CN113308517B - 多重耐药微生物的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多重耐药微生物的检测方法，该检测方法先用核酸适配体磁珠捕获多重耐药微生物，并释放出与适配体互补的阻断序列，将蛋白质信号转化为核酸信号，再通过指数扩增反应扩增阻断序列，对扩增后的阻断序列进行测定。本发明在指数扩增反应体系中加入分子增强剂来抑制非特异性扩增反应，在测定过程中加入纳米级过渡金属二卤族化合物作为结果读取载体，进一步降低背景信号的强度。本发明操作简便、高效,可实现无背景、快速、超敏检测的目的，能解决传统检测技术检测周期长、灵敏度低、检测结果存在背景信号、受人为主观因素影响导致结果判读不准确、等温扩增反应存在严重的非特异性扩增等关键技术问题。本发明适用于检测微生物的耐药性。

Description

多重耐药微生物的检测方法
技术领域
本发明属于多重耐药细菌蛋白检测技术领域，涉及一种耐药微生物，具体地说是一种多重耐药微生物的检测方法。
背景技术
磁珠是一种具有磁性的纳米颗粒，因其表面积大、易于修饰、分离方便等优势，在致病性细菌的分离与检测中具有广泛的应用。通过在磁珠表面修饰官能团，如链霉亲和素、羧基等，可以将核酸、抗体等生物分子连接到磁珠表面形成功能性磁珠。其中适配体功能化磁珠（Aptamer-Functionalized Magnetic Beads，AFMBs）具有特异性高、易分离等特点，受到广泛关注。
核酸适配体一种低聚DNA或RNA，由指数富集法筛选得到，对相应配体具有极强的结合能力，它们能高特异性的捕获目标，其结合能力强于DNA双链间的氢键，是将蛋白质信号转化为核酸信号的理想的信号转换器。近年来，已有大量基于AFMBs的分析方法被报道用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌的分析，通过结合电化学、荧光、PCR等下游信号分析策略，AFMBs可以实现对各种细菌的检测。然而，由于信号读出方法的局限性，绝大多数传感策略的背景信号都不稳定，影响了对结果的判断。
纳米级别的过渡金属二卤族化合物因其具有可吸附单链DNA和猝灭荧光等特性，近年来受到广泛关注。纳米级别的过渡金属二卤族化合物基面与碱基之间可通过范德华力结合，从而实现对单链DNA的强力吸附。当单链DNA杂交形成双链DNA时，碱基被高密度的嵌入负螺旋磷酸盐主链中，与纳米级别的过渡金属二卤族化合物基面之间的相互作用力大大减弱，导致双链DNA会脱离。尽管基于纳米级别的过渡金属二卤族化合物的传感器已经大量开发，但由于缺乏信号放大技术，其灵敏度受到限制。
等温扩增技术是一种能够在恒温条件下快速高效地扩增核酸序列的新型扩增技术，近年来发展十分迅速。等温扩增技术种类繁多，常见的有指数扩增反应（EXPAR）、环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增、杂交链式反应、滚环扩增技术等。等温扩增技术因其反应时间短、无需设备支持的优势，解决了传统核酸检测系统依赖设备、耗时长的问题，在病原微生物检测方面显示出巨大的潜力。
目前常见的多重耐药微生物检测方法主要分为三大类，即培养法、免疫检测法和核酸扩增法。
培养法：培养法是目前临床应用最为广泛的多重耐药微生物检测方法，利用多重耐药微生物对抗生素药物的耐药性，使其在具有抗生素药物的培养基中培养，通过观察生长情况进行判断。目前基于培养的多重耐药微生物检测方法包括：纸片扩散法、显色培养基法和琼脂筛选法等。其中，纸片扩散法是目前最为常用的多重耐药微生物检测方法。将抗生素纸片贴在涂有多重耐药微生物的培养基上，培养一段时间后测量抑菌圈大小，抑菌圈≤11 mm为多重耐药细菌，≥17 mm为普通细菌。培养法具有检测结果准确，选择性高，无需大型仪器设备支持等优势，但由于受到技术自身的限制，需要复杂的细菌培养步骤，导致检测周期长达1-2天，且灵敏度较低，无法定量，检测结果的判读往往依赖于实验人员的主观判断，因此难以实现MRSA感染的早期精准检测。
