浓度时，它们可以进一步氧化存在于H.p.油性树脂中的类胡萝卜素。两个样品均观察到颜色逐渐消失。如先前所报告的，类胡萝卜素的自氧化产物由于在可见光的吸收波长处缺乏发色团而不呈现颜色性质。对从NP和H.p.油性树脂中提取的ASX的HPLC分析示出没有ASX的选择性降解：事实上，对于包封的H.p.油性树脂中存在的所有化合物都观察到了损失。在480nm处没有检测到新的峰表明类胡萝卜素转化为不同的产物。据报告，类胡萝卜素在氧存在情况下的热降解导致挥发性化合物和较大的非挥发性化合物的形成。抵抗热处理的WPC壳的保护不足可能是由于NP的高表面暴露，这可以导致ASX对热的大部分暴露，并且结果是导致ASX碳链的降解。

实施例14

通过体外模拟消化评价生物可利用度

在消化期间类胡萝卜素的吸收主要发生在肠的第一部分中。类胡萝卜素的亲脂性是其摄取的众所周知的限制，但是在ASX的情况下，与脂肪酸的酯化代表另一个负面地影响肠吸收的因素，因为酯化的类胡萝卜素主要作为游离形式被摄取。

通过模拟消化(SD)实验，计算以下是可能的：在胃期之后，从NP释放并且因此生物可利用的ASX的量为约43％(图21)。这种释放可能是由两个因素的组合所诱导的：1)使乳清蛋白壳部分地降解的胃蛋白酶的活性，和2)可以诱导颗粒的团聚和蛋白质壳的不稳定的低pH，如在时间零释放20％的总ASX所证明的。由于高的PDI值，试图通过DLS测量粒度不能得到可靠的结果。

在肠期期间，作为pH的中和的结果，团聚现象消失。165.5nm的颗粒的平均尺寸以及0.290的低PDI也证实了这一点。在肠消化2小时之后，ASX的释放达到约76％，肠消化在该模型中代表小肠。在肠消化3小时之后，生物可利用的ASX的量为86％。

进行模拟消化(SD)不仅是为了解决包封的ASX的生物可利用度，也是为了评价类胡萝卜素可能的化学修饰。来自消化之前和之后收集的NP的油性树脂提取物的HPLC分析可以给出ASX提取物的酯化度变化的描述。图22A-图22B示出了消化之前的酯组成主要由单酯和二酯表示，单酯和二酯总体上占存在的ASX的99％，而在肠消化两小时之后，主要形式由游离ASX(75％)表示。相反，在以相同方式处理的大豆油中稀释的H.p.油性树脂样品给出了完全不同的结果，即酯的相对分布未受影响。

据报告，类胡萝卜素与膳食脂肪和油的组合通过促进向胶束相的转移和由胆汁盐介导的胶束化过程本身来改善它们的生物可利用度。不受任何特定理论的束缚，两个样品之间观察到的差异可以考虑NP的尺寸来解释。事实上，NP的较高的表面与体积比可以促进脂肪酶对虾青素酯的较大程度的水解，脂肪酶是参与三酰基甘油的水解的主要的酶。对含有H.p.油性树脂的样品的水解的损失的另一种解释可能与存在大量的三酰基甘油(是脂肪酶的优选底物)有关，可能阻碍了这种酶对其他分子诸如ASX酯的活性。

该结果非常重要，因为如上文提及的，类胡萝卜素的去酯化是类胡萝卜素通过肠粘膜摄取所需的关键步骤。

实施例15

通过流化床制粒的包封

使用流化床制粒机(Mini-Glatt流化床系统，德国)按照先前描述的制粒工艺包封若干种化合物。在该工艺中，评价化合物在乙酸乙酯中的溶解度是重要的，以便避免活性成分的沉淀。

