CN113376240A - 基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb2+的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测pb²⁺的方法：织物基微流控芯片的制作：该织物基芯片由亲水织物、疏水织物、棉线、支撑板和三电极系统组成，通过连接便携式电化学检测站，实现重金属的检测；镀金纸片的制作：CeMOF的制备；织物基微流控芯片检测Pb²⁺。该芯片是利用镀金工作电极，结合GR‑5DNAzyme，实现了重金属离子的快速检测，本发明的织物基微流控芯片有很好的重现性且省时、省力、廉价、减少溶剂使用、减少对环境的污染等。

Description

基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb2+的方法

技术领域

本发明涉及生物化学分析检测，特别涉及基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb²⁺的方法。

背景技术

铅是一种众所周知的高毒性重金属，其广泛应用导致了广泛的环境污染和重大的公共健康问题。由于其生物累积性和不可生物降解性，即使痕量的铅离子也会导致一系列不良健康后果。较高的Pb²⁺摄入量会通过在地下水和土壤中的循环对活生物体产生毒性作用。暴露于Pb²⁺会导致多种症状，尤其是儿童，如肌肉麻痹、易怒、贫血和记忆力丧失。Pb²⁺水平升高会延迟儿童的精神或身体发育，还会损害心血管、肾脏和神经系统。为保障食品安全和人类身体健康需要建立灵敏实时检测Pb²⁺的方法。Pb²⁺传统的检测方法包括色谱分析法和质谱分析法等，然而这些方法需要复杂的样品前处理步骤，使用昂贵的仪器，不适用于原位测量。因此需要建立一种灵敏的、有选择性的、实时快速的检测Pb²⁺的方法。

适配体是一种单链DNA或RNA，能够特异性捆绑相应的目标分子，可以显著提高传感器的选择性。铈-金属有机框架化合物CeMOF具有良好的电化学活性，利用其标记信号探针DNA可以获得灵敏的电化学信号。同时，织物基微流控芯片由于其廉价易得、制备简单、轻便实用、样品消耗少、无需流体驱动装置、可一次性使用、环境中易降解等优点，在医学快速诊断、食品安全快速检测以及环境质量快速监控等领域具有巨大的潜在应用价值。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供可定量、精确基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb²⁺的方法。

技术方案：本发明提供一种基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb²⁺的方法，包括如下步骤：

(1)织物基微流控芯片的制作：该织物基芯片由亲水织物、疏水织物、棉线、支撑板和三电极系统组成，支撑板上一端固定亲水织物，一端固定疏水织物，二者通过棉线连接，疏水织物端放置滤纸，滤纸上镀金膜，作为工作电极，上层叠加塑料盖板，其上设置铜线作为导线，与连接固定在塑料盖板上的AgCl参比电极和对电极，构建三电极体系，通过连接便携式电化学检测站，实现重金属的检测；

(2)镀金纸片的制作：将滤纸置于真空离子溅射仪中镀金膜；

(3)CeMOF的制备；

(4)织物基微流控芯片检测Pb²⁺：将CeMOF浸入EDC/NHS溶液中，活化CeMOF的羧基，使CeMOF与GR-5DNAzymeApt2组装，得到Apt2-CeMOF信号探针；将Apt1负载在镀金纸片上，得到Au-Apt1；将Apt2-CeMOF信号探针与Au-Apt1通过碱基互补配对原则进行连接；用移液枪在镀金纸片上加入不同浓度的Pb²⁺，利用织物基底结合镀金工作电极、AgCl参比电极和对电极三电极体系，通过连接便携式电化学检测站进行电化学测试。

当Pb²⁺存在时，DNA酶的基底DNA链被催化切断，用CeMOF标记的催化DNA链则会从镀金纸片上脱落，随着Pb²⁺浓度增加，脱落的催化DNA链的量也增加，峰电流强度值也随之下降，峰电流强度值与Pb²⁺的浓度呈负相关，得到峰电流和Pb²⁺浓度的线性方程以及检测限，从而实现Pb²⁺的定量测定。

进一步地，所述CeMOF的制备方法包括：吡咯与对甲酰基苯甲酸甲酯混合后加入丙酸使有机物完全溶解，将溶液加热回流冷却至室温，加入无水乙醇，抽滤得到粗产物，分别用乙醇和乙酸乙酯洗涤，最后将粗产物干燥提纯得到紫色卟啉前驱体，将卟啉前驱体和CeCl₃·7H₂O溶于N，N二甲基甲酰胺中，加入水，将生成的沉淀物过滤，水洗，再将所得固体用二氯甲烷溶解，然后用HCl和水萃取，有机层旋蒸得到紫红色粉末，紫红色粉末溶解在四氢呋喃和甲醇混合液中，然后加入KOH水溶液，加热后冷却至室温，然后酸化处理直至没有固体产生为止，抽滤所得固体，蒸馏水冲洗后干燥得到四羧基卟啉配体，将ZrCl4、四羧基卟啉配体、苯甲酸超声溶解于N，N二甲基甲酰胺中，反应，冷却至室温，再用N，N二甲基甲酰胺、丙酮洗涤后真空干燥得到CeMOF。