抗原检测法：多重耐药微生物表面均存在标志性抗原作为检测靶标，目前常见的用于多重耐药微生物诊断的免疫检测法是乳胶凝集法。乳胶凝集法是一种间接凝集方法，以乳胶颗粒作为载体，将可溶性抗原吸附在乳胶颗粒表面，当相应的抗体与其特异性结合后，可产生凝集反应，并通过肉眼进行判断。抗原检测法具有特异性高、操作简便、检测时间短、不需要专业仪器设备支持等独特优点，尤其适用于现场检测，在临床检验中被广泛应用。然而，由于抗原抗体反应的局限性，其检测灵敏度不高，且具有显著的背景信号。
PCR扩增法：PCR扩增法是目前应用较为广泛的一种核酸检测方法。模板DNA在94℃条件下变性解旋，55℃退火与引物结合，72℃引物延伸形成两条完整的双链，经过多次循环后实现指数级扩增。利用多重耐药细菌特异性表面蛋白对应的编码基因位点设计扩增引物，并裂解细菌提取其中的DNA，在固定的反应条件下进行扩增反应，并通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，最终实现多重耐药微生物的定性检测。PCR法具有较培养法和抗原检测法更高的灵敏度，且显著缩短了检测时间，但仍然存在无法定量、灵敏度达不到早期检测要求的问题。
发明内容
本发明的目的，旨在提供一种多重耐药微生物的检测方法，以实现无背景、快速、超敏检测的目的，并解决传统检测技术检测周期长、灵敏度低、检测结果存在背景信号、受人为主观因素影响导致结果判读不准确、等温扩增反应存在严重的非特异性扩增等关键技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种多重耐药微生物的检测方法，该检测方法包括依次进行的以下步骤：
S1.蛋白质信号的转换
（11）取核酸适配体，加入 blocker溶液X，水浴反应、冷却后，得到混合产物A，备用；
（12）将混合产物A加入磁珠溶液中，和缓冲液混合后，进行孵育，得到适配体功能化磁珠；
（13） 取待测菌液，加入适配体功能化磁珠中进行置换反应后，弃去磁珠、取上清液，得blocker溶液Y；
S2.核酸信号的放大
将由限制性内切酶、DNA聚合酶、缓冲液G、分子增强剂、扩增模板、dNTP、缓冲液H和blocker溶液Y混合后，进行指数扩增反应，得扩增反应产物C；
S3.核酸信号的检测
将荧光探针、扩增反应产物C加入过渡金属二卤族化合物纳米片溶液或石墨烯纳米片溶液中，水浴，测定荧光强度。
作为一种限定，步骤（11）中：
所述核酸适配体为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌适配体、多重耐药铜绿假单胞菌适配体、耐万古霉素肠球菌适配体、多重耐药鲍曼不动杆菌适配体、耐甲氧西林表皮葡萄球菌适配体和耐红霉素肺炎链球菌适配体中的一种，浓度为5-20μM；
所述blocker为与核酸适配体互补的单链DNA；
所述水浴反应温度为80-120℃，时间为3-10min；
所述冷却后温度为0-40℃；
所述核酸适配体、 blocker溶液X的体积比为1:1-10。
作为另一种限定，步骤(12)中:
所述磁珠为四氧化三铁、三氧化二铁和铁锰酸磁性纳米颗粒中的一种，浓度为10mg/mL；
所述缓冲液为EDC溶液、NHS溶液或两者混合溶液，浓度为10mg/mL；
所述混合产物A、磁珠溶液和缓冲液的体积比为30-50:110-180:1；
所述孵育的温度为15-35℃，时间为10-20h。
作为第三种限定，步骤(13)中:
所述置换反应的温度为20-50℃，转速为20-300rpm，时间为1-30min。
作为第四种限定，步骤S2中，所述限制性内切酶为10000 U/mL的Nt.BstNBI限制性内切酶；所述DNA聚合酶的浓度为 2000 U/mL ，所述缓冲液G为10×Thermopol 缓冲液，所述扩增模板是3’和5’端完全相同、与blocker互补且可以被限制性内切酶识别的DNA序列，浓度为10μM，dNTP浓度为10 mM，缓冲液H为10×NEB缓冲液。