姜黄素(20％w/w)用蚕豆蛋白包封。(图23A-图23B和图24)。可以观察到，溶出产生了均匀的溶液，没有大的可见颗粒(图23A-图23B)。

成功地包封了以下化合物：1)辅酶Q10(12.4％±0.1w/w)(图25A-图25B和图26)；2)β-胡萝卜素(1.6％±0.03w/w)(图27A-图27B和图28)；3)鱼油(10.53％±0.78w/w)(图29A-图29B和图30)；4)植物甾醇(11.82％±0.07w/w)(图31A-图31B和图32)；和5)CBD提取物(24％±0.5w/w)。

实施例16

通过喷雾干燥的包封

通过喷雾干燥成功地包封了咖啡因(3％±0.17w/w)(图33-图34)。为了获得供给喷雾干燥的咖啡因乳液，将咖啡因溶解在乙酸乙酯中。在该过程(NP的形成和产生)期间，评价化合物在乙酸乙酯中的溶解度是重要的，以便避免活性成分的沉淀。由于咖啡因显示出在该溶剂中的低溶解度，因此达到的最大负载仅为20mg/ml。将包封剂基质在使用前在去离子水中再水合持续至少1小时，以允许聚合物的完全溶出。使聚合物溶解在蒸馏水中。使咖啡因溶液与聚合物溶液以9:1(聚合物溶液：提取物)的比组合。使用超声发生器持续10分钟来产生细乳液。在该过程结束时，使用旋转蒸发器系统来除去乙酸乙酯。干燥过程使用Buchi Mini喷雾干燥器B-290(瑞士)进行。使用的条件如下：干燥空气流量40m³/h；入口空气温度180±3；出口空气温度100±3，以及4mL/min的进料流量。将形成的微粒收集在旋风分离器底部处的收集器中。

对表没食子儿茶素没食子酸酯应用相同的工艺。由于该化合物在乙酸乙酯中的溶解度较高，因此在粉末中获得的最终负载也较高。通过喷雾干燥成功地包封表没食子儿茶素没食子酸酯(24％±0.03w/w)(图35-图36)。

对用WPC和3％的咖啡因获得的乳液以及对应的粉末形式进行了DLS分析(图37-图38)，两者分别示出0.348和0.244的低PDI。

可以观察到，在干燥过程之前和之后，制剂保持相同的尺寸。这是所获得的制剂非常稳定并且可以承受干燥过程的高压和苛性条件的指示。

实施例17

虾青素纳米颗粒的抗氧化能力

ASX NP是以乳清蛋白浓缩物为包封剂基质通过乳液溶剂蒸发技术获得的。获得的颗粒在溶液中是稳定的，其特征在于高度负的Z电势值(-28.5mV)，90nm-100nm的平均直径和低的多分散性指数(PDI)(0.245)，强调了存在NP的略微多分散的群体。

抗氧化能力

来自H.p.油性树脂的ASX的0.2mg/ml的浓度显示出具有30的Trolox当量抗氧化能力(TEAC)值(表示为mmol Trolox/kg提取物)，比文献中发现的值低6倍和9倍之间，这可能是因为ASX的低提取效率或由于所使用的藻类批次的差异。ASX NP显示出比在相同浓度测试的H.p.油性树脂高11倍的抗氧化能力。该结果可以考虑乳清蛋白的抗氧化性质和NP的小直径来解释，如果与未包封的H.p.油性树脂的结晶形式相比，这可能增大表面与体积比。对WPC天然蛋白质的抗氧化能力(AOC)进行了测试，并发现其贡献了总ASX NP抗氧化能力的74.2％。

WPC ASX NP的细胞抗氧化活性

WPC ASX NP的AOC也通过使用模型细胞系进行了测试。起初，在三种不同的浓度(0.2mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml)测试了H.p.油性树脂和WPC NP对HepG2细胞的细胞毒性。所获得的结果(图39)显示WPC ASX NP的可忽略的毒性作用，以及用0.1mg/ml的H.p.油性树脂处理的细胞的略微的生存力下降。