进一步地，Apt1的序列：

5’-tcctcgtatgttttgtagtgatccaacccaaaacatacgaggatcactaggttggatcgtatgttttgggttgggcggg-SH-3’。

进一步地，Apt2的序列：

5’-NH₂-atcactaggttggatcactaggttgggttttgtatgctcctagtgatccaacctagcatacaaattgggt-3’。

进一步地，CeMOF自身带有一个羧基，Apt2链的末端标记有-NH₂，二者被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基-琥珀酰亚胺(EDC/NHS)修饰，作为传感器的第二信号探针。

进一步地，Apt1负载在镀金纸片上的方法为：带有-SH的Aptl链在3’末端通过Au-S键固定在镀金纸片上。

进一步地，Apt2-CeMOF溶液修饰到镀金纸片表面的方法为利用碱基互补配对原则将被CeMOF标记的催化DNA链固定在镀金纸片上。

进一步地，Pb²⁺的浓度分别为0、0.005、0.01、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20nM。

有益效果：本发明的织物基微流控芯片可以实现即时、定量检测，避免了送样、检测、等待结果等复杂繁琐的步骤，同时无需专业人士进行操作，设备携带方便，可在待检测样本处实现快速分析。另外，它可以通过棉线的对折，设立多通道，从而进行多组分的检测。

附图说明

图1为CeMOF材料的SEM图；

图2为织物基微流控芯片图；

图3为检测Pb²⁺原理图。

具体实施方式

织物基微流控芯片的构建：

(1)镀金纸片的制作：将滤纸裁剪成直径40mm的小圆片，置于真空离子溅射仪中，在溅射电流30mA、溅射时间80s的条件下镀金膜；

(2)CeMOF的制备：吡咯(3.0g，0.043mol)与对甲酰基苯甲酸甲酯(6.9g，0.042mol)置于250mL三颈烧瓶中，然后加入100mL丙酸使有机物完全溶解。将溶液置于油浴锅中140℃加热回流1h后冷却至室温，加入50mL无水乙醇置于4℃过夜，抽滤得到粗产物，分别用乙醇和乙酸乙酯洗涤两次，最后将粗产物干燥提纯得到紫色卟啉前驱体。将卟啉前驱体(1.0g)和CeCl₃·7H₂O(2.5g)溶于100mL N，N二甲基甲酰胺中，100℃回流6h，冷却至室温后，加入150mL水。将生成的沉淀物过滤，用水洗涤，再将所得固体用二氯甲烷溶解，然后用HCl和水萃取，有机层旋蒸得到紫红色粉末。紫红色粉末(0.85g)溶解在60mL四氢呋喃和60mL甲醇混合液中，然后加入60mL KOH水溶液，水溶液中含有6.82gKOH.80℃加热此混合溶液并保持12h后冷却至室温。然后利用1M HCl溶液对此固体进行酸化处理直至没有固体产生为止。抽滤所得固体，用大量蒸馏水进行冲洗后干燥得到四羧基卟啉配体。将ZrCl₄(75mg)、四羧基卟啉配体(50mg)、苯甲酸(2.7g)超声溶解于15mL N，N二甲基甲酰胺中，混合物置于140℃反应24h，冷却至室温，再用N，N二甲基甲酰胺、丙酮洗涤后真空干燥得到CeMOF。

(3)织物基微流控芯片的制作：该织物基芯片由亲水织物、疏水织物、棉线、支撑板和三电极系统组成。在支撑板上，一端固定亲水织物，一端固定疏水织物，二者通过棉线连接。疏水织物端放上一个圆形滤纸，在其上镀金膜，作为工作电极，上层叠加一个塑料盖板，其上铜线作为导线，通过连接固定在塑料盖板上的AgCl参比电极和对电极，构建三电极体系，通过连接便携式电化学检测站，实现重金属的检测。亲水织物制备吸水垫与棉线共同组成唾液储存池，固定在支撑板的一侧；亲水织物侧可以固定在河蟹的口部采集唾液。将疏水织物(含有Apt2-CeMOF和Au-Apt1)固定在支撑板上构建微流控芯片。弯折疏水织物，将微流控芯片测试单元固定在河蟹背上。通过棉线将唾液引流至测试部位进行测试。利用织物基底结合固定在塑料片对电极和工作电极进行电化学测试。