作为第五种限定，步骤S2中，所述分子增强剂为四甲基氯化铵、牛血清白蛋白和单链结合蛋白中的一种，浓度为1mg/mL；所述限制性内切酶、DNA聚合酶、缓冲液G、模板溶液、dNTP溶液、缓冲液H、blocker溶液Y和分子增强剂的体积比为2-5:2-5:6-12:0.5-3:1-5:2-7:1-5:5-25；指数扩增反应温度为55-65℃，时间为20-60 min。
作为第六种限定，步骤S3中:
所述荧光探针中的序列为与blocker互补的DNA片段；
所述荧光探针中的荧光基团为Cy5、Cy3、FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、FITC、罗丹明、IAF、Cy7和TRITC中的一种，浓度为10μM；
所述过渡金属二卤族化合物为MoS2、WS2、MoSe2、TiSe2和WTe2中的一种，浓度为1mg/mL；
所述荧光探针、扩增反应产物C和过渡金属二卤族化合物纳米溶液或石墨烯溶液的体积比为0.5-2:3-7:0.5-2。所述水浴温度为20-50℃，时间为20-100 min。
本发明的多重耐药微生物无背景检测方法的原理：
本发明检测原理如图1所示，本发明所提出的无背景多重耐药微生物检测系统由三个模块组成：信号转换模块，信号放大模块，信号读取模块。
(i)当适配体-blocker双链修饰的磁珠上的适配体与多重耐药微生物特异性结合时，其构象会发生改变，同时释放出单链的blocker，从而实现信号转换；
(ii)分离的blocker与EXPAR模板杂交，EXPAR模板的3’和5’端是完全相同且与阻断序列（blocker）互补的序列，其中一个负责与blocker杂交，另一个在DNA聚合酶的作用下延伸，直到在EXPAR的模板的另一端产生一个新的blocker序列，随后切刻内切酶在双链模板上的识别位点处切割并释放blocker。然后DNA聚合酶再次与模板结合，开始一个新的循环，实现blocker的信号放大；
(iii)将与blocker完全互补的标记有荧光基团的探针加入到纳米级过渡金属二卤族化合物溶液中，使其完全吸附在纳米级过渡金属二卤族化合物表面，展现出无法读取的荧光强度。当blocker存在时，荧光探针与blocker杂交形成DNA双链并从纳米级过渡金属二卤族化合物上脱落，Cy5的荧光表现出明显的恢复。通过读取荧光信号值即可实现多重耐药微生物的无背景检测。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
(1)本发明提出了一种多重耐药微生物无背景检测方法，在检测流程上进行了优化，选择改进版的EXPAR作为扩增手段，即加入四甲基氯化铵、牛血清白蛋白和单链结合蛋白作为分子增强剂，抑制非特异性扩增的产生，该方法可在1小时内实现无背景荧光干扰的多重耐药微生物检测，灵敏度达到5个菌落/mL；
(2)本发明的检测方法利用用适配体修饰的磁珠将蛋白信号转换为核酸信号，显著提高了检测特异性，同时采用EXPAR进行信号放大，显著提高了检测灵敏度。且通过纳米级过渡金属二卤族化合物作为结果读取载体，进一步降低了背景信号强度，提高了检测精度，在多重耐药细菌感染早期诊断中具有极大的推广应用价值；
(3)本发明构建的检测方法，解决了传统检测技术检测周期长、灵敏度不够、检测结果往往存在背景信号、受人为主观因素影响，导致结果判读不准确和等温扩增反应存在严重的非特异性扩增的关键技术问题，提供了一种快速、超敏的多重耐药微生物检测方法。
本发明适用于细菌感染患者的耐药情况检测，创伤患者的耐药菌感染检测。
附图说明
图1是无背景多重耐药微生物检测原理示意图；
图2是MoS2纳米片的表征示意图；
图3是用聚丙烯酰胺凝胶电泳评估非特异性扩增的抑制结果示意图；
图4是不同浓度梯度的MRSA溶液的荧光光谱示意图；
图5是根据荧光峰值绘制的标准曲线示意图；
图6是加入106 CFU/mL的MDR-Pa溶液后的荧光光谱示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
实施例1 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法