细胞抗氧化活性(CAA)是由Wolfe及同事开发的。这是使用最多的用于研究在高度反应性物质存在的情况下细胞系统中抗氧化物质的作用的抗氧化技术中的一种。尽管该技术已经在使用HepG2细胞的微孔板实验装置中得到很好的确立，但我们将该系统应用于我们的样品的尝试并没有产生一致和可重现的结果。由于该原因，并且因为先前提及的方法在实验期间没有提供关于细胞生存力的任何信息，所以选择了基于流式细胞术的不同的方法。该方法给出在活细胞和非活细胞之间进行区分的机会，这是由于它们的光的前向散射性质和侧向散射性质。为了进行测定，选择来自成年小鼠的巨噬细胞细胞系(J774A.1)。与常用于CAA测定的HepG2相比，J774A.1细胞呈现较高的吞噬细胞活性，并且更容易操纵。此外，它们天然地能够产生大量的ROS。开发该方法的第一步是确定用于由细胞产生ROS的适当刺激。巨噬细胞经受不同的处理：热冲击，以及与不同的化学物质例如ABAP、H₂O₂一起孵育。然后ROS的产生将使DCFH-DA氧化，其中绿色荧光伴随发射。在处理中，如图40A-图40D中所示，相对于用ABAP(图40B)和热冲击(图40C)进行处理的荧光分布接近于由对照样品产生的信号(图40A)。在用H₂O₂处理的细胞的情况下(图40D)，荧光信号相对于对照大幅增强，强调了由这些应激细胞的ROS物质的较高的产量。由于该原因，选择用H₂O₂的处理，以诱导在时间方面强烈且均匀的ROD物质产生。

如荧光数据所示，在图41A中，WPC ASX NP能够以剂量依赖性方式比呈天然蛋白质和H.p.油性树脂形式的单独的WPC更有效地抑制荧光发射。特别地，WPC ASX NP示出分别比测试的最大浓度(14μg/ml)的H.p.油性树脂高4倍和比1％WPC溶液高5倍的AOC。有趣的是观察到，不同于ABTS，通过该体系WPC没有示出抗氧化性质，并且所有的活性看起来都与ASX有关。由纳米包封的体系示出的较高CAA可能源于就H.p.油性树脂形式而言细胞对ASX的较高摄取。在该比较(contest)中，另一个要强调的重点是以下事实：当与含水介质接触时，溶解在DMSO中的H.p.油性树脂的分散体可能已经形成了团聚物，这导致形成就NP体系而言具有较大尺寸的团聚物，以这种方式减少了细胞内活性成分的吸收。

如图41B中所示，还将NP的抗氧化能力与Trolox进行了比较。在所有测试浓度，呈NP形式的ASX示出较高的抗氧化活性。

ASX NP的细胞摄取

从实用和伦理的角度来看，通过体内系统测试NP的生物利用度是难以进行的。以这种方式，在过去十年中，体外模型(诸如通过共聚焦显微镜学系统进行的细胞摄取分析)已经引起了极大的兴趣，因为它可以提供关于复杂系统中NP的潜在命运的有用信息的事实。它还相对容易、快速地进行，并且它允许对多个样品进行相对廉价的筛选。

图42示出了由共聚焦显微镜获得的显微照片。特别地，对于HepG2细胞，ASX NP在孵育15分钟之后在细胞内是可见的，这强调了NP的摄取过程非常快，如通过荧光的略微增加可以观察到的，在孵育的第一小时和第二小时期间，积累看起来在之后进行。

ASX NP的摄取还可见于Caco2细胞中。NP显示出团聚在细胞膜附近，导致2小时之后较大的团聚物。

抑制研究

为了研究在ASX NP的情况下的细胞摄取机制，对HepG2细胞和Caco2细胞两者在内吞阻断条件存在的情况下对摄取进行了测试。在测试的条件4℃，所有的能量依赖性过程都被抑制，并且因此细胞内吞作用也被抑制。在图43A-图43B中，HepG2细胞示出86％的NP摄取抑制百分比，Caco2细胞示出68％的抑制。较低的摄取可能是由于降低的细胞活性和细胞膜的不足的流动性。仍被测量到的摄取可以通过残余ATP的存在来解释，残余ATP可以用于细胞中NP的运输。特别地，在内吞内化作用期间，当该过程由细胞膜穴样内陷和网格蛋白介导(caveolae-and clathrin-mediated)时的肌动蛋白丝的聚合和重排被报告，这看起来证实了我们先前关于在HepG2细胞的情况下NP在细胞摄取期间沿着肌动蛋白丝的特殊定位的观察结果(图42)。