实验中用的的Tris缓冲液为20mM的Tris、140mM的NaCl、5mM的MgCl₂的pH为7.4的20mMTris-HCl缓冲液。

检测原理见图3：将Apt1负载在镀金的纸片上，得到Au-Apt1；将CeMOF浸入新鲜制备的20mM EDC/NHS溶液中30分钟，以活化CeMOF的羧基，从而使CeMOF与Apt2组装，得到Apt2-CeMOF信号探针；Apt2-CeMOF信号探针与Au-Apt1会通过碱基互补配对原则进行连接；当加入不含重金属离子的溶液时，Au-Apt1不会断裂，Apt2-CeMOF信号探针与Au-Apt1会维持连接状态，峰电流强度较高。当含重金属离子的溶液，将其滴加到镀金纸片中，Au-Apt1链被催化切断，用CeMOF标记的Apt2-CeMOF链则会从镀金纸片上脱落，随着重金属离子浓度增加，脱落的催化DNA链的量也增加，峰电流强度值也随之下降，峰电流强度值与重金属离子的浓度呈负相关，从而实现重金属离子的定量测定。

Claims (8)

1.一种基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测pb²⁺的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)织物基微流控芯片的制作：该织物基芯片由亲水织物、疏水织物、棉线、支撑板和三电极系统组成，支撑板上一端固定亲水织物，一端固定疏水织物，二者通过棉线连接，疏水织物端放置滤纸，滤纸上镀金膜，作为工作电极，上层叠加塑料盖板，其上设置铜线作为导线，与连接固定在塑料盖板上的AgCl参比电极和对电极，构建三电极体系，通过连接便携式电化学检测站，实现重金属的检测；

(2)镀金纸片的制作：将滤纸置于真空离子溅射仪中镀金膜；

(3)CeMOF的制备；

(4)织物基微流控芯片检测pb²⁺：将CeMOF浸入EDC/NHS溶液中，活化CeMOF的羧基，使CeMOF与GR-5DNAzymeApt2组装，得到Apt2-CeMOF信号探针；将Apt1负载在镀金纸片上，得到Au-Apt1；将Apt2-CeMOF信号探针与Au-Apt1通过碱基互补配对原则进行连接；用移液枪在镀金纸片上加入不同浓度的Pb²⁺，利用织物基底结合镀金工作电极、AgCl参比电极和对电极三电极体系，通过连接便携式电化学检测站进行电化学测试。

2.根据权利要求1所述的基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb^{2 +}的方法，其特征在于：所述CeMOF的制备方法包括：吡咯与对甲酰基苯甲酸甲酯混合后加入丙酸使有机物完全溶解，将溶液加热回流冷却至室温，加入无水乙醇，抽滤得到粗产物，分别用乙醇和乙酸乙酯洗涤，最后将粗产物干燥提纯得到紫色卟啉前驱体，将卟啉前驱体和CeCl₃·7H₂O溶于N，N二甲基甲酰胺中，加入水，将生成的沉淀物过滤，水洗，再将所得固体用二氯甲烷溶解，然后用HCl和水萃取，有机层旋蒸得到紫红色粉末，紫红色粉末溶解在四氢呋喃和甲醇混合液中，然后加入KOH水溶液，加热后冷却至室温，然后酸化处理直至没有固体产生为止，抽滤所得固体，蒸馏水冲洗后干燥得到四羧基卟啉配体，将ZrCl₄、四羧基卟啉配体、苯甲酸超声溶解于N，N二甲基甲酰胺中，反应，冷却至室温，再用N，N二甲基甲酰胺、丙酮洗涤后真空干燥得到CeMOF。

3.根据权利要求1所述的基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测pb^{2 +}的方法，其特征在于：

Apt1的序列：

5’-tcctcgtatgttttgtagtgatccaacccaaaacatacgaggatcactaggttggatcgtatgttttgggttgggcggg-SH-3’。

4.根据权利要求1所述的基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测pb^{2 +}的方法，其特征在于：

Apt2的序列：

5’-NH₂-atcactaggttggatcactaggttgggttttgtatgctcctagtgatccaacctagcatacaaattgggt-3’。

5.根据权利要求1所述的基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb^{2 +}的方法，其特征在于：CeMOF自身带有一个羧基，Apt2链的末端标记有-NH₂，二者被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基-琥珀酰亚胺(EDC/NHS)修饰，作为传感器的第二信号探针。

6.根据权利要求1或3所述的基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测Pb²⁺的方法，其特征在于：Apt1负载在镀金纸片上的方法为：带有-SH的Apt1链在3’末端通过Au-S键固定在镀金纸片上。

7.根据权利要求1所述的基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测pb^{2 +}的方法，其特征在于：Apt2-CeMOF溶液修饰到镀金纸片表面的方法为利用碱基互补配对原则将被CeMOF标记的催化DNA链固定在镀金纸片上。

8.根据权利要求1所述的基于CeMOF标记的DNA适配体构建的织物基微流控芯片检测pb^{2 +}的方法，其特征在于：Pb²⁺的浓度分别为0、0.005、0.01、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20nM。

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