本实施例包括依次进行的以下步骤：
S1.蛋白质信号的转换
①将10μM的MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）适配体溶液100μL和10μM的blocker溶液100μL，在100℃水浴中反应10 min，自然冷却至20℃，得到混合产物A1，备用；
②将混合产物A1加入到600μL浓度为10mg/mL的四氧化三铁磁珠溶液中，再加入5μL浓度为10mg/mL的EDC溶液，在15℃条件下孵育20h，得到适配体功能化磁珠B1；
③取待测菌液，加入适配体功能化磁珠B1中，于50℃、转速为20rpm的条件下，进行置换反应30min后，用磁铁吸出磁珠，取上清液，得blocker溶液Y1；
S2.MoS2纳米片的合成及表征
在40m去离子水中加入0.3 g二水合钼酸钠，超声分散3-5min，调整溶液pH值至6.5，加入L-半胱氨酸0.8g，将溶液稀释至80mL，用氮气搅拌90min，将溶液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的高压灭菌器中，置于180°C的电热恒温干燥箱中48h，冷却至25℃后，用无水乙醇洗涤3次，然后真空冷冻干燥24 h，即得MoS2纳米片；
对上述MoS2纳米片的表征进行验证：
取10 mg 的MoS2纳米片放入离心管中，加入无水乙醇溶解，超声15 min进行分散，将分散后的溶液滴加到碳支持膜上，并将碳支持膜放到样品杆上，在透射电镜中进行测试，测定结果如图2所示；
根据图2可知，本实施例合成的MoS2纳米片为纳米级别的片状结构；
S3.核酸信号的放大
将10000 U/mL的 Nt.BstNBI限制性内切酶2μL、2000 U/mL 的DNA聚合酶 2μL、10×Thermopol Buffer溶液5μL、10μM的模板0.5 μL、10 mM的dNTP溶液1.5μL、10×NEB缓冲液2.5μL 、10μM的blocker溶液Y1 1μL和1mg/mL的四甲基氯化铵1μL于涡旋振荡器中混合后，在60°C条件下反应35min后，在98°C条件下反应15min，得扩增反应产物C1；
用聚丙烯酰胺凝胶电泳评估非特异性扩增的抑制情况，结果如图3所示，从泳道4和泳道5可以看到在加入四甲基氯化铵后，非特异性扩增显著降低，几乎观察不到靶标的条带，证明了在加入四甲基氯化铵后，可以显著控制EXPAR的非特异性扩增；
S4.无背景检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
将10μM的Cy5荧光探针20μL加入到1mg/mL的 MoS2纳米片溶液100μL中，30℃条件下反应10min。将20μL的扩增反应产物C加入溶液中，37℃水浴反应60 min。采用荧光分光光度计(激发波长为646-652nm)测定668 nm处溶液的荧光强度；
S5.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测结果
将MRSA菌液稀释到依次稀释到10-106 CFU/mL，取100 μL分别加入到50 μL的适配体功能化磁珠B1中，在摇床上37℃反应10 min，磁分离后取上清进行EXPAR扩增，将扩增产物加入到200 μL含有Cy5荧光探针的MoS2纳米片溶液中，在37℃水浴反应10 min，用荧光分光光度计测量其荧光光谱，测定结果如图4和图5所示；
根据图4可知，浓度为106 CFU/mL的菌液在波长为668nm处出现荧光强度的峰值；
根据图5可知，不同浓度菌液的荧光强度峰值呈现出线性关系。
实施例2 一种多重耐药铜绿假单胞菌的检测方法
S1.蛋白质信号的转换
①将10μM的多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-Pa）适配体溶液100μL和10μM的blocker溶液100μL混合，在90℃水浴中反应3 min，自然冷却至30℃，得到混合产物A2，备用；