实施例18

不同植物蛋白的H.p.油性树脂的纳米包封的评价

化学品和试剂

大豆分离蛋白(SPI)购自ACEF(米兰,意大利)。蛋白质组成(w:w)为80％的蛋白质。豌豆分离蛋白(PPI)和大米分离蛋白(RPI)购自Raab Vitalfood(Rohrbach，德国)。PPI蛋白质组成为80％(w/w)。RPI蛋白质组成为80％(w/w)。雨生红球藻粉末购自本地供应商(意大利)。乙酸乙酯、HPLC级丙酮、胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶和胆酸钠购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO,USA)。

表面虾青素

通过连续搅拌持续10分钟，用1ml的乙酸乙酯提取0.5ml体积的NP。使样品以12000rpm离心持续5分钟。如先前描述的，收集上清液，稀释并通过分光光度计分析。

SPI、PPI和RPI被用作可选择的包封剂基质，以通过乳液-溶剂蒸发技术改善ASX的水分散性和生物利用度。植物蛋白通常更好地被消费者接受，因为它们可以符合特定的文化和宗教指示，即素食、严格素食、无乳糖和按照犹太教规定制作的食物(kosher)。此外，根据EU条例(EU Food Information for Consumers Regulation第1169/2011号的附件II和Commission Delegated Regulation(EU)第78/2014号，Regulation(EU)第1169/2011号的修订的附件II)，豌豆蛋白和大米蛋白不被视为过敏源。

SPI ASX NP和PPI ASX NP的产生

使用先前描述的相同方法，SPI和PPI的包封参数的优化始于随着蛋白质和H.p.油性树脂的浓度变化的NP的尺寸和z-电势的变化的研究。考虑的第一个参数即包封ASX所需的蛋白质的浓度是至关重要的，因为在连续相中游离的未吸收的蛋白质分子的存在可能促进油滴的消耗和絮凝。

ASX SPI NP

SPI是目前最丰富的植物蛋白中的一种。它们呈现出高营养价值和作为乳化剂和组织化处理剂(texturizing agent)的合意的功能性质。从化学的角度来看，它们包含极性、非极性和带电荷的氨基酸的平衡组合物，并且因此它们能够结合具有不同化学特性的分子。SPI的主要部分包含大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。

在SPI ASX NP产生的情况下，与WPC不同，由于有限的蛋白质溶解度，使用比5％更浓的溶液获得NP是不可能的(参见图44A-图44B)。平均尺寸、PDI和ζ电势被认为是评价该工艺的性能的参考参数。在第一实验中，所有NP都是通过将H.p.油性树脂的量(1％)保持恒定和改变包封剂基质的量来产生的。如在图44A中呈现的，从103nm至200nm的范围内的尺寸，证实了尺寸对蛋白质浓度的强烈依赖性，以及植物蛋白给出较大NP的趋势，这可能是由于：这种蛋白质结合水的较高趋势(作为结果还增加了溶液的粘度)、刚性结构和致使蛋白质通过油/水界面的扩散较慢的较高的分子量所给出的较高的界面张力，以及与乳蛋白相比的疏水性氨基酸的降低的存在。对于在从0.24(0.1％的SPI)至0.25(5％的SPI)范围内的所有制剂，PDI值都是可接受的，描述了中等多分散的样品。如已经提及的，高于+20mV和低于-20mV的ζ电势值是NP稳定性的良好指标，SPI ASX NP对于所有样品显示出从-30mV至-35.8mV的高度负值(图44B)。与使用WPC获得的值相比，更负的值是由于大豆蛋白的化学结构和中性pH时带负电的基团更多的存在。

为了评价H.p.油性树脂浓度对NP产生的影响，将SPI浓度设定为1％。与使用WPC时不同，增加油性树脂的浓度导致NP尺寸的增长(图45A)，从使用1％油性树脂的83nm增长到使用4.5％油性树脂的125nm。进一步增加油性树脂的浓度导致直径的意外的减小。PDI值在0.23-0.28的范围内。如同WPC的情况，没有特别的趋势可以被理解，并且没有发现PDI与直径的相关性。1％油性树脂的样品给出了不太负的Z电势值(-19.7mV)(图45B)。该最新的结果可以考虑以下来解释：充当乳化剂的蛋白质和亲脂性分子之间的特定比率应当被关注。可能地，在包含1％蛋白质和1％H.p.油性树脂的样品的情况下，蛋白质的量相比于油性树脂的量高得多。

这种游离蛋白质级分连同新产生的NP的相互作用可能导致表面电荷的分配中和(partition neutralization)，从而解释该样品的低Z电势。随着H.p.油性树脂的量的增加，蛋白质/油性树脂比率的降低可以允许蛋白质迁移到油滴表面，产生对这些样品所测量的较高电荷。

所获得的ASX SPI NP(图46A-图46B)的特征是红橙颜色和略微乳白光(opalescence)，特别是在高蛋白质浓度的情况下(图46A)。该类型的系统中的乳白光可能是由通过高粒度(高于100nm)表征的颗粒的存在引起的，或者是由倾向于形成团聚物的蛋白质之间的相互作用引起的。

ASX PPI NP

对于使用PPI作为包封剂基质的ASX的纳米包封也进行了相同的分析。PPI的主要级分包括豆球蛋白(60,000Da)、豌豆球蛋白(50,000Da)和convicilin(70,000Da)。与SPI的情况一样，所测试的蛋白质浓度的百分比为从0.1％至5％，这是由于较高的蛋白质浓度导致产生不适合我们的目的的非常粘性的溶液的事实。如图47A中所示，所获得的ASX PPI NP的平均直径在从94nm至130nm的范围内，其中NP的特征是分别用0.1％和5％的蛋白质浓度产生的较大的尺寸。Z电势在从-29.9mV至-24.4mV的范围内，强调了所产生的所有NP都通过以下表征：高度负电荷，并且因此针对絮凝和团聚现象的稳定性(图47B)。在蛋白质浓度和Z电势之间没有发现相关性。保持蛋白质浓度恒定(1％)，通过增加H.p.油性树脂的量，所获得的ASX PPI NP的尺寸在从100nm至140nm的范围内(图48A)，其中所产生的NP的尺寸与油性树脂的％相关，证实了在ASX SPI NP的情况下已经观察到的趋势。对于含有从1％至5％的H.p.油性树脂的制品，PDI在0.21和0.25之间，同时用7％的H.p.油性树脂产生的NP显示出较高的PDI，即0.257，这仍然可以被认为与中等多分散的体系有关。对于用最高浓度的H.p.油性树脂(9％和10％)产生的NP，毫无疑问地观察到显著较低的PDI(即0.19)。这些样品的较低的蛋白质与油性树脂比率产生了更均匀的具有较大平均尺寸的NP群体。所有样品的表面电荷都是高度负的，从-27.7mV至-31.9mV(图48B)，对H.p.油性树脂的量没有明显的依赖性。

植物蛋白包封性质的评价

商业的蛋白质分离物通常在乳化-溶剂蒸发技术中用作乳化剂，但有时与实验室纯化的蛋白质相比，它们在水相中示出差的溶解度，从而限制进一步放大该工艺的可能性。与分离物相关的典型问题是基质可能的不完全溶出，这可能引起大颗粒和团聚物的产生，阻碍工艺的效率。由于该原因，发明人决定研究经受以下不同预处理的蛋白质的包封性质：热处理、将pH调节到远离蛋白质的等电点的值以及这两个参数的组合。