②将混合产物A2加入到550μL浓度为10mg/mL的三氧化二铁磁珠溶液中，再加入5μL浓度为10mg/mL的NHS溶液，在35℃条件下孵育10h，得到适配体功能化磁珠B2；
③取待测菌液，加入适配体功能化磁珠B2中，于20℃、转速为100rpm的条件下，进行置换反应30min后，用磁铁吸出磁珠，取上清液，得blocker溶液Y2；
S2.单层石墨烯的合成
由98%的浓硫酸180mL和85%的浓磷酸20mL混合制备出200ml的混酸，取1.5g石墨置于500mL烧杯中，将混酸沿杯壁倒入放有石墨的烧杯中，将烧杯置于50℃的磁力搅拌油浴锅中搅拌，搅拌的同时加入9g的高锰酸钾，待高锰酸钾完全加入后继续加热6小时，在持续进行50℃加热搅拌条件下，向烧杯中持续加入15%的双氧水，使溶液颜色由黑色变成略带紫色最后到亮黄色，直到不再产生气泡为止，继续50℃加热搅拌3小时后，冷却至25℃，以9000rpm的条件离心洗涤3-5 min，洗涤5次，即得单层石墨烯；
S3.核酸信号的放大
将10000 U/mL的 Nt.BstNBI限制性内切酶2μL、2000 U/mL 的DNA聚合酶 2μL、10×Thermopol Buffer溶液5μL、10μM的模板0.5 μL、10 mM的dNTP溶液1.5μL、10×NEB缓冲液2.5μL 、10μM的blocker溶液Y2 1μL和1mg/mL的牛血清白蛋白1μL于涡旋振荡器中混合后，在60°C条件下反应35min后，在98°C条件下反应15min，得扩增反应产物C2；
S4.无背景检测多重耐药铜绿假单胞菌
将10μM的Cy3荧光探针20μL加入到1mg/mL的 单层石墨烯溶液100μL中，20℃条件下反应10min。将S3中EXPAR扩增产物20μL加入溶液中，37℃水浴反应60 min。采用荧光分光光度计(激发波长为646-652nm)测定668 nm处溶液的荧光强度。图6是加入106CFU/mL 的MDR-Pa溶液后的荧光光谱；
根据图6可知，加入菌液后在波长为668nm处出现荧光强度的峰值。

Claims (1)

1.一种非疾病诊断和治疗目的的多重耐药微生物的检测方法，其特征在于，该检测方法包括依次进行的以下步骤：
S1.蛋白质信号的转换
（11）取核酸适配体，加入 blocker溶液X，水浴反应、冷却后，得到混合产物A，备用；
（12）将混合产物A加入磁珠溶液中，和缓冲液混合后，进行孵育，得到适配体功能化磁珠；
（13）取待测菌液，加入适配体功能化磁珠中进行置换反应后，弃去磁珠、取上清液，得blocker溶液Y；
S2.核酸信号的放大
将由限制性内切酶、DNA聚合酶、缓冲液G、分子增强剂、扩增模板、dNTP、缓冲液H和blocker溶液Y混合后，进行指数扩增反应，得扩增反应产物C；
S3.核酸信号的检测
将荧光探针、扩增反应产物C加入过渡金属二卤族化合物纳米片溶液或石墨烯纳米片溶液中，水浴，测定荧光强度；
步骤（11）中：所述核酸适配体为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌适配体、多重耐药铜绿假单胞菌适配体、耐万古霉素肠球菌适配体、多重耐药鲍曼不动杆菌适配体、耐甲氧西林表皮葡萄球菌适配体和耐红霉素肺炎链球菌适配体中的一种，浓度为5-20μM；
所述blocker为与核酸适配体互补的单链DNA；
所述水浴反应的温度为80-120℃，时间为3-10min；
所述冷却后的温度为0-40℃；
所述核酸适配体、 blocker溶液X的体积比为1:1-10；
步骤(12)中： 所述磁珠为四氧化三铁、三氧化二铁和铁锰酸磁性纳米颗粒中的一种，浓度为10mg/mL；
所述缓冲液为EDC溶液、NHS溶液或两者混合溶液，浓度为10mg/mL；
所述混合产物A、磁珠溶液和缓冲液的体积比为30-50:110-180:1；
所述孵育的温度为15-35℃，时间为10-20h；
步骤(13)中： 所述置换反应的温度为20-50℃，转速为20-300rpm，时间为1-30min；
步骤S2中，所述限制性内切酶为10000 U/mL的Nt.BstNBI限制性内切酶；所述DNA聚合酶的浓度为 2000 U/mL ，所述缓冲液G为10×Thermopol 缓冲液，所述扩增模板是