大豆分离蛋白(SPI)

进行比较性测试以便了解蛋白质在包封之前的预处理(热、pH和两者的组合)是否可以对其溶解度具有影响，并且作为结果是否对ASX的包封效率具有影响。图49示出了获得的ASX SPI NP：所有的溶液都是透明的，并且示出橙红色的明亮颜色。

用未处理的蛋白质(N)获得最小直径，即135nm，用在pH 8溶解的蛋白质获得最大直径，即164.6nm(图50A)。所有制品的PDI值都在0.22和0.26的范围内。所有制品的Z电势值(图50B)都是高度负的，强调了所有制备的ASX SPI NP的很大程度的稳定性。

在表6中报告了用于评价包封工艺的两个重要参数：包封效率(EE)，指的是有效包封在NP内部的ASX的量；以及表面ASX(sASX)，它描述NP表面上存在的ASX的量。sASX可以容易地经历氧化反应，失去其结构完整性和功能性。由于该原因，推荐非常低的表面ASX值。

表6：预处理对ASX SPI NP的包封效率(EE％)和表面ASX％的影响。由相同字母指示的值之间的差异是在统计学上显著的(P<0.05)。

ASX SPI NP	EE％	sASX％
			未处理的	93±0.01<sup>abc</sup>	0.0037±0.0001<sup>AB</sup>
热	99±1.03<sup>a</sup>	0.0097±0.0004<sup>C</sup>
			pH	99±0.85<sup>b</sup>	0.0261±0.0023<sup>AC</sup>
pH+热	96±0.14<sup>c</sup>	0.0153±0.0004<sup>B</sup>

所有样品的EE都是高的，其中对于热处理的样品获得99％的最高值。对于样品N获得最低值，具有93％的EE。由样品H显示的较高的EE可能是温度诱导的蛋白质构象变化的结果，蛋白质构象变化可以允许更好地分配油相。所有样品的表面ASX的量是可忽略的：从0.026％至0.0037％。

豌豆分离蛋白(PPI)

ASX PPI NP的外观在图51中示出。溶液是透明的并且颜色是橙红色。样品之间没有观察到明显的差异。

获得的NP的平均尺寸(图52A)小于用SPI获得的那些平均尺寸，并且更类似于用WPC获得的那些平均尺寸。样品H给出了具有最小平均尺寸(91nm)的NP，经pH处理的样品和经pH+热处理的样品给出了较大的NP直径(约100nm)。所有样品的PDI值都非常类似，在从0.25至0.265的范围内，强调了蛋白质的预处理可能对ASX PPI NP的尺寸分布没有相当大影响。所有样品的Z电势值都是高度负的(图52B)，并且在样品之间没有显著差异可观察到。EE％在从94％-96％的范围内，其中样品N呈现出最低的值，并且样品H呈现出最高的值。样品H还表现出最低的表面ASX量，0.026％，并且样品N表现出最高的表面ASX量，0.0325％。与SPI相比，sASX总的来说较高，但仍然非常低(表7)。

表7：预处理对ASX PPI NP的包封效率(EE％)和表面ASX％的影响

ASX PPI NP	EE％	sASX％
			未处理的	94±2.6	0.033±0.0005
热	96±0.5	0.027±0.0001
			pH	93±1.4	0.028±0.0012
pH+热	95±0.3	0.027±0.0003

大米分离蛋白(RPI)

为了鉴定新颖的非致敏且无麸质的候选蛋白质，发明人还尝试采用大米分离蛋白(RPI)。如图53中所示，使用这种蛋白质作为乳化剂来获得ASX NP是不可能的：对于所有样品都观察到大量的未包封的ASX和乳白光，可能是因为存在团聚的或未溶解的蛋白质。据本发明人所知，在文献中没有报告涉及这种类型的用于通过乳化-溶剂蒸发技术进行纳米颗粒产生的基质的数据。在研究中，旨在除去不溶性蛋白质级分即谷蛋白的纯化步骤的缺乏可能负面地影响工艺。这种蛋白质级分的特征是二硫键的高度存在和高分子量。这些特性使RPI成为不足的乳化剂，并且因此不适合用于NP产生。