3’和5’端完全相同、与blocker互补且可以被限制性内切酶识别的DNA序列，浓度为10μM，dNTP浓度为10 mM，缓冲液H为10×NEB缓冲液；
步骤S2中，所述分子增强剂为四甲基氯化铵、牛血清白蛋白和单链结合蛋白中的一种，浓度为1mg/mL；所述限制性内切酶、DNA聚合酶、缓冲液G、模板溶液、dNTP溶液、缓冲液H、blocker溶液Y和分子增强剂的体积比为2:2:5:0.5:1.5:2.5:1:1；指数扩增反应温度为55-65℃，时间为20-60 min；
步骤S3中： 所述荧光探针中的序列为与blocker互补的DNA片段；
所述荧光探针中的荧光基团为Cy5、Cy3、FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、FITC、罗丹明、IAF、Cy7和TRITC中的一种，浓度为10μM；
所述过渡金属二卤族化合物为MoS2、WS2、MoSe2、TiSe2和WTe2中的一种，浓度为1mg/mL；
所述荧光探针、扩增反应产物C和过渡金属二卤族化合物纳米溶液或石墨烯溶液的体积比为1:1:5；
所述水浴的温度为20-50℃，时间为20-100 min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450920A (zh) * 2014-12-11 2015-03-25 华南师范大学 基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法
CN109207567A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 江南大学 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105764490B (zh) * 2013-09-24 2020-10-09 加利福尼亚大学董事会 用于生物测定和诊断的胶囊封装的传感器和感测系统及其制造和使用方法
CN107475364A (zh) * 2017-06-30 2017-12-15 北京百康芯生物科技有限公司 耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450920A (zh) * 2014-12-11 2015-03-25 华南师范大学 基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法
CN109207567A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 江南大学 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Competitive fluorometric assay for the food toxin T-2 by using DNA-modified silver nanoclusters, aptamer-modified magnetic beads, and exponential isothermal amplification;Man Zhang等;《Microchimica Acta》;20190307;第186卷;219 *
基于SELEX技术筛选前白蛋白的核酸适配体及磁珠适配体传感器检测细菌内毒素的应用;左明艳;《万方中国学位论文全文数据库》;20150520;第1-74页 *
基于生物传感器的内毒素检测研究进展;温路新等;《化学通报》;20180118;第81卷(第01期);第29-36页 *
适配体在靶向特异性检测中的最新应用进展;年宇娇等;《化学通报》;20170918;第80卷(第09期);第819-828页 *

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