所获得的数据表明，SPI和PPI可以用于NP产生，该NP在小粒度、窄PDI和聚结稳定性方面具有令人满意的结果。在这两种情况下，通过加热和/或调节pH进行的蛋白质的预处理不导致包封性能的显著变化。由于该原因，在接下来的实验中发明人决定避免这些处理。

通过模拟消化来评价ASX释放

通过模拟胃肠消化来评估ASX从ASX SPI NP和ASX PPI NP中的体外释放，并将结果与ASX WPC NP进行比较。这些实验数据对于研究释放概况的可能差异以及因此包封的活性分子的生物可利用度的可能差异是重要的。理想地，ASX的释放应该发生在肠内，吸收被认为发生在肠内。ASX的时间依赖性释放在图54中示出。在时间0，ASX从ASX WPC NP中的释放是最高的，占总量的36％。ASX SPI NP和ASX PPI NP示出类似的模式，具有22％-23％的释放。所有制剂的这种初始释放可能是由于胃介质的酸性条件(pH 3)，其可能使NP结构不稳定。为了进一步证实该假设，通过显微镜学和DLS分析了ASX PPI NP的平均尺寸(图55A-图55B)，示出GS中团聚物的形成。由于样品中的高PDI(>1)和团聚物的存在，获得关于粒度的信息是不可能的。在GS结束时，ASX从ASX WPC NP和ASX PPI NP中的释放是相当的，即分别为45％和46％。高得多的是从ASX SPI NP中的释放，其占总ASX的80％。对于ASX WPC NP和ASX PPI NP两者，在肠期(IS)期间ASX的释放在最初3小时内持续增加，但SPI制剂除外，由于在GS期间释放了大量的ASX，在IS的第一小时达到99.7％的释放之后，该制剂示出平稳状态。在IS结束时，从三种制剂中释放的ASX的量同等地在从96％和94％的范围内。

实施例19

葵花油的包封

遵照先前对于ASX NP所描述的相同程序，使用葵花油用于包封。在该情况下，成功地包封了71％(w/w)的葵花油。图56A-图56C示出了在溶剂蒸发之后，在以15000rpm离心持续5分钟之后获得的NP溶液。在图56B和图56C中，在图像中可以观察到没有未包封的油。

实施例20

NP尺寸的控制

颗粒的尺寸可以以不同的方式减小和增加：调节能量的量、设备的类型或在纳米乳液制备期间使用的循环次数。例如，发明人能够如已经描述的使用10W的功率对溶液声处理持续10分钟而不是5分钟，来将NP尺寸从100nm减小到60nm。相反，本发明人能够使用高剪切均化器以13500rpm持续5分钟以产生乳液，在1μm的范围内增加粒度。还观察到，溶液内部固体的浓度可能对产生的颗粒的尺寸具有影响。由于低分子量，水解蛋白质的使用可能有助于减小颗粒的直径。在这种特定情况下，使用先前针对ASX NP描述的相同的配方和制备程序，但使用水解乳清蛋白而不是乳清分离蛋白，发明人能够获得56nm的颗粒(图57)。

尽管本发明已经结合其特定的实施方案进行了描述，但明显的是，许多替代方案、修改和变型将对本领域技术人员是明显的。因此，意图包括落入所附权利要求的精神和宽范围内的全部这样的替代方案、修改和变型。

本说明书中提及的全部出版物、专利和专利申请通过引用到本说明书中以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地指示为通过引用并入本文。此外，本申请中的任何参考文献的引用或识别不应被理解为承认这样的参考文献作为本发明的现有技术是可获得的。在使用章节标题的程度上，其不应被理解为必定是限制性的。

Claims (38)

1.一种颗粒，包含：(i)至少一种化合物，所述至少一种化合物具有至少部分地包围所述至少一种化合物的基于蛋白质的壳，以及(ii)包含多糖的包衣，所述包衣包封至少一种带壳化合物。

2.根据权利要求1所述的颗粒，具有5nm至10000nm的直径。

3.根据权利要求1所述的颗粒，具有1μm至500μm的直径。

4.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述至少一种化合物和所述壳具有5nm至300nm的直径。

5.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述部分地包围是所述至少一种化合物的总表面的至少85％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的颗粒，包含1％至80％(w/w)的所述化合物。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的颗粒，包含0.1％至99％(w/w)的所述基于蛋白质的壳。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的颗粒，其中所述化合物在所述颗粒中的浓度为0.01mg/g至500mg/g。

9.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述至少一种化合物可溶于有机溶剂。

10.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述至少一种化合物选自由以下组成的组：亲脂性化合物、挥发性有机化合物、香精、蛋白质、芳香剂、维生素、亲脂性代谢物、部分亲脂性代谢物或其任何组合。

11.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述基于蛋白质的壳选自由以下组成的组：乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、胶原或其任何组合。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的颗粒，其中所述至少一种化合物包括虾青素、姜黄素、ω3、咖啡因、β-胡萝卜素、鱼油、葵花油、植物甾醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、辅酶Q10、大麻素或其功能性衍生物、维生素D或其任何组合。

13.根据权利要求1所述的颗粒，还包含与所述基于蛋白质的壳的至少一部分相互作用的阳离子聚合物。

14.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述相互作用是静电相互作用。

15.根据权利要求1或14中任一项所述的颗粒，具有50nm至300nm的直径。

16.一种组合物，包含多个根据权利要求1至15中任一项所述的颗粒。

17.根据权利要求16所述的组合物，选自由以下组成的组：可食用组合物、膳食补充剂组合物、药物组合物、农用化学组合物或化妆品组合物。

18.根据权利要求16所述的组合物，呈粉末的形式。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述粉末包含1％至80％(w/w)的所述至少一种化合物。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述粉末具有0.5mg/g至500mg/g的含量的至少一种化合物。

21.根据权利要求16所述的组合物，其中当重新分散在水中时，至少80％的所述颗粒具有在5nm至300nm的范围内的尺寸。

22.根据权利要求16至21中任一项所述的组合物，具有0.05至0.7的多分散性指数。

23.根据权利要求16所述的组合物，其中具有至少部分地包围所述至少一种化合物的基于蛋白质的壳的所述至少一种化合物具有-50mV至-10mV的ζ电势。

24.根据权利要求16至23中任一项所述的组合物，具有抗氧化活性。

25.根据权利要求16所述的组合物，其中所述颗粒具有0mV至100mV的ζ电势。

26.根据权利要求16至25中任一项所述的组合物，其中20％至90％的所述化合物在生理条件下在肠期释放。

27.一种用于包封化合物的方法，包括以下步骤：

a.将化合物和溶剂混合，

b.将所述化合物和所述溶剂与蛋白质或多糖或两者混合，从而获得纳米乳液；

c.蒸发所述溶剂，从而获得颗粒；以及

d.使具有蛋白质、多糖或其混合物的所述颗粒干燥，

从而包封所述化合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述颗粒具有5nm至300nm的直径。

29.根据权利要求27所述的方法，包括在所述干燥之前添加阳离子聚合物的步骤。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述干燥是所述颗粒的喷雾干燥、粒化、团聚或其任何组合。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述化合物处于悬浮液中。

32.根据权利要求27所述的方法，其中所述溶剂具有在35℃至80℃的范围内的沸点。

33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其中所述溶剂包括乙酸乙酯。

34.根据权利要求27所述的方法，其中所述化合物和所述蛋白质以4:1至1:50(w/w)的比使用。

35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，具有60％至95％的包封产率。

36.根据权利要求27至35中任一项所述的方法，具有80％至100％的包封效率。

37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述化合物在所述颗粒中的浓度为0.01mg/g至500mg/g。

38.由权利要求27至37中任一项所述的方法产生的颗粒。